DE2743444A1

DE2743444A1 - Immunchemisches messverfahren

Info

Publication number: DE2743444A1
Application number: DE19772743444
Authority: DE
Inventors: Masakatsu Hashimoto; Ei Mochida; Nobuhisa Ogawa; Hiroyuku Shinkai
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1976-09-30
Filing date: 1977-09-27
Publication date: 1978-04-06
Also published as: NL7710585A; FR2366570B1; DE2743444C3; JPS5344622A; DE2743444B2; GB1550320A; FR2366570A1; US4200436A

Description

Beschreibung

Es wurden zahlreiche Versuche unternommen, Antigensubstanzen sowie ihre Antikörper aufgrund der ausgezeichneten Spezifität und Empfindlichkeit der Reaktion von Antigensubstanzen, wie menschlichem Choriumgonadotropin, Wachstumshormon, Insulin sowie Immunoglobulinen, zur Bindung ihrer Antikörper zu messen. Es werden bereits viele immunchemische Meßverfahren eingesetzt.

Beispielsweise kann man auf folgende Verfahren zurückgreifen: Immundiffusionsmethoden, bei deren Durchführung das Antigen und der Antikörper miteinander in einem Agargel umgesetzt werden, Agglutinierungsreaktionen und Agglutinierungsinhibierungsreaktionen, bei deren Durchführung Blutzellen oder feine Teilchen eines Polystyrollatex als Träger für Antigen oder Antikörper eingesetzt werden, Radioimmunoassay (RIA), bei deren Durchführung Radioisotope als Markierungsmittel eingesetzt werden, Enzymimmunoassay (EIA), bei deren Durchführung Enzyme zur Markierung des Antigens oder des Antikörpers eingesetzt werden, sowie eine Fluoreszenzimmunoassay, bei deren Durchführung fluoreszierende Substanzen zur Markierung des Antigens oder Antikörpers verwendet werden.

Zur Messung von Substanzen mit niederen Molekulargewichten, wie Steroiden, Thyroidhormonen, physiologisch aktiven Peptiden oder Aminen, deren Antikörper schwierig zu erzeugen sind, kann man eine konkurrierende Proteinbindeassay verwenden, bei deren Durchführung die Reaktion mit einem Rezeptorprotein oder Bindeprotein ausgenützt wird, d. h. mit einem Protein, das spezifisch derartige Substanzen mit niederem Molekulargewicht bindet. Diese Substanzen wurden jedoch in neuerer Zeit nach dem gleichen Verfahren gemessen, wie sie auf die vorstehend erwähnten Antigensub- » stanzen mit hohem Molekulargewicht angewendet werden, da die Antikörper sogar dieser Substanzen mit niederem Mo-

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lekulargewicht nunmehr relativ einfach herzustellen sind.

Diese Verfahren sind in einein breiten Umfange anwendbar. So werden neben anderen Verfahren RIA und EIA aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit bei der Messung sowie der quantitativen Präzision in breitem Umfange angewendet. Die durch diese Verfahren meßbaren Substanzen bestehen aus einer Vielzahl von Substanzen mit hohem Molekulargewicht, wie Proteinhormonen, Immunoglobulinen und Viren sowie Substanzen mit niederem Molekulargewicht, wie Peptiden, Steroiden, Aminen oder synthetischen Arzneimitteln.

RIA und EIA basieren auf einem gemeinsamen Prinzip, und zwar auf der Verwendung eines markierten Antigens, wobei das Antigen durch ein Markierungsmittel markiert wird, oder durch die Verwendung eines markierten Antikörpers, wobei der Antikörper durch ein Markierungsmittel markiert wird.

Das Verfahren, das unter Verwendung eines markierten Antigen durchgeführt wird, ist ein sog. konkurrierendes Verfahren, bei dessen Durchführung eine unbekannte Menge eines nichtmarkierten Antigens und eine gegebene Menge eines markierten Antigens konkurrierend mit einer gegebenen Menge eines Antikörpers zur Umsetzung gebracht werden, wobei die Aktivitäten des Markierungsmittels, das sich mit dem Antikörper verbunden hat, oder des markierten Antigens, das keine Bindung eingegangen ist, gemessen werden. Zwischenzeitlich wird eine Verdünnungsreihe unter Einsatz einer Bezugssubstanz mit bekannter Konzentration hergestellt, wobei in der gleichen vorstehend beschriebenen Weise die Aktivität des Markierungsmittels in jeder Verdünnung gemessen wird. Eine Standardkurve, die durch Auftragen der gemessenen Aktivitäten erhalten wird, wird zur Bestimmung der Menge der zu messenden Substanz verwendet. Als Mittel zur Abtrennung des markierten Antigens, das sich mit dem Antikörper verbunden hat, sowie des nichtgebundenen Antigens wird ein nichtsolubilisierter Antikörper verwendet.

