DE69920048T2

DE69920048T2 - Verfahren und biosensor zum nachweis von antigenen

Info

Publication number: DE69920048T2
Application number: DE69920048T
Authority: DE
Inventors: Isao Kawasaki-shi KARUBE; Yoko Nomura
Original assignee: Karube Isao Kawasaki; Ebara Corp
Current assignee: Karube Isao Kawasaki; Ebara Corp
Priority date: 1999-01-12
Filing date: 1999-01-12
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2019-01-13
Also published as: EP1143251B1; WO2000042433A1; AU1785499A; ATE275728T1; EP1143251A1; EP1143251B9; DE69920048D1; EP1143251A4; CN1309771A

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Antigens und einen Biosensor, insbesondere ein Verfahren zum Nachweis eines Antigens und einen Biosensor, wobei Verfahren und Biosensor die Oberflächenplasmonresonanz verwenden.
Verwandter Stand der Technik
Endokrine Unterbrecher sind Chemikalien, die die endokrinen Funktionen eines Organismus nachteilig beeinflussen. Wenn eine solche Chemikalie, freigesetzt in die Umgebung, in den Körper eines Organismus eintritt, wirkt sie wie ein Hormon, und unterbricht die Wirkungen intrinsischer Hormone (z.B. von Thyroidhormonen und Östrogenen) und übt nachteilige Einflüsse auf die Reproduktionsfunktionen sowie Immunfunktionen des normalen Organismus aus, wie auch der Nachkommen. "Endokrine Unterbrecher" können als Endokrin-unterbrechende Chemikalien oder Hormonchemikalien bezeichnet werden.
Gemäß "An Intrim Report from the Research Group on the Problem of Exogenous Endocrine-Disrupting Chemicals" (1997) von der Environmental Agency in Japan, können endokrine Unterbrecher z.B. in (a) industrielle Chemikalien (synthetische Detergenzien, Farben, Kosmetika, Kunststoffweichmacher), (b) Dioxine, (c) Agrochemikalien (Herbizide, Antipilzmittel, Insektizide), (d) Arzneimittel (synthetische Hormone) und (e) natürlich auftretende Substanzen, eingeteilt werden.
Beispiele für die Industriechemikalien sind Alkylphenole wie z.B. Nonylphenol und Octylphenol, einige Bisphenole wie z.B. Bisphenol A und Phthalsäurederivate, wie z.B. Butylbenzylphthalat und Dibutylphthalat. Beispiele für die Agrochemikalien sind DDT (DDD, DDE), Endosulfan, Methoxychlor, Heptachlor, Toxaphen, Dieldrin und Lindan. Beispiele für die Arzneimittel sind Diethylstilbestrol (DES) und Ethinylöstradiol (ein orales Kontraceptivum). Unter den natürlich auftretenden Substanzen befinden sich Sojabohnen und Genistein, wobei es sich um ein Pflanzenöstrogen handelt, das insbesondere in Sojabohnen enthalten ist.
Tabelle 1 stellt die Klassifikation endokriner Unterbrecher beispielhaft dar.
Endokrine Unterbrecher werden im Körper im wesentlichen durch Nahrungsmittel aufgenommen. Die meisten endokrinen Unterbrecher sind hoch fettlöslich und kaum abbaubar. Daher neigen sie dazu, im Körper durch die Nahrungsmittelkette angehäuft zu werden. Sie werden insbesondere in Vögeln oder marinen Säugern auf einem oberen Niveau in der Nahrungsmittelkette hoch angehäuft. Wenn ein endokriner Unterbrecher in vivo angehäuft wird, führt er zu einem Ungleichgewicht von Hormonen, was zu Abnormalitäten bei Wachstum, Entwicklung und Immunfunktion oder Krebs führen kann, wie z.B. Brustkrebs oder Hodenkrebs oder die Spermatozoen unterdrückt. Es wurde z.B. über eine Mutation von Seeschnecken durch Tributylzinn berichtet und Abnahme der Zahl von Alligatoren in Florida durch DDT.
Die endokrinen Unterbrecher, denen die größte Aufmerksamkeit in den letzten Jahren geschenkt wurde, sind Dioxine. Dioxin ist eine karzinogene Substanz mit der höchsten Toxizität aller vom Menschen erzeugten Substanzen. Dioxin ist so toxisch, dass die Aufnahmeerlaubnis niedrig ist.
Das Ministerium für Health and Welfare in Japan schlug z.B. im Juni 1996 10 Picogramm -TEQ kg^-1 Tag^-1 als tolerierbare tägliche Aufnahme (TDI) von Dioxinen vor. Andererseits etablierte die Environmental Agency in Japan 5 Picogramm -TEQ kg^-1 Tag^-1 als den Richtwert für die Gesundheitsrisikobewertung im Dezember 1996. Tabelle 2 fasst die Aufnahmeerlaubniswerte für Dioxine zusammen, die in unterschiedlichen Ländern festgesetzt wurden. Tabelle 2
(Zitiert aus "Risk Evaluation of Dioxin", unter der Aufsicht von Environmental Agency Dioxin Risk Evaluation Study Meeting, Chuo Hoki Publishing, 1997)
Da die Aufnahmeerlaubnis für Dioxine so niedrig liegt, wie oben festgehalten ist es schwierig, solche Spurenmengen an Dioxinen zu messen. Außerdem existieren vielzählige Isomere von Dioxinen und ihre Analyse wird dadurch noch schwieriger. Weiterhin involviert eine Probe, die Dioxine enthält, häufig die gleichzeitige Gegenwart von Dibenzofuranen und PCB, die in ihrer Struktur den Dioxinen ähnlich sind und die Abtrennung von diesen Substanzen ist ebenfalls anspruchsvoll. Bis jetzt wurde die Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) als verlässlichstes Verfahren für die Messung von Dioxinen zugelassen. Bei der GC-MS ist jedoch eine sehr komplizierte Vorbehandlung nötig und diese Vorbehandlung benötigt z.B. 2 bis 3 Wochen.
12 zeigt ein Flussdiagramm für die Vorbehandlung einer Abwasserprobe. Die Abwasserprobe wird in geeigneter Menge durch ein Glasfaserfilterpapier (Porendurchmesser 1 μm) gefiltert und dadurch in ein Filtrat und Feststoffe geteilt. Das Filtrat (1 l) wird zweimal mit 100 ml Dichlormethan extrahiert. Die Feststoffe werden mit Aceton dehydratisiert und dann einer Soxhlet-Extraktion mit Toluol für 16 Stunden oder mehr unterzogen.
Zu einer Mischung der jeweiligen Extrakte werden innere Standards 13C-2,3,7,8-TCDD, 13C-2,3,7,8-TCDF, 13C-2,3,7,8-OCDD und 13C-2,3,7,8-OCDF zugefügt. Die Mischung wird durch eine Konzentriervorrichtung auf ungefähr 5 ml konzentriert. So viel Toluol wie möglich wird abdestilliert, wobei Stickstoffgas auf das Konzentrat geblasen wird und dann wird die Probe mit Schwefelsäure behandelt. Die inneren Standards sollten wünschenswerterweise, wenn möglich, in geeigneten Bereichen von 17 Typen von Isomeren zugefügt werden, einschließlich Chlor-substituierter Verbindungen, wobei es sich nicht um die oben erwähnten vier Isomere handelt und für eine Korrektur wiedergewonnen werden. Nach einer solchen Vorbehandlung werden die Dioxine durch gewöhnliche GC-MS gemessen.
Wie oben beschrieben, benötigt die GC-MS eine sehr komplizierte Vorbehandlung, die außerdem zeitaufwendig ist. Weiterhin ist ein hoher Grad an Sicherheitsmaßnahmen notwendig, um den Arbeiter vor einer Aussetzung gegenüber den endokrinen Unterbrechern auf der Stufe der Vorbehandlung zu schützen.
Unter diesen Umständen sucht man nach einem einfachen und sicheren Nachweis von endokrinen Unterbrechern, wie Dioxinen, statt einer GC-MS.
Öffentlich bekannte Substanzen können noch nicht als endokrine Unterbrecher etabliert worden sein. Wenn eine neue Substanz synthetisiert wird, kann diese neue Substanz ein endokriner Unterbrecher sein.
Es ist jedoch nicht einfach zu untersuchen, ob eine bestimmte Substanz in vivo in derselben oder einer ähnlichen Weise wie ein Hormon wirkt, um das endokrine System zu unterbrechen oder nicht.
So ist es wünschenswert, auf einfache Weise zu überprüfen, ob eine Substanz, die noch nicht als endokriner Unterbrecher anerkannt wurde, ein endokriner Unterbrecher ist oder nicht. Das heißt, es ist wünschenswert, eine bestimmte Substanz im Hinblick auf ihre Möglichkeit, ein endokriner Unterbrecher zu sein, zu untersuchen und dann zu untersuchen, ob ein Kandidat für einen endokrinen Unterbrecher, der das Screening passiert hat, das endokrine System in vivo unterbricht oder nicht.
Eine Sammlung von Zusammenfassungen von "The Fifth World Congress of Biosensors", abgehalten am 03. bis 05. Juni 1998 im Inter-Continental Hotel in Berlin, Deutschland beschreibt, dass Atrazin durch eine Oberflächen-Plasmonresonanz unter Verwendung eines Sensorchips mit einem daran fixierten Atrazin-Antikörper nachgewiesen wird. Diese Referenz ist jedoch nicht aussagekräftig im Hinblick auf Antikörper gegen andere endokrine Unterbrecher als Atrazin.
Satoshi Sasaki, Ryohei Nagata, Bertold Hock, Isao Karube, Analytica Chimica Acta 368 (1998) 71–76, vom 17. Juli 1998 beschreibt, dass Atrazin durch Oberflächenplasmonresonanz unter Verwendung eines Sensorchips mit einem daran fixierten Atrazin-Antikörper nachgewiesen wird. Diese Referenz beschreibt jedoch keine Antikörper gegen endokrine Unterbrecher, bei denen es sich nicht um Atrazin handelt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung kann ein Antigen mit hoher Empfindlichkeit durch Verwendung der Oberflächenplasmonresonanz nachweisen. Die Empfindlichkeit kann etwa ungefähr 0,1 ppb erreichen. Die Erfindung kann auch das Antigen in qualitativer und quantitativer Weise nachweisen. Weiterhin ist die Erfindung in ihrem Verfahren im Vergleich mit dem konventionellen GC-MS-Verfahren oder Verfahren unter Verwendung von Enzymreaktionen einfach. Daneben verwendet die Erfindung eine Antigen-Antikörper-Reaktion und ist daher im Hinblick auf ihre Selektivität ausgezeichnet.
Wenn das Antigen ein endokriner Unterbrecher ist, kann die Erfindung den endokrinen Unterbrecher nachweisen. Wenn das Antigen eine Substanz mit einem Steroidskelett ist, eine Substanz zum Erhalt, der Unterstützung und der Inhibition der physiologischen Wirkung eines Steroidhormons oder eine Substanz zum Erhalt, der Unterstützung oder Inhibition der physiologischen Wirkung eines Sexualhormons, ist die Erfindung für das Screening des endokrinen Unterbrechers nützlich.
Wenn das Antigen ein Steroidhormon oder ein Sexualhormon ist, ist die Erfindung ebenfalls als medizinischer Sensor nützlich. Die Erfindung kann z.B. für Tests im Hinblick auf eine abnormale Sekretion eines Steroidhormons oder Sexualhormons (z.B. Test im Hinblick auf eine Sterilität), Schwangerschaftstests, Test für das menopausale Syndrom und Dopingtests bei Sportlern angewandt werden.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren für die Verwendung eines Sensorchips für ein Oberflächenplasmonresonanz bereitgestellt mit einem metallischen dünnen Film; einen oder mehrere Antikörper gegen ein oder mehr Antigene, gewählt aus einer Substanz mit einem Steroidskelett, einer Substanz zum Erhalt, der Unterstützung oder Inhibition der physiologischen Wirkung eines Steroidhormons, einer Substanz zum Erhalt, der Unterstützung oder Inhibition der physiologischen Wirkung eines Sexualhormons und einen endokrinen Unterbrecher (ausschließlich einer Triazinverbindung) und eine Fixierungsschicht zur Fixierung des Antikörpers an der dünnen Metallschicht.
