JP3287578B2 - 生物学および医学に応用される被保持物クロマトグラフィーおよびタンパク質チップアレイ - Google Patents
生物学および医学に応用される被保持物クロマトグラフィーおよびタンパク質チップアレイInfo
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Description
33および1997年12月1日出願の同時継続出願60/067,484
の優先日に基づく優先権を主張する。これらの出願の内
容はその全体が本明細書中に参考として援用される。
生化学の分野に関する。
析、示差的な遺伝子発現、タンパク質の発見、細胞的お
よび臨床的診断および薬物スクリーニングを包含する)
に適用される。
も、一部には、細胞によって発現される遺伝子(すなわ
ち遺伝子機能)に依存する。遺伝子発現は定性的および
定量的な両方の局面を有する。すなわち、細胞は、発現
される特定の遺伝子に関してと、同じ遺伝子の発現の相
対レベルに関しての両方で異なり得る。示差的な遺伝子
発現は、例えば、その遺伝子によってコードされるタン
パク質の発現における差異、または発現されるタンパク
質の翻訳後調節における差異によって明白になり得る。
例えば、タンパク質は、炭水化物またはリン酸基で修飾
され得、あるいはペプチド切断を通じてプロセシングさ
れ得る。従って、生化学レベルにおいて、細胞は生物体
生体分子の複合体混合物を表す。
物(proteomics)」の1つの目標は細胞型の間で示差的
に発現される生物体生体分子の同定および特徴付けであ
る。発現を比較することによって、細胞の特定の病理学
的作用の原因となり得る分子を同定することができる。
例えば、癌細胞中で発現するが正常細胞中では発現しな
いタンパク質を同定することは、診断のために有用であ
り、そして最終的には薬物の発見および病理学的処置の
ために有用である。ヒトゲノムプロジェクトが完了すれ
ば、全てのヒト遺伝子はクローン化され、配列決定さ
れ、そしてデータベースとして体系化される。この「ゲ
ノム後(post−genome)」の世界では、示差的に発現さ
れたタンパク質を同定する能力は、今度は、それをコー
ドする遺伝子の同定に通じる。従って、遺伝学の能力
は、細胞期脳の問題を有すると考えられ得る。
の分子の複合体混合物が微量で存在する場合でさえも、
それを分離(resolve)し得、定量し得、そして同定し
得るツールを必要とする。しかしこの目的のための現在
の分析化学的ツールは、それらの分野の各々で制限され
ている。1つの普及した生体分子分別(separation)法
は電気泳動である。しばしば、ゲル中での等電点電気泳
動による第1のタンパク質の分別は、ドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAG
E)による第2の区別と組み合わされる。この結果は、
タンパク質を等電点(正味の電荷)およびサイズ(すな
わち質量)の次元に従って分離するマップである。しか
しこの方法は有用ではあるが、いくつかの点で限界があ
る。第1に、この方法は生体分子のわずか2つの性質に
ついての情報を提供するに過ぎない。質量および等電点
(「pI」)である。第2に、各次元における分離はゲル
の分離性によって制限される。例えば、その質量の差が
約5%未満、または約0.5pI未満の分子はしばしば分離
が困難である。第3に、ゲルはローディング受容量(ca
pacity)能力が限られ、それゆえ選択性に限りがある。
少量で発現される生体分子は検出され得ない。第4に、
分子量が約10〜20kDaを下回る小さいタンパク質および
ペプチドは観察されない。
克服し得るが、それらを効率的に組み合わせることは困
難である。例えば、分析クロマトグラフィーは生体分子
を種々の被分析物/吸着体相互作用に基づいて区別する
ことができるが、多次元分析は困難であり、かつ時間が
かかる。さらに、この方法は感受性に限界がある。
る能力を必要とする。しかし、このような診断の発展の
ためには、マーカーに特異的に結合する試薬を調製する
のに必要とされる時間、または複合体混合物中のマーカ
ーを識別し得る時間が障害となる。
する物質を迅速にスクリーニングする能力を必要とす
る。しばしば、このようなスクリーニングにおける律速
段階はリガンド/レセプター相互作用を検出する能力で
ある。従って、結合事象を同定するための迅速かつ特異
的な方法は当該分野における進歩となる。
ター対のメンバーを同定するところから、このマーカー
またはメンバーに特異的に結合する物質を産生するまで
のプロセスが困難である。1つの方法では、正常組織お
よび疾患組織を比較して、疾患組織で上昇または減少し
ているmRNA種または発現配列タグ(「EST」)を同定す
る。これらの種を単離し、そしてこれらがコードするポ
リペプチドを組換えDNAの日常的方法を通じて産生す
る。次に、ポリペプチドを単離し、そしてマーカーに対
して特異的な抗体を惹起する免疫原として使用する。こ
の抗体を例えばELISAアッセイで用いて、患者の試料中
のマーカーの量を決定する。
抗体を産生するために9ヶ月かから1年かかり得、その
時間の大半は免疫化のためのポリペプチドの十分量を単
離するためのプロトコルを作成するために費やされる。
さらに、この方法は、RNA発現の差異はタンパク質発現
の差異として表されるという希望に頼る。しかし、この
仮説は、常に信頼出来るわけではない。従って、示差的
に発現されるタンパク質は直接検出される方法および特
異的リガンドが優位に短い時間で産生され得る方法は、
この分野にとって非常に利益である。
合物中の個々の生体分子を同定し、そして1つまたはそ
れ以上の標的被分析物を含む特異的分子認識事象を同定
するためのツールが、分析生化学、生物学および医学の
ために所望される。
のための装置および方法を提供する。被保持物クロマト
グラフィーは組合せ的な方法であり、複合体混合物中の
被分析物の高度情報分離を、多次元分別方法の使用を通
じて提供する。これは生物学および医学のために統合さ
れた被分析物検出および機能的分析の可能性を提供し、
これは、遺伝子機能、タンパク質機能、細胞機能、およ
び生物体全体の機能に関連する被分析物発現パターンの
直接検出のための単一の一体化された操作システムによ
って特徴づけられる。1つの局面では、本発明は遺伝子
機能、タンパク質機能、または巨大分子アセンブリ全
体、細胞、および全生物体の発見または診断のための統
合された操作システムを提供する。
で分離され得、それにより多次元情報が提供される。被
分析物は最初に少なくとも2つの異なる第1の次元中
で、少なくとも2つの異なる選択条件下で固定相に吸着
するその能力(例えば、アニオン性/カチオン性ポテン
シャル、疎水性/親水性、または特異的生体分子認識)
に基づいて分別される。次に、被分析物は第2の次元で
脱離スペクトロメトリ(例えば、レーザー脱離質量スペ
クトロメトリ)により質量に基づいて分別され、これに
より分別された被分析物の検出がさらに提供される。被
分析物が吸着する吸着体の性質は被分析物に関する物理
化学的情報を提供する。
る。これは並列かつ多重な被分析物の処理能力を含むこ
とで特徴づけられる。被分析物が直接検出できるので、
本発明は単一の単位操作の間に、同じ「サーキット」
(すなわち、アドレス可能な「チップ」位置」から2つ
以上の独立した標的被分析物シグナルを同時に発信する
ことが可能である。
クロマトグラフィーと異なる。第1に、被保持物クロマ
トグラフィーでは、吸着体上に保持された被分析物が検
出される。従来のクロマトグラフィー法では、被分析物
は検出の前に吸着体から溶離している。従来のクロマト
グラフィーにおいては、吸着体から溶離していない被分
析物を検出するための日常的または簡便な手段は存在し
ない。従って、被保持物クロマトグラフィーは、保持さ
れた被分析物の化学的または構造的特性に関する直接的
な情報を提供する。第2に、吸着クロマトグラフィーと
脱離スペクトロメトリによる検出との組み合わせは、フ
ェムトモルの範囲という驚くべき高感度と非常に優れた
分離を提供する。第3に、一部には被分析物を直接検出
できるという理由で、被保持物クロマトグラフィーは種
々の異なる選択条件で被保持物を迅速に分析する能力を
提供し、それゆえ、試料中の被分析物の迅速な多次元の
特徴付けを提供する。第4に、吸着体は、所定のアドレ
ス可能な位置のアレイで基材に付着され得る。これによ
り、異なる溶離条件下でアレイ上の異なる吸着体部位
(すなわち、「親和性部位」または「スポット」)に曝
露される被分析物の並列処理が可能となる。
いて多くの用途を有する。これらの用途としては、被分
析物の組合せ的な生化学的分別および精製、示差的な遺
伝子発現および分子認識事象の研究、診断および薬物発
見が挙げられる。
1つの基本的な用途は、試料を異なる吸着体/溶離物の
組み合わせの組合せ的な取り合わせ(assortment)に曝
露すること、および異なる条件下での被分析物の挙動を
検出することを含む。これにより、被分析物が精製さ
れ、そして試料中の被分析物の検出のために有用な条件
が同定される。このようにして同定された吸着体を有す
る基材は、1つまたは複数の被分析物の特異的検出器と
して使用され得る。進行的な抽出法においては、試料を
第1の吸着体/溶離物の組み合わせに曝露し、そして第
1の吸着体によって吸着された被分析物が枯渇した洗浄
液を第2の吸着体に曝露して、他の被分析物を枯渇させ
る。被分析物を保持するものとして同定される選択条件
はまた分取的精製手順にも用いられ得る。この手順で
は、被分析物を含む不純試料をその被分析物を保持する
吸着体に連続的に曝露し、不純物を除去し、そして保持
された被分析物を次のラウンドで吸着体から採取する。
置の個々の選択条件によって特徴づけられる各クラスま
たは型の分子認識事象(例えば、標的吸着体−標的被分
析物の相互作用)が直接検出され、その間、関連する分
子がアドレス可能な位置にそれでもなお局在化(すなわ
ち「保持」)されていることである。すなわち、直接的
手段による選択および検出は、標的被分析物の溶離、回
収、増幅、または標識化を必要としない。
以上の位置での1つ以上の所望の分子認識事象の検出
が、少なからぬ量の総吸着体−被分析物の画分の除去ま
たは消費を必要としないことである。それゆえ、非使用
の部分は、構造および機能の解明のためにインサイチュ
で(すなわちアドレス可能な位置の境界内で)直接行わ
れる1つ以上の「二次的処理」(さらなるアセンプリ
(assembly)またはジアセンブリ(diassembly)、修
飾、または増幅(直接または間接)の後に、さらに問い
合わせ(interrogate)され得る。
行的分離(progressive resolution)」と呼ばれる中間
的なプロセスによって開発され得る。このプロセスで
は、被分析物を保持することが証明された吸着体または
溶離物をさらなる変数で試験して、より優れた結合特性
の組み合わせが同定される。他の方法では、被分析物に
特異的な抗体吸着体を有する基材の迅速な作製が可能と
なる。この方法は、被分析物を吸着体にドッキングする
こと、およびファージ提示ライブラリーを被分析物に結
合するファージについてスクリーニングすることを伴
う。
び細胞生物学における用途も有する。2つの試料中に示
差的に存在する被分析物(例えば2つの細胞抽出物中に
示差的に発現するタンパク質)は、試料を脱離スペクト
ロメトリによる分析のための種々の吸着体/溶離物の組
み合わせに曝露することによって同定され得、これによ
り、他の分別および検出系ではかなうことができないこ
の系の高度情報分離能力が利用できる。未知の標的タン
パク質は、吸着体/溶離物の組み合わせの化学的性質に
基づいて物理化学的性質(分子量を包含する)を決定す
ることによって同定され得、そしてこの情報を用いて同
様のプロファイルを有するタンパク質についてデータベ
ースをスクリーニングし得る。
される吸着体は診断において有用である。より詳細に
は、化学的な吸着体または生体特異的な吸着体のいずれ
かが、重要な診断的マーカーの検出のために開発され得
る。特定の実施態様において、基材は、疾患または症候
群のための診断的なマーカーの組み合わせについて選択
された吸着体スポットのアレイを有し得る。
有用である。レセプター/リガンド対の1つのメンバー
を吸着体にドッキングし、そして結合パートナーに結合
するその能力を物質(agent)の存在下で試験する。吸
着が迅速に試験され得るので、物質の組合せ的なライブ
ラリーは相互作用を調節するその能力について容易に試
験され得る。
被分析物の高度情報分離のための方法を提供する。この