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Das Verfahren unter Einsatz eines markierten Antikörpers arbeitet derart, daß nach der Umsetzung zwischen einer unbekannten Menge eines Antigens und einer gegebenen Menge eines markierten Antikörpers die Aktivitäten des markierten Antikörpers, der sich mit dem Antigen verbunden hat, oder dessen markierten Antikörpers, der keine Bindung eingegangen ist, gemessen werden. Zwischenzeitlich wird eine Verdünnungsreihe unter Einsatz einer Bezugssubstanz mit bekannter Konzentration durchgeführt, wobei in der gleichen Weise, wie sie vorstehend beschrieben worden ist, die Aktivität des Markierungsmittels in jeder Verdünnung gemessen wird. Eine Standardkurve, die durch Auftragen der gemessenen Aktivitäten erhalten wird, wird zur Bestimmung der Menge der zu messenden Substanz verwendet. Zur Abtrennung des markierten Antikörpers, der sich mit dem Antigen verbunden hat, sowie des Antikörpers, der keine Bindung eingegangen ist, wird ein nichtsolubilisiertes Antigen oder ein nichtsolubilisierter Antikörper verwendet.

Das Verfahren, das unter Einsatz des nichtsolubilisierten Antikörpers arbeitet, ist ein sog. Sandwich-Verfahren, das eine sehr hohe Meßempfindlichkeit besitzt. Allerdings ist es mit dem Nachteil behaftet, daß aufgrund der Tatsache, daß ein Antikörper mit weniger Bindestellen als ein Antigen unlöslich gemacht wird, die Reaktivität bezüglich des zu messenden Antigens abnimmt. Darüber hinaus ist dieses Verfahren nicht für die Messung von Haptenen einsetzbar.

Demgegenüber ist es möglich, unter Einsatz des insolubilisierten Antigens, das eine geringere Reaktivitätsverminderung infolge der Tatsache erfährt, daß das Antigen unlöslich gemacht wird, Haptene zu messen, aus den nachfolgend angegebenen Gründen ist jedoch die Meßempfindlichkeit gering.

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Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines immunchemischen Verfahrens zur Messung von physiologisch aktiven Substanzen mit hoher Präzision und Empfindlichkeit. Ferner soll durch die Erfindung ein Reagens zur Messung von physiologisch aktiven Substanzen zur Verfügung gestellt werden, das auf dem Verfahrensprinzip basiert.

Die Erfindung wird durch die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 ein Diagramm, das eine Messung unter Anwendung des herkömmlichen Inhibierungsverfahrens erläutert;

Fig. 2 ein Diagramm, das ein immunchemisches Meßverfahren gemäß vorliegender Erfindung wiedergibt;

Fig. 3 eine graphische Darstellung der gemessenen Ergebnisse gemäß Beispiel 1 vorliegender Erfindung;

Fig. 4 eine graphische Darstellung der gemessenen Ergebnisse gemäß Beispiel 2 gemäß vorliegender Erfindung;

Fig. 5 eine graphische Darstellung der gemessenen Ergebnisse gemäß Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung.

Die Erfindung bedeutet eine Verbesserung des Verfahrens, das unter Einsatz von markierten Antikörpern und insolubilisierten Antigenen arbeitet und nachfolgend als Inhibierungsverfahren bezeichnet wird. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Antikörper, der eine monovalente Bindung mit dem Antigen eingeht, als zu markierender Antikörper verwendet wird.

Das Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nachfolgend in Gegenüberstellung zu dem Inhibierungsverfahren erläutert.

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Bei der Durchführung des herkömmlichen Inhibierungsverfahrens, wie es durch Fig. 1 erläutert wird, wird das zu messende Antigen (nachfolgend als ANTIGEN bezeichnet) 1 mit einer gegebenen Menge des markierten Antikörpers 2 umgesetzt, d. h. eines Antikörpers zu diesem ANTIGEN, das markiert worden ist, wobei ein markierter Antikörper-ANTIGEN-Komplex 2a erhalten wird. Anschließend wird der umgesetzten Lösung ein insolubilisiertes Antigen 3 zugesetzt. Dann wird, wie aus Fig. 1A hervorgeht, der markierte Antikörper 2, der nicht an das ANTIGEN gebunden ist, zu einer Bindung mit nichtsolubilisierten Antigen 3 gebracht. Auf diese Weise können der markierte Antikörper-ANTIGEN-Komplex 2a, der mit dem ANTIGEN verbunden ist, und der markierte Komplex 2+3 aus markiertem Antikörper und nichtsolubilisiertem Antigen, der nicht an das ANTIGEN gebunden ist, voneinander getrennt werden. Man nimmt dabei folgenden Reaktionsmechanismus an: der markierte Antikörper 2, der sich vollständig mit dem nichtsolubilisierten Antigen 3 in Abwesenheit von ANTIGEN 1 verbinden sollte, wurde an dem Eingehen einer Bindung auf Kosten des vorliegenden ANTIGEN 1 gehindert.

Da der markierte Antikörper 2 gewöhnlich eine divalente Bindung eingeht, geht das ANTIGEN 1, falls es in einer kleinen Menge vorliegt, eine Bindung an einer der zwei aktiven Stellen des Antikörpers 2 ein, so daß ein ungesättigter Komplex 2b erzeugt wird, wie aus den Fig. 1-B und 1-C hervorgeht. Dieser ungesättigte Komplex 2b bindet nach der Zugabe des nichtsolubilisierten Antigens 3 das nichtsolubilisierte Antigen 3 an einer freien aktiven Stelle, wobei 2b+3 erhalten wird. Daher ist es unmöglich, eindeutig den markierten Antikörper 2a, der sich mit dem ANTIGEN verbunden hat, von dem markierten Antikörper 2+3 zu trennen, der keine Bindung eingegangen ist. Daher sind die Genauigkeit und die Empfindlichkeit der Messung gering.