Bei der Erfindung ist der Antikörper vorzugsweise ein Antikörper gegen ein Steroidhormon oder gegen eine Substanz, die dieselbe physiologische Wirkung wie diejenige des Steroidhormons zeigt. Alternativ ist der Antikörper vorzugsweise ein Antikörper gegen ein Sexualhormon oder gegen eine Substanz, die dieselbe physiologische Wirkung wie ein Sexualhormon zeigt.
Noch bevorzugter ist der Antikörper ein Antikörper gegen ein Östrogen. Alternativ ist der Antikörper vorzugsweise ein Antikörper gegen einen endokrinen Unterbrecher mit einem zyklischen Kohlenwasserstoffbereich und noch bevorzugter ein Antikörper gegen Dioxine.
Vorzugsweise ist der Antikörper an die Fixierungsschicht durch eine kovalente Bindung fixiert. Die Fixierungsschicht beinhaltet vorzugsweise eine oder mehr organische Dünnfilmschichten.
Die organische Dünnfilmschicht weist vorzugsweise eine Verbindungsschicht auf, die die dünne Metallschicht beschichtet. Alternativ weist die organische Dünnfilmschicht vorzugsweise eine Hydrogelschicht auf. Alternativ weist die organische Dünnfilmschicht vorzugsweise eine Streptavidinschicht auf. Alternativ weist die organische Dünnfilmschicht vorzugsweise eine hydrophobe Schicht auf. Die hydrophobe Schicht enthält vorzugsweise ein Siliziumatom, das an die dünne Metallschicht bindet.
Die dünne Metallschicht weist vorzugsweise eine Bestrahlungsoberfläche auf, die mit eintreffendem Licht bestrahlt wird und eine Nachweisoberfläche auf einer gegenüberliegenden Seite zu der Bestrahlungsoberfläche. Die Fixierungsschicht beschichtet vorzugsweise die Nachweisoberfläche der dünnen Metallschicht. Die Bestrahlungsoberfläche der dünnen Metallschicht beschichtet vorzugsweise ein Substrat, das gegenüber einstrahlendem Licht durchlässig ist. Der Sensorchip weist vorzugsweise zwei oder mehr der Antikörper gegen zwei oder mehr der Antigene auf.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis eines Antigens bereitgestellt, umfassend die folgenden Schritte:
Aussetzen eines Antikörpers eines Sensorchips für eine Oberflächenplasmonresonanz gegenüber einer Probe, wobei der Sensorchip eine dünne Metallschicht aufweist; ein oder mehr der Antikörper gegen ein oder mehr Antigene, gewählt aus einer Substanz mit einem Steroidskelett, einer Substanz zum Erhalt, der Unterstützung oder Inhibition der physiologischen Wirkung eines Steroidhormons, einer Substanz zum Erhalt, der Unterstützung oder Inhibition der physiologischen Wirkung eines Sexualhormons und einem endokrinen Unterbrecher (ausschließlich einer Triazinverbindung) und eine Fixierungsschicht zur Fixierung des Antikörpers auf der dünnen Metallschicht;
Bestrahlen der dünnen Metallschicht mit Licht und
Nachweis der Intensität des reflektierten Lichts von der dünnen Metallschicht.
In der Erfindung beinhaltet das Verfahren vorzugsweise weiterhin den Schritt des Auffindens einer Verlagerung im Winkel des Verschwindens des reflektierten Lichts. Außerdem beinhaltet das Verfahren vorzugsweise weiterhin den Schritt der Bindung eines markierten Antigens, wobei es sich um das obige Antigen, gebunden an ein Markierungsmaterial handelt, an den Antikörper vor dem Expositionsschritt.
Der Antikörper ist vorzugsweise ein Antikörper gegen ein Steroidhormon oder gegen eine Substanz, die dieselbe physiologische Wirkung wie ein Steroidhormon zeigt. Alternativ ist der Antikörper vorzugsweise ein Antikörper gegen ein Sexualhormon oder gegen eine Substanz, die dieselbe physiologische Wirkung wie ein Sexualhormon zeigt. Vorzugsweise ist der Antikörper ein Antikörper gegen ein Östrogen.
Alternativ ist der Antikörper vorzugsweise ein Antikörper gegen einen endokrinen Unterbrecher mit einem zyklischen Kohlenwasserstoffbereich. Vorzugsweise ist der Antikörper ein Antikörper gegen Dioxine.
Der Sensorchip für die Oberflächenplasmonresonanz weist vorzugsweise zwei oder mehr der Antikörper gegen zwei oder mehr der Antigene auf und kann zwei oder mehr Antigene nachweisen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Oberflächenplasmonresonanzapparat bereitgestellt, umfassend:
einen Sensorchip für eine Oberflächenplasmonresonanz mit einer dünnen Metallschicht; einen oder mehr Antikörper gegen ein oder mehr Antigene, gewählt aus einer Substanz mit einem Steroidskelett, einer Substanz zum Erhalt, der Unterstützung, Inhibition oder physiologischen Wirkung eines Steroidhormons, einer Substanz zum Erhalt, der Unterstützung oder Inhibition der physiologischen Wirkung eines Sexualhormons und einem endokrinen Unterbrecher (ausschließlich einer Triazinverbindung) und eine Fixierungsschicht zum Fixieren des Antikörpers an die dünne Metallschicht;
ein optisches System mit einer Lichtquelle für eine Bestrahlung des Sensorchips für die Oberflächenplasmonresonanz mit Bestrahlungslicht; einen Detektor für den Nachweis von reflektiertem Licht von dem Sensorchip für die Oberflächenplasmonresonanz und ein Prisma, das mindestens gegenüber dem Bestrahlungslicht durchlässig ist; und
ein Fließpassagensystem, um eine Probe in Kontakt mit dem Antikörper des Sensorchips für die Oberflächenplasmonresonanz zu bringen.
In der Erfindung weist das Fließpassagensystem vorzugsweise eine Fließzelle auf und der Sensorchip für die Oberflächenplasmonresonanz ist in einer Position, korrespondierend zu der Fließzelle lokalisiert.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A ist eine schematische erklärende Zeichnung eines Verfahrens zur Messung eines endokrinen Unterbrechers gemäß der vorliegenden Erfindung;
1B ist eine schematische erklärende Zeichnung des Verfahrens zur Messung eines endokrinen Unterbrechers gemäß der Erfindung;
2A ist eine Grafik, die die Korrelation zwischen dem Einfallwinkel von bestrahltem Licht, d.h. dem Winkel der Reflexion von reflektiertem Licht und der Intensität von reflektiertem Licht darstellt;
2B ist eine Grafik, die die Korrelation zwischen der vergangenen Zeit und einem Resonanzsignal darstellt;
3 ist eine erklärende Teilansicht einer Ausführungsform eines Sensorchips für eine Oberflächenplasmonresonanz gemäß der Erfindung;
4 ist eine erklärende Teilansicht einer anderen Ausführungsform des Sensorchips für die Oberflächenplasmonresonanz gemäß der Erfindung;
5A ist eine Aufrissteilansicht des Sensorchips für die Oberflächenplasmonresonanz der Erfindung und eines SPR-Apparats;
5B ist eine erklärende Teil-Zeichnung des Sensorchips für die Oberflächenplasmonresonanz der Erfindung und des SPR-Apparats;
6A ist eine erklärende Zeichnung eines Fließpassagensystems des SPR-Apparats;
6B ist eine vergrößerte Teilansicht des Fließpassagensystems des SPR-Apparats;
7 ist eine vergrößerte erklärende Zeichnung des Fließpassagensystems des SPR-Apparats;
8A, 8B und 8C sind erklärende Zeichnungen eines kompetitiven Verfahrens;
9 zeigt die Korrelation zwischen der Dioxinkonzentration und dem Antwortwert im kompetitiven Verfahren;
10 zeigt die Korrelation zwischen der vergangenen Zeit nach Fixierung eines Antidioxin-monoklonalen Antikörpers und dem Antwortwert;
11 zeigt die Korrelation zwischen der vergangenen Zeit nach Fixieren eines Anti-Östradiol-monoklonalen Antikörpers und dem Antwortwert;
12 ist ein Flussdiagramm für eine konventionelle Vorbehandlung einer Abwasserprobe;
13 zeigt Kopplungsverfahren und
14 zeigt Kopplungsverfahren.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
Die Erfindung betrifft einen Biosensor und ein Verfahren zum Nachweis eines Antigens, wobei Biosensor und Verfahren Oberflächenplasmonresonanz (SPR) verwenden.
Oberflächenplasmonresonanz betrifft ein Phänomen, wobei wenn eine dünne Metallschicht mit Licht bestrahlt wird, das Licht zu einer Oberfläche auf einer gegenüberliegenden Seite zu der bestrahlten Oberfläche transmittiert wird. Bedingungen, unter denen eine Oberflächenplasmonresonanz stattfindet, werden als einzigartig bestimmt.
In der Erfindung kann ein SPR-Apparat, der als BIACORE bezeichnet wird (eingetragene Marke) und der von Pharmacia Biosensor (nun Biacore), Schweden, erzeugt wird, vorzugsweise verwendet werden. In Japan kann dieser Apparat von Biacore Kabushiki Kaisha (3-25-1, Hyakunin-cho, Shinjuku-ku, Tokyo 169-0073, Japan) erhalten werden.
Das Messprinzip und das Messverfahren durch einen Biosensor, der eine Oberflächenplasmonresonanz verwendet und BIACORE werden in S. Hashimoto, "Analysis of biomolecule interaction utilizing surface plasmon resonance phenomenon", Bunseki 1997 (5) 362–368; herausgegeben von K. Nagata und H. Handa, "Methods for real time analysis experiments on biomaterial interaction – Focused on BIACORE", Schpringer Fairlark Tokyo, 1998; und S. Kawada (1989) "Surface plasmon sensor" 0 plus E, 112, 133–139 beschrieben. Diese Beschreibungen sind in der Beschreibung der vorliegenden Anmeldung zitiert.
Zunächst wird das Prinzip der Oberflächenplasmonresonanz im Hinblick auf die 1A erklärt. In 1A beinhaltet ein Sensorchip 10 eine dünne Metallschicht und ein Antikörper 19 gegen ein bestimmtes Antigen ist an eine Oberfläche des Sensorchips 10 fixiert. Der Antikörper 19 ist gegenüber einer Fließpassage 22 exponiert, durch die eine Probe, die optional ein bestimmtes Antigen 29 enthält, fließt. Die Probe ist ein Fluid und typischerweise eine Flüssigkeit.
3 ist eine erklärende Teilansicht des Sensorchips 10. In 3 beinhaltet der Sensorchip 10 eine dünne Metallschicht 14 und die dünne Metallschicht 14 weist eine Bestrahlungsoberfläche 14s auf, die mit einfallendem Licht bestrahlt wird und eine Nachweisoberfläche 14t auf der gegenüberliegenden Seite zu der Bestrahlungsoberfläche 14s. Anders ausgedrückt, weist die dünne Metallschicht 14 eine Nachweisoberfläche 14t auf der Seite auf, auf der der Antikörper 19 fixiert ist und die Bestrahlungsoberfläche 14s auf der gegenüberliegenden Seite.