方法は、複数の被分析物の並列な分別および検出を含む
組合せ的な分別方法である。この方法は、a)被分析物
を少なくとも2つの異なる選択条件に曝露する工程であ
って、各選択条件が吸着体および溶離物の組み合わせに
よって規定され、この被分析物を吸着体で保持させる、
工程;およびb)異なる選択条件下で保持された被分析
物を脱離スペクトロメトリで検出する工程を包含する。
異なる選択条件下での保持された被分析物の検出は、被
分析物の高度情報分離を提供する。
は、並列処理のための異なる所定のアドレス可能な位置
で定義される。他の実施態様においては、この方法は、
i)被分析物を定義された位置で第1の選択条件に曝露
して、被分析物を吸着体で保持させる工程;ii)第1の
選択条件下で保持された被分析物を脱離スペクトロメト
リによって検出する工程;iii)吸着体を定義された位置
で第2の異なる選択条件下で洗浄して、被分析物を吸着
体で保持させる工程;およびiv)第2の選択条件下で保
持された脱離スペクトロメトリによって検出する工程を
包含する。
多量体分子複合体または巨大分子構築物である。他の実
施態様において、生物体生体分子は酵素、免疫グロブリ
ン、細胞表面レセプターまたは細胞内レセプターであ
る。
ン、疎水性相互作用吸着体、ポリペプチド、核酸、炭水
化物、レクチン、色素、還元剤、炭化水素またはそれら
の混合物を含む。他の実施態様において、吸着体は、ガ
ラス、セラミック、磁性材料、生物体ポリマー、伝導性
ポリマー、天然バイオポリマー、金属または生物体ポリ
マーでコートされた金属を含む基材に付着する。他の実
施態様において、吸着体は、ミクロ乳濁液、ラテック
ス、層、またはビーズの形態であり得る。他の実施態様
において、基材上の位置は線状または直交アレイに配置
される。他の実施態様において、吸着体は被分析物が選
択条件に曝露される前に基材上に異なる位置で配置され
る。他の実施態様において、吸着体は被分析物が選択条
件に曝露された後に基材上に異なる位置で配置される。
他の実施態様において、異なる選択条件は異なる結合条
件または異なる溶離条件を含む。
レーザー脱離質量スペクトロメトリで検出する工程を包
含する。
析物の保持を最適化すべく選択される。他の実施態様に
おいて、少なくとも1つの被分析物は1つより多い被分
析物である。他の実施態様において、複数の選択条件が
異なる吸着体および同じ溶離物で定義される。
基材を提供する工程をさらに包含し、各吸着体は被分析
物の保持を同定する選択条件による吸着体である。他の
実施態様において、溶離条件はpH、緩衝能、イオン強
度、水構造特性、界面活性剤の型、界面活性剤強度、疎
水性または比誘電率に従って異なる。他の実施態様にお
いて、複数の選択条件が同じ溶離物によって規定され
る。
系列的に抽出する方法を提供する。これは、並列な複数
の被分析物のために組合せ的な系列分別および精製展開
方法(purification development method)である。こ
の方法は、a)被分析物を含む試料を第1の選択条件に
曝露して、被分析物を第1の吸着体に保持させ、そして
被保持試料を作製する工程;b)被分析物を含む非保持試
料を採取し、非保持試料を第2の選択条件に曝露して、
被分析物を第2の吸着体に保持させ、そして非保持試料
を作製する工程;およびc)異なる選択条件下で保持さ
れた被分析物を脱離スペクトロメトリで検出する工程を
包含する。
ための基材を提供し、これは吸着体を含み、この吸着体
の結合特性は1つ以上の直線軸に沿う勾配で変化する。
する分離が改善された選択条件を進行的に同定する方法
を提供する。この方法は以下の工程を含む:(a)試料
中の被分析物を保持する選択条件を以下の工程(i)〜
(iii)で同定する工程: (i)試料を選択条件のセットに曝露する工程であっ
て、各選択条件が少なくとも1つの結合特性および少な
くとも1つの溶離特性によって定義される、工程;(i
i)各選択条件下で保持された被分析物を脱離スペクト
ロメトリで検出する工程;および(iii)被分析物を保
持する選択条件を同定する工程;ならびに(b)被分析
物に対する改善された分離を有する選択条件を以下の工
程(i)〜(iii)によって同定する工程:(i)少な
くとも1つの結合特性または溶離特性を同定された選択
条件から選択し、そしてそれを選択性特性の定常のセッ
トに加える工程;(ii)改変された選択条件のセットに
試料を曝露する工程であって、ここで改変されたセット
中の各選択条件が以下を含む工程:(1)定常セットに
おける選択性特性および(2)定常セットにおいてでは
ない結合特性または溶離特性;および(iii)改変され
たセットからの選択条件を先に同定された選択条件と比
べて改善された分離を有する被分析物を保持する脱離ス
ペクトロメトリによって同定する工程。1つの実施態様
は、工程(b)を少なくとも1回繰り返す工程を包含す
る。他の実施態様は、工程(b)を、選択条件が試料か
ら標的被分析物のみを保持することが同定されるまで繰
り返す工程を包含する。
て被分析物を分離するものとして同定された選択条件に
よる吸着体を含む、脱離スペクトロメトリのための基材
を提供する。1つの実施態様において、基材はキットの
形態で与えられ、このキットはさらに、選択条件による
溶離物、または溶離物を吸着体と組み合わせて使用する
指示を含む。
の分取的精製のための方法を提供する。この方法は、以
下の工程を包含する:a)試料を複数の異なる選択条件下
で基材に曝露する工程;脱離スペクトロメトリにより異
なる選択条件下で、保持された被分析物を検出する工
程;および被分析物が保持される選択条件を同定する工
程;(b)被分析物を、複数の異なる同定された選択条
件について以下のi)〜iii)を包含する一連の工程を
繰り返すことによって精製する工程;i)試料を、同定さ
れた選択条件下、吸着体に曝露して被分析物を吸着体に
よって保持させる工程;ii)被分析物を基材によって保
持されない不純物から分別する工程;およびiii)被分
析物を吸着体から採取する工程。
の被分析物を検出するための基材を調製するための方法
を提供する。この方法は、被分析物特異的吸着体の設計
および同定のための組合せ的な方法である。これは標的
被分析物の検出において有用である。この方法は、a)
試料を少なくとも2つの異なる選択条件に曝露する工程
であって、各選択条件が吸着体と溶離物との組み合わせ
によって規定され、被分析物を吸着体により保持させる
工程;b)被分析物が保持されるもとで少なくとも1つの
選択条件で脱離スペクトロメトリによって同定する工
程;およびc)同定された選択条件の少なくとも1つの
吸着体を含む基材を調製する工程を包含する。1つの実
施態様において、同定工程は、複数の被分析物が保持さ
れるもとで少なくとも1つの選択条件を同定する工程を
包含する。他の実施態様において、調製工程は、ある溶
離条件下で被分析物を多重な吸着体として保持する複数
の吸着体を含む基材を調製する工程を包含する。
とも1つの診断マーカーで特徴づけられる疾患を診断す
る方法を提供する。これは、複数の診断マーカーの同時
検出のための組合せ的な方法である。この方法は、a)
脱離スペクトロメトリで使用するための基材を提供する
工程であって、この基材が少なくとも1つのアドレス可
能な位置を含み、各アドレス可能な位置が、ある溶離条
件下少なくとも1つの診断マーカーを分離する吸着体を
含む、工程;b)基材を、その溶離条件下、被験体からの
生物学的試料に曝露して、診断マーカーを保持させる工
程;およびc)保持された診断マーカーを脱離スペクト
ロメトリで検出する工程、を包含する。保持された診断
マーカーの検出は疾患の診断を提供する。
するためのキットを提供する。このキットは、(1)脱
離スペクトロメトリで使用するための基材であって、少
なくとも1つのアドレス可能な位置を含み、各アドレス
可能な位置が、吸着体および溶離物を含む選択条件下で
被分析物を分離する吸着体を含む、基材;および(2)
試料をこの選択条件に曝露するための溶離物または指
示、を含む。1つの実施態様において、キットは、複数
の診断マーカー、および複数のアドレス可能な位置を含
む基材により特徴づけられ、各アドレス可能な位置は少
なくとも1つの診断マーカーを分離する吸着体を含む。
のための基材を提供する。この基材は少なくとも1つの
吸着体を少なくとも1つのアドレス可能な位置に含み、
ここでこの少なくとも1つの吸着体は、患者試料から病
理学的条件についての複数の診断マーカーを分離する。
いて同一候補を選択する方法を提供する。この方法は、
少なくとも2つの物理化学的特性に基づくタンパク質同
定のための組合せ的な方法である。この方法は以下の工
程を包含する:a)試料中のタンパク質被分析物の少なく
とも第1および第2の物理化学的性質についてのマッチ
パラメータを特定する値のセットを、以下の工程i)お
よびii)によって決定する工程:i)被分析物を複数の異
なる選択条件に曝露する工程であって、ここでタンパク
質被分析物と基材との吸着がタンパク質被分析物の物理
化学的性質を同定する引力(attraction)に基づいて媒
介される、工程;およびii)異なる選択条件下、保持さ
れた被分析物を脱離スペクトロメトリによって検出する
工程;およびb)プログラム可能なデジタルコンピュー
タで以下の工程i)〜iii)を実行する工程:i)参照ポ
リペプチドの1つのセットの各メンバーについて、この
参照ポリペプチドの少なくとも第1および第2の物理化
学的性質を特定する値のセットを含むデータベースにア
クセスする工程;ii)タンパク質被分析物の物理化学的
性質を特定する値のセットを入力する工程;iii)マッチ
パラメータ内の値のセットを有する参照ポリペプチドを
データベースからソートする工程。ソートされた参照ポ
リペプチドはタンパク質被分析物についての同一候補を
提供する。非ソートの参照ポリペプチドは同一候補から
除外されたポリペプチドである。
持するための方法を提供する。この方法は、多量体の巨
大分子または超分子アセンブリのモニタリング方法であ
る。これは分子認識妨害による薬物発見のための方法と
して有用である。この方法は、a)第1試料を一次吸着
体および溶離物に曝露して、第1被分析物をこの吸着体
によって保持させ、そして吸着した被分析物を脱離スペ
クトロメトリによって検出して、これにより保持された
第1被分析物が二次吸着体になる工程;b)第2試料を二
次吸着体および溶離物に曝露して、第2被分析物を二次
吸着体で保持させ、そして吸着した第2被分析物を脱離
スペクトロメトリによって検出して、これにより保持さ
れた第2被分析物が三次吸着体になる工程、を包含す
る。
る方法を提供する。この方法は:a)吸着体およびこの吸
着体に結合した酵素基質を含む固相を提供する工程であ
って、ここで酵素基質上の酵素の活性により特徴的な分
子量を有する産物が産生される工程;b)基質を試料に曝
露する工程;およびc)脱離スペクトロメトリによって
産物を検出する工程、を包含する。産物の検出により酵
素の検出が提供される。
2の生物学的試料中に示差的に存在する(例えば示差的
に発現される)かどうかを決定するための方法を提供す
る。この方法は、示差的遺伝子発現を示差的タンパク質
提示によってモニタリングするための組合せ的な方法と
して有用である。この方法は:a)第1試料中の被分析物
についての第1保持マップを少なくとも1つの選択条件
について決定する工程;b)第2試料中の被分析物につい
ての第2保持マップを同じ選択条件について決定する工
程;およびc)第1保持マップおよび第2保持マップ間
の差異を検出する工程、を包含する。保持マップ間の差
異は、被分析物が第1試料および第2試料中で示差的に
存在することの決定を提供する。
が、2つの異なる細胞間、およびこの細胞またはこの細
胞由来の物質を含む第1および第2の試料間で示差的に
発現するかどうかを決定するための方法である。他の実
施態様において、この方法は、ある物質が生物学的試料
中のタンパク質の発現を変化させるかどうかを決定する
ための方法であるならば、この物質を第1の生物学的試
料に投与するが第2の生物学的試料に投与しない工程を
包含する。他の実施態様において、第1の生物学的試料
は健康な被験体由来であり、そして第2の生物学的試料
は病理学的状態に罹患した被験体由来である。試料は、
例えば、血液、尿、血清および組織から選択され得る。
病理学的被験体由来の試料において増加することが見い
だされる被分析物が診断マーカーの候補である。一般
に、診断マーカーの確認は多くの被験体からマーカーを
検出することを含む。
ンドを同定するための方法を提供する。この方法は:a)