Falls, wie aus Fig. 1-C hervorgeht, das ANTIGEN 1 vollständig den markierten Antikörper 2 nur an einer aktiven Stel-

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le unter Erzeugung eines Komplexes 2b bindet, wird eine Bindung des markierten Antikörpers 2 mit dem nichtsolubilisierten Antigen 3 nicht verhindert, so daß sich eine Veränderung der Menge des ANTIGEN 1 nicht in einer Veränderung der Aktivität des markierten Antikörpers zu erkennen gibt. Die Empfindlichkeit der Messung wird daher schlechter.

Erfindungsgemäß wird ein markierter Antikörper eingesetzt, der eine monovalente Bindung mit dem Antigen eingeht, wie aus Fig. 2 hervorgeht, wobei die Aktivität des Antikörpers 2¹ eine einfache ist. Demgemäß vermag der Antikörper 2', der sich mit dem ANTIGEN 1 verbunden hat, keine Bindung mehr mit dem nichtsolubilisierten Antigen 3 einzugehen, so daß die verhindernde Wirkung des ANTIGEN 1 vollständig ist und eine klare Trennung zwischen dem markierten Antikörper 2'a, der sich mit dem ANTIGEN verbunden hat, und dem markierten Antikörper 2' möglich ist, der keine Bindung eingegangen ist, so daß eine hohe Meßgenauigkeit die Folge ist. Darüber hinaus ermöglicht die Erfindung eine genauere Messung, da eine Veränderung der Menge des ANTIGENS, auch wenn sie sehr gering ist, direkt als Änderung der Menge des markierten Antikörpers, der sich mit dem ANTIGEN verbunden hat, oder eines Antikörpers, der keine Bindung mit dem ANTIGEN eingegangen ist, gemessen werden kann.

Die Erfindung wird gewöhnlich wie folgt durchgeführt:

Eine ausreichend verdünnte Testprobe wird einer Lösung eines markierten monovalenten Antikörpers zugesetzt, worauf die Reaktionsmischung bebrütet wird. Dann wird die Mischung mit einer Suspension des insolubilisierten Antigens versetzt. Nach einer Bebrütung wird die Mischung zur Abtrennung der festen Phase von der flüssigen Phase zentrifugiert. Dann wird die Aktivität des markierten Antikörpers in der festen Phase oder in der flüssigen Phase gemessen. Besteht das Markie-. rungsmittel beispielsweise aus einem Enzym, dann wird die abgetrennte feste oder flüssige Phase einer entsprechenden

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Substratlösung zur Umsetzung zugesetzt. Die Aktivität des Enzyms wird gemessen. Die Menge des in der Testprobe enthaltenen Testobjekts wird in der Weise bestimmt, daß die gemessene Aktivität auf einer Standardkurve aufgetragen wird, die in der gleichen Weise unter Verwendung einer Bezugssubstanz, deren Konzentration bekannt ist, hergestellt worden ist.

Zur Durchführung der Messung sollten die Meßbedingungen, wie das Volumen der Testprobe, die Konzentration und das Volumen der Reagentien sowie die Reaktionszeit experimentell in Abhängigkeit von der Art der,zu messenden Substanz, dem Titer des eingesetzten Antikörpers sowie der Art und der spezifischen Aktivität des Markierungsmittels ausgewählt werden.

Als erfindungsgemäß zu verwendende monovalente Antikörper seien folgende empfohlen: ein Fragment (nachfolgend Fab genannt) eines Antikörpers zu dem nach der Methode von Porter mit Papain digerierten ANTIGEN (Porter, R. R., Biochem. J. 73, 119 (1959)) sowie ein Fragment davon, das mit Pepsin nach der Methode von Peterman digeriert (Peterman, M. L., J. Phys. Chem., 45, 1 (1941)) und zu einem monovalenten Antikörper reduziert worden ist (das auf diese Weise erhaltene Fragment wird als Fab¹ bezeichnet).

Zur Abtrennung des markierten monovalenten Antikörpers, der an das ANTIGEN gebunden ist, von dem markierten monovalenten Antikörper, der nicht daran gebunden ist, empfiehlt sich die Verwendung eines nichtsolubilisierten Antigens.

Um das Antigen unlöslich zu machen, kann man auf bekannte Methoden zurückgreifen, beispielsweise auf einen Einsatz von Polysacchariden (beispielsweise Cellulose, Agarose oder Dextran) oder Kunststoffen (beispielsweise Polystyrol, Polyäthylen, Polypropylen, Polyvinylchlorid, Polyacetal, Acrylnitril/Butadien/Styrol-Copolymere) als Träger sowie ein che-

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misches Binden oder physikalisches Adsorbieren.

Als Markierungsmittel für den Antikörper sind beispielswei-

1 25 se folgende verfügbar: Radioisotope (beispielsweise J,

J, H, C), Enzyme (beispielsweise Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, ß-D-Galactosidase, Glukoseoxidase oder Glucoamylase) sowie fluoreszierende Materialien (bei-, spielsweise Fluoreszeinisothiocyanat oder Rhodamin). Berücksichtigt man die Empfindlichkeit, die Präzision sowie die Einfachheit der Messung, dann empfiehlt sich die Verwendung von Enzymen.