In 1A ist ein Prisma 34 auf einer Oberfläche 10s des Sensorchips 10 angeordnet. Eine Lichtquelle 32 projiziert Licht, das durch das Prisma 34 passiert, um die Bestrahlungsoberfläche 14s der dünnen Metallschicht 14 des Sensorchips 10 zu bestrahlen. Dieses Licht ist vorzugsweise polarisiertes Licht und seine Wellenlänge beträgt vorzugsweise 300 bis 2.000 nm. Ein Detektor 36 überwacht die Intensität des reflektierten Lichts, das von der Bestrahlungsoberfläche 14s der dünnen Metallschicht 14 des Sensorchips 10 reflektiert wurde und durch das Prisma 34 passierte. Der Auftreffwinkel des bestrahlenden Lichts und der Reflektionswinkel des reflektierten Lichts entsprechen sich ohne Zweifel. Auf der dünnen Metallschicht werden in der Regel 90% oder mehr des einfallenden Lichtes reflektiert und der Rest dringt durch die dünne Metallschicht.
2A zeigt die Korrelation zwischen dem Einfallwinkel des bestrahlenden Lichts, d.h. dem Reflexionswinkel von reflektiertem Licht und der Intensität von reflektiertem Licht. Wenn das Licht mit einem Einfallwinkel, der variiert, projiziert wird, gibt es einen Winkel, bei dem die Intensität des reflektierten Lichts abgeschwächt wird, wie dargestellt durch ein "Lichttal" 42 auf Kurve 40. Dieser Winkel wird als Winkel des Verschwindens oder SPR-Winkel des reflektierten Lichts bezeichnet. Bei diesem Winkel des Verschwindens tritt ein quantum-mechanisches Phänomen, das als Oberflächenplasmonresonanz bezeichnet wird, auf der Detektionsoberfläche 14t der dünnen Metallschicht 14 auf. Genauer ausgedrückt wird eine Welle, die sich nur durch die Detektionsoberfläche 14t der dünnen Metallschicht 14 ausdehnt (wobei diese Welle als evaneszente Welle bezeichnet wird) erzeugt, um ein Oberflächenplasmon von freien Elektronen der dünnen Metallschicht zu induzieren. Ein Teil der Energie des bestrahlten Lichts wird in die Energie der Oberflächenplasmonresonanz umgewandelt und in Übereinstimmung mit diesem Phänomen zerfällt die Intensität des reflektierten Lichts.
Dieser Winkel des Verschwindens variiert abhängig von dem Zustand der Detektionsoberfläche 14t der dünnen Metallschicht 14, d.h. die Oberfläche 14t der dünnen Metallschicht 14 auf der Seite, auf der der Antikörper 19 fixiert ist, z.B. abhängig davon, ob das bestimmte Antigen 29 von dem Antikörper 19 gefunden wurde. Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird daher eine Verlagerung des Winkels des Verschwindens gemessen.
Wenn eine Probe, enthaltend das bestimmte Antigen 29, durch die Fließpassage 22 geströmt wird, wie dargestellt in 1A, bindet das bestimmte Antigen 29 an den Antikörper 19 auf der Oberfläche des Sensorchips 10, wie angegeben in 1B.
Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird eine Veränderung im Winkel des Verschwindens gemessen, wie dargestellt in 2A. Gemäß einer anderen Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird ein Zeitverlauf eines Resonanzsignals bei einem bestimmten Winkel, typischerweise dem Winkel des Verschwindens, gemessen, wie dargestellt in 2B.
In 2A zeigt die Kurve 40 die Korrelation zwischen dem Einfallswinkel des einfallenden Lichts und der Intensität des reflektierenden Lichts in einem Zustand, in dem das bestimmte Antigen 29 nicht an den Antikörper 19 gebunden hat. Eine Kurve 44 zeigt andererseits eine Korrelation zwischen dem Einfallwinkel von einfallendem Licht und der Intensität von reflektiertem Licht in einem Zustand, in dem das bestimmte Antigen 29 an den Antikörper 19 gebunden hat. Man wird feststellen, dass als Ergebnis der Bindung des bestimmten Antigens 29 an den Antikörper 19 das "Tal des Lichts" 42 zu einem "Tal des Lichts" 46 wandert. Das heißt, die Bindung des bestimmten Antigens 29 an den Antikörper 19 führt zu einer Verlagerung des Winkels des Verschwindens. Der Grad der Verlagerung bei dem Winkel des Verschwindens korreliert zu der Menge des an den Antikörper 19 gebundenen bestimmten Antigens, d.h. zu der Menge des bestimmten Antigens in der Probe.
Als eine Einheit, die den Bewegungsgrad des "Tal des Lichts" repräsentiert, wird eine Veränderung von 0,1° im SPR-Winkel als 1.000 Resonanzeinheiten (RU) definiert. Experimente wurden durch Verwendung eines radioisotop-markierten Proteins durchgeführt, um die Korrelation zwischen einem SPR-Signal und der Proteinkonzentration auf der Sensorchipoberfläche zu beobachten. Diese Experimente haben bestätigt, dass 1.000 RU zu einer Massenveränderung von ungefähr 1 ng/mm² im Protein auf der Sensorchipoberfläche korrespondieren. Dieser Wert ist fast konstant, unabhängig von der Art des Proteins. Bei tatsächlichen Messungen kann eine Veränderung von ungefähr 10 RU (ungefähr 10 pg/mm²) beobachtet werden.
2B zeigt die Korrelation zwischen Zeit und Intensität von reflektiertem Licht im "Tal des Lichts" 42, d.h. im Winkel des Verschwindens. Anders ausgedrückt zeigt 2B den Zeitverlauf der Intensität von reflektiertem Licht in einem Winkel des Verschwindens 42. Es kann gesehen werden, dass bei Bindung des bestimmten Antigens 29 an den Antikörper 19 der Winkel des Verschwindens variiert und keine Oberflächenplasmonresonanz mehr auftritt. Die Wechselwirkung zwischen Antikörper 19 und bestimmtem Antigen 29 auf der Oberfläche des Sensorchips 10 kann in Echtzeit überwacht werden.
3 zeigt eine Ausführungsform eines Sensorchips für eine Oberflächenplasmonresonanz gemäß der Erfindung. US-Patent 5,242,828 beschreibt eine Detektionsoberfläche für einen Biosensor. Diese Detektionsoberfläche für einen Biosensor kann vorzugsweise für den Sensorchip für die Oberflächenplasmonresonanz der Erfindung verwendet werden.
Der Sensorchip 10 weist vorzugsweise ein Substrat 12 auf, das gegenüber Licht durchlässig ist. Als Substrat 12 wird typischerweise Glas verwendet. Als Substrat kann ein Material einer optischen Faser verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Glasobjektträger mit einer Dicke von 0,2 bis 0,8 mm verwendet werden.
Der Sensorchip 10 weist eine dünne Metallschicht 14 auf, da die Oberflächenplasmonresonanz in der Detektionsoberfläche 14t der dünnen Metallschicht 14 auftritt, wenn Licht auf die Bestrahlungsoberfläche 14s der dünnen Metallschicht 14 unter bestimmten Bedingungen projiziert wird. Wenn der Sensorchip 10 erzeugt werden soll, wird die dünne Metallschicht 14 z.B. auf dem Glassubstrat 12 durch Dampfablagerung, Zerstäuben oder Elektroplattieren gebildet. Eine Vakuumablagerung kann eine physikalische Vakuumablagerung oder chemische Vakuumablagerung sein.
Die dünne Metallschicht 14 kann eine Einzelschichtstruktur oder eine vielschichtige Struktur, wie z.B. eine zweischichtige Struktur, aufweisen. In 3 hat die dünne Metallschicht 14 eine einzelschichtige Struktur.
Die Dicke der dünnen Metallschicht 14 beträgt vorzugsweise 10 bis 100 nm, noch bevorzugter 20 bis 80 nm und noch bevorzugter 20 bis 60 nm. Wenn die Dicke mehr als 100 nm beträgt, tritt eine Oberflächenplasmonresonanz minimal auf. Wenn die Dicke weniger als 10 nm beträgt, wird es schwierig, eine einheitliche Dicke zu bilden. Um die Reproduzierbarkeit des SPR-Signals zu verbessern, ist die Dicke der dünnen Metallschicht 14 vorzugsweise einheitlich.
Die dünne Metallschicht 14 umfasst vorzugsweise Gold, Silber, Kupfer, Aluminium, Platin oder Iridium oder vorzugsweise umfasst sie ein Edelmetall wie z.B. Gold, Silber oder Platin. Die Bestrahlungsoberfläche 14s umfasst insbesondere vorzugsweise ein Edelmetall. Dies liegt daran, dass ein Edelmetall chemisch inert ist und eine hohe Effizienz für die Erzeugung eines SPR-Signals aufweist. Von den Edelmetallen wird Silber aus bestimmten Gründen bevorzugt, wie z.B. seiner chemischen Stabilität und einer hohen SPR-Signalerzeugungseffizienz.
Die dünne Metallschicht 14 kann aus nicht weniger als 80 Gew.-%, vorzugsweise nicht weniger als 90 Gew.-% eines Edelmetalls und nicht mehr als 20 Gew.-%, vorzugsweise nicht mehr als 10 Gew.-% eines anderen Metalls bestehen. Beispiele für andere Metalle sind typische Metalle, wie z.B. Aluminium und Übergangsmetalle wie z.B. Chrom.
Der Sensorchip 10 weist eine Fixierungsschicht 16 zum Fixieren des Antikörpers 19 an der dünnen Metallschicht 14 auf. Die Fixierschicht 16 wird auf der Detektionsoberfläche 14t der dünnen Metallschicht 14 gebildet, da es schwierig ist, den Antikörper 19 direkt an der dünnen Metallschicht 14 zu fixieren.
Die Fixierschicht 16 weist eine vielschichtige Struktur, wie z.B. eine zweischichtige Struktur auf oder kann eine einzelschichtige Struktur aufweisen. In 3 weist die Fixierschicht 16 eine zweischichtige Struktur auf, bestehend aus einer Bindeschicht 17 und einem Fixierungskörper 18. Die Bindeschicht 17 beschichtet vorzugsweise die Detektionsoberfläche 14t der dünnen Metallschicht 14 und wie beschrieben in dem vorher erwähnten U.S.P. 5,242,828, und kann vorzugsweise die Detektionsoberfläche 14s der dünnen Metallschicht 14 vor einer Korrosion usw. schützen.
Der Fixierkörper 18 dient andererseits dazu, den Antikörper 19 stabil zu fixieren. Der Antikörper 19 ist vorzugsweise durch eine kovalente Bindung an den Fixierkörper 18 gebunden. Ebenfalls ist der Fixierkörper 18 vorzugsweise durch eine kovalente Bindung an die Bindeschicht 17 gebunden.
Ein Beispiel für eine Verbindungsschicht 17 ist, wie in der USP 5,242,828 beschrieben, eine einzelne Schicht eines organischen Moleküls, ausgedrückt durch die Formel X-R-Y, worin X Disulfid, Sulfid, Selenid, Thiol, Nitril oder Isonitril bedeutet.
R bezeichnet eine Kohlenwasserstoffgruppe mit 12 bis 30 Kohlenstoffatomen, die durch ein Heteroatom, wie z.B. ein Sauerstoffatom, unterbrochen sein kann. R ist z.B. eine Alkylengruppe.
Y ist eine aktive Gruppe für die Bindung an den Antikörper 19, wie z.B. eine Hydroxylgruppe, Carboxylgruppe, Aminogruppe, Aldehydgruppe, Hydrazidgruppe, Carbonylgruppe, Epoxygruppe oder Vinylgruppe.
Als X-R-Y wird z.B. 16-Mercaptohexadecanol verwendet.
Als Fixierungskörper 18 kann ein Hydrogel, wie beschrieben in USP 5,436,161 verwendet werden. Als Wasserstoff können vorzugsweise Polysaccharide und organische Polymere verwendet werden. Die Polysaccharide beinhalten Agarose, Dextran oder ihre carboxymethylierten Derivate. Beispiele für die organischen Polymere sind Polyvinylalkohol, Polyacrylsäure, Polyacrylamid und Polyethylenglykol.
Als Hydrogel wird Dextran oder sein Derivat, wie z.B. Carboxymethyldextran, bevorzugt. Insbesondere wird ein einzelkettiges Dextran ohne vernetzte Struktur oder das Derivat davon, wie z.B. Carboxymethyldextran, bevorzugt. Die Verwendung des Dextrans oder des Derivats davon führt zu den folgenden Vorteilen:

➀ Durch Verwendung einer chemischen Reaktion bei breiter Verwendung kann der Antikörper 19 durch eine covalente Bindung fixiert werden.
➁ Das Volumen des Antikörpers 19 in gebundener Form kann erhöht werden.
➂ Eine flexible, hydrophile Matrixumgebung, geeignet für die Interaktion zwischen dem Antikörper 19 und dem bestimmten Antigen 29 kann bereitgestellt werden.
➃ Eine nicht spezifische Bindung an die Sensorchipoberfläche kann niedrig gehalten werden.

Um die Beobachtung des SPR-Signals zu erleichtern, beträgt die Dicke des fixierenden Körpers 18 vorzugsweise ein- bis dreimal die Dicke der dünnen Metallschicht 15. Die Dicke des Fixierungskörpers 18 beträgt vorzugsweise 50 bis 200 nm und noch bevorzugter 60 bis 150 nm. Für die Reproduzierbarkeit des SPR-Signals ist die Dicke des Fixierungskörpers vorzugsweise einheitlich.
4 zeigt eine andere Ausführungsform des Sensorchips für die Oberflächenplasmonresonanz gemäß der Erfindung. Dieselben konstituierenden Elemente sind mit denselben Referenzzahlen bezeichnet und ihre Erklärungen werden weggelassen. Bei dem Sensorchip der 4 weist die dünne Metallschicht 14 eine zweischichtige Struktur auf. Eine dünne Übergangsmetallschicht 15a aus Chrom oder ähnlichen wird auf dem Substrat 12 gebildet. Auf der dünnen Übergangsmetallschicht 15a wird eine dünne Schicht aus einem Edelmetall 15b gebildet. Die dünne Übergangsmetallschicht 15a ist vorzugsweise dünner als die dünne Schicht aus dem Edelmetall 15b. Die Dicke der dünnen Übergangsmetallschicht 15a beträgt vorzugsweise nicht mehr als 30%, noch bevorzugter nicht mehr als 20% der Dicke der dünnen Metallschicht 14.
In 4 weist die Fixierungsschicht 16 keine zweischichtige Struktur auf, sondern eine einzelschichtige Struktur. In einer Ausführungsform wird eine Organisiliziumverbindung mit einer funktionellen Gruppe, wie z.B. γ-Aminopropylethoxysilan oder (NH₂CH₂CH₂CH₂)(CH₃CH₂O)SiH₂ verwendet, wobei die Fixierungsschicht 16 stabil an die dünne Metallschicht 14 über das Siliziumatom gebunden werden kann. Außerdem wird die Aminogruppe der Organosiliziumverbindung mit einem Aldehyd umgesetzt und dann wird der Antikörper 19 eingeführt, wodurch eine kovalente Bindung zwischen der Fixierungsschicht 16 und dem Antikörper 19 gebildet werden kann.
Die Fixierungsschicht und der Antikörper weisen vorzugsweise einen Bereich auf, der durch die Formel Si-L-Z-A repräsentiert wird,
worin L eine Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen darstellt, die durch ein Heteroatom, wie z.B. ein Sauerstoffatom, unterbrochen sein kann,
A ist der Antikörper und
Z ist eine Bindung, gebildet durch eine Kopplung der aktiven Gruppe der Fixierungsschicht an den Antikörper.
L ist vorzugsweise eine Gruppe der Formel -(CH₂)_n-, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 18, vorzugsweise 2 bis 10 ist.
Beispiele für Z sind eine Thiolbindung (-SS-), eine Säureamidbindung (-C(=O)NH-), eine Streptavidin-Biotin-Bindung und eine Bindung der Formel -C(=O)-N(H)N=C-.
In einer anderen Ausführungsform der 4 kann die Fixierungsschicht 16 eine Thiolalkangruppe sein, die es ermöglicht, eine sehr hydrophobe Oberfläche zu bilden und einen Zustand zu reproduzieren, der einer Biomembran auf der Sensoroberfläche ähnelt. Die Fixierungsschicht 16 kann z.B. eine einschichtige Struktur aufweisen und kann durch Bildung der oben erwähnten Verbindungsschicht mit einer großen Dicke gebildet werden.
Die Fixierungsschicht kann eine dreischichtige Struktur aufweisen. Streptavidin kann z.B. durch eine Aminkopplung an den Fixierungskörper 18 des Sensorchips für die Oberflächenplasmonresonanz, beschrieben in 3, zur Bildung einer Streptavidinschicht gebunden sein. Die Fixierungsschicht kann z.B. durch Laminieren der Verbindungsschicht 17, der Hydrogelschicht und einer Streptavidinschicht in dieser Reihenfolge gebildet werden.
Streptavidin ist ein Protein mit einer tetrameren Struktur mit einem Molekulargewicht von 60.000. Da die Dissoziationskonstante für die Bindung von Streptavidin- Biotin 10¹⁵ M beträgt, kann die Streptavidinschicht den biotinylierten Antikörper sehr stabil fixieren.
Weiterhin können verschiedene Schichten in der Fixierungsschicht durch öffentlich bekannte Kopplungsverfahren gebildet werden, wie dargestellt in den 13 und 14, um eine vielschichtige Struktur zu entwerfen.
Bei dem Sensorchip der Erfindung wird ein bestimmter Antikörper 19 an die Fixierungsschicht 16 fixiert. Zunächst wird der bestimmte Antigen beschrieben und dann der Antikörper 19, der gegen ihn gerichtet ist.
Gemäß der Erfindung dient eine Substanz mit einem Steroidskelett, eine Substanz zum Erhalt, der Unterstützung oder der Inhibition des physiologischen Wirkung eines Steroidhormons, eine Substanz zum Erhalt, der Unterstützung oder der Inhibition der physiologischen Wirkung eines Sexualhormons oder ein endokriner Unterbrecher (außer einer Triazinverbindung) als Antigen. Ein typisches Beispiel für die Substanz zum Erhalt, der Unterstützung oder die Inhibition der physiologischen Wirkung eines Steroidhormons, insbesondere die Substanz zum Erhalt der physiologischen Wirkung eines Steroidhormons, ist ein Steroidhormon. Ähnlich ist ein typisches Beispiel einer Substanz zum Erhalt, die Unterstützung oder Inhibition der physiologischen Wirkung eines Sexualhormons, insbesondere die Substanz zum Erhalt der physiologischen Wirkung eines Sexualhormons ein Sexualhormon.
Eine bestimmte Substanz kann eine Substanz aufweisen mit einem Steroidskelett, ein Steroidhormon und gleichzeitig ein Sexualhormon. Zum Beispiel ist Östradiol-17β eine Substanz mit einem Steroidskelett, ein Steroidhormon und gleichzeitig ein Sexualhormon. Zudem kann eine bestimmte Substanz eine Substanz zum Erhalt, der Unterstützung oder Inhibition der physiologischen Wirkung eines Steroidhormons, eine Substanz zum Erhalt, der Unterstützung oder Inhibition der physiologischen Wirkung eines Sexualhormons und gleichzeitig ein endokriner Unterbrecher (außer einer Triazinverbindung) sein. In der Erfindung ist es eine Aufgabe, eine Substanz nachzuweisen, die unter eine der obigen Kategorien fällt.
Wenn z.B. ein Antikörper gegen Östradiol-17β an den Sensorchip fixiert ist, kann Östradiol-17β in einer Probe durch Oberflächenplasmonresonanz nachgewiesen werden. Eine andere Substanz als Östradiol-17β kann an den Antikörper gegen Östradiol-17β gebunden sein. Durch Verwendung der Oberflächenplasmonresonanz kann nachgewiesen werden, ob eine bestimmte Substanz an den Antikörper gegen Östradiol-17β gebunden hat.
Eine Substanz, die an den Antikörper gegen Östradiol-17β auf dem Sensorchip bindet, bindet vermutlich an einen Rezeptor von Östradiol-17β in vivo und unterbricht das endokrine System. Das heißt, eine solche Substanz kann eine ähnliche physiologische Wirkung wie die von Östradiol-17β zeigen und kann in die Kategorie der endokrinen Unterbrecher passen. So dient der Nachweis, ob oder nicht eine bestimmte Substanz an den Antikörper gegen Östradiol-17β bindet als Screening, ob diese Substanz ein endokriner Unterbrecher ist oder nicht.
Das Prinzip des Screenings nach einem endokrinen Unterbrecher ist nicht nur auf Substanzen mit einer physiologischen Wirkung anwendbar, die der von Östradiol-17β ähnlich ist, sondern auch auf andere Substanzen, die eine ähnliche physiologische Wirkung wie die anderer Steroidhormone und Sexualhormone zeigen.
Zusätzlich legt die Tatsache, dass eine bestimmte Substanz an einen Antikörper gegen Dioxine bindet nahe, dass diese Substanz eine physiologische Wirkung zeigen kann, die ähnlich der von Dioxinen in vivo ist.
Unter Betrachtung dieser Tatsachen kann das Prinzip des Screenings ebenfalls auf eine Substanz angewandt werden, die ein Steroidskelett aufweist, eine Substanz zum Erhalt, der Unterstützung oder Inhibition der physiologischen Wirkung eines Steroidhormons und eine Substanz zum Erhalt, der Unterstützung oder Inhibition der physiologischen Wirkung eines Sexualhormons. Eine weitere detaillierte Beschreibung des Antigens wird unten angegeben.
Steroid ist ein generischer Name für eine Gruppe von Verbindungen mit einem Steroidskelett, d.h. ein Cyclopentanoperhydrophenanthren-Kohlenstoffskelett. Die Struktur des Steroidskeletts ist unten dargestellt.
Grundstruktur des Steroids
Unter den Steroiden sind Sterole, Gallensäure, Sexualhormone und Adrenocorticohormone beinhaltet. Sexualhormone sind in vielen Fällen Steroide, können jedoch Nicht-Steroidhormone, wie Östrogenhormone beinhalten.
Unter den C₁₈-Steroiden werden Östrogene genannt. Beispiele für C₁₉-Steroide sind Androgene. Beispiele für C₂₁-Steroide sind Gestagene und Adrenalcorticoide. Beispiele für C₂₄-Steroide sind Gallensäure.
Nebennieren-Corticoide werden grob in Glucocorticoide und Mineralcorticoide klassifiziert. Unter den Glucocorticoiden befinden sich Cortisol, Cortison und Corticosteron. Unter den Mineralcorticoiden sind Aldosteron, 11-Deoxycorticosteron und 11-Deoxycortisol beinhaltet.
Viele Gallensäuren bei höheren Vertebraten, wie z.B. Säugern, sind Hydroxyderivate von Cholansäure. Menschliche Galle enthält Cholinsäure, Deoxycholinsäure, Chenodeoxycholinsäure und Lithocholinsäure. Abhängig von der Art der Tiere können die Arten und Zusammensetzungen der Gallensäure leicht differieren.
Unter den Substanzen mit einem Steroidskelett ist Tetrodotoxin beinhaltet. Da Tetrodotoxin ein tödliches Gift ist, ist der einfache Nachweis einer Spurenmenge von Tetrodotoxin sehr bedeutungsvoll.
Steroidhormone beziehen sich auf Hormone, die Steroide sind und ihre Beispiele sind Östrogene, Androgene, Gestagene und Nebennierencorticoide.
Sexualhormone bezeichnen allgemein Hormone, die im wesentlichen von den Gonaden sezerniert werden, um das Wachstum und die Entwicklung des Reproduktionssystems zu induzieren und zu unterstützen und auch sekundäre sexuelle Charaktere und Reproduktionsverhalten hervorrufen. Unter den Sexualhormonen sind Androgene, Östrogene und Gestagene beinhaltet.
Androgene beziehen sich allgemein auf Steroidhormone mit einer androgenen Hormonaktivität. In der gegenwärtigen Beschreibung bezieht sich Androgene jedoch auf Steroide mit einem Androstanskelett mit 19 Kohlenstoffatomen. Das Androstanskelett ist unten dargestellt.
Androstanskelett
Unter den Androgenen sind Testosteron, Androstendion und Dehydroepiandrosten beinhaltet.
Die physiologischen Wirkungen von Androgen beinhalten z.B. eine sexuelle Differenzierung im Embryostadium, den Erhalt der Funktion der männlichen Genitalorgane (Ductus deferens, Prostata, Samenvesikel, Epididymis, externe Genitalien), Entwicklung sekundärer sexueller Charaktere, Unterstützung der Spermatogenese und Unterstützung der anabolischen Proteinwirkung im Skelettmuskel. Ein anderes Beispiel ist die Wirkung auf den Hypothalamus und die Hypophyse zur Unterdrückung der luteinisierenden Hormonsekretion durch einen negativen Rückkopplungsmechanismus.