吸着体を含む基材を提供する工程であって、ここでレセ
プターが吸着体に結合する、工程;b)結合したレセプタ
ーを、レセプターとリガンドとの間を結合させる条件
下、リガンドを含む試料に曝露する工程;およびc)結
合したリガンドを脱離スペクトロメトリで検出する工
程、を包含する。
と吸着体との間の結合を調節するかどうかを決定するた
めのスクリーニング方法を提供する。これは薬物発見の
ための組合せ的な方法である。この方法は:a)ある溶離
条件下で標的被分析物が結合する吸着体を含む基材を提
供する工程;b)基材を標的被分析物および上記物質に上
記溶離条件下で曝露して、標的被分析物と吸着体との間
を結合させる工程;c)標的被分析物と吸着体との間の結
合の量を脱離スペクトロメトリで検出する工程;および
d)測定した量が、基材を上記物質なしの溶離条件下、
標的被分析物に曝露した場合のコントロール結合量と異
なるかどうかを決定する工程、を包含する。測定量とコ
ントロール量との間の差異は、この物質が結合を調節す
ることを示す。
に結合するポリペプチド物質をコードするポリヌクレオ
チドを含む遺伝子パッケージを検出する方法を提供す
る。これは、1つの局面において、被分析物特異的ファ
ージを提示ライブラリーから選択するための組合せ的な
方法であり、被保持物マッピングによって単離された標
的タンパク質またはインビボ転写および翻訳によりイン
サイチュで生成された標的タンパク質の使用を包含す
る。この方法は:a)標的吸着体を含む基材を提供する工
程;b)複数の異なる遺伝子パッケージを含む提示ライブ
ラリーを提供する工程であって、異なる遺伝子パッケー
ジの各々がポリペプチド物質をコードするヌクレオチド
配列を含むポリヌクレオチドを含み、そして異なる遺伝
子パッケージの各々が、コードされたポリペプチド物質
が提示される表面を有する、工程;c)基材を溶離条件下
で提示ライブラリーに曝露して、ポリペプチド物質と標
的吸着体との間を特異的結合させる工程であって、これ
によりポリペプチド物質を含む遺伝子パッケージが基材
上に保持される工程;およびd)基材上に保持された遺
伝子パッケージを脱離スペクトロメトリによって検出す
る工程。
はファージ提示ライブラリーである。他の実施態様にお
いて、ファージはM13である。他の実施態様において、
ポリペプチドは単鎖抗体である。他の実施態様におい
て、標的被分析物は、異なる表現型の細胞間で示差的に
発現されるポリペプチド被分析物である。他の実施態様
において、基材は細胞または細胞表面を含む。
提供する工程は:i)吸着体を含む基材を提供する工程で
あって、ここで吸着体が標的被分析物をある溶離条件下
で保持する、工程;およびii)吸着体を上記溶離条件
下、標的被分析物に曝露して、標的被分析物を吸着体に
よって保持させる工程であって、ここで標的被分析物が
標的吸着体になる工程、を包含する。1つの実施態様に
おいて、標的被分析物は標的ポリペプチドであり、そし
て吸着体を曝露する工程ii)は、標的ポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドのインビトロ翻訳によって標
的ポリペプチドをインサイチュで吸着体上に産生する工
程を包含し、そしてさらにポリヌクレオチド配列をイン
サイチュで基材上で増幅する工程を包含し得る。
oring)ポリペプチドに結合する吸着体、および(2)
固定化ポリペプチドを提示する表面を有する少なくとも
1つの標的遺伝子パッケージを含み、この標的遺伝子パ
ッケージは標的吸着体をコードするヌクレオチド配列を
含むポリヌクレオチドを含み、ここで標的遺伝子パッケ
ージは固定化ポリペプチドを介して吸着体に結合する。
の工程を包含する:ポリペプチド物質をコードするヌク
レオチド配列を配列決定する工程;保持された遺伝子パ
ッケージを単離する工程またはポリペプチド物質を産生
する工程。
ための基材を提供し、この基材は遺伝子パッケージの表
面上に提示された固定化ポリペプチドに結合する吸着体
を含み、ここで遺伝子パッケージの表面はさらに標的ポ
リペプチドを提示し、そしてここで遺伝子パッケージは
標的ポリペプチドをコードするヌクレオチドを含むポリ
ヌクレオチドを含む。
を検出するための方法を提供する。この方法は:a)脱離
スペクトロメトリで使用するための吸着体を含む基材を
提供する工程;b)基材を、ポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド、およびポリヌクレオチドのインビトロ
翻訳のための物質と接触させる工程であって、ここでポ
リペプチドが産生される、工程;c)基材を溶離物に曝露
して、ポリペプチドを吸着体によって保持させる工程;
およびd)保持されたポリペプチドを脱離スペクトロメ
トリによって検出する工程、を包含する。ポリペプチド
の検出により、ポリヌクレオチドの翻訳の検出が提供さ
れる。
む基材を示す。このストリップは引力(疎水性、イオン
性、配位共有、および混合機能)を基準にして分類され
る6つの異なるセットの吸着剤を含む。このストリップ
は、各型の吸着体ごとに数個のスポットを含み、これら
のスポットは異なる溶離物で異なる時点に問い合わせす
ることを可能とし、あるいはこれらのスポットは記録お
よび次の分析のためである。
相互作用ポテンシャル)の直交アレイを示す。アレイは
またプレートの形状をとり得る。アレイは種々の吸着体
を含む。被分析物に曝露すると、各ストリップは種々の
溶離物(選択性閾値調節物)で洗浄され得る。異なる選
択条件下で保持される被分析物により、保持マップまた
は認識プロファイルが得られる。
による被分析物の定量分析、および脱離した被分析物の
レーザー脱離質量スペクトロメトリによる定量的検出を
表す。
ために使用され得るソフトウェアを実行するために使用
されるコンピュータシステムの例を示す。図4Aはコンピ
ュータシステム1を示し、これはモニター3、スクリー
ン5、キャビネット7、キーボード9、およびマウス11
を含む。マウス11はマウスボタン13のような1つ以上の
ボタンを有し得る。キャビネット7はCD−ROMドライブ1
5およびハードドライブ(図示せず)を収納し、これは
本発明を取り入れたコードを含むコンピュータプログラ
ムを記録し、そして検索するために利用され得る。CD−
ROM17がコンピュータで読みとり可能な記憶媒体として
図示されるが、コンピュータを読みとり可能な他の記憶
媒体(フロッピーディスク、DRAM、ハードドライブ、フ
ラッシュメモリ、テープなどを包含する)も利用され得
る。キャビネット7はまた、プロセッサ、メモリなどの
普通のコンピュータ構成要素(図示せず)も収納する。
用され得るソフトウェアを実行するために使用されるコ
ンピュータシステム1のシステムブロックダイアグラム
を示す。図4Aに示すように、コンピュータシステム1
は、モニター3およびキーボード9を含む。コンピュー
タシステム1はさらに、セントラルプロセッサ102、シ
ステムメモリ104、I/Oコントローラ106、ディスプレイ
アダプタ108、リムーバブルディスク112、固定ディスク
116、ネットワークインターフェース118、およびスピー
カ120のようなサブシステムを含む。リムーバブルディ
スク112は、フロッピー、テープ、CD−ROM、リムーバブ
ルハードドライブ、フラッシュメモリ等のようなリムー
バブルなコンピュータで読みとり可能な媒体を代表す
る。固定ディスク116は内部ハードドライブ、DRAMなど
を表す。本発明での使用に適した他のコンピュータシス
テムは、追加の、あるいはより少ないサブシステムを含
み得る。例えば、他のコンピュータシステムは1つより
多くのプロセッサ102(すなわち、マルチプロセッサシ
ステム)またはメモリキャッシュを含み得る。
溶離物を含む選択条件下でのリゾチームの保持マップを
示す。
分析物の低分子量および高分子量での分離を示す。
るヒト血清中の被分析物の低分子量および高分子量での
分離を示す。
による早期児の尿の低分子量および高分子量での分離を
示す。
離物を用いた初期小児尿中の被分析物の分離を示し、そ
の結果、1つの被分析(*)物がTween洗浄条件で選択
的に保持されることが発見された。
培地中の被分析物の分離を示す。
物によって定義される選択条件に曝露された早期児尿の
複合保持マップを示す。
(pIおよび見かけ上の分子量)を示す。
ク質を有するファージについてのファージ提示ライブラ
リーでのパニング法を示す。上に示す基材は、ほんのわ
ずかの特異的に結合するファージでさえも、そのファー
ジが含む多くのコートタンパク質の検出によって脱離ス
ペクトロメトリで検出され得ることを示す。下では、い
くつかの吸着体スポットを有する基材が、標的被分析物
が特異的に結合されるように開発される。ファージはこ
れらのスポットに曝露される。結合したファージが脱離
スペクトロメトリによって検出される。他のスポットに
結合したファージは単離され得、そして増殖され得る。
用するための標的タンパク質をドッキングするために、
パニング法で同定されたリガンド物質(この場合には一
本鎖抗体)をどのようにして吸着体として用い得るかを
示す。標的はインサイチュで精製され(スポット2)、
そしてファージ提示ライブラリーをパニングするために
使用される(スポット4)。一本鎖抗体を単離し、そし
て基材(スポット6)に吸着体として付着させる。次い
で、標的が一本鎖抗体に吸着される。この標的がここ
で、タンパク質−タンパク質相互作用の研究のためにド
ッキングされる(スポット8)。
合には一本鎖抗体)への結合を妨害する能力についてス
クリーニングするための方法を示す。標的タンパク質に
対して特異的な一本鎖抗体を、例えば、それ自体がタン
パク質Aまたはタンパク質Gを介してドッキングされ得
る抗ファージ抗体を介して、基材上のスポットにドッキ
ングさせる。一本鎖抗体を標的タンパク質および薬物候
補に曝露する。薬物が被分析物タンパク質に結合する能
力、およびリガンドと被分析物との結合を妨害する能力
を、脱離スペクトロメトリーでモニターする。
を妨害する能力についてスクリーニングするための方法
を示す。この方法は、薬物が、それ自体がリガンドと結
合することによって被分析物の結合を妨害する能力を脱
離スペクトロメトリでモニターすること以外は、前図に
示した方法と同様である。
質1)と二次的リガンド(標的タンパク質II)との結合
を妨害する能力についてスクリーニングするための方法
を示す。前の2つの図のように、標的は基材とドッキン
グしてそれ自体がリガンドの吸着体となる。この場合、
被分析物は一本鎖抗体を介してドッキングされる。次い
で、標的をリガンドおよび薬物候補に曝露する。薬物
が、被分析物とリガンドとの間の結合を(例えば、標的
被分析物に結合することによって)妨害する能力を、脱
離スペクトロメトリーでモニターする。
の同定から始まり、脱離スペクトロメトリによる検出の
ためのポリペプチドを特異的に結合するための診断プラ
ットフォームの作製に終わる、フローチャートを示す。
保持マップを示す。図19A:アニオン性吸着体;図19B:順
相吸着体;図19C:Ni(II)吸着体;図19D:疎水性吸着
体。
的分離を示す。各場合の吸着体はアニオン性吸着体であ
る。図20A:第1工程において、試料を曝露した後、スポ
ットを150μlの20mMリン酸ナトリウム、0.5M塩化ナト
リウム、pH7.0で洗浄した。第2工程において、吸着体
および溶離物のリン酸ナトリウム特性を特性の定常セッ
トに加えた。新規の溶離特性を加えた。図20B:20mMリン
酸ナトリウム、pH7.0に加えて、スポットを0.05%Trito
n X100および0.15M NaCl(全体で150μl)で洗浄し
た。図20C:20mMリン酸ナトリウム、pH7.0に加えて、ス
ポットを100mMイミダゾール、0.15M NaCl(全体で150μ
l)で洗浄した。
間の比較の結果を示す。図21A:吸着体アレイCu(II)部
位上の正常血清の保持マップ。図21B:吸着体アレイCu
(II)部位上の疾患血清の保持マップ。図21C:両血清試
料の保持被分析物を重ね合わせ様式で組み合わせられ
る。表示を単純化するために、保持被分析物の各ピーク
を直線に変換し、点線が正常血清から保持された被分析
物を表し、そして実線が疾患血清から保持された被分析
物を表す。図21D:2つの試料間の差異をよりはっきりと
識別するために、比較プロットを作製する。ここで試料
から保持された被分析物の比を計算し、そして示した。
「*」でマークされた2つの被分析物が、疾患血清中の
有意な増加を示す(5〜10倍の増加)。
されたマウスの尿のCu(II)吸着体上での保持マップの