Diese Markierungsmittel können mit dem Antikörper nach bekannten Methoden verbunden werden, beispielsweise nach der Hunter-Greenwood-Methode (Hunter, W.M., Greenwood, . ., Nature, 194, 495 (1962)) oder nach der P. Nakane-A. Kawaoi-Methode (P. Nakane, A. Kawaoi, J. Hisochem. Cytchem., 22, 1084 (1974)).

Die erfindungsgemäß meßbaren Antigene umfassen die Substanzen mit hohen Molekulargewichten, beispielsweise die sog. vollständigen Antigene, beispielsweise menschliches Choriumgonadotropin, Wachstumshormon, Insulin, Adrenocorticotropic Thyroid-stimulierende Hormone, Immunoglobulin E, ,X-Fötoprotein, Hepatitis-B-Antigen oder menschliches Mutterkuchenlactogen sowie Substanzen mit niederen Molekulargewichten, d. h. die sog. Haptene, beispielsweise Steroide, wie Testosteron, östriol, Progesteron, Corticosteron oder Aldosteron, Thyroidhormone, wie Thyroxin oder Trijodthyronin, Peptide, wie Bradykinin oder Angiotensin, Thyroidhormone-freisetzende Hormone, luteinisierende Hormone-freisetzende Hormone, physiologisch aktive Amine, wie Epinephrin, Norepinephrin, Histamin, Serotonin oder Prostaglandin. Zur Messung von Haptenen kann man insolubilisierte Haptenproteinkonjugate in vorteilhafter Weise verwenden.

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Die Erfindung verbessert bei der Durchführung des herkömmlichen Inhibierungsverfahrens die geringe Empfindlichkeit sowie die geringe Meßpräzision durch Verwendung eines markierten monovalenten Antikörpers. Daher stellt die Erfindung eine wichtige Verbesserung insbesondere bezüglich der Messung von Haptenen dar. Da Haptene mit dem Antikörper eine monovalente Bindung eingehen, kann das Sandwich-Verfahren nicht angewendet werden, vielmehr muß man auf das konkurrierende Verfahren oder das Inhibierungsverfahren zurückgreifen. Diese beiden Verfahren besitzen eine geringe Meßempfindlichkeit, bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können jedoch nicht nur vollständige Antigene sondern auch Haptene mit zufriedenstellenden Empfindlichkeiten und einer befriedigenden Genauigkeit gemessen werden.

In der folgenden Tabelle sind die Meßempfindlichkeiten verschiedener Verfahren unter Verwendung eines Enzyms als Markierungsmittel bei der Messung von menschlichem Choriumgonadotropin und östriol verglichen. Wie aus dieser Tabelle hervorgeht, ist das erfindungsgemäße Verfahren bezüglich der Meßempfindlichkeit dem herkömmlichen Inhibierungsverfahren überlegen.

Tabelle

menschliches Choriumgonadotropin (vollständiges Antigen) (mlü/ml)

östriol (Hapten) (ng/tal)

Erfindungsgemäßes Verfahren

0,1 - 1,0

0,2

Inhibierungsverfahren

Herkönmli- Konkurrierenche Ver- des Verfahren fahren

Sandwich-Verfahren

5 - 20

10 - 20

0,1 - 1,0

0,5

3,0

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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Messung des menschlichen Choriumgonadotropins (hCG)

A) Herstellung einer hCG-Standardlösung.

Das in "Japanese Pharmacopoeia" erwähnte Standard hCG wird in einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung (PBS), die 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) enthält, zur Herstellung von Lösungen mit Konzentrationen von 500, 50, 5 und 0 IU/1 aufgelöst.

B) Herstellung von Anti-hCG-Antikörper.

Ein Kaninchen wird routinemäßig gegen hCG immunisiert, worauf Anti-hCG-Serum gewonnen wird. Durch Aussalzen des erhaltenen Serums mit Natriumsulfat wird ein Anti-hCG-Antikörperglobulin erzeugt.

C) Herstellung von Anti-hCG-Antikörper Fab.

Der gemäß B) hergestellte Anti-hCG-Antikörper wird nach der Methode von Porter mit Papain digeriert und mit einer Carboxymethylcellulosesäule (pH 5,5) fraktioniert, wobei der AntihCG-Antikörper Fab erhalten wird.

D) Herstellung eines Anti-hCG-Antikörper Fab-Enzymkonjugats.

5 mg Meerrettichperoxidase (HRP) werden in 1 ml eines frisch hergestellten 0,3m Natriumbicarbonats (pH 8,1) aufgelöst. Nach der Zugabe von 0,1 ml 1 % 2,4-Dinitrofluorbenzol in absolutem Äthanol wird die Mischung während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur gerührt. Dann schließt sich die Zugabe von 1 ml eines 0,08m Natriumperjodats in destilliertem Wasser an. Es wird während einer Zeitspanne von 30 Minuten bei Zimmertemperatur gemischt. Dann wird 1,0 ml