Testosteron zeigt z.B. die folgenden physiologischen Wirkungen: Testosteron hat die Wirkungen einer Entwicklung sekundärer sexueller Charaktere, das Aufzeigen einer proteinanabolischen Aktion und die Unterstützung des Wachstums von Muskeln. Es wirkt auch auf die Hypophyse um die Sekretion von gonadotropen Hormonen zu unterdrücken und zeigt außerdem die physiologische Wirkung des konstant Haltens der Testosteronkonzentration im Blut durch einen Rückkopplungsmechanismus.
Östrogen ist eine Art eines Sexualhormons, die im wesentlichen von den Ovarien in Vertebraten sezerniert wird, um die weiblichen Gonadenanhänge für ihre volle Funktion wachsen zu lassen. Bei Säugern induziert Östrogen einen Östruszustand. Östrogen wird ebenfalls von der Plazenta sezerniert und wird auch in geringen Mengen vom Nebennierencortex und Testis sezerniert. Östrogen beinhaltet Östrogenhormone und Corpus luteum Hormone. Die Hauptöstrogene sind Östradiol-17β, Östron und Östriol.
Östrogene werden grob in die folgenden Klassen klassifiziert 1) Steroidhormone und ihre Metaboliten, wie z.B. Östradiol, synthetisiert in reifen Eileiterfollikeln der Eileiter und der Plazenta bei einer Schwangerschaft und davon sezerniert und Östron, Östriol, Equilin und Equilinin, angetroffen in großen Mengen im Urin usw., 2) chemische Derivate dieser Hormone mit Östrogenwirkung (z.B. Homoöstron, Ethinylöstradiol, Doisynolsäure (doisynolic acid)) und 3) synthetische Substanzen ohne Steroidstruktur, die jedoch eine Östrogenwirkung zeigen, d.h. synthetische Östrogene (z.B. Diethylstilbestrol, Hexestrol).
Östradiol-17β zeigt z.B. die folgenden physiologischen Wirkungen: es unterstützt das Wachstum des Eileiterfollikels und die Brustdrüse und wirkt auf die adnexalen Gonaden, beschleunigt sekundäre sexuelle Charakteristika. Es wirkt auch auf die arciformen Kerne (arcuate nuclei), um eine negative Rückkopplung für das luteinisierende Hormon (LH) zu induzieren. Es wirkt jedoch positiv im Frontbereich des Fasciculus opticus, um Gonadotropin-freisetzendes Hormon (GnRH) zu sezernieren und erhöht auch die Empfindlichkeit der Hypophyse gegenüber GnRH, was eine LH-Ausschüttung vor der Ovulation auslöst. Bei Vögeln unterstützt Östradiol-17β, die Synthese und Sekretion von Eiweißprotein im Oviduct. Bei oviparen Vertebraten wirkt Östradiol-17β auf die Leber und einen Transport von Vitellogenin, einem Eigelbprotein-Vorläufer auszulösen, zu den Ovarien durch den Blutstrom, so dass Vitellogenin in das Ei aufgenommen wird, um zu einem Eigelbprotein zu werden.
Gestagen ist eine generische Bezeichnung für Verbindungen mit Progesteron-ähnlichen Wirkungen, wie z.B. einer Implantation eines befruchteten Eis und einem Erhalt der Schwangerschaft bei Säugern. Gestagen wird auch als Progestin oder Progestogen bezeichnet. Ein typisches Beispiel von Gestagen ist Progesteron, jedoch Steroide, die Progesteron ähneln, die nicht die oben erwähnten Aktivitäten aufweisen, wie z.B. 20β-Dihydroxyprogesteron und Pregnandiol sind ebenfalls in den Gestagenen umfasst. Gestagen wird vom Corpus luteum sezerniert, der der Wirkung des Corpus luteum Hormons ausgesetzt wurde.
Die physiologische Wirkung von Gestagen ist eine Zusammenarbeit mit Östrogen, um eine Verdickung des Endometriums auszulösen sowie eine Verzweigung der Uterusdrüse und dadurch Stimulation einer Implantation des befruchteten Eis. Eine andere Wirkung ist die Wirkung im Antagonismus zu Östrogen, um den Östrus zu unterdrücken, was eine Fortsetzung der Schwangerschaft ermöglicht.
Gestagen wird vom Cortus luteum der Lactation ebenfalls sezerniert und abhängig von der Art wird es in großen Mengen während der Schwangerschaft sezerniert. Gestagen wirkt auf den vorderen Lobus der Hypophyse in Kooperation mit Östrogen, um die Sekretion des luteinisierenden Hormons zu unterdrücken. So tritt keine Ovulation auf, während der Corpus luteum arbeitet.
Endokrine Unterbrecher sind chemische Substanzen, die die endokrine Funktion eines lebenden Organismus negativ beeinflussen, wie vorher festgehalten. Wenn eine chemische Substanz in die Umgebung freigesetzt wird und in den Körper eines Organismus eindringt, übt sie eine ähnliche Funktion wie die eines Hormons aus, um die Wirkungen intrinsischer Hormone zu unterbrechen (z.B. der Thyroidhormone und Östrogene) und übt nachteilige Einflüsse auf die reproduktive Funktion, die Immunfunktion usw. von gesunden Organismen und ihren Nachkommen aus.
Beispiele für endokrine Unterbrecher sind Dioxine, polychlorierte Biphenyle (PCB), polybromierte Biphenyle (PCB), Hexachlorbenzol (HCB), Pentachlorphenol (PCP), 2,4,5-Trichlorphenoxyessigsäure, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, Amitrol, Atrazin, Alachlor, Simazin, Hexachlorcyclohexan, Ethylparathion, Carbaryl, Chlordan, Oxychlordan, trans-Nonachlor, 1,2-Dibrom-3-chlorpropan, DDT, DDE, DDD, Kelthan, Aldrin, Endrin, Dieldrin, Endosulfan (Benzoepin), Heptachlor, Heptachlorepoxid, Malathion, Methomyl, Methoxychlor, Mirex, Nitrophen, Toxaphen, Tributylzinn, Triphenylzinn, Trifluralin, Alkylphenol (C4 bis C9), Bisphenol A, Di-2-ethylhexylphthalat, Butylbenzylphthalat, Di-n-butylphthalat, Dicyclohexylphthalat, Diethylphthalat, Benzo(a)pyren, 2,4-Dichlorphenol, Di-2-ethylhexyladipat, Benzophenon, 4-Nitrotoluol, Octachlorstyrol, Aldicarb, Benomyl, Kepon (Chlordecon), Manzeb (Mancozeb), Maneb, Methyram, Metributzin, Cypermethrin, Esfenvalerat, Fenvalerat, Permethrin, Vinclozolin, Zineb, Ziram, Dipentylphthalat, Dihexylphthalat, Dipropylphthalat, Dimer und Trimer von Styrol, Styrol, n-Butylbenzol und Östradiol. Von diesen endokrinen Unterbrechern werden Atrazin und Simazin als Triazinverbindungen genannt.
Von den endokrinen Unterbrechern mit einem zyklischen Kohlenwasserstoffanteil sind einige hoch toxisch. Der zyklische Kohlenwasserstoffanteil kann aromatisch oder aliphatisch sein. Beispiele für den zyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffanteil sind ein Benzolring, Naphthalinring, Phenanthrenring, Anthrazenring und Pyrenring. Inden, Phenol und Styrol haben z.B. einen aromatischen zyklischen Kohlenwasserstoffanteil, einen Benzolring. Der cyclische Kohlenwasserstoffanteil kann ein grundlegender Bestandteil eines kondensierten Rings sein.
Beispiele für die endokrinen Unterbrecher mit einem zyklischen Kohlenwasserstoffanteil sind Dioxine, polychlorierte Biphenyle (PCB), polybromierte Biphenyle (PCB), Hexachlorbenzol (HCB), Pentachlorphenol (PCP), 2,4,5-Trichlorphenoxyessigsäure, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, Triphenylzinn, Alkylphenol (C4 bis C9), Bisphenol A, Phthalsäurealkylester, Benzo(a)pyren, 2,4-Dichlorphenol, Benzophenon, Nitrotoluol, Octachlorstyrol, Dimer und Trimer von Styrol, Styrol, n-Butylbenzol und Östradiol.
Unter den endokrinen Unterbrechern mit einem zyklischen Kohlenwasserstoffanteil, substituiert durch ein Halogenatom, insbesondere denjenigen mit einem zyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffanteil, substituiert durch ein Halogenatom, sind diejenigen beinhaltet, die eine besonders hohe Toxizität aufweisen. Das Halogenatom bezieht sich auf ein Fluor, Chlor, ein Brom- oder ein Iodatom oder eine willkürliche Kombination von diesen. Chlor- und Bromatome führen insbesondere zu Problemen. Beispiele der endokrinen Unterbrecher mit einem zyklischen Kohlenwasserstoffanteil, substituiert durch ein Halogenatom, sind Dioxine, polychlorierte Biphenyle (PCB), polybromierte Biphenyle (PCB), Hexachlorbenzol (HCB), Pentachlorphenol (PCP), 2,4,5-Trichlorphenoxyessigsäure, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure und 2,4-Dichlorphenol.
Dioxine beziehen sich generisch auf Polychlordibenzoparadioxin (hiernach bezeichnet als PCDD) und Polychlordibenzofuran (hiernach als PCDF bezeichnet). Die Strukturformeln dieser Verbindungen sind unten angegeben.
PCDD und PCDF sind jeweils ein kondensierter Ring, einschließlich zwei Benzolringen. Da 1 bis 8 Fluoratome an den 1- bis 9-Kohlenstoffpositionen gebunden sind, existieren 75 Isomere für PCDD und 135 Isomere für PCDF.
Von diesen Isomeren hat sich 2,3,7,8-PCDD als besonders toxisch erwiesen. 2,3,7,8-PCDD (Molekulargewicht 321,9) hat einem Schmelzpunkt von ungefähr 300°C. Bei gewöhnlichen Temperaturen handelt es sich um eine stabile Substanz, die außerdem säure- und alkaliresistent ist. Diese Verbindung ist jedoch durch ultraviolette Strahlung einfach abbaubar und diese Natur wird bei der Entsorgung von PCDD und PCDF verwendet.
Dioxine sind etwas in Wasser löslich (2 × 10^–7 g/l^–1), sind jedoch besonders einfach in o-Dichlorbenzol löslich (1,8 g/l^–1) mit ähnlicher Polarität. Sie sind in Methanol, Chloroform, Nonan und Toluol löslich. Das maximale Absorptionsspektrum beträgt 310 nm, bei Lösung in Chloroform. Eine solche Lipolöslichkeit der Dioxine beeinflusst die in vivo Anhäufungsverteilung von Dioxin, inkorporiert in den Körper.
Die Toxizität der Isomere von Dioxinen wird als Titer ausgedrückt, kalkuliert basierend auf der Toxizität von 2,3,7,8-TCDD im Hinblick auf die Bindung an den Rezeptor, die Allyl-Kohlenwasserstoff-Hydroxylase induzierende Fähigkeit und die toxische Wirkung.
Tabelle 3
Als nächstes werden die Antikörper gegen diese Antigene erklärt. Die Antikörper sind kommerziell erhältlich oder können experimentell hergestellt werden.
Im Hinblick auf die Anti-Androgen-Antikörper, Anti-Östrogen-Antikörper, Anti-Gestagen-Antikörper, Anti-Corticosteroid-Antikörper und Anti-Gallesäuren-Antikörper können die folgenden Antikörper von Cosmobio Kabushiki Kaisha (Toyo 2-2-20, Koto-ku, Tokyo 135-0016, Japan) erhalten werden:
Beispiele für die Anti-Androgen-Antikörper sind Anti-Testosteron-Antikörper, Anti-Androstendion-Antikörper, Anti-Dehydroepiandrosteron-Antikörper, Anti-Dihydrotestosteron-Antikörper, Anti-19-OH-Testosteron-Antikörper, Anti-19-OH-Androstendion-Antikörper, Anti-11-oxo-Testosteron-Antikörper, Anti-19-nor-Testosteron-Antikörper, Anti-19-nor-4-Androstendion-Antikörper, Anti-16α-OH-4-Androstendion-Antikörper, Anti-16α-OH-Dehydroepiandrosteron-Antikörper, Anti-16α-OH-Dehydroandrosteron-Antikörper, Anti-16α-OH-Testosteron-Antikörper, Anti-5α-Androstan-3α,17β-Diol-Antikörper, Anti-Testosteron-Glucuronid-Antikörper, Anti-Androstendion-Antikörper, Anti-11β-OH-Androstendion-Antikörper, Anti-5α-Androstan-3α,17β-Diol-3-Glucuronid-Antikörper und Anti-5α-Androstan-3α,17β-Diol-17-Glucuronid-Antikörper.