比較、ならびに疾患および薬物処置尿中のマーカーの量
の定量を示す。
ットで示される、4人のヒトガン患者からの尿中の被分
析物の保持マップを示す。患者1、2および3の間の示
差マップは、これらの患者において増大した量で存在す
る2つの共通の被分析物を示す。
よる、遺伝子VIIIコートタンパク質の検出を通じてのM1
3ファージの検出を示す。オリジナルの1012ファージ/ml
の希釈は1:10から1:100,000,000の範囲である。
離スペクトロメトリによるM13の捕捉を示す。図22Aは遺
伝子VIIIおよび遺伝子IIIタンパク質を表すピークによ
るM13ファージの捕捉を示す。図22Bは、抗体吸着体(一
重(singly)および二重(doubly)チャージを示すピー
クを示すコントロールである。
の、tatタンパク質吸着体による吸着を示す。単一の強
度を1:10から1:10,000のファージ希釈下で示す。
合タンパク質に結合したTGF−βの、1μg/ml(図27A)
および100ng/ml(図27B)での保持マップを示す。実線
は遊離のTGF−βレセプターの非存在下での結合を示
す。点線はTGF−βレセプターの存在下での結合を示
す。
力を示す。図28A−28Cは、疎水性、カチオン性、および
Cu(II)吸着体を用いたHemophilus溶解物からのタンパ
ク質の分離を、0kDから30kDの分子量で示す。各保持被
分析物は直線で示され、直線の高さは保持被分析物の強
度を示す。図29A−29Cは、疎水性、カチオン性、および
Cu(II)吸着体を用いたHemophilus溶解物からのタンパ
ク質の分離を、約30kDから約100kDの分子量で示す。図3
0は、3種の吸着体の各々による0kDから30kDのHemophil
usタンパク質から組み合わせた分離を示す。図31は、3
種の吸着体の各々による20kDから100kDのHemophilusタ
ンパク質から組み合わせた分離を示す。
示す。
ッキングしたGST融合レセプターとの結合(図33A)、お
よびリガンドとGST融合レセプターを含まないコントロ
ールアレイとの結合が存在しないこと(図33B)を示
す。
技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業
者に普通に理解される意味を有する。以下の参考文献
は、当業者に、本発明で使用される多くの用語の一般的
な定義を提供する。Singleotnら、DICTIONARY OF MICRO
BIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(第2版、1994);THE
CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCEIENCE AND TECHNOLOGY(W
alker編,1988);THE GLOSSARY OF GENETICS第5版,R.Ri
egerら(編),Spring Verlag(1991);およびHale &
Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY(1
991)。本明細書において、以下の用語は特に指示のな
い限り、これらに依る意味を有する。
れる、試料の成分をいう。この用語は試料中の単一の成
分または成分のセットをいい得る。
う。用語「吸着体」は本明細書において、被分析物が曝
露される単独の材料(「モノプレックス吸着体」)(例
えば、化合物または官能基)、および試料が曝露される
複数の異なる材料(「マルチプレックス吸着体」)の両
方をいう。マルチプレックス吸着体中の吸着体材料を
「吸着体種」という。例えば、基材上のアドレス可能な
位置は、異なる結合特性を有する多くの異なる吸着体種
(例えば、アニオン交換材料、金属キレート剤、または
抗体)で特徴づけられるマルチプレックス吸着体を含み
得る。
前または後のいずれかの、吸着体と被分析物との間の検
出可能な結合をいう。
う。
定する化学的および物理的特徴をいう。2種の吸着体
は、もし同一の溶離条件下で同じ被分析物を異なる親和
性の程度で結合する場合、異なる結合特性を有する。結
合特性としては、例えば、塩で促進される相互作用の程
度、疎水性相互作用の程度、親水性相互作用の程度、静
電的相互作用の程度、および本明細書で記載される他の
ものが挙げられる。
う。
ために使用される物質(agent)(典型的には溶液)を
いう。溶離物はまた「選択性閾値調節剤」とも称され
る。
が被分析物と吸着体との間の吸着を媒介する能力を決定
する特徴をいう。2つの溶離物は、被分析物および吸着
体と接触させたときに、被分析物の吸着体に対する親和
性の程度が異なる場合、異なる溶離特性を有する。溶離
特性としては、例えば、pH、イオン強度、水構造の改
変、界面活性剤強度、疎水性相互作用の改変、および本
明細書で記載される他のものが挙げられる。
う。
特定の溶離特性を有する溶離物との組み合わせの特徴を
いい、これは溶離物で洗浄した後に吸着体に保持される
被分析物の特異性を決定する。
いう。
分子に引きつけられることを生じさせる化学的および/
または物理化学的特性をいう。
力の強さをいう(親和性としても知られる)。
または「被分析物の分離」は、試料中の少なくとも1つ
の被分析物の検出をいう。分離は、試料中の複数の被分
析物を分別し、そして次に示差的に検出することによる
検出を包含する。分離は、被分析物を混合物中の他の被
分析物から完全に区別することを必ずしも必要としな
い。むしろ、少なくとも2つの被分析物の間の識別を可
能とする任意の分別であれば十分である。
される被分析物の少なくとも1つの物理化学的特性(例
えば、分子量)を検出する様式での被分析物の分離をい
う。
をいう。ここで被分析物は被分析物を固定相から気相に
脱離させるエネルギーに曝露され、そして脱離した被分
析物またはその識別可能な部分は、被分析物を第2の固
定相上に捕捉する中間的工程を経ることなく、検出器で
直接検出される。
または量を同定することをいう。
による吸着をいう。
分析物の検出(必要に応じて、質量の検出を包含する)
を示すデータをいう。
分析物についての保持データを特定する値のセットをい
う。
析物の相対的保持を特定する値のセットをいう。
成される被分析物をいう。
たは物理的分解による生成物をいう。フラグメントは中
性またはイオン状態であり得る。
おける、検出可能な差異をいう。
たは生物由来の試料であり、細胞、組織または器官の溶
解物またはホモジネート、あるいは体液試料、例えば、
血液、尿または脳脊髄液を包含するがこれらに限定され
ない。
い、例えば、ステロイド、アミノ酸、ヌクレオチド、
糖、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、複合炭水化物ま
たは脂質をいう。
子のサイズに匹敵するサイズの有機分子をいう。この用
語は、有機バイオポリマー(例えば、タンパク質、核酸
など)を除外する。好ましい小有機分子は、約5000Daま
で、約2000Daまで、または約1000Daまでの範囲のサイズ
である。
い、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖ま
たはポリグリセリド(例えば、ジグリセリドまたはトリ
グリセリド)をいう。
リマー、関連する天然に存在する構造的改変体、および
ペプチド結合で連結したその合成の非天然アナログ、関
連する天然に存在する構造的改変体、およびその合成の
非天然アナログをいう。合成ポリペプチドは、例えば、
自動ポリペプチド合成機を用いて合成され得る。用語
「タンパク質」は典型的には大きなポリペプチドをい
う。用語「ペプチド」は典型的には短いポリペプチドを
いう。
されるポリマーをいう。ポリヌクレオチドは、天然に存
在する核酸、例えば、デオキシリボ核酸(「DNA」)お
よびリボ核酸(「RNA」)、ならびに核酸アナログを包
含する。核酸アナログは、非天然の塩基を含むアナロ
グ、天然に存在するホスホジエステル結合以外の他のヌ
クレオチドとの結合に関与するヌクレオチド、またはホ
スホジエステル結合以外の結合を介して結合する塩基を
含むものを包含する。従って、ヌクレオチドアナログ
は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエー
ト、ホスホロトリエステル、ホスホルアミデート、ボラ
ノホスフェート、メチルホスホネート、キラル−メチル
ホスホネート、2−O−メチルリボヌクレオチド、ペプ
チド−核酸(PNA)などを包含するが、これらに限定さ
れない。このようなポリペプチドは、例えば自動DNA合
成機を用いて合成され得る。用語「核酸」は典型的には
大きなポリヌクレオチドをいう。用語「オリゴヌクレオ
チド」は典型的には短いポリヌクレオチドをいい、一般
的には、約50ヌクレオチドを越えない。ヌクレオチド配
列がDNA配列(すなわち、A、T、G、C)によって繰
り返される場合、これはまた、RNA配列(すなわち、
A、U、G、C)を含み、ここで「U」が「T」を置換
すると理解される。
化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段によ
って検出可能な組成物をいう。例えば、有用な標識は、
32P、35S、蛍光色素、電子密度試薬、酵素(例えば、EL
ISAで一般に使用されるようなもの)、ビオチン−スト
レプトアビジン、ジオキシゲニン、ハプテン、およびタ
ンパク質(それに対する抗血清またはモノクローナル抗
体が入手可能なもの)、または標的に対して相補的な配
列を有する核酸分子を包含する。検出可能な部分はしば
しば、放射性シグナル、色素原性シグナル、または蛍光
シグナルのような測定可能なシグナルを発生し、これは
試料中の結合した検出可能な部分の量の定量のために使
用され得る。検出可能な部分は、プライマーまたはプロ
ーブに、共有結合的に、またはイオン結合、ファンデル
ワールス結合もしくは水素結合を介してのいずれかで取
り込まれ得るか、あるいは付加し得る。例えば放射性ヌ
クレオチド、またはストレプトアビジンで認識されるビ
オチン化ヌクレオチドが取り込まれる。検出可能な部分
は、直接的または間接的に検出され得る。間接的検出
は、この検出可能な部分に第2の直接的または間接的に
検出可能な部分の結合を伴う。例えば、検出可能な部分
は、結合パートナーのリガンド(例えばビオチン(これ
はストレプトアビジンに対する結合パートナーであ
る))、またはヌクレオチド配列(これは相補的配列の
結合パートナーであり、これに対して特異的にハイブリ
ダイズし得る)であり得る。結合パートナーはそれ自体
直接的に検出可能であり得、例えば、抗体はそれ自体が
蛍光分子で標識され得る。結合パートナーはまた間接的
に検出可能であり、例えば、相補的ヌクレオチド配列を
有する核酸は分枝DNAの一部であり得、これが次に他の
標識された核酸分子とのハイブリダイゼーションによっ
て検出可能となる。(例えば、PD.FahrlanderおよびA.K
lausner、Bio/Technology(1988)6:1165を参照のこ
と)。シグナルの定量は、例えば、シンチレーション計
数、デンシトメトリー、またはフローサイトメトリーに
よって達成される。
ら少なくとも1つの混入物を除去することを意味する。
精製は精製された化合物が100%純粋であることを必要
としない。
ある。
である。
数の免疫グロブリン遺伝子、またはそのフラグメントで
実質的にコードされるポリペプチドをいい、これはエピ
トープ(例えば、抗原)を特異的に結合および認識す
る。認識される免疫グロブリン遺伝子は、カッパおよび
ラムダ軽鎖定常領域遺伝子、アルファ、ガンマ、デル
タ、イプシロンおよびミュー重鎖定常領域遺伝子、およ
び無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。抗体
は、例えば、インタクトな免疫グロブリンとして、ある
いは種々のペプチダーゼでの切断によって生成する詳細
に特徴づけられる多数のフラグメントとして存在する。
これは、例えば、Fab'およびF(ab)'2フラグメントを
包含する。用語「抗体」は本明細書において、また、抗
体全体の改変によって生成された抗体フラグメント、ま
たは新規に組換えDNA方法論を用いて新規に合成された
ものも包含する。これはまた、ポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体を包含
する。抗体の「Fc」部分は、免疫グロブリンの重鎖部分
をいい、これは1つ以上の重鎖定常領域ドメイン、C
H1、CH2、およびCH3を含むが、重鎖可変領域を含まな