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Ο,ΐβιη Äthylenglykol in destilliertem Wasser zugesetzt, worauf 1 Stunde bei Zimmertemperatur gemischt wird. Nach einer über Nacht durchgeführten Dialyse gegen 0,01m Natriumcarbonatpuffer /pH 9,5) wird 1,0 ml einer Lösung des vorstehend erwähnten Anti-hCG-Antikörper Fab-Fragments, gelöst in 0,01m Natriumcarbonatpuf f er (pH 9,5) bis zu einer Konzentration von 5 mg/ml zugesetzt, worauf während einer Zeitspanne von 3 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt wird. Dann schließt sich die Zugabe von 5 mg Natriumborhydrid an, worauf die Reaktion während weiterer 3 Stunden bei 4⁰C durchgeführt wird. Die Mischung wird über Nacht gegen PBS (pH 7,2) dialysiert und dann auf eine mit Sephadex G-200 (Pharmacia Finechemical) gefüllte Säule aufgebracht. Auf diese Weise wird gereinigtes Anti-hCG-Antikörper Fab-HRP-Konjugat erhalten.

E) Herstellung von hCG-gekuppelter Cellulose.

8 g Cellulosepulver werden zu 320 ml eines 2,5 %igen Bromcyans gegeben. Die erhaltene Suspension wird auf einen pH von 10 bis 11 durch 1n Natriumhydroxid eingestellt. Nach einer 2 Minuten dauernden Umsetzung unter Rühren wird diese Suspension durch ein Glasfilter geschickt und mit 0,1m Natrxumbicarbonat gewaschen. Auf diese Weise wird aktivierte Cellulose erhalten. Nachdem die erhaltene aktivierte Cellulose in 32 ml einer 0,1m Natriumbicarbonatlösung suspendiert worden ist, werden 8 mg hCG zugesetzt. Die Reaktion erfolgt unter Rühren während einer Zeitspanne von 22 Stunden bei 4⁰C. Dann wird mit PBS gewaschen, worauf in PBS suspendiert wird, das 1 % BSA enthält.

F) hCG-Messung.

Jeweils 0,1 ml einer Standard-hCG-Lösung, 0, 1 ml der gemäß D9 erhaltenen Anti-hCG-Antikörper Fab-HRP-Konjugatlösung und 0,3 ml PBS, enthaltend 0,5 % BSA und 0,5 % Tween 20 (Atlas Powder), wobei diese Bestandteile in ein Reagensglas eingefüllt worden sind, werden während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei ZimmertemperatUÄ <b^t«:ütfit-. Dana schließt sich die Zu-

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gäbe von 0,3 ml der gemäß E) erhaltenen Suspension aus hCG-gekuppelter Cellulose an. Anschließend wird während einer Zeitspanne von 2 Stunden bei Zimmertemperatur bebrütet. Nach der Bebrütung wird die feste Phase mit einer physiologischen Kochsalzlösung, die 0,005 % Tween 20 enthält, gewaschen. 3 ml einer Substratlösung (60 mg/dl 5-Aminosalicylsäure und 1 ml/dl eines 0,3 %igen Wasserstoffperoxids) werden der festen Phase zugesetzt. Die Mischung läßt man während einer Zeitspanne von 60 Minuten bei Zimmertemperatur stehen. Die Reaktion wird durch Zugabe von 1 Tropfen eines 1,6 %igen Natriumazids abgestoppt, worauf zentrifugiert wird. Dann wird die Absorptionsfähigkeit der überstehenden Flüssigkeit bei 500 run gemessen. Diese Ergebnisse gehen aus Fig. 3 hervor.

Beispiel 2

Messung von östriol

A) Herstellung einer Standardöstriollösung.

östriol (Sigma Chemical) wird in PBS (pH 6,4) enthaltend 0,1 % BSA, bis zu Konzentrationen von 160, 40, 10, 2,5 und 0 ng/ml aufgelöst.

B) Herstellung von östriol-1 6 , ^-Dihemisuccinat-BSA-Konjucrat.

600 mg östriol-16,17-dihemisuccinat (Am. J. Obest. Gyn., 109, 897 (1971)) werden in 12 ml Dioxan gelöst, worauf 0,3 ml Tri-n-butylamin zugesetzt wird. Dann werden bei 12⁰C 0,17 ml Isobutylchlorcarbonat zugesetzt, worauf die Lösung gut durch Rühren vermischt wird. Die Lösung wird mit einer Lösung vermischt, die durch Auflösen von 1,7 g BSA in 40 ml destilliertem V^Tasser erhalten worden ist, Der pH wird auf 12,0 durch 1n Natriumhydroxid eingestellt, worauf 4 0 ml Dioxan zugesetzt werden. Dann wird die Mischung bei 12⁰C gehalten. · Nach einer Umsetzung während einer Zeitspanne von 4 Stunden unter Rühren werden nichtumgesetzte Substanzen mit niederem

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Molekulargewicht unter Verwendung einer mit Sephadex G-25 gefüllten Säule abgetrennt. Dann schließen sich eine Dialyse gegen eine 0,1 %ige Natriumazidlösung sowie ein Gefriertrocknen an. Dabei wird ein östriol-16,17-dihemisuccinat-BSA-Konjugat erhalten.

C) Herstellung von östron-17-oxim-hämoglobinkonjugat.