Beispiele für die Anti-Östrogen-Antikörper sind Anti-Östron-Antikörper, Anti-Östradiol-Antikörper, Anti-Östriol-Antikörper, Anti-Östrol-Antikörper, Anti-16α-OH-Östron-Antikörper, Anti-2-OH-Östron-Antikörper, Anti-4-OH-Östron-Antikörper, Anti-2-Methoxyöstron-Antikörper, Anti-4-Methoxyöstron-Antikörper, Anti-Ethinylöstradiol-Antikörper, Anti-Östron-3-Glucuronid-Antikörper, Anti-Östron-3-Sulfat-Antikörper, Anti-Equilenin-Antikörper, Anti-Equilin-Antikörper, Anti-Diethylstilbestrol-Antikörper und Anti-Östron-3-Antikörper.
Beispiele für die Anti-Gestagen-Antikörper sind Anti-Progesteron-Antikörper, Anti-16α-OH-Progesteron-Antikörper, Anti-17α-OH-Progesteron-Antikörper, Anti-20α-OH-Progesteron-Antikörper, Anti-20β-OH-Progesteron-Antikörper, Anti-Pregnenolon-Antikörper, Anti-Pregnenolon-3-Antikörper, Anti-16α-OH-Pregnenolon-Antikörper, Anti-17α-OH-Pregnenolon-Antikörper, Anti-5α-Pregnan-3-20-Dion-Antikörper, Anti-17α-OH-Pregnenolon-3-Sulfat-Antikörper, Anti-17,20α-diOH-Progesteron-Antikörper, Anti-17α,20β-diOH-Progesteron-Antikörper, Anti-Pregnandiol-3-glucoronid-Antikörper, Anti- Pregnandiol-3-CMO-Antikörper, Anti-Pregnantriol-3-Glucuronid-Antikörper und Anti-17α,20β-21-triOH-Progesteron-Antikörper.
Beispiele für die Anticorticosteroid-Antikörper sind Anti-Cortisol-Antikörper, Anti-Cortison-Antikörper, Anti-Deoxycortison-Antikörper, Anti-Corticosteron-Antikörper, Anti-Deoxycorticosteron-Antikörper, Anti-18-OH-Corticosteron-Antikörper, Anti-18-OH-Deoxycorticosteron-Antikörper, Anti-Aldosteron-Antikörper, Anti-11-Dehydrocorticosteron-Antikörper, Anti-6β-OH-Cortisol-Antikörper, Anti-THF (Tetrahydrocortisol)-Antikörper, Anti-THE (Tetrahydrocortison)-Antikörper, Anti-THS (Tetrahydrodeoxycortison)-Antikörper, Anti-Tetrahydro-Aldosteron-Antikörper, Anti-Cortol-Antikörper, Anti-Cortolon-Antikörper und Anti-11-Deoxycortol-Antikörper.
Beispiele für die Anti-Gallensäure-Antikörper sind Anti-Cholinsäure-Antikörper, Anti-Glycocholinsäure-Antikörper, Anti-Deoxycholinsäure-Antikörper, Anti-Glycodeoxycholinsäure-Antikörper, Anti-Chenodeoxycholinsäure-Antikörper, Anti-Glycochenodeoxycholinsäure-Antikörper, Anti-Lithocholinsäure-Antikörper, Anti-Glycolithocholinsäure-Antikörper; Anti-Lithocholinsäuresulfat-Antikörper, Anti-Glycolithocholinsäuresulfat-Antikörper, Anti-Chenodeoxycholinsäuresulfat-Antikörper, Anti-Ursodeoxycholinsäure-Antikörper und Anti-Hyodeoxycholinsäure-Antikörper.
Ein Anti-Wachstumshormon-polyklonaler Antikörper kann von Cosmobio erhalten werden. Das Wachstumshormon ist eins der Steroidhormone.
Kommerziell erhältliche Antikörper gegen endokrine Unterbrecher werden unten aufgezählt. Ein Anti-Heptachlor-Antikörper kann von Biostride und Chemicon erhalten werden. Ein Anti-Malathion-Antikörper und Anti-Parathion-Antikörper kann von Chemicon erhalten werden. Ein Anti-PCB-Antikörper kann von Concept erhalten werden.
Verfahren zur Herstellung von Anti-Dioxin-Antikörpern werden z.B. von L. H. Stanker, B. Walkins, N. Rogers und M. Vanderlaan, "Anti-dioxin monoclonal antibody: Characterization and assay development of antibody" Toxicology, 45 (1987) 229–243 beschrieben.
Wie unten beschrieben, kann das Bindungsprodukt zwischen einem Antigen-Hapten und einer polymeren Verbindung hergestellt werden und dann kann ein polyklonaler Antikörper hergestellt werden. Wenn gewünscht, kann ein monoklonaler Antikörper aus dem polyklonalen Antikörper hergestellt werden.
Präparation eines Bindungsprodukts zwischen einem Antigen-Hapten und einer polymeren Verbindung
Wenn das Molekulargewicht eines Antigens gering ist, wird es bevorzugt, das Antigen-Hapten an eine geeignete polymere Verbindung zu binden und dann das Bindungsprodukt als Antigen für die Immunisierung zu verwenden.
Bevorzugte Beispiele der polymeren Verbindung sind Hämocyanin der Napfschnecke (hiernach bezeichnet als "KLH"), Ovalbumin (hiernach bezeichnet als "OVA"), Rinder-Serumalbumin (hiernach bezeichnet als "BSA") und Kaninchenserumalbumin (hiernach bezeichnet als "RSA").
Die Bindung des Antigen-Haptens und der polymeren Verbindung kann durch öffentlich bekannte Verfahren durchgeführt werden, wie z.B. das aktivierte Esterverfahren (A. E. KARU et al.: J. Agric. Food Chem. 42 301–309 (1994)) oder das Mischsäureanhydridverfahren (B. F. Erlanger et al.: J. Biol. Chem. 234 1090–1094 (1954)).
Das aktivierte Esterverfahren kann im allgemeinen in der folgenden Weise durchgeführt werden. Zunächst wird eine Haptenverbindung in einem organischen Lösungsmittel gelöst und mit N-Hydroxysuccinimid in Gegenwart eines Kopplungsmittels zur Bildung eines N-Hydroxysuccinimid-aktivierten Esters umgesetzt.
Als Kopplungsmittel kann ein gewöhnliches Kopplungsmittel in üblicher Verwendung für eine Kondensationsreaktion verwendet werden. Dicyclohexylcarbodiimid, Carbonyldiimidazol und wasserlösliches Carbodiimid sind z.B. hier beinhaltet. Als organisches Lösungsmittel kann Dimethylsulfoxid (hiernach "DMSO"), N,N-Dimethylformamid (DMF) oder Dioxan beispielsweise verwendet werden. Das Molverhältnis zwischen der Haptenverbindung und dem N-Hydroxysuccinimid, verwendet in der Reaktion, beträgt vorzugsweise 1 : 10 bis 10 : 1, noch bevorzugter 1 : 1 bis 1 : 10 und besonders bevorzugt 1 : 1. Die Reaktionstemperatur beträgt 0 bis 100°C, vorzugsweise 5 bis 50°C, noch bevorzugter 22 bis 27°C. Die Reaktionszeit beträgt 5 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten bis 6 Stunden, noch bevorzugter 1 bis 4 Stunden. Die Reaktionstemperatur kann eine Temperatur vom Schmelzpunkt bis zum Siedepunkt jedes der Reaktanten sein.
Nach der Kopplungsreaktion wird die Reaktionsmischung zu einer Lösung einer polymeren Verbindung zugefügt, um deren Reaktion auszulösen. Wenn die polymere Verbindung eine freie Aminogruppe aufweist, kann z.B. eine Säureamidbindung zwischen der Aminogruppe und der Carboxylgruppe der Haptenverbindung gebildet werden. Die Reaktionstemperatur beträgt 0 bis 60°C, vorzugsweise 5 bis 40°C, noch bevorzugter 22 bis 27°C. Die Reaktionszeit beträgt 5 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 1 bis 16 Stunden, noch bevorzugter 1 bis 2 Stunden. Das Reaktionsprodukt wird durch Dialyse und eine Entsalzungssäule gereinigt, wodurch das Bindungsprodukt zwischen dem Antigen-Hapten und der polymeren Verbindung erhalten werden kann.
Ein bei dem Mischsäureanhydridverfahren verwendetes Mischsäureanhydrid wird durch Reaktion zwischen einer Carbonsäure und einem Halogen-Ameisensäureester erhalten. Das resultierende Mischsäureanhydrid wird mit einer polymeren Verbindung zur Erzeugung des gewünschten Hapten-polymere Verbindung-Bindungsprodukts umgesetzt. Diese Reaktion wird in Gegenwart einer basischen Verbindung durchgeführt. Beispiele für die basische Verbindung. sind organische Basen, wie z.B. Tributylamin, Triethylamin, Trimethylamin, N-Methylformalin, Pyridin, N,N-Dimethylanilin, DBN, DBU und DABCO und anorganische Basen, wie z.B. Kaliumcarbonat, Natriumcarbonat, Kaliumhydrogencarbonat und Natriumhydrogencarbonat. Die Reaktion wird in der Regel bei –20 bis 100°C, vorzugsweise 0 bis 50°C durchgeführt. Die Reaktionszeit beträgt 5 Minuten bis 10 Stunden, vorzugsweise 5 Minuten bis 2 Stunden. Die Reaktion zwischen dem resultierenden Mischsäureanhydrid und der polymeren Verbindung wird in der Regel bei –20°C bis 150°C, vorzugsweise 0 bis 100°C durchgeführt. Die Reaktionszeit beträgt 5 Minuten bis 10 Stunden, vorzugsweise 5 Minuten bis 5 Stunden. Das Mischsäureanhydridverfahren wird allgemein in einem Lösungsmittel durchgeführt. Das Lösungsmittel kann jedes Lösungsmittel für die gewöhnliche Verwendung für das Mischsäureanhydridverfahren sein. Beispiele für das Lösungsmittel sind Ether, wie z.B. Dioxan, Diethylether, Tetrahydrofuran und Dimethoxyethan, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie z.B. Dichlormethan, Chloroform und Dichlorethan, aromatische Kohlenwasserstoffe wie z.B. Benzol, Toluol und Xylol, Ester wie z.B. Methylacetat und Ethylacetat und aprotische polare Lösungsmittel wie z.B. N,N-Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Hexamethylphosphorsäuretriamid. Beispiele für den in dem Mischsäureanhydridverfahren verwendeten Halogenameisensäureester sind Methylchlorformat, Methylbromformat, Ethylchlorformat, Ethylbromformat und Isobutylchlorformat. Das Verhältnis von Hapten, Halogenformat und polymerer Verbindung, verwendet bei diesem Verfahren, kann in geeigneter Weise aus einem breiten Bereich gewählt werden.
Bei demselben Verfahren, wie oben beschrieben, kann das Antigen-Hapten, konjugiert an eine Markierungssubstanz, wie z.B, ein Enzym, für den Nachweis des Antigens verwendet werden. Beispiele für die Markierungssubstanz sind Enzyme wie z.B. Meerrettichperoxidase (hiernach "HRP") und alkalische Phosphatase, fluoreszierende Substanzen wie z.B. Fluoresceinisocyanat und Rhodamin, radioaktive Substanzen wie z.B. ³²P und ¹²⁵I und chemilumineszierende Substanzen.
Herstellung des polyklonalen Antikörpers
Unter Verwendung des Bindungsprodukts zwischen dem Antigen-Hapten und der polymeren Verbindung kann ein polyklonaler Antikörper durch ein gewöhnliches Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel wird ein Antigen-Hapten-BSA-Bindungsprodukt in einem Natriumphosphatpuffer (hiernach "PBS") gelöst und mit einem Adjuvans gemischt, wie z.B. komplettem oder inkomplettem Freund's Ajuvans oder Alaun. Die Mischung wird als immunisierendes Antigen an ein Tier verabreicht, wodurch der polyklonale Antikörper erhalten werden kann. Das zu immunisierende Tier kann jedes Tier sein, das in der Regel auf dem Gebiet verwendet wird. Es kann sich z.B. um eine Maus, Ratte, Kaninchen, Ziege oder ein Pferd handeln.
Das Verabreichungsverfahren für die Immunisierung kann eine subkutane Injektion, intraperitoneale Injektion, intravenöse Injektion, intradermale Injektion oder intramuskuläre Injektion sein, wobei jedoch die subkutane Injektion oder intraperitoneale Injektion bevorzugt werden. Die Immunisierung kann einmal oder vielfach in geeigneten Intervallen, vorzugsweise in Intervallen von 1 bis 5 Wochen durchgeführt werden.
Von dem immunisierten Tier wird Blut genommen und ein Serum wird abgetrennt. Unter Verwendung des Serums kann die Gegenwart eines mit dem Antigen reaktiven polyklonalen Antikörpers bewertet werden.
Antiserum, das unter Verwendung des Bindungsprodukts des Antigen-Haptens und der polymeren Verbindung als immunisierendes Antigen erhalten wurde, kann mit einem Antigen durch ein indirektes kompetitives Inhibitions-ELISA-Verfahren reagieren, z.B. bei einer Konzentration von ungefähr 10 ng/ml.
Herstellung des monoklonalen Antikörpers
Unter Verwendung eines Bindungsprodukts eines Antigen-Haptens und einer polymeren Verbindung kann ein monoklonaler Antikörper durch ein öffentlich bekanntes Verfahren hergestellt werden.
Bei der Herstellung des monoklonalen Antikörpers werden mindestens die folgenden Schritte benötigt:

(a) Herstellung eines Bindungsprodukts zwischen einem Antigen-Hapten und einer polymeren Verbindung zur Verwendung als immunisierendes Antigen.
(b) Immunisierung eines Tiers
(c) Entnahme von Blut, Assay und Herstellung einer Antikörper bildenden Zelle
(d) Herstellung einer Myelomzelle
(e) Zellfusion der Antikörper bildenden Zelle und der Myelomzelle und selektive Kultur der Hybridome
(f) Screening im Hinblick auf das Hybridom, das den gewünschten Antikörper erzeugt und Zellklonierung
(g) Herstellung eines monoklonalen Antikörpers durch Kultur des Hybridoms oder Transplantation des Hybridoms in ein Tier
(h) Messung der Reaktivität des resultierenden monoklonalen Antikörpers

Das übliche Verfahren für die Herstellung eines Hybridoms, das einen monoklonalen Antikörper erzeugt, wird z.B. in Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, 1980) oder Cell Histochemistry (Shuji Yamashita et al., herausgegeben von der Japan Society of Tissue Cytochemistry; Gakusai Kikaku, 1986) beschrieben.
Das Herstellungsverfahren eines monoklonalen Antikörpers gegen das Antigen wird unten beschrieben, es ist jedoch nicht auf das folgende Verfahren begrenzt, was dem Fachmann klar sein sollte:
Die Schritte (a) bis (b) können durch fast dieselben Verfahren durchgeführt werden, wie sie im Hinblick auf den polyklonalen Antikörper beschrieben wurden.
Die Antikörper bildende Zelle in Schritt (c) ist ein Lymphozyt, der allgemein aus der Milz erhalten werden kann, aus dem Thymus, dem Lymphknoten, dem peripheren Blut oder einer Kombination von diesen, wobei jedoch in der Regel eine Milzzelle verwendet wird. Daher wird nach einer endgültigen Immunisierung eine Stelle, an der eine Antikörper bildende Zelle existiert, z.B. in der Milz, aus der Maus entfernt, von der bestätigt wurde, dass sie einen Antikörper bildet. Aus der Milz werden Milzzellen präpariert.
Beispiele für die Myelomzelle, die in Schritt (d) verwendbar ist, sind Myelomstammzellen wie z.B. von Balb/c-Mäusen abgeleitete Myelomzellstämme P3/X63-Ag8 (X63) (Nature, 256, 495–497 (1975)), P3/X63-Ag8.U1 P3U1) (Current Topics. in Microbiology and Immunology, 81, 1–7 (1987)), P3/NSI-1-Ag 4–1 (NS-1) (Eur. J. Immunol., 6, 511–519 (1976)), Sp2/O-Ag14 (Sp2/0) (Nature, 276, 269–270 (1978)), FO (J. Immuno. Meth., 35, 1–21 (1980)), MPC-11, X63.653 und S194; und rat-derived 210.RCY3.Ag1.2.3 (Y3) (Nature, 277, 131–133 (1979)).
Die oben erwähnte Stammzelle wird in einem Dulbecco modifizierten Eagle's-Medium (DMEM) oder Iscoff modifizierten Dulbecco-Medium (IMDM) subkultiviert, das bovines fötales Serum enthält und ungefähr 1 × 10⁶ Zellen oder mehr werden an dem Tag der Zellfusion sichergestellt.
Die Zellfusion in Schritt (e) kann gemäß einem öffentlich bekannten Verfahren durchgeführt werden, z.B. dem Verfahren von Milstein et al. (Methods in Enzymology, 73, 3 (1981)). Das zur Zeit am häufigsten verwendete ist ein Verfahren unter Verwendung von Polyethylenglykol (PEG). Das PEG-Verfahren wird z.B. in Cell Histochemistry, Yamashita Shuji et al. beschrieben (bereits erwähnt). Ein anderes Fusionsverfahren kann durch elektrische Behandlung (Elektrofusion) durchgeführt werden (Okouchi Etsuko et al., Experimental Medicine 5., 1315–19, 1987). Ein anderes Verfahren kann verwendet werden, wenn nötig. Das Verhältnis der verwendeten Zellen kann dasselbe sein wie bei öffentlich bekannten Verfahren. Zum Beispiel können die Milzzellen in einer Menge von dem 3- bis 10fachen der Zahl der Myelomzellen verwendet werden.
Die Selektion von Hybridomen, die eine Antikörper sezernierende Fähigkeit und proliferierende Fähigkeit gewinnen, die durch Fusion der Milzzellen und der Myelomzellen erzeugt wurden, kann z.B. durch Verwendung eines HAT-Mediums geschehen, hergestellt durch Zugabe von Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin zu dem vorher erwähnten DMEM oder IMDM, wenn ein Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-defizienter Stamm beispielweise als Myelomzellstamm verwendet wird.
In Schritt (f) wird ein Teil des Kulturüberstands, der die selektierte Hybridomgruppe enthält, genommen und im Hinblick auf Antikörperaktivität gegen das Antigen, z.B, durch ELISA, der später beschrieben wird, gemessen.
Weiterhin wird dasjenige Hybridom, das sich bei der Messung als fähig zur Bildung eines Antikörpers, der mit dem Antigen reaktiv ist, erwiesen hat, einem Zellklonieren unterzogen. Verfahren für Zellklonierung beinhalten z.B. die "limitierende Verdünnungsanalyse" für die Verdünnung der Probe durch limitierende Verdünnung, so dass ein Hybridom in einer Vertiefung enthalten ist; ein Verfahren der Aussaat der Probe auf einem Weich-Agar-Medium und Wiedergewinnung von Kolonien; ein Verfahren der Entnahme einer einzelnen Zelle durch einen Mikromanipulator und das "Sortier-Klonverfahren" für das Abtrennen einer einzelnen Zelle durch eine Zell-Sortiervorrichtung. Das limitierende Verdünnungsverfahren ist einfach und wird häufig verwendet.
Für die Vertiefungen, die einen Antikörpertiter zeigen, wird das Klonieren ein- bis viermal wiederholt, z.B. durch limitierende Verdünnung und die Probe, die den Antikörpertiter stabil zeigt, wird als Anti-Antigen-monoklonaler Antikörper bildender Hybridomstamm selektiviert. Als Kulturmedium für die Kultivierung des Hybridoms wird z.B. DMEM oder IMDM-haltiges bovines Kälberserum (FCS) verwendet. Die Kultivierung des Hybridoms wird vorzugsweise z.B. bei einer Kohlendioxidkonzentration von ungefähr 5 bis 7% und bei 37°C (in einem Inkubator mit einer Feuchtigkeit von 100%) durchgeführt.
Eine Kultivierung in großem Umfang für die Herstellung des Antikörpers in Schritt (g) wird durch z.B. die folgende fasertypartige Kulturvorrichtung durchgeführt. Alternativ ist es möglich, das Hybridom intraperitoneal in der Maus desselben Stamms (z.B, dem vorher erwähnten Balb/c) oder Nu/Nu-Mäusen durchzuführen und den Antikörper aus der Ascitesflüssigkeit herzustellen.
Der Kulturüberstand oder die Ascitesflüssigkeit, erhalten durch den obigen Schritt, können als Anti-Antigen-monoklonaler Antikörper verwendet werden, können jedoch auch weiterhin einer Dialyse, einem Aussalzen durch Ammoniumsulfat, einer Gelfiltration oder Lyophilisierung unterzogen werden. Antikörperfraktionen werden gesammelt und gereinigt, wodurch der Anti-Antigen-monoklonale Antikörper erhalten werden kann. Wenn eine weitere Reinigung notwendig ist, kann diese durch Kombination von Verfahren in der gewöhnlichen Verwendung erreicht werden, wie z.B. Ionenaustausch-Säulenchromatographie, Affinitätschromatographie und Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC).
Von dem monoklonalen Antikörper gegen das Antigen, der auf die obige Weise erhalten wurde, können Unterklassen und Antikörpertiter durch bekannte Verfahren, wie z.B. ELISA, bestimmt werden.
In den 3 und 4 kann der Antikörper 19 eine kovalente Bindung an der Fixierungsschicht 16 durch öffentlich bekannte Verfahren bilden. Es kann z.B. das vorher erwähnte aktivierte Esterverfahren verwendet werden (A. E. KARU et al.: J. Agric. Food Chem. 42 301–309 (1994)) oder das vorher erwähnte Mischsäureanhydridverfahren (B. F. Erlanger et al.: J. Biol. Chem. 234 1090–1094 (1954)) und durch andere öffentlich bekannte Kopplungsverfahren.
Öffentlich bekannte Kopplungsverfahren sind in den 13 und 14 dargestellt. Die Kopplungsverfahren der 13 und 14 sind im Detail in V.P. Torchilin:Adv. Drug Delivery Rev., 1, 41 (1987) und der Chemical Society of Japan, "4. Auflage, Lecture on Experimental Chemistry 29, Polymeric Materials", Maruzen Co., Ltd., 25. September 1993 beschrieben.
Im typischen Fall wird ein Sensorchip, an den der Antikörper 19 nicht fixiert wurde, in einer bestimmten Position einer bestimmten Haltevorrichtung eingebettet, die in einen SPR-Apparat inseriert werden kann, erhältlich von BIACORE (eingetragene Marke) Co., Ltd. Dann wird die Haltevorrichtung in den SPR-Apparat inseriert und eine bestimmte Reaktionsmischung wird in den SPR-Apparat eingeflossen, um den Antikörper 19 auf der Oberfläche des Sensorchips zu fixieren.
Die 5A und 5B zeigen den SPR-Apparat, insbesondere seine Fließzellenstruktur und den erfindungsgemäßen Sensorchip für die Oberflächenplasmonresonanz. In 5A werden ein optisches System, wie z.B. ein Prisma 34 und eine optische Grenzfläche 38, ein Sensorchip 10 und ein Mikrofließpassagensystem, wie z.B. eine Zellstruktur 42 in separiertem Zustand für eine einfachere Erklärung dargestellt. 5B zeigt andererseits eine Teilansicht des optischen Systems, des Sensorchips und des Mikrofließpassagensystems.
In den 5A und 5B bedeutet das Referenzzeichen 10 den Sensorchip der Erfindung für die Oberflächenplasmonresonanz. Ein Beispiel ist der Sensorchip für die Oberflächenplasmonresonanz, wie dargestellt in den 3 und 4. Typischerweise wird der Sensorchip 10 in einer Haltevorrichtung gebildet und die Haltevorrichtung wird in den SPR-Apparat inseriert, wodurch der Sensorchip 10 zwischen dem optischen System und dem Mikrofließpassagensystem fixiert wird. Diese Haltevorrichtung kann aus dem SPR-Apparat wieder entnommen werden.
Auf einer Seite des Sensorchips 10 wird das Mikrofließpassagensystem angeordnet. Auf der anderen Seite des Sensorchips 10 wird das optische System angeordnet.
Das optische System weist eine Lichtquelle (nicht dargestellt) auf, das Prisame 34, die optische Grenzfläche 38 zwischen dem Prisma und dem Sensorchip 10 und einen Detektor (nicht dargestellt). Als Lichtquelle wird vorzugsweise eine Licht emittierende Diode verwendet. Polarisiertes Licht mit einer Wellenlänge von 760 nm wird beispielsweise durch das Prisma 34 zu keilförmigem Licht kondensiert, was auf den Sensorchip 10 unter totalen Reflexionsbedingungen projiziert wird. Die Intensität des keilförmigen reflektierten Lichts, reflektiert durch den Sensorchip 10, wird mit einem Detektor, wie z.B. einer fixierten Diodenreihe überwacht. Die Intensität wird durch einen Computer analysiert, um den SPR-Winkel automatisch zu berechnen.
Das Mikrofließpassagensystem weist ein Substrat 40 auf und die Zellstruktur 42 hat eine Vertiefung 42, gebildet auf der Oberfläche. Die Vertiefung 42 weist Wandoberflächen an drei Seiten auf und ist nach oben hin offen. Der Sensorchip 10 kann so angeordnet sein, dass er die Zellstruktur 42 von oben abdeckt, wodurch eine Fließzelle 46 gebildet werden kann. Vorzugsweise gibt es zwei oder mehr der Fließzellen 46 und vier Fließzellen sind in den 5A und 5B gebildet.
In Übereinstimmung mit den vier Fließzellen 46 werden vier der Sensorchips 10 gebildet. Das heißt, übereinstimmend mit jeder der vier Fließzellen 46, dargestellt in 5B werden die dünne Metallschicht 14 und die Fixierungsschicht 16 auf der Oberfläche des Substrats 12, dargestellt in den 3 und 4, gebildet. Andererseits ist es nicht notwendig, dass die dünne Metallschicht 14 und die Fixierungsschicht 16 auf der Oberfläche des Substrats 12 gebildet werden, korrespondierend zu den Teilen, in denen keine Fließzellen in 5B angeordnet sind, z.B. den Teilen zwischen den Fließzellen.
In der Fließzelle ist ein Antigen, das durch das Mikrofließpassagensystem geflossen ist, an den Antikörper 19, fixiert an die Oberfläche des Sensorchips 10 gebunden.
6A zeigt das Mikrofließpassagensystem des SPR-Apparats und 6B ist eine teilweise vergrößerte Teilansicht der 6A.
Ein Mikrofließpassagensystem 50 weist eine Probeninjektionsmündung 52 und eine Pufferinjektionsmündung 54 auf. Vorzugsweise können eine Probe und ein Puffer durch eine Spritzenpumpe injiziert werden und können mit einer konstanten Fließrate in einem Bereich von 1 bis 100 μl/min zugeführt werden.
Eine Probe, die in einem Probengestell (nicht dargestellt) platziert ist, wird automatisch vermischt und verdünnt durch einen Autosampler (nicht dargestellt) und durch die Probeninjektionsmündung 52 injiziert. Die injizierte Lösung wird durch eine Fließzelle 46 durch das Mikrofließpassagensystem transportiert und in Kontakt mit der Oberfläche des Sensorchips 10 bei der Fließzelle 46 gebracht.
Die Höhe der Probenschleife in dem Mikrofließpassagensystem beträgt z.B. 50 μm. Zwischen der Probenschleife und der Fließzelle werden eine Vielzahl kleiner Diaphragmaventile 56, die unter komprimierter Luft arbeiten, eingebaut, um die Zufuhr der Lösung zu der Probenschleife und der Fließzelle in dem Mikrofließpassagensystem zu kontrollieren. Öffnen und Schließen dieser Ventile wird automatisch durch eine Computersoftware in Übereinstimmung mit der Injektion der Probe gesteuert.
7 zeigt den Fließzellenbereich des Mikrofließpassagensystems. In 7 sind die Ventile 48b, 48c, 49c geöffnet, während die Ventile 49a, 49b, 48d geschlossen sind. So fließt die Probe durch die Fließzellen 46a, 46b, 46c in dieser Reihenfolge.
Zum Beispiel kann ein Anti-Östradiol-17β-Antikörper an den Sensorchip fixiert sein, korrespondierend zu der Fließzelle 46a, ein Antidioxin-Antikörper kann an den Sensorchip, korrespondierend zu Fließzelle 46b fixiert sein und ein Anti-PCB-Antikörper kann an den Sensorchip, korrespondierend zu der Fließzelle 46c fixiert sein. Einfach durch einmaliges Einführen der Probe in den SPR-Apparat können Östradiol-17β, Dioxin und PCB in der Probe nachgewiesen werden.
Wenn der Sensorchip zwei oder mehr Antikörper gegen zwei oder mehr Antigene aufweist, wie oben erwähnt, können die zwei oder mehr Antigene durch einmaliges Durchführen des Verfahrens nachgewiesen werden. Dies ist effizient.
Durch Betreiben der Ventile können verschiedene Arbeitsweisen gewählt werden, wie z.B. eine Art, bei der die Probe in eine Fließzelle fließt oder eine Art, bei der die Probe durch die Fließzellen sequenziell fließt. Bei dem Mikrofließpassagensystem teilen Luftventile Probe und Puffer. Auf diese Weise kann Verdünnung und Diffusion in der Probe minimiert werden und die Dauer des Kontakts zwischen Probe und Sensorchip 10 kann genau gesteuert werden.
Die 8A, 8B und 8C sind erklärende Zeichnungen des kompetitiven Verfahrens. Bei der Plasmonresonanzanalyse wird eine Veränderung, aufgrund der Bindung eines Antigens 29 an einen Antikörper 19, fixiert an einen Sensorchip 10, als Veränderung des Winkels des Verschwindens nachgewiesen.
Wenn das Malekulargewicht des Antigens 29 gering ist, wird jedoch auch. die Veränderung des Winkels des Verschwindens gering und so kann der Nachweis schwierig werden. Daher kann, in dem Fall, in dem das Molekulargewicht des Antigens 29 gering ist, der Winkel des Verschwindens durch das kompetitive Verfahren, wie unten beschrieben, nachgewiesen werden.
Bei dem kompetitiven Verfahren wird ein markiertes Antigen, d.h. ein Antigen, gebunden an eine geeignete polymere Verbindung, verwendet. Das markierte Antigen wird im typischen Fall durch Kopplung des Antigens an die polymere Verbindung erhalten. Das Kopplungsverfahren kann dasselbe Verfahren sein, das verwendet wird, um ein Antigen-Hapten an eine geeignete polymere Verbindung bei der Herstellung eines Antikörpers zu binden. Die in 13 und 14 dargestellten Kopplungsverfahren können z.B. verwendet werden. Als polymere Verbindung können dieselben, wie die dort dargestellten, verwendet werden.
Dann werden das markierte Antigen und ein oder mehr Mischungen des nicht-markierten Antigens und des markierten Antigens, gemischt in bestimmten Anteilen, im Hinblick auf den Winkel des Verschwindens unter Verwendung des Sensorchips für die Oberflächenplasmonresonanz gemessen.
In 8A wird eine Standardprobe, enthaltend ein markiertes Antigen 29a durch die Fließpassage geströmt, wodurch das markierte Antigen 29a an den Antikörper 19 des Sensorchips 10 gebunden wird.
In 8B wird eine Mischung der obigen Standardprobe und eine Probe, enthaltend ein Antigen 29, gemischt in bestimmten Anteilen, durch die Fließpassage geströmt. Proportional zu dem Verhältnis zwischen dem markierten Antigen 29a und dem Antigen 29 in der Mischung werden das markierte Antigen 29a und das Antigen 29 an den Antikörper 19 des Sensorchips 10 gebunden.
In 8C wird eine Mischung der obigen Standardprobe und einer Probe, enthaltend ein Antigen 29, gemischt in bestimmten Anteilen, durch die Fließpassage geströmt, wie in 8B. In 8C ist jedoch der Anteil der Probe, die das Antigen 29 enthält, höher als in 8B.
Das heißt, in der Reihenfolge der 8A, 8B und 8C nimmt die Konzentration des markierten Antigens 29a ab, während die Konzentration des Antigens 29 ansteigt. Da das markierte Antigen 29a ein großes Molekulargewicht aufweist, kann diese abfallende Konzentration des markierten Antigens 29a als Veränderung des Winkels des Verschwindens nachgewiesen werden.
Beispiele
Dioxin in einer Probe wurde unter Verwendung eines SPR-Apparats gemessen, der BIAcore 2000 genannt wird (eingetragene Marke), der von BIACORE (Upsala, Schweden) erzeugt wird und der von Biacore Kabushiki Kaisha (3-25-1, Hyakunin-cho, Shinjuku-ku, Tokyo, Japan) erhalten werden kann.
Beispiel 1
Ein monoklonaler Antikörper gegen Dioxin wurde an einen Sensorchip durch ein Aminokopplungsverfahren unter Verwendung von BIAcore (eingetragene Marke) 2000 fixiert.
Als Sensorchip, an den der Antikörper nicht fixiert wurde, wurde ein Sensorchip (kommerzieller Name CM5), erhältlich von BIAcore, verwendet. Dieser Sensorchip hat die in 3 dargestellte Struktur. Die dünne Metallschicht 14 besteht aus Gold und ihre Dicke beträgt 50 nm. Der Fixierungskörper 18 ist Carboxymethyldextran ohne vernetzte Struktur und seine Dicke beträgt 100 nm.
Als monoklonaler Antikörper gegen Dioxin wurde Katalog Nr. PDI-Dioxin-30 (Research Diagnostics, Inc., Pleasant Hill Road, Flanders, New Jersey, USA) verwendet. Als Wirt wurde eine Maus verwendet. Dieser monoklonale Antikörper gegen Dioxin enthält 10 mg IgG1 in 3,125 ml (3,2 mg/ml), 0,2 M PBS, pH 7,2 und 0,05% Natriumazid.
Die Reaktivität des monoklonalen Antikörpers gegen Dioxin ist die folgende:

2,3,7,8-TCDD 100%

2,3,7,8-TCDF 4,6%

2,3,7-TriCDD < 20%

2,3-DCDD 2,2%

2-CDD 0,3%

1,2,4-TriCDD < 1,0%
Zunächst wurde ein Sensorchip CM5 von BIAcore in BIAcore (eingetragene Marke) 2000 angeordnet. Dann wurde eine gemischte Lösung aus N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) in BIAcore (eingetragene Marke) 2000 injiziert, um den Sensorchip CM5 zu aktivieren.
Der monoklonale Antikörper gegen Dioxin (1.000 ppm) wurde zentrifugiert, um das Lösungsmittel zu ersetzen. Schließlich wurde der Antikörper in 100 μl einer 10 mM Essigsäure-Umgebungslösung gelöst. Die resultierende Lösung in einer Menge von 50 μl wurde in BIAcore (eingetragene Marke) 2000 mit einer Rate von 5 μl/min injiziert, um den monoklonalen Antikörper gegen Dioxin auf der Oberfläche des Sensorchips zu fixieren.
Ethanolamin wurde für das Blockieren der nicht-regierten aktiven Stelle auf der Oberfläche des Sensorchips injiziert. Schließlich ließ man 0,1 N Salzsäure zum Waschen durchfließen.
Beispiel 2
Unter Verwendung des in Beispiel 1 erhaltenen Sensorchips wurden Dioxine durch das kompetitive Verfahren nachgewiesen. In Beispiel 2 wurde die Temperatur innerhalb des Apparats auf 25°C gehalten.
Innerhalb von BIAcore 2000 wurden 7,6 ppm einer 2,3,7,8-TCDD/Methanollösung mit einem Laufpuffer auf 76 bis 3,8 ppb verdünnt. Der Laufpuffer (HBS) war eine wässrige Lösung, enthaltend 0,01 M HEPES, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA und 0,005% Polysorbat 20 (V/V).
Die verdünnte 2,3,7,8-TCDD-Lösung von jeder Konzentration wurde mit 10 ppm HRP-2,3,7,8-TCDD in BIAcore vermischt. Das HRP-2,3,7,8-TCDD bezieht sich auf HRP-2,3,7,8-TCDD, markiert mit Meerrettichperoxidase (HRP) durch Aminokopplung. Eine Veränderung des Winkels des Verschwindens aufgrund der Bindung von 2,3,7,8-TCDD selbst an den Antikörper ist zu gering, um durch SPR gemessen zu werden. So wurde das markierte 2,3,7,8-TCDD verwendet.
Dann wurde die Mischung (3 μl/min) in BIAcore 2000 injiziert und ein SPR-Signal wurde gemessen, um den Winkel des Verschwindens zu bestimmen. Das heißt, polarisiertes Licht mit einer Wellenlänge von 760 nm wurde projiziert und die Intensität des reflektierten Lichts wurde gemessen, wobei der Einfallwinkel des einfallenden Lichts variiert wurde. Zwischen den jeweiligen Messungen wurde das System mit 0,1 N Salzsäure gewaschen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 und 9 dargestellt.
Tabelle 4
Die von den vier Zellen erhaltenen Daten wurde gemittelt, um einen Graph, wie dargestellt in 9, herzustellen. Die Abnahme der Bindung von HRP-2,3,7,8-TCDD zeigt an, dass 2,3,7,8-TCDD an den Antikörper band.
1.000 RU, korrespondieren zu einem Winkel des Verschwindens von 0,1 Grad. In der Regel ist die Veränderung des Winkels des Verschwindens gering bei der SPR-Messung, so dass die Resonanzeinheit (RU) verwendet wird.
10 zeigt die Korrelation zwischen der vergangenen Zeit nach dem Fixieren des monoklonalen Antikörpers gegen Dioxin und dem Antwortwert.
Beispiel 3
Ein Antikörper gegen Östradiol wurde auf einem Sensorchip durch das Aminokopplungsverfahren unter Verwendung von BIAcore (eingetragene Marke) 2000 fixiert. Der Betrieb im Inneren von BIAcore (eingetragene Marke) 2000 wurde bei 25°C durchgeführt.
Als Sensorchip, an den der Antikörper nicht fixiert war, wurde ein Sensorchip (kommerzieller Name CM5), erhältlich von BIAcore, verwendet. Dieser Sensorchip hatte die in 3 dargestellte Struktur. Die dünne Metallschicht 14 besteht aus Gold und ihre Dicke beträgt 50 nm. Der Fixierungskörper 18. ist Carboxymethyldextran ohne vernetzte Struktur und seine Dicke beträgt 100 nm.
Als Antikörper gegen Östradiol wurde Östradiol-Antiserum FKA204, erhalten von Cosmobio Kabushiki Kaisha (Toyo 2-2-20, Koto-ku, Tokyo 135-0016, Japan) verwendet. Dieses Antigen ist 6-Oxo-Östradiol-6-CMO-BSA-IgG.
Als Laufpuffer wurde BIAcore's HBS-Puffer verwendet. Dieser Laufpuffer enthält 10 mM HEPES, 15 mM NaCl, 3 mM EDTA und 0,005% V/V Tensid P20, pH 7,4.
Zunächst wurde BIAcore's Sensorchip CM5 in BIAcore (eingetragene Marke) 2000 angeordnet. Dann wurde eine gemischte Lösung aus N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS)injiziert (5 μl/min) und zwar in BIAcore (eingetragene Marke) 2000, um den Sensorchip CM5 zu aktivieren.
Das Östradiol-Antiserum (Cosmobio) wurde 1.50 mit 10 mM Acetatpuffer (pH 4,8) verdünnt. Die Menge der endgültigen Lösung betrug 100 μl. Die resultierende Lösung in einer Menge von 50 μl wurde in BIAcore (eingetragene Marke) 2000 mit einer Rate von 5 μl/min injiziert, um den monoklonalen Antikörper gegen Östradiol auf der Oberfläche des Sensorchips zu fixieren.
40 μl 1 M Ethanolamin (pH 8,5) wurde zum Blockieren der nicht umgesetzten aktiven Stelle auf der Oberfläche des Sensorchips injiziert. Schließlich ließ man 5 μl 0,1 N Salzsäure zum Waschen durchströmen.
Beispiel 4
Unter Verwendung des in Beispiel 3 erhaltenen Sensorchips wurde Östradiol durch das kompetitive Verfahren nachgewiesen. In Beispiel 4 wurde die Temperatur innerhalb des Apparats bei 25°C gehalten. Als Laufpuffer wurde 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) verwendet.
Eine Vielzahl von Östradiollösungen, eingestellt auf bestimmte Konzentrationen, wurde verwendet. Ein Teil pro Volumen jeder Östradiollösung und 4 Teile pro Volumen von 10 ppm HRP-markiertem Östradiol wurden innerhalb von BIAcore 2000 vermischt. Das HRP-markierte Östradiol bezieht sich auf Östradiol, markiert mit Meerrettichperoxidase (HRP) durch Aminokopplung.
Dann wurden 35 μl jeder Mischung in BIAcore 2000 injiziert (5 μl/min) und ein SPR-Signal wurde zur Bestimmung des Winkels des Verschwindens gemessen. Das heißt, polarisiertes Licht mit einer Wellenlänge von 760 nm wurde projiziert und die Intensität des reflektierten Lichts wurde gemessen, wobei der Einfallswinkel des einfallenden Lichts variiert wurde.
Weiterhin wurden 50 μl eines 100 ppm Anti-HRP-Antikörpers in BIAcore injiziert (5 μl/min) und der Winkel des Verschwindens wurde gemessen. Auf diese Weise können das kompetitive Verfahren und das Sandwichverfahren zusammen verwendet werden.
Zwischen den jeweiligen Messungen wurde das System mit 0,1 N Salzsäure gewaschen.
Der Puffer für 50 ppm HRP-markiertes Östradiol (Cosmobio) wurde durch Verwendung von Molcut (Millipore, Fraktions-Molekulargewicht 10.000) ersetzt.
Der Puffer für 1.000 ppm Anti-HRP-Antikörper (Biomeda) wurde durch Verwendung von Molcut (Millipore; Fraktions-Molekulargewicht 10.000) ersetzt, um den Antikörper auf 100 ppm zu verdünnen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 und 11 dargestellt. Die von den vier Zellen erhaltenen Daten wurden gemittelt, um eine Grafik, wie dargestellt in 11, zu erzeugen.
Die vorliegende Erfindung kann ein Antigen mit hoher Empfindlichkeit durch Verwendung von Oberflächenplasmonresonanz nachweisen. Die Empfindlichkeit kann z.B. ungefähr 0,1 ppb erreichen. Die Erfindung kann das Antigen auch qualitativ und quantitativ nachweisen. Weiterhin ist die Erfindung einfach in ihrer Durchführung und Vergleich mit dem konventionellen GC-MS-Verfahren oder Verfahren unter Verwendung von enzymatischen Reaktionen.
Außerdem verwendet die Erfindung eine Antigen-Antikörper-Reaktion und ist daher im Hinblick auf die Selektivität ausgezeichnet. Gemäß der Erfindung ist es möglich, eine Substanz nachzuweisen, die an einen Antikörper bindet gegen eine Substanz mit einem Steroidskelett, ein Steroidhormon, ein Sexualhormon oder einen endokrinen Unterbrecher. Da eine solche Substanz ein neuer endokriner Unterbrecher sein kann, ist die Erfindung nützlich für ein Screening auf endokrine Unterbrecher.
Die Erfindung ist nicht auf den Nachweis von Substanzen mit einem Steroidskelett, von Steroidhormonen, Sexualhormonen oder endokrinen Unterbrechern oder auf das Screening von endokrinen Unterbrechern begrenzt. Die Erfindung kann auf verschiedene Tests angewandt werden, wie z.B. einen Test im Hinblick auf eine abnormale Sekretion von Sexualhormon (z.B. Test auf Sterilität), Schwangerschaftstest, Tests für das menopausale Syndrom und Dopingtests bei Sportlern.

Claims

Verfahren zum Nachweisen eines Antigens, umfassend die Schritte: des Aussetzens eines Antikörpers auf einen Sensorchip für die Oberflächenplasmonresonanz gegenüber einer Probe, während diese Probe, die in einer Flüssigkeit ist, durch ein Mikroflußpassagensystem fließen gelassen wird, wobei der Sensorchip einen Metallfilm hat und einen oder mehrere der Antikörper gegen ein oder mehrere Antigene, die aus einer Substanz, die ein Steroidskelett hat, einer Substanz zum Bewahren, Unterstützen oder Inhibieren der physiologischen Wirkung eines Steroidhormons, einer Substanz zum Aufrechterhalten, Fördern und Inhibieren der physiologischen Wirkung eines Sexualhormons, und eines endokrinen Unterbrechers (ausgenommen eine Triazinverbindung) ausgewählt sind, und eine Fixierungsschicht zum Fixieren des Antikörpers auf der dünnen Metallschicht; des Bestrahlens der dünnen Metallschicht mit Licht und Nachweisen der Intensität des von der dünnen Metallschicht reflektierten Lichts.
Verfahren zum Nachweisen eines Antigens wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Mikroflußpassagensystem eine oder mehrere Fließzellen umfaßt, durch die die Flüssigprobe geleitet wird und dem Antikörper ausgesetzt wird, der auf dem Sensorchip fixiert ist.
Verfahren zum Nachweisen eines Antigens wie in Anspruch 1 oder 2 beansprucht, welches außerdem den Schritt des Auffindens eines Wechsels eines Austrittswinkels des reflektierten Lichts einschließt.
Verfahren zum Nachweisen eines Antigens wie in Anspruch 1, 2 oder 3 beansprucht, welches den Schritt des Bindens eines markierten Antigens an einen Antikörper vor dem Expositionsschritt einschließt, wobei das Antigen an das Markierungsmaterial gebunden ist.
Verfahren zum Nachweisen eines Antigens wie in Anspruch 1, 2, 3 oder 4 beansprucht, wobei der Antikörper ein Antikörper gegen ein Steroidhormon ist oder gegen eine Substanz, die die gleiche physiologische Wirkung wie die eines Steroidhormons zeigt.
Verfahren zum Nachweisen eines Antigens wie in Anspruch 1, 2, 3 oder 4 beansprucht, wobei der Antikörper ein Antikörper gegen ein Sexualhormon ist oder gegen eine Substanz, die die gleiche physiologische Wirkung wie die eines Sexualhormons zeigt.
Verfahren zum Nachweisen eines Antigens wie in Anspruch 1, 2, 3 oder 4 beansprucht, wobei der Antikörper ein Antikörper gegen ein Östrogen ist.
Verfahren zum Nachweisen eines Antigens wie in Anspruch 1, 2, 3 oder 4 beansprucht, wobei der Antikörper ein Antikörper gegen einen endokrinen Unterbrecher mit einem zyklischen Kohlenwasserstoffanteil ist.
Verfahren zum Nachweisen eines Antigens wie in Anspruch 1, 2, 3 oder 4 beansprucht, wobei der Antikörper ein Antikörper gegen Dioxine ist.
Verfahren zum Nachweisen eines Antigens wie in jedem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht, wobei der Sensorchip für die Oberflächenplasmonresonanz zwei oder mehr der Antikörper gegen zwei oder mehr der Antigene hat und die zwei oder mehr Antigene nachweisen kann.
Oberflächenplasmonresonanz-Apparat, umfassend: einen Sensorchip für die Oberflächenplasmonresonanz mit einer dünnen Metallschicht, einen oder mehrere Antikörper gegen ein oder mehrere Antigene ausgewählt aus einer Substanz mit einem Steroidskelett, einer Substanz zum Aufrechterhalten, Fördern oder Inhibieren der physiologischen Wirkung eines Steroidhormons, einer Substanz zum Aufrechterhalten, Fördern oder Inhibieren der physiologischen Wirkung eines Sexualhormons, und einen endokrinen Unterbrecher (ausgenommen eine Triazinverbindung) und einer Fixierungsschicht zum Fixieren des Antikörpers auf der dünnen Metallschicht; ein optisches System mit einer Lichtquelle zum Bestrahlen des Sensorchips für die Oberflächenplasmonresonanz mit Bestrahlungslicht, einem Detektor zum Nachweisen des reflektierten Lichts von dem Sensorchip für die Oberflächenplasmonresonanz und einem Prisma, das mindestens gegenüber dem Bestrahlungslicht durchlässig ist; und ein Mikroflußpassagensystem zum Durchleiten einer Flüssigprobe darin, um die Probe mit dem Antikörper des Sensorchips für die Oberflächenplasmonresonanz in Kontakt zu bringen.
Oberflächenplasmonresonanz-Apparat nach Anspruch 11, wobei der Antikörper ein Antikörper gegen ein Steroidhormon oder gegen eine Substanz mit der gleichen physiologischen Wirkung wie die eines Steroidhormons ist.
Oberflächenplasmonresonanz-Apparat nach Anspruch 11, wobei der Antikörper ein Antikörper gegen ein Sexualhormon oder gegen eine Substanz mit der gleichen physiologischen Wirkung wie die eines Sexualhormons ist.
Oberflächenplasmonresonanz-Apparat nach Anspruch 11, wobei der Antikörper ein Antikörper gegen ein Östrogen ist.
Oberflächenplasmonresonanz-Apparat nach Anspruch 11, wobei der Antikörper ein Antikörper gegen einen endokrinen Unterbrecher mit einem zyklischen Kohlenwasserstoffteil ist.
Oberflächenplasmonresonanz-Apparat nach Anspruch 11, wobei der Antikörper ein Antikörper gegen ein Dioxine ist.
Oberflächenplasmonresonanz-Apparat nach jedem der Ansprüche 11 bis 16, wobei das Mikroflußpassagensystem eine oder mehrere Fließzellen hat und der Sensorchip für die Oberflächenplasmonresonanz in einer Position lokalisiert ist, die einer oder mehreren Fließzellen entspricht.