い。
リガンドまたはレセプターが、異種化合物の試料中の被
分析物の存在を決定する結合反応において機能する場合
に、化合物被分析物に対して「特異的に結合する」また
は「特異的に免疫反応性である」。従って、指定のアッ
セイ(例えば、イムノアッセイ)条件下で、リガンドま
たはレセプターは特定の被分析物に優先的に結合し、そ
して試料中に存在する他の化合物の有意な量とは結合し
ない。例えば、ポリヌクレオチドはハイブリダイゼーシ
ョン条件下で相補的配列を含む被分析物ポリヌクレオチ
ドに特異的に結合する;抗体は、イムノアッセイ条件下
で、その抗体が惹起されたエピトープを有する抗原被分
析物に特異的に結合する;そして吸着体は、適切な溶離
条件下で被分析物に特異的に結合する。
合物、未知組成物の試料、組合せ的な小分子アレイ、生
物学的巨大分子、バクテリオファージペプチド提示ライ
ブラリー、バクテリオファージ抗体(例えば、scFv)提
示ライブラリー、ポリソームペプチド提示ライブラリ
ー、あるいは細菌、植物、真菌、または動物細胞もしく
は組織のような生物学的材料から作製した抽出物をい
う。適切な技術は、ファージまたは同様のベクター中の
組換え抗体のライブラリーの選択を伴う。Huseら(198
9)Science 246:1275−1281;およびWardら(1989)Natu
re 341:544−546を参照のこと。Huseによって記述され
るプロトコルはファージ提示技術との組み合わせによっ
てより効率的になる。例えばDowerら、WO 91/17271およ
びMcCaffertyら、WO 92/01047を参照のこと。
しない配列を有するポリヌクレオチドをいう。増幅また
は組み立てられた組換えポリヌクレオチドを適切なベク
ターに入れてもよく、そしてこのベクターを用いて適切
な宿主細胞を形質転換し得る。組換えポリヌクレオチド
を含む宿主細胞を「組換え宿主細胞」という。次いで、
遺伝子を組換え宿主細胞中で発現させて、例えば「組換
えポリペプチド」を産生する。組換えポリヌクレオチド
は、また、非コーディング機能(例えば、プロモータ
ー、複製起点、リボソーム結合部位など)として作用し
得る。適切な単細胞宿主は、真核生物または哺乳類ポリ
ヌクレオチドの発現において日常的に使用される任意の
単細胞宿主を包含し、例えば、E.coliのような原核生
物;および例えば酵母のような真菌を含む真核生物;お
よび昆虫細胞(例えばSf9)および動物細胞(例えば、C
HO、R1.1、B−W、L−M、アフリカミドリザル腎臓細
胞(例えば、COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40およびBMT 1
0)および培養ヒト細胞)を包含する哺乳類細胞を包含
する。
チド配列であって、それに作動可能に連結したヌクレオ
チド配列の発現(転写および/または翻訳)を調節する
配列をいう。「作動可能に連結した」は、2つの部分の
機能的関係であって、1つの部分の活性(例えば、転写
を調節する能力)の結果、他の部分が作用する(例え
ば、配列の転写)ものをいう。発現調節配列は、例え
ば、プロモーター(例えば、誘導性、抑制性、または構
成的)、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コド
ン(すなわちATG)、イントロンのためのスプライシン
グシグナル、および終止コドンの配列を包含し得るが、
これらに限定されない。
作動可能に連結した発現制御配列を含む組換えポリヌク
レオチドを含むベクターをいう。発現ベクターは、発現
のための十分なシス作動性要素を含む;発現のための他
の要素は宿主細胞またはインビトロ発現系によって補充
され得る。発現ベクターは当該分野で公知の全てのベク
ター、例えば、コスミド、プラスミド(例えば、裸の、
あるいはリポソーム中に含まれた)および組換えポリヌ
クレオチドを取り込んだウイルスである。
子、cDNA、またはmRNA)中の特定のヌクレオチド配列
が、定義されたヌクレオチドの配列(すなわち、rRNA、
tRNAおよびmRNA)または定義されたアミノ酸の配列のい
ずれかを有し、そしてその結果得られる生物学的特性を
有する他のポリマーまたは巨大分子の生物学的プロセス
における合成のための鋳型として働く固有の特性をい
う。従って、遺伝子によって産生されるmRNAの転写また
は翻訳によって、細胞中または他の生物学的系中でタン
パク質が産生される場合、その遺伝子はタンパク質をコ
ードする。遺伝子またはcDNAのコード鎖(そのヌクレオ
チド配列がmRNA配列と同一であり、そして通常、配列表
として提供される)および非コード鎖(転写の鋳型とし
て使用される)の両方が、タンパク質、あるいはその遺
伝子またはcDNAの他の産物をコードすると称され得る。
特に指示のない限り、「アミノ酸配列をコードするヌク
レオチド配列」は、互いに縮重したバージョンであっ
て、同じアミノ酸配列をコードする、全てのヌクレオチ
ド配列を包含する。タンパク質およびRNAをコードする
ヌクレオチド配列はイントロンを含み得る。
エネルギー源からエネルギーを吸収して、それによりプ
ローブ表面からの被分析物の脱離を可能とする分子をい
う。MALDIで使用されるエネルギー吸収分子はしばしば
「マトリクス」と称される。ケイ皮酸誘導体、シナピン
酸(cinapinic acid)、およびジヒドロキシ安息香酸
が、生体有機分子のレーザー脱離におけるエネルギー吸
収分子としてしばしば使用される。
次元分離のための方法である。この方法は、(1)複数
の異なる吸着体/溶離物の組み合わせ(「選択条件」)
下で、試料中から被分析物を基材に選択的に吸着する工
程、および(2)吸着された被分析物の保持を脱離スペ
クトロメトリによって検出する工程を包含する。各選択
条件は、第1の分別の次元を提供し、吸着されない被分
析物から、吸着された被分析物を分別する。脱離質量ス
ペクトロメトリは、第2の分別の次元を提供し、吸着し
た被分析物を質量に従って互いに分別する。被保持物ク
ロマトグラフィーは複数の異なる選択条件の使用を伴う
ので、多くの分別の次元が達成される。1つ以上の被分
析物の2つの選択条件下での相対的な吸着もまた決定さ
れ得る。この多次元分別は被分析物の分離およびその特
徴付けの両方を提供する。
物マップにドッキングしたままであり、これは試験(例
えば、被分析物の構造および/または機能)のためのさ
らなる操作をし易い。また、ドッキングした被分析物は
それ自体、基材に曝露される他の被分析物をドッキング
するための吸着体として使用され得る。要約すれば、本
発明は、被分析物の迅速、多次元かつ高度情報分離を提
供する。
様において、被分析物は2つの物理的に異なる位置で2
つの異なる吸着体に吸着され、そして各吸着体は同じ溶
離物(選択閾値調節物)で洗浄される。別の実施態様に
おいて、被分析物は2つの物理的に異なる位置で同一の
吸着体に吸着され、そして2つの異なる溶離物で洗浄さ
れる。別の実施態様において、被分析物は物理的に異な
る位置で2つの異なる吸着体に吸着され、そして2つの
異なる溶離物で洗浄される。別の実施態様において、被
分析物は吸着体に吸着され、そして第1の溶離物で洗浄
され、そして保持が検出される。次いで、吸着された被
分析物は第2の異なる溶離物で洗浄され、そして次に保
持が検出される。
に保持される被分析物は基材上でエネルギー源に対して
提示される。被分析物を含む試料を、吸着体を基材(こ
れは被分析物を脱離手段に提示するのに役立つ)に添加
する前または後に、吸着体に接触させ得る。接触の目的
のために、吸着体は液体形態または固体形態(すなわち
基材または固相上)であり得る。詳細には、吸着体は、
溶液、懸濁液、分散液、油中水型乳濁液、水中油型乳濁
液、またはミクロ乳濁液の形態であり得る。吸着体が懸
濁液、分散液、乳濁液またはミクロ乳濁液の形態で提供
される場合、適切な界面活性剤もまた存在し得る。この
実施態様において、試料は、液体試料が液体吸着体と混
合されることによって吸着体と接触され得る。あるい
は、試料は固体支持体上に提供され得、そして接触は、
試料を含む固体支持体を液体吸着体中に浸漬(bathin
g)、ソーキング、またはディッピングすることによっ
て達成される。さらに、試料は、固体支持体に液体吸着
体を吹き付けるか、または固体支持体を液体吸着体で洗
うことによって接触され得る。この実施態様において、
異なる吸着体は異なる容器中に提供され得る。
る。基材は吸着体を結合または保持し得る任意の材料で
あり得る。代表的には、基材は、ガラス;セラミック;
電気伝導性ポリマー(例えば、炭素化PEEK);TEFLON
コート材料;有機ポリマー;天然バイオポリマー;金属
(例えば、ニッケル、真鍮、鋼またはアルミニウム);
フィルム;多孔質および非多孔質の架橋ポリマーのビー
ズ(例えば、アガロース、セルロースまたはデキストラ
ン);他の不溶性ポリマー;またはそれらの組み合わせ
から構成される。
されるプローブまたは試料提示手段の形態をとる。例え
ば、図1を参照すると、基材はストリップの形態でをと
り得る。吸着体は基材にスポットの線状アレイの形態で
付着され得、これらの各々が被分析物に曝露され得る。
いくつかのストリップが互いに連結され、その結果複数
の吸着体が定義された列に不連続のスポットを有するア
レイ30を形成し得る。基材はまた、吸着体の水平および
垂直の列のアレイを有するプレートの形態であり得、こ
れは正方形、長方形または円のような規則的な幾何学的
パターンを形成する。
固体材料、例えば、ステンレス鋼、アルミニウムまたは
ケイ素ウエハであり得る。次いで、金属基材は表面が誘
導体化され得る材料でコートされ得る。例えば、金属表
面は酸化ケイ素、酸化チタンまたは金でコートされ得
る。
ーは1つの端に、表面上の官能基と供給結合し得る官能
基を含む。従って、官能基は無機酸化物または金のため
にはスルフヒドリル基であり得る。リンカーの他の端は
一般にアミノ官能基を有する。有用な二官能基リンカー
としては、アミノプロピルトリエトキシシランまたはア
ミノエチルジスルフィドが挙げられる。
する基でさらに誘導体化される。一般に、吸着体はプロ
ーブ上のアドレス可能な位置に付加される。1つのプロ
ーブの型では、直径約3mmのスポットが直交アレイで配
置される。吸着体はそれ自体が、利用可能なアミノ基と
反応する基および吸着体として作用する官能基を含む二
官能性分子の一部であり得る。官能基は、例えば、順相
(酸化ケイ素)、逆相(C18脂肪族炭化水素)、第四級
アミンおよびスルホネートを包含する。また、表面はさ
らにカルボジイミドおよびN−ヒドロキシスクシンイミ
ドのような他の二官能性分子で誘導体化され得、予備活
性化ブランクを作製する。これらのブランクは生体有機
吸着体(例えば、核酸、抗体および他のタンパク質リガ
ンド)で官能化され得る。バイオポリマーが、アミン残
基またはスルフヒドリル残基を通じてブランク上の官能
基に結合し得る。1つの実施態様において、吸着体は架
橋ポリマー(例えばフィルム)に結合し、架橋ポリマー
はそれ自体は、利用可能な官能基を通じてプローブの表
面に結合する。このようなポリマーは、例えば、セルロ
ース、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、
ポリアクリルアミドおよびこれらの混合物を包含する。
付着した吸着体を有するプローブは使用の準備ができて
いる。
せて固相(例えば、ポリマーまたはガラスのビーズ)を
提供し、これを次に第2の基材上に配置し、第2の基材
は、脱離検出器の脱離エネルギーに試料を提示する手段
として働く。例えば、第2の基材は、所定のアドレス可
能な位置に一連のウェルを有するプレートの形状であり
得る。ウェルは吸着体で誘導体化された第1の基材(例
えば、吸着体で誘導体化されたポリマー生ビーズ)のた
めの容器として働き得る。この実施態様の1つの利点
は、被分析物が第1の基材に1つの物理的状況で吸着さ
れ得、そして脱離スペクトロメトリによる分析のために
試料を提示する基材に移され得ることである。
た被分析物を検出するために本発明の方法で使用される
検出器での使用に適合する。1つの実施態様において、
基材は脱離検出器中に取り外し可能に挿入され得、脱離
検出器中でエネルギー源がスポットに当たり、そして被
分析物を脱離させ得る。基材は水平および/または垂直
に移動できるキャリッジへの装着に適切であり得、この
キャリッジが水平および/または垂直に基材を動かし、
エネルギー源の呼びかけおよびそこに結合した被分析物
の検出のためのパス中の吸着体の各所定のアドレス可能
な位置に連続的に配置する。基材は従来の質量スペクト