687 mg östron-17-oxim (Erlanger, B.F., J. Biol. Chem., 234, 1090 (1959)) werden in 20 ml Dioxan aufgelöst. Nach der Zugabe von 0,9 ml Tri-n-butylamin wird die Lösung bei 11⁰C gehalten, worauf sie gerührt wird. Dabei werden 0,27 ml Isobutylchlorcarbonat zugesetzt. Die Lösung wird mit einer Lösung vermischt, die durch Auflösen von 2,42 g Hämoglobin (Hb) in 70 ml destilliertem Wasser erhalten worden ist, wobei der pH von 9,5 eingestellt worden ist. Dann erfolgt ein weiteres Vermischen mit 70 ml Dioxan, worauf die Mischung bei 11⁰C gehalten wird. Es schließt sich dann eine 4-stündige Reaktion unter Rühren an, worauf nichtumgesetzte Substanzen mit niederem Molekulargewicht durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephadex G-25 abgetrennt werden. Die auf diese V7eise erhaltenen Substanzen werden gegen 0,1 %ige Natriumazidlösung dialysiert und anschließend gefriergetrocknet. Dabei wird ein östron-17-oxim-Hb-Konjugat erhalten.

D) Herstellung von Antiöstriolantikörper.

Das gemäß B) erhaltene östriol-16,17-dihemisuccinat-BSA-Konjugat wird in einer physiologischen Kochsalzlösung aufgelöst. Zusammen mit vollständigem Freund'sehen Adjuvans (Freund's complete advuvant) wird die Emulsion subkutan wiederholt in das Hinterteil eines erwachsenen Kaninchens eingespritzt, wobei jeweils 2 mg des Konjugats verwendet werden. Nachdem ein Anstieg des Antikörpertiters festgestellt worden ist, wird das Blut gesammelt. Das Serum wird abgetrennt und mit Natriumsulfat ausgesalzen, wobei eine Globu- » linfraktion erhalten wird. Dann wird der Antikörper zu BSA

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von diesem Antikörper unter Verwendung von BSA gekuppelter Sepharose (Pharmacia Finechemical) entfernt. Die BSA-gekuppelte Sepharose wird in einer Menge von 25 ml bis 50 ml der Antikörperlösung zugesetzt. Nach einem Stehenlassen bei 37°C während einer Zeitspanne von 30 Minuten wird die Suspension über Nacht bei 4⁰C bebrütet. Die flüssige Phase wird durch Zentrifugieren während einer Zeitspanne von 10 Minuten bei 4⁰C abgetrennt, wobei ein Antikörper erzeugt wird, der auf östriol spezifisch ist.

E) Herstellung von Antiöstrolantikörper Fab-HRP-Konjugat.

Durch Behandeln des gemäß D) erhaltenen Antikörpers nach der in Beispiel 1 C) beschriebenen Weise wird ein Antiöstriolantikörper-Fab-Fragment erhalten. Man läßt Fab und HRP miteinander in der in Beispiel 1 D) beschriebenen T'Teise reagieren, wobei ein Antiöstriolantikörper-Fab-HRP-Konjugat erhalten wird.

F) Herstellung von östron-17-oxim-hämoglobin-gekuppelter Cellulose

Unter Verwendung von 8 mg östron-17-oxim-hämoglobin wird östron-17-cxim-hämoglobin-gekuppelte Cellulose nach dem in Beispiel 1 E) beschriebenen Verfahren erhalten.

G) östriolmessung

Jeweils 0,1 ml einer Standardöstriollösung gemäß A), 0,1 ml einer Antiöstriolantikörper-Fab-HRP-Konjugatlösung gemäß

E) und 0,3 ml PBS, enthaltend 0,5 % BSA und 0,5 % Tween 20, werden in ein Reagensglas gegeben, worauf die Mischung während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur bebrütet wird. Die Lösung wird mit 0,3 ml einer Suspension aus östron-17-oxim-hämoglobin-gekuppelter Cellulose gemäß

F) versetzt und während einer Zeitspanne von 2 Stunden bei Zimmertemperatur bebrütet. Anschließend wird nach der in Bei-

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spiel 1 beschriebenen Arbeitsweise die Absorptionsfähigkeit bei 500 nm gemessen. Die Ergebnisse gehen aus Fig. 4 hervor.

Beispiel 3
Insulinmessung

A) Herstellung einer Standardinsulinlösung.

Kristallines Rinderinsulin (Sigma Chemical, 25 IU/mg) wird in PBS, enthaltend 0,1 % BSA, bis zur Konzentration von 160, 80, 40, 20, 10, 5 und 0 uIU/ml aufgelöst.

B) Herstellung von Antiinsulinantikörper.

Kristallines Rinderinsulin wird in einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert und anschließend durch Zugabe von 0,1η Chlorwasserstoffsäure, wobei die Zugabe Tropfen für Tropfen erfolgt, aufgelöst, wobei eine Konzentration von 2 mg/ml eingestellt wird. Die Insulinlösung wird mit Aktivkohlepulver (Fako, chemisch rein) in einer Menge von 10 mg bis 1 ml der Insulinlösung vermischt, wobei das Insulin an der Aktivkohle adsorbiert wird. Die Aktivkohle mit dem adsorbierten Insulin wird durch Zentrifugieren abgetrennt. Durch Zugabe von 0,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung zu 10 mg dieser Aktivkohle wird eine Suspension aus Aktivkohle mit adsorbiertem Insulin erhalten. Ein Meerschweinchen wird jede Woche mit einer Mischung aus 0,25 ml dieser Suspension und 0,25 ml eines vollständigen Freund'sehen Adjuvanses gespritzt. Die Injektion wird 10 mal wiederholt. 1 Woche nach der letzten Injektion wird das Blut aus der Halsschlagader des Tieres gesammelt, wodurch ein Meerschweinchenantiinsulinserum erhalten wird. Das auf diese Weise erhaltene Antiserum wird zweimal mit Natriumsulfat ausgesalzen, wobei Antiinsulinantikörper erhalten werden.