ロメトリプローブの形状であり得る。
の技術を用いて作製され得る。その後、被分析物を含む
試料と接触させる前に、吸着体を基材上に直接的または
間接的にカップリング、取り付け、または堆積し得る。
吸着体を、付着または固定化に適切な任意な手段によ
り、基材上に直接的または間接的にカップリングし得
る。例えば、吸着体は、基材を吸着体で誘導体化して、
吸着体が共有結合または非共有結合を通じて基材に直接
結合するようにすることによって、基材と直接カップリ
ングし得る。
れ得る。基材は、予め調製された吸着体分子を基材に付
着することによって、完全に調製された吸着体分子で誘
導体化され得る。あるいは、吸着体は、前駆体分子を基
材に付着させ、そして次の第1の前駆体分子によって基
材に結合した成長中の鎖にさらなる前駆体分子を付加す
ることによって、基材上に形成され得る。基材上に吸着
体を構築するこの機構は、吸着体がポリマー、特にDNA
またはRNA分子のようなバイオポリマーである場合、特
に有用である。バイオポリマー吸着体は、オリゴヌクレ
オチドチップ技術の分野で公知の方法を用いて、基材に
付着した最初の塩基に連続的に塩化を付加することによ
って提供され得る。例えば、米国特許第5,445,934号(F
odorら)を参照のこと。
および10、100、1000、10,000個以上の程度の多くの吸
着体が単一の基材にカップリングされ得る。吸着体部位
のサイズは、実験設計および目的に応じて変化し得る。
しかし、衝突エネルギー源の直径(例えば、レーザース
ポット直径)より大きい必要ははい。スポットは同じま
たは異なる吸着体に続き得る。いくつかの場合において
は、同じ吸着体を基材上の複数の位置に提供して、複数
の異なる溶離物に対する評価を可能にするか、あるいは
その結果、結合した被分析物を将来の使用、またはおそ
らく二次処理における参照のために保存し得ることが有
利である。複数の異なる吸着体を有する基材を提供する
ことによって、単一の試料に関して異なる吸着体の組み
合わせによって提供される複数の結合特性を利用し、そ
してそれによって、より広範囲の異なる被分析物を結合
し、かつ検出することが可能である。単一の試料の評価
のために基材上の複数の異なる吸着体を使用すること
は、各々異なるクロマトグラフィーカラムを用いる複数
のクロマトグラフィー実験を同時に行うことと本質的に
等価であるが、本発明はただ一つの系のみが必要とされ
るという利点を有する。
レス可能な位置に提供することが特に有用である。所定
のアドレス可能な位置に吸着体を提供することによっ
て、第1の所定のアドレス可能な位置の吸着体を第1の
溶離物で洗浄し、そして第2の所定のアドレス可能な位
置の吸着体を第2の溶離物で洗浄することが可能とな
る。この様式において、被分析物に対する単一の吸着体
の結合特性を複数の溶離物の存在下で評価することがで
きる。複数の溶離物の各々は吸着体の結合特性を異なる
仕方で選択的に改変する。アドレス可能な位置は任意の
パターンに配列され得るが、好ましくは、規則的なパタ
ーン、例えば、線、直交アレイ、または円のような規則
的な曲線で配置される。同様に、基材が複数の異なる吸
着体を含む場合、溶離物の存在下で所定の吸着体の結合
特性を評価するために、異なる各吸着体に関して単一の
溶離物を評価することが可能である。異なる溶離物の存
在下で異なる吸着体の結合特性を評価することもまた可
能である。
数の異なるポリマー吸着体を合成することによって提供
され得る。異なるポリマー吸着体は、前駆体分子を基材
に付着し、重合反応を開始し、そして各吸着体について
異なる完了程度で重合反応を停止することによって提供
され得る。また、ポリマーの末端官能基は、異なる親和
性試薬(例えば、−NH3、またはCOO-)で異なる程度ま
でこれらを化学的に誘導体化するように反応され得る。
重合または誘導体化反応を停止することによって、異な
る重合度または誘導体化度の吸着体が生成される。異な
る重合度または誘導体化度は異なる各ポリマー吸着体に
ついて異なる結合特性を提供する。この実施態様は、複
数の異なるバイオポリマー吸着体を基材上に提供するた
めに特に有用である。
容器中で行われ得る。例えば、異なる結合特性のポリマ
ー吸着体が、重合/誘導体化反応が進行するにつれ反応
容器から生成物のアリコートを抽出することによって提
供され得る。重合/誘導体化反応の間の種々の時点で抽
出されたアリコートは、種々の重合/誘導体化の程度を
示し、複数の異なる吸着体を生じる。次に、生成物の異
なるアリコートを、異なる結合特性を有する吸着体とし
て利用し得る。あるいは、反応の停止工程、生成物のア
リコートを抜き取る工程、および重合/誘導体化反応を
再度開始する工程を連続的に繰り返すことによって、複
数の異なる吸着体を提供し得る。各停止時点で抽出され
た生成物は異なる程度の重合/誘導体化を示し、そして
その結果、異なる結合特性を有する複数の吸着体が提供
される。
レートの形状で提供され、基材は1つ以上の結合特性が
一次元または二次元の勾配で変化した吸着体でコートさ
れる。例えば、一端では疎水性が弱い、他の一端では疎
水性が強い吸着体を有するストリップが提供される。あ
るいは、1つの角では疎水性およびアニオン性が弱く、
そして対角線上に対向する角では疎水性およびアニオン
性が強いプレートが提供される。このような吸着勾配
は、被分析物の定量分析に有用である。吸着勾配は、制
御された吹き付け塗布によって、あるいは材料を、時間
の経過につれて勾配の次元に対する反応の完了の漸増を
可能にするような様式で表面に流すことによって作製さ
れ得る。このプロセスを正しい角度で繰り返して、異な
る結合特性を有する同じまたは異なる吸着体の直交勾配
を提供し得る。
または後のどちらかに、被分析物と吸着体との間の結合
を可能とする任意の適切な方法を用いて吸着体と接触さ
せ得る。吸着体は試料と単に混合または合わされ得る。
試料は、基材を試料中に浸漬もしくはソーキングするこ
とにより、または基材を試料中にディッピングすること
により、または試料を基材上に吹き付けることにより、
試料を基材上で洗浄することにより、または試料もしく
は被分析物を吸着体と接触させることによって、吸着体
と接触し得る。さらに、試料は、試料を溶離物中に溶解
するか、あるいは試料を溶離物と混合し、そしてこの溶
離物および試料の溶液を任意の上記の技術(すなわち、
浸漬、ソーキング、ディッピング、吹き付け、または洗
浄)を用いて吸着体と接触させることによって、吸着体
と接触し得る。
露することは、吸着体の選択性を改変し、同時に試料を
吸着体に接触させる効果を有する。吸着体に結合し、そ
れにより保持される試料の成分は、吸着体の選択性を改
変する溶離特性の非存在下で吸着体に結合する全ての成
分ではなく、むしろ試料と合わされた特定の溶離物の存
在下で吸着体に結合する成分のみを含む。
間、吸着体に接触させるべきである。代表的には、試料
を、約30秒から約12時間の間、吸着体に接触させる。好
ましくは、試料を、約30秒から約15分間の間、吸着体に
接触させる。
選択される吸着体の関数である。代表的には、試料を周
囲の温度および圧力条件下で吸着体と接触させるが、い
くつかの試料については、改変された温度(代表的には
4℃から37℃)および圧力条件が所望され得、そしてこ
れは当業者によって容易に決定され得る。
が数多くの異なる実験を非常に少量の試料で行うことを
可能とすることである。一般に、吸着体の結合のために
は、1μlから500μl中に数原子モルから100ピコモル
の被分析物を含む容量の試料で十分である。被分析物
は、吸着体に結合させた後、将来の実験のために保存さ
れ得る。なぜなら保持された被分析物の全ての脱離工程
および検出工程に供されなかった任意の吸着体位置は、
その上に被分析物を保持するからである。従って、試料
の非常に少量しか分析のために利用できない場合、本発
明は、試料を無駄にすることなく、異なる回数で行われ
る異なる吸着体および/または溶離物を用いる多数の実
験を可能とするという利点を提供する。
吸着体に結合した後、吸着体を溶離物で洗浄する。代表
的には、多次元分析を提供するために、各吸着体位置を
少なくとも第1および第2の異なる溶離物で洗浄する。
溶離物による洗浄は、特定された吸着体上に保持された
被分析物の集団を改変する。吸着体の結合特性と溶離物
の溶離特性との組み合わせが、洗浄後に吸着体によって
保持される被分析物を制御する選択条件を提供する。し
たがって、洗浄工程は吸着体から試料成分を選択的に除
去する。
上述のように、試料を吸着体に接触させる前に、試料を
第1の溶離物中に溶解するか、あるいは試料を第1の溶
離物と混合し得る。試料を吸着体に接触させる前または
それと同時に、試料を第1の溶離物に曝露することは、
被分析物を吸着体と結合させ、そして次に吸着体を第1
の溶離物で洗浄することと同じ正味の効果を一次近似の
程度まで有する。合わせた溶液を吸着体に接触させた
後、吸着体を第2のまたは次の溶離物で洗浄し得る。
よびその上に結合した被分析物を有する基材を溶離物中
に浸漬、ソーキング、またはディッピングする事によっ
て達成され得る。または基材を溶離物でリンスし、基材
に溶離物を吹き付け、もしくは溶離物で洗浄することに
よって達成され得る。親和性試薬の直径の小さなスポッ
トに溶離物を導入することは、ミクロ流体工学(microf
luidics)プロセスによって最もよく達成される。
複数の異なる溶離物が洗浄工程で用いられる場合、各溶
離物の存在下での吸着体の選択性に関する情報が独立し
て得られ得る。1つの位置で吸着体に結合した被分析物
は、溶離物による各洗浄の後、第1の溶離物による洗
浄、保持された被分析物の脱離および検出、次いで第2
の溶離物による洗浄、および保持された被分析物の脱離
および検出の繰り返しパターンに従って決定され得る。
洗浄とその後の脱離および検出の工程は、同じ吸着体を
用いて複数の異なる溶離物について連続的に繰り返され
得る。この様式において、単一の位置に保持された被分
析物を有する吸着体は、複数の異なる溶離物で再試験さ
れて、個々の各洗浄の後に保持された被分析物に関する
一群の情報が提供され得る。
能な位置に提供される場合(吸着体が全て同一の場合、
または異なる場合のいずれでも)にも有用である。しか
し、被分析物が複数の位置の同じまたは異なる吸着体の
いずれかに結合する場合、洗浄工程は、代わりに、より
平行処理を伴う系統的かつ効率的なアプローチを用いて
行われ得る。すなわち、洗浄工程は、第1の位置で溶離
物を吸着体を洗浄し、次に第2の吸着体を溶離物で洗浄
し、次に第1の吸着体に保持された被分析物を脱離およ
び検出し、そしてその後第2の吸着体で保持された被分
析物を脱離および検出することによって行われ得る。換
言すれば、全ての吸着体を溶離物で洗浄し、そしてその
後、各々によって保持された被分析物を吸着体の各々の
位置について脱離および検出する。所望であれば、各吸
着体位置での検出の後、各吸着体位置について第2の洗
浄段階を実行し得、次いで第2の脱離および検出段階を
実行し得る。全ての吸着体位置の洗浄、次いで各吸着体
位置での脱離および検出の工程が、複数の異なる溶離物
について繰り返され得る。この様式で、アレイ全体が試
料中の被分析物の性質の効率的な決定のために利用され
得る。この方法は、全ての吸着体位置を第1の洗浄段階
で同じ溶離物で洗浄する場合でも、あるいは複数の吸着
体を第1の洗浄段階で複数の異なる溶離物で洗浄する場
合でも、有用である。
着される。基材上に保持される被分析物は、以下の脱離
スペクトロメトリにより検出される:吸着体から被分析
物を脱離する工程および脱離した被分析物を直接検出す
る工程。
ネルギー源に曝露することを伴う。通常、このことは、
被分析物に放射エネルギーまたはエネルギー粒子を衝突
させることを意味する。例えば、エネルギーはレーザー
エネルギー(例えばUVレーザー)またはフラッシュラン
プからのエネルギーの形態の光エネルギーであり得る。
あるいは、エネルギーは高速原子の流れであり得る。熱
もまた、脱離の誘導/補助のために使用され得る。
する方法が当該分野で周知である。このような方法の1
つはマトリクス補助(matrix−assisted)レーザー脱離
/電離、すなわちMALDIと呼ばれる。MALDIでは、被分析
物溶液をマトリクス溶液と混合し、そして混合物を不活
性プローブ表面上に堆積させた後に結晶化させ、被分析
物を結晶中にトラップすることで脱離が可能となり得
る。マトリクスは、レーザーエネルギーを吸収し、そし
てそのエネルギーを被分析物に明らかに与え、その結果
脱離および電離が生じるように選択される。一般に、マ
トリクスはUV範囲で吸収する。大きいタンパク質のため
のMALDIは、例えば、米国特許第5,118,937号(Hillenka
mpら)および米国特許第5,045,694号(Beavisおよびcha
it)に記載される。
(すなわちSELDI)は、特異性、選択性および感度の点
で、MALDIに対して顕著な進歩を示す。SELDIは米国特許
第5,719,060号(HutchensおよびYip)に記載される。SE
LDIは脱離のための固相法であり、ここで被分析物は表
面上でエネルギー流に対して提示され、これが被分析物
の捕捉および/または脱離を増強する。対照的に、MALD
Iは液相法であり、ここで被分析物は液体材料と混合さ
れ、この液体材料が被分析物の周囲に結晶化する。
のバージョンは、被分析物を親和性捕捉装置(すなわち
吸着体)とともに脱離エネルギーに対して提示すること
を伴う。被分析物がそのように吸着される場合、被分析
物は、脱離エネルギー源に対して、標的被分析物の脱離
を達成する機会がより増すように提示され得ることが見
いだされた。エネルギーを吸収する材料が、プローブに
付加されて脱離を補助し得る。次にプローブを、被分析
物を脱離するためのエネルギー源に対して提示する。
バージョンは、被分析物がその上に配置されるエネルギ
ー吸収材料の層の使用を伴う。基材表面は、その表面に
化学的に結合し、そして/あるいは本質的に結晶を含ま
ないエネルギー吸収分子の層を含む。次に被分析物を単
独(すなわちニート)で層の表面に付与し、実質的にこ
れと混合しない。エネルギー吸収分子は、マトリクスの
ように脱離エネルギーを吸収し、そして被分析物の脱離
が引き起こされる。この改良は、実質的なものである。
なぜなら、被分析物がここでエネルギー源に対してより
単純かつより均一な様式で提示され得るからである。な
ぜなら、溶液混合物の性能およびランダムな結晶化が除
外されるからである。これにより、より均一かつ予想可
能な結果が提供され、これによりプロセスの自動化が可
能となる。エネルギー吸収材料は古典的なマトリクス材
料であり得るか、またはそのpHが中和されたかもしくは
塩基性範囲にされたマトリクス材料であり得る。エネル
ギー吸収分子は、共有結合的または非共有結合的手段を
通じてプローブに結合し得る。
ELDIの別のバージョンは感光性結合分子の使用を伴う。
感光性結合分子は、固相(例えば、平板なプローブ表面
またはプローブの一部を構成し得る別の固相(例えばビ
ーズ))に共有結合する1つの部位、および親和性試薬
または被分析物に共有結合し得る第2の部位を有する二
価分子である。感光性結合分子は、表面および被分析物
の両方に結合する場合、光に曝露したときに親和性試薬
または被分析物を放出し得る感光性結合も含む。感光性
結合は、結合分子内にあり得るか、または被分析物(ま
たは親和性試薬)もしくはプローブ表面のいずかに対す
る結合部位にあり得る。
れ得る。被分析物が脱離プロセス(例えばレーザー脱離
/電離質量スペクトロメトリ)で電離される場合、検出
器はイオン検出器であり得る。質量スペクトロメトリ
は、一般に、脱離イオンの飛行時間を決定する手段を含
む。この情報は質量に変換される。しかし、脱離イオン
を分離および検出するために脱離イオンの質量を決定す
る必要はない。電離した被分析物が検出器に異なる時間
で衝突する事実により、それらの検出および分離が提供
される。
性部分で検出可能に標識され得る。これらの場合、検出
器は蛍光検出器または放射能検出器であり得る。
よび被保持物に関連する機能をアレイの各位置で十分に
呼びかけし得る。
手段、および脱離した被分析物を直接検出する手段を含
む。すなわち、脱離検出器は、別の固相中に被分析物を
捕捉する中間工程およびそれを次の分析に供する工程を
伴わずに、脱離した被分析物を検出する。被分析物の検
出は通常、シグナル強度の検出を伴う。これは、次に
は、吸着体に吸着した被分析物の量を反映する。
また有し得る。このような要素の1つは、脱離した被分
析物を検出器に向かって加速する手段である。別の要素
は、脱離から検出器による検出までの被分析物の飛行時
間を決定するための手段である。
トロメーターであり、これは当該分野で周知である。質
量スペクトロメーターは、吸着した被分析物を運ぶ基材
(例えば、プローブ)を挿入するポートを含む。脱離
は、被分析物にレーザーエネルギーのようなエネルギー
を衝突させることによって達成される。装置は、アレイ
上の任意のスポットがレーザービームのライン中に運ば
れるように、表面を移動する手段を含み得る。被分析物
にレーザーを当てると、その結果、無傷の被分析物が飛
行管中に脱離し、そして電離する。飛行管は一般に真空
スペースを規定する。真空管中の一部にある帯電したプ
レートが電位を形成し、これが電離した被分析物を検出
器に向けて加速する。時計により飛行時間を測定し、そ
して系のエレクトロニクスにより被分析物の速度を決定
し、そしてこれを質量に変換する。当業者が理解するよ
うに、任意のこれらの要素が、脱離、加速、検出、時間
測定などの種々の手段を使用する脱離検出器のアセンブ
リ中で、本明細書に記載される他の要素と組み合わされ
得る。
び認識プロファイルの形態での被分析物についての情報
の両方を提供する、種々の異なる結合および溶離条件に
被分析物を曝露する能力である。従来のクロマトグラフ
方法におけるように、吸着体が被分析物を保持する能力
は、溶離物に対する被分析物のまたは吸着体に対する溶
離物の引力または親和性と比較した、吸着体に対する被
分析物の引力または親和性に直接関連する。試料のいく
つかの成分は吸着体への親和性を有し得ず、したがって
試料が吸着体に接触する場合に吸着体に結合しない。吸
着体に結合することが不可能であるため、これらの成分
は、分離されるべき被分析物からすぐに分別される。し
かし、試料および利用される特定の吸着体の性質に依存
して、多くの異なる成分は、最初に吸着体に結合し得
る。
着体は、被保持物クロマトグラフィーに用いられ得る。
異なる吸着体は、大きく異なる結合特性、幾分異なる結
合特性、または微妙に異なる結合特性を示し得る。大き
く異なる結合特性を示す吸着体は、代表的には、引力の
基礎または相互作用の態様が異なる。引力の基礎は、一
般的に、化学物または生物学的分子認識の機能である。
吸着体と被分析物との間の引力についての基礎は、例え
ば、(1)塩促進された相互作用、例えば、疎水性相互
作用、親硫黄性相互作用、および固定された染料相互作
用;(2)水素結合および/またはファンデルワールス
力相互作用、および電荷移動相互作用、例えば、親水性
相互作用の場合;(3)静電相互作用、例えば、イオン
電荷相互作用、特に陽または陰イオン電荷相互作用;
(4)被分析物が吸着体の金属イオンと配位共有結合
(すなわち、配位複合体形成)を形成する能力;(5)
酵素活性部位結合;(6)可逆的共有相互作用、例え
ば、ジスルフィド交換相互作用;(7)糖タンパク質相
互作用;(8)生物特異的相互作用;または(9)相互
作用の上記の態様の2つ以上の組み合わせ、を含む。す
なわち、吸着体は、吸着力の2つ以上の基礎を示し得、
したがって「混合機能性」吸着体として公知である。
着体には、疎水性相互作用吸着体を含む。疎水性相互作
用吸着体の例には、脂肪族炭化水素、特にC1−C18脂肪
族炭化水素を有するマトリクス;およびフェニル基のよ
うな芳香族炭化水素官能基を有するマトリクスが含まれ
る。疎水性相互作用吸着体は、非荷電溶媒に曝露された
アミノ酸残基、そして詳細には、フェニルアラニンおよ
びトリプトファンのような非極性、芳香族、および疎水
性アミノ酸残基と普通呼ばれるアミノ酸残基を含む、被
分析物を結合する。疎水性相互作用吸着体に結合する被
分析物の特定の例には、リゾチームおよびDNAが挙げら
れる。特定の理論により拘束されることは望まないが、
DNAが、DNA中の芳香族ヌクレオチド、詳細にはプリンお
よびピリミジン基によって、疎水性相互作用吸着体に結
合すると考えられる。
着体には、例えば、Pierce,Rockford,Illinoisから市販
される親硫黄性吸着体の1つの型であるT−GEL のよ
うな、親硫黄相互作用吸着体が挙げられる。親硫黄相互
作用吸着体は、例えば、IgGのような免疫グロブリンを
結合する。IgGとT−GEL との間の相互作用のメカニズ
ムは、完全には知られていないが、溶媒に曝露されたtr
p残基は、役割を果たすと思われる。
も関連する第3の吸着体は、固定された染料相互作用吸
着体を含む。固定された染料相互作用吸着体には、例え
ば、Pharmacia Biotech,Piscataway,New Jerseyから入
手可能な、例えば、CIBACHRONTMブルーのような固定さ
れた染料のマトリクスが挙げられる。固定された染料相
互作用吸着体は、一般的に、タンパク質およびDNAを結
合する。固定された染料相互作用吸着体に結合するタン
パク質の1つの特定の例は、ウシ血清アルブミン(BS
A)である。
ンデルワールス力を観察するために有用である吸着体
は、ケイ素酸化物(すなわち、ガラス)のような順相吸
着体を含む表面を含む。順相またはケイ素酸化物表面
は、官能基として作用する。さらに、ポリエチレングリ
コール、デキストラン、アガロース、またはセルロース
のような親水性ポリマーで改変された表面を含む吸着体
はまた、親水性相互作用吸着体として機能し得る。ほと
んどのタンパク質は、水素結合またはファンデルワール
ス力を含む親水性相互作用によって結合するアミノ酸残
基(すなわち、親水性アミノ酸残基)の基または組み合
わせのため、親水性相互作用吸着体を結合する。親水性
相互作用吸着体を結合するタンパク質の例には、ミオグ
ロビン、インスリン、およびシトクロムCが挙げられ
る。
るタンパク質は、親水性表面に保持される。あるいは、
表面に曝露された親水性糖部分を有する糖タンパク質は
また、親水性吸着体に高い親和性を有する。
である吸着体には、例えば、硫酸アニオン(すなわち、
SO3 -)のマトリクス、およびカルボン酸アニオン(すな
わち、COO-)またはリン酸アニオン(OPO3 -)のマトリ
クスのようなアニオン性吸着体が挙げられる。硫酸アニ
オンを有するマトリクスは、永続して負に荷電する。し
かし、カルボン酸アニオンを有するマトリクスは、その
pKaより高いpHでのみ負電荷を有する。pKa以下のpHで
は、マトリクスは、実質的に中性の電荷を示す。適切な
アニオン性吸着体はまた、硫酸およびカルボン酸アニオ
ンならびにリン酸アニオンの組み合わせを有するマトリ
クスであるアニオン性吸着体を含む。組み合わせは、pH
の機能として連続して変化し得る負電荷の強度を提供す
る。これらの吸着体は、例えば、リボヌクレアーゼおよ
びラクトフェリンのような正電荷を有するタンパク質お
よび巨大分子を誘引および結合する。特定の理論に拘束
されることは望まないが、吸着体と正荷電アミノ酸残基
(リジン残基、アルギニン残基、およびヒスチジル残基
を含む)との間の静電相互作用は、結合相互作用を担う
と考えられる。
である他の吸着体には、カチオン性吸着体が含まれる。
カチオン性吸着体の特定の例には、二級、三級、または
四級アミンのマトリクスが含まれる。四級アミンは、永
続して正に荷電する。しかし、二級および三級アミン
は、pH依存的である電荷を有する。pKa以下のpHでは、
二級および三級アミンは、正に荷電し、そしてそのpKa
以上のpHでは、負に荷電する。適切なカチオン性吸着体
はまた、異なる二級、三級、および四級アミンの組み合
わせを有するマトリクスであるカチオン性吸着体を含
む。組み合わせは、pHの機能として連続して変化し得る
正電荷の強度を提供する。カチオン性相互作用吸着体
は、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基のような、
溶媒に曝露されたアミノ酸残基を有するタンパク質を含
む分子上の、アニオン性部位を結合する。
の両方)の場合、アニオンおよびカチオンの両方を含む
混合態様イオン性吸着体を使用することが、しばしば所
望される。このような吸着体は、pHの機能として連続緩
衝化能力を提供する。連続緩衝化能力は、特に2〜11の
pH範囲で異なる緩衝化成分を有する溶離物への、被分析
物の組み合わせの曝露を可能にする。これによって、固
定された滴定可能なプロトン交換基によって定義される
吸着体の局所的pH環境を生成する。このようなシステム
は、クロマトフォーカシングとして公知の固相分別技術
と等価である。濾胞刺激ホルモンイソ形態は、主に荷電
した炭水化物成分で異なり、これは、クロマトフォーカ
シング吸着体で分別される。