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131 C) Markierung von Antiinsulinantikörper Fab mit J.

Der gemäß B) erzeugte Antiinsulinantikörper wird nach der in Beispiel 1 C) beschriebenen Weise behandelt, wobei Antiinsulinantikörper-Fab erhalten wird. Unter Anwendung der Methodi
kiert.

Methode von Hunter-Greenwood wird dieses Fab mit J marin einem kleinen Reagensglas werden 2 mCI Na J (0,005 ml) zu 0,0025 ml eines 0,5m Phosphatpuffers gegeben, worauf 0,0025 ml Fab-Lösung und 0,02 ml Chloramin T zugesetzt und eingemischt werden. 10 Sekunden später wird die Reaktion durch Zugabe von 0,1 ml Natriumpyrosulfit abgestoppt. Nach einer Fraktionierung durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephadex G-25 wird J-Antiinsulinantikörper-Fab erhalten.

D) Herstellung von Insulin-gekuppelter Sepharose.

10 ml Sepharose werden mit destilliertem Wasser auf einem Glasfilter gewaschen und dann in 20 ml destilliertem Wasser suspendiert. Die Suspension wird mit 20 ml eines 2,5 %igen Bromcyans vermischt, worauf der pH auf 10 bis 11 unter Verwendung von 1n Natriumhydroxid eingestellt wird. Dann läßt man während einer Zeitspanne von 8 Minuten eine Reaktion ablaufen. Nach einem Durchschicken durch ein Glasfilter und einem Waschen mit destilliertem Wasser und ein anschließendes Waschen mit 0,1m Natriumbicarbonat erfolgt eine Suspendierung in 10 ml Insulinlösung (50 mg/10 ml) und eine Reaktion bei 4⁰C über Nacht. Nach der Reaktion wird gründlich mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, worauf PBS, enthaltend 0,5 % BSA, suspendiert wird.

E) Messung des Insulins.

Jeweils 0,1 ml Standard-Insulinlösung gemäß A), 0,1 ml J-Antiinsulinantikörper-Fab-Lösung gemäß C) und 0,3 ml

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PBS, enthaltend 0,5 % BSA und 0,5 % Tween 20, werden in ein Zählreagensglas gegeben und während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehengelassen. Dann werden 0,2 ml einer Suspension aus insulingekuppelter Sepharose gemäß D) zugesetzt, worauf während einer Zeitspanne von 2 Stunden bei Zimmertemperatur bebrütet wird. Nach einem zweimaligen Waschen mit physiologischer Kochsalzlösung, die 0,005 % Tween 20 enthält, wird die Radioaktivität der Sedimente gemessen. Nach diesem Verfahren können mehr als 0,1 μΐϋ Insulin gemessen werden.

Beispiel 4

Messung von flf-Fötoprotein.

A) Herstellung einer Standard- ßf-fötoproteinlösung.

(X-Fotoprotein (AFP), das aus Bauchasciten eines Patienten mit primärem Hepatoma extrahiert und nach der Methode von Nishi et al. (Cancer Res., 30, 2507 (1970)) gereinigt worden ist, wird in PBS, enthaltend 0,5 % BSA und 0,5 % Tween 20, bis zu Konzentrationen von 160, 80, 40, 20, 10 und 5 ng/ml aufgelöst.

B) Herstellung von Anti-AFP-Antikörper.

Gereinigtes AFP wird bis zu einer Konzentration von 2 mg/ml in einer physiologischen Kochsalzlösung aufgelöst, worauf 0,5 ml dieser Lösung mit 0,5 ml eines vollständigen Freund¹ sehen Adjuvanses vermischt werden. Ein Kaninchen wird mehr als fünfmal mit der Mischung zur Immunisierung gespritzt, wobei das Anti-AFP-Serum erhalten wird. Durch Aussalzen mit Natriumsulfat wird der Anti-AFP-Antikörper aus diesem Antiserum erhalten.

C) Herstellung von Anti-AFP-Antikörper-Fab.

Nach der in Beispiel 1 C) beschriebenen Methode wird der Anti-AFP-Antikörper gemäß B) einer Papaindigerierung unter-

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zogen, wobei das Anti-AFP-Antikörper-Fabfragment erhalten wird.

D) Herstellung von Anti-AFP-Antikörper-Fab-Enzym-Konjugat.

0,3 ml einer alkalischen Phsophataselosung (Grad 1) (Böhringer Mannheim) in einer Konzentration von 5 mg/ml werden zentrifugiert. Nach der Entfernung der überstehenden Flüssigkeit erfolgt eine Auflösung in 0,1 ml des Anti-AFP-Antikörper-Fab gemäß C). Nach einer Dialyse über Nacht gegen PBS erfolgt ein Vermischen mit 0,01 ml eines 4,2 %igen Glutaraldehyds. Die Mischung wird während einer Zeitspanne von 2 Stunden bei Zimmertemperatur bebrütet. Dann wird das Volumen der Lösung aus 1 ml durch Zugabe von PBS eingestellt. Eine Dialyse über Nacht gegen PBS schließt sich an, worauf eine Fraktionierung durch Säulenchromatographie unter Einsatz von Sepharose 6B durchgeführt wird. Dabei erhält man Anti-AFP-Antikörper-Fab-alkalisches Phosphat-Konjugat.

E) Herstellung von AFP-gekuppelter Cellulose.

Nach der in Beispiel 1 E) beschriebenen Arbeitsweise werden 8 g Bromcyan-aktivierter Cellulose und 8 mg AFP miteinander umgesetzt, wobei AFP-gekuppelte Cellulose erhalten wird.

F) AFP-Messung

0,1 ml der Standard-AFP-Lösung gemäß A) und 0,1 ml Anti-AFP-Antikörper Fab-alkalisches Phosphatase-Konjugat-Lösung gemäß E) werden in ein Reagensglas eingefüllt. Die Suspension wird während einer Zeitspanne von 2 Stunden bei Zimmertemperatur bebrütet. Dann wird die feste Phase in der Suspension mit physiologischer Kochsalzlösung, die 0,005 % Tween 20 enthält, gewaschen. Dann werden 3 ml einer Substratlösung , (p-Nitrophenylphosphat, 100 mg/dl, Magnesiumchlorid, 1 mM, pH 9,8) zugesetzt, worauf man während einer Zeitspanne von

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1 Stunde bei Zinunertemperatur stehenläßt. Durch Zugabe von 0,3 ml einer 1n Natriumhydroxidlösung wird die Reaktion
abgestoppt. Nach einem Zentrifugieren wird das Absorptionsvermögen der überstehenden Flüssigkeit gemessen. Die Ergebnisse gehen aus der Fig. 5 hervor.

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Claims

MÜLLER-BORE · DEUFSL · SCHOi · HERTTSL

PATENTASWiLTE

27A3444

DR. WOLFGANG MÜLLER-BORE (PATENTANWAUTVON J9Z7-1975) DR. PAUL DEUFEL, DIPL-CHEM. DR. ALFRED SCHÖN. DlPL.-CHEM. WERNER HERTEL. DIPL..-PHYS.

M 2517

MOCHIDA SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA, 7-banchi, 1-chome, Yotsuya, Shinjuku-ku, Tokyo,

Japan.

Immunchemisches Meßverfahren.

Patentansprüche

.j Immunchemisches Meßverfahren, gekennzeichnet durch die Verwendung eines markierten Antikörpers, d. h. eines markierten monovalenten Antikörpers zur einer zu messenden Antigensubstanz sowie eines insolubilisierten Antigens, d. h. der gleichen Antigensubstanz wie die zu messende Substanz.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Antikörper ein Papain-digeriertes Fragment des Antikörpers zu der zu messenden Antigensubstanz oder ein Pepsin-digeriertes und reduziertes Fragment des Antikörpers zu der zu messenden Antigensubstanz ist.

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MCMCHES 8β · SIEBERTSTR. 4 ■ POSTFACH 8B0720 · KABEL·: ItUEDOPAT · TEL. (USO) 474003 · TELEX 3-¹JiCS

2743U4
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das eingesetzte Markierungsmittel aus einem Radioisotop, Enzym oder fluoreszierenden Material besteht.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der eingesetzte insolubilisierte Antikörper ein Antigen ist, das durch Binden an einen Träger insolubilisiert worden ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der eingesetzte Träger aus einem Polysaccharid oder Kunststoff besteht.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu messende Antigensubstanz eine Substanz mit hohem Molekulargewicht, d. h. ein sog. vollständiges Antigen, oder eine Substanz mit niedrigem Molekulargewicht, d. h. ein sog. Hapten, ist.
7. Reagens zur Durchführung einer immunchemischen Messung, gekennzeichnet durch einen markierten Antikörper, d. h. einen markierten monovalenten Antikörper zu einer zu messenden Antigensubstanz, und ein insolubilisiertes Antigen, d. h. die gleiche Antigensubstanz wie die zu messende Substanz .
8. Reagens nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der monovalente Antikörper ein Papain-digeriertes Fragment des Antikörpers der zu messenden Antigensubstanz oder ein Pepsin-digeriertes und reduziertes Fragment des Antikörpers zu der zu messenden Antigensubstanz ist.
9. Reagens nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Markierungsmittel aus einem Radioisotop, Enzym oder fluoreszierenden Material besteht.

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10. Reagens nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das insolubilisierte Antigen ein Antigen ist, das durch Binden an einen Träger insolubilisiert worden ist.
11. Reagens nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus einem Polysaccharid oder Kunststoff besteht.
12. Reagens nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die zu messende Antigensubstanz eine Substanz mit hohem Molekulargewicht, d. h. ein sog. vollständiges Antigen, oder eine Substanz mit niederem Molekulargewicht, d. h. ein sog. Hapten, ist.
13. Reagens nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der markierte Antikörper und das insolubilisierte Antigen gefriergetrocknet sind.

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