吸着体には、相互作用が静電的であるが、形式電荷また
は滴定可能タンパク質ドナーまたはアクセプターが関与
しない、双極子−双極子相互作用吸着体が挙げられる。
ために有用である吸着体には、例えば、二価および三価
金属イオンを有するマトリクスが挙げられる。固定され
た金属イオンキレーターのマトリクスが、遷移金属イオ
ンとの配位共有結合相互作用の基礎を形成する1つ以上
の電子ドナー基を有する固定された合成有機分子を提供
する。固定された金属イオンキレーターとして機能する
一次電子ドナー基には、酸素、窒素、および硫黄が挙げ
られる。金属イオンは、被分析物の電子ドナー基との相
互作用のためのいくつかの数の残存する部位を有する金
属イオン複合体を生じる固定された金属イオンキレータ
ーに結合される。適切な金属イオンには、一般的に、
銅、ニッケル、コバルト、亜鉛、鉄のような遷移金属イ
オン、ならびにアルミニウムおよびカルシウムのような
他の金属イオンが挙げられる。何らかの特定の理論に拘
束されることは望まないが、金属イオンは、ペプチド、
タンパク質、または核酸において特定のアミノ酸残基と
選択的に相互作用すると考えられる。代表的には、この
ような相互作用に関与するアミノ酸残基には、ヒスチジ
ン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、システイ
ン残基、ならびにアスパラギン酸およびグルタミン酸の
ような酸素基を有するアミノ酸残基が挙げられる。例え
ば、固定された三価鉄イオンは、タンパク質上のホスホ
セリン。ホスホチロシン、およびホスホトレオニン残基
と相互作用する。固定された金属イオンに依存して、上
記のアミノ酸残基の十分な局所密度を有するそれらのタ
ンパク質のみが、吸着体によって保持される。金属イオ
ンとタンパク質との間のいくつかの相互作用は、非常に
強いので、タンパク質は従来の手段によって複合体から
切断され得ない。高度にリン酸化されるヒトβカゼイン
は、固定されたFe(III)に非常に強く結合する。6−
ヒスチジンタグと発現される組換えタンパク質は、固定
されたCu(II)およびNi(II)に非常に強く結合する。
る吸着体には、プロテアーゼ(例えぼ、トリプシン)、
ホスファターゼ、キナーゼ、およびヌクレアーゼが挙げ
られる。相互作用は、被分析物(代表的には、バイオポ
リマー)の酵素結合部位と酵素の触媒結合部位との配列
特異的相互作用である。この型の酵素結合部位には、例
えば、配列にリジン−リジンまたはリジン−アルギニン
対を有するタンパク質およびペプチドと相互作用するト
リプシンの活性部位が含まれる。より詳細には、大豆ト
リプシンインヒビターは、固定されたトリプシンの吸着
体と相互作用しそして結合する。あるいはセリンプロテ
アーゼは、固定されたL−アルギニン吸着体に選択的に
保持される。
体には、ジスルフィド交換相互作用吸着体が含まれる。
ジスルフィド交換相互作用吸着体には、固定されたスル
フィドリル基、例えば、メルカプトエタノールまたは固
定されたジチオトレイトールを含む吸着体が含まれる。
相互作用は、吸着体と被分析物上の溶媒に曝露されたシ
ステイン残基との間の共有ジスルフィド結合の形成に基
づく。このような吸着体は、システイン残基、および還
元された硫黄化合物を含むように改変された塩基を含む
核酸を有するタンパク質またはペプチドを結合する。
着体には、そこに固定したレクチン(すなわち、オリゴ
糖を有するタンパク質)を有する吸着体のような糖タン
パク質相互作用吸着体が含まれ、その例は、Pharmacia
Biotech of Piscataway,New Jerseyから市販されるCONC
ONAVALINTMである。このような吸着体は、巨大分子の炭
水化物部分の分子認識に関連する相互作用に基づいて機
能する。糖タンパク質相互作用吸着体と相互作用しそし
て結合する被分析物の例には、糖タンパク質、特にヒス
チジンリッチ糖タンパク質、全細胞および単離された細
胞下画分が挙げられる。
体は、一般的に「生物特異的親和性吸着体」と呼ばれ
る。吸着は、選択的でありそして親和性(平衡解離定
数、Kd)が少なくとも10-3M(例えば、10-5M、10-7M、1
0-9M)であるならば、生物特異的と考えられる。生物特
異的親和性吸着体の例には、特定の生体分子と特異的に
相互作用しそして結合する任意の吸着体が挙げられる。
生物特異的親和性吸着体には、例えば、抗原に結合する
固体された抗体;DNA結合タンパク質、DNA、およびRNAに
結合する固定されたDNA;タンパク質および酵素に結合す
る固定された基質またはインヒビター;薬物結合タンパ
ク質に結合する固定された薬物;レセプターに結合する
固定されたリガンド;リガンドに結合する固定されたレ
セプター;DNAおよびRNA結合タンパク質に結合する固定
されたRNA;ビオチンおよびビオチン化分子を結合する固
定されたアビジンまたはストレプトアビジン;脂質結合
タンパク質を結合する固定されたリン脂質メンブランお
よびベシクルが挙げられる。酵素は、そこへの被分析物
吸着体を改変し得る有用な吸着体である。細胞は、吸着
体として有用である。その表面は、複合結合特性を提示
する。細胞への吸着は、例えば、表面レセプターに結合
するリガンドまたはシグナル分子を同定するために有用
である。ウイルスまたはファージも、吸着体として有用
である。ウイルスは、しばしば、細胞表面レセプターへ
のリガンド(例えば、CD4に対するgp120)を有する。ま
た、ファージ提示ライブラリーの形態では、ファージコ
ートタンパク質は、標的への結合を試験するための因子
として作用する。生物特異的相互作用吸着体は、上記の
ような公知の特異的相互作用に頼る。吸着体が利用され
得る生物特異的相互作用の他の例は、当業者に容易に理
解され、そして本発明によって意図される。
析物を結合することに直接関与しない補助または「ヘル
パー」分子をさらに含み得る。
て、試料の成分は、種々の吸着体との相互作用に基づい
て大きく分離され得る。したがって、種々の態様の相互
作用を有する吸着体に対する被分析物の引力は、第1の
分別パラメータを提供する。例えば、疎水性に関する引
力に基づく第1の吸着体およびイオン電荷に関する引力
に基づく第2の吸着体に、被分析物を含む試料を曝露す
ることによって、疎水性吸着体に結合する被分析物を試
料から分別すること、および特定のイオン電荷を有する
吸着体に結合する被分析物を分別することが可能であ
る。
析物だけでなく、引力の同じ基礎によって吸着体に対す
る引力を示す試料中の何らかの他の成分も結合するの
で、低い程度の特異性で被分析物の分離を提供する。例
えば、疎水性吸着体は、疎水性被分析物だけでなく、試
料中の任意の他の疎水性成分も結合し;負に荷電した吸
着体は、正に荷電した被分析物だけでなく、試料中の任
意の他の正に荷電した成分も結合するなどである。
物の分離は、比較的中間の特異性または変化した引力の
強度の結合特性を利用することによって、さらに洗練さ
れ得る。中間の特異性の結合特性を基礎とする被分析物
の分離は、例えば、混合した機能性吸着体を利用するこ
とによって、達成され得る。被分析物の分離が比較的低
い特異性で達成されると、目的の被分析物を誘引するこ
とが見いだされる結合特性は、さらに多くの望ましくな
い成分を除去し、それによって被分析物を分離するため
に、種々の他の結合および溶離特性と組み合わせて利用
され得る。
被分析物は、引力の1つの基礎として疎水性相互作用を
示し、そしてまた引力の第2の異なる基礎を示す、混合
された機能性吸着体を提供することによって、他の疎水
性試料成分からさらに分離され得る。混合された機能性
吸着体は、正に荷電した疎水性被分析物を結合するよう
に、疎水性相互作用および負に荷電したイオン相互作用
を示し得る。あるいは、混合された機能性吸着体は、吸
着体において金属イオンとの配位複合体を形成する能力
を有する疎水性被分析物を結合するように、疎水性相互
作用および金属イオンとの配位共有結合を形成する能力
を示し得る。中間の特異性の結合特性を示す吸着体のな
おさらなる例は、上記の開示および例に基づいて当業者
に容易に理解される。
は、比較的高い特異性の結合特性を利用することによっ
て、さらに洗練され得る。比較的高い特異性の結合特性
は、引力の同じ基礎であるが引力の異なる強度を示す種
々の吸着体を利用することによって利用され得る。言い
換えれば、引力の基礎は同じであるが、他の試料成分か
らの被分析物のさらなる分離は、被分析物についての親
和性の異なる程度を有する吸着体を利用することによっ
て達成され得る。
る被分析物は、特定の酸性pH範囲における被分析物への
親和性を有する吸着体を利用することによって、他の酸
性試料成分からさらに分離され得る。したがって、被分
析物は、pH1〜2の試料成分に誘引される1つの吸着
体、pH3〜4の試料成分に誘引される別の吸着体、およ
びpH5〜6の試料成分に誘引される第3の吸着体を使用
して分離され得る。このように、5〜6のpHの被分析物
を結合する吸着体への特異的親和性を有する被分析物
は、1〜4のpHの試料成分から分離される。特異性が増
加した吸着体は、引力の間隔、すなわち、引力の同じ基
礎を示す吸着体の結合特性間の差を減少させることによ
って利用され得る。
着体特性を有し得る。この場合、基材に吸着した一次被
分析物は、二次被分析物を単離するための二次吸着体に
なり得る。次に、保持された二次被分析物は、試料から
三次被分析物を単離するために三次吸着体として機能し
得る。このプロセスは、数回の反復によって持続し得
る。
の吸収の閾値を選択的に改変する。溶離物が結合した被
分析物を脱離および溶離する能力は、溶離特性の機能で
ある。異なる溶離物は、大きく異なる溶離特性、幾分異
なる溶離特性、または微妙に異なる溶離特性を示し得
る。
試料および吸着体の機能である。代表的には、溶離物
は、0℃と100℃との間、好ましくは4℃と37℃との間
の温度で、吸着体に接触する。しかし、いくつかの溶離
物については、改変された温度は、所望の温度であり
得、そして当業者によって容易に決定される。
溶離物は、一般的に、引力の基礎で異なる。例えば、溶
離物と被分析物との間の引力の種々の基礎には、電荷ま
たはpH、イオン強度、水構造、特異的競合結合試薬の濃
度、表面張力、誘電率、および上記の2つ以上の組み合
わせが挙げられる。
する溶離物には、公知のpH緩衝液、酸性溶液、および塩
基性溶液が挙げられる。特定のpH緩衝液で所定の吸着体
に結合した被分析物を洗浄することによって、電荷は改
変され得、したがって特定のpH緩衝液の存在における吸
着体と被分析物との間の結合の強度がチャレンジされ得
る。溶離物のpHで吸着体について他のものよりも低い競
合であるこの被分析物は、吸着体から脱離されそして溶
離し、溶離物のpHで吸着体により強く結合する被分析物
のみを結合させておく。
には、種々の型および濃度の塩溶液が挙げられる。溶離
溶液に溶解された塩の量は、溶離物のイオン強度に影響
を及ぼし、そして対応して吸着体結合能力を改変する。
低濃度の塩を含む溶離物は、イオン強度に関して吸着体
結合能力のわずかな改変を提供する。高濃度の塩を含む
溶離物は、イオン強度に関して吸着体結合能力のより大
きな改変を提供する。
変する溶離物には、尿素およびカオトロピック塩溶液が
挙げられる。代表的には、尿素溶液は、例えば、0.1〜8
Mの濃度の範囲の溶液を含む。溶離物を提供するために
使用され得るカオトロピック塩には、チオシアン酸ナト
リウムが挙げられる。水構造に基づく溶離物は、水和ま
たは結合水構造の変化に起因して被分析物を結合する吸
着体の能力を改変する。この型の溶離物には、例えば、
グリセロール、エチレングリコール、および有機溶媒が
挙げられる。カオトロピックアニオンは、非極性部分の
水溶解度を増加させ、それによって被分析物と吸着体と
の間の疎水性相互作用を減少させる。
を改変する溶離物には、界面活性剤(detergent)およ
び界面活性剤(surfactant)が挙げられる。溶離物とし
ての使用に適切な界面活性剤には、CHAPS、TWEEN、およ
びNP−0のようなイオン性および非イオン性界面活性剤
が挙げられる。界面活性剤の疎水性および親水性基が導
入される場合、疎水性相互作用が改変されるので、界面
活性剤に基づく溶離物は、吸着体が被分析物を結合する
能力を改変する。被分析物と吸着体との間、および被分
析物内の疎水性相互作用は改変され、そして荷電基が導
入される(例えば、SDSのようなイオン性界面活性剤を
用いるタンパク質変性)。
疎水性相互作用に関して吸着体の選択性を改変する溶離
物である。この能力において機能する適切な溶離物の例
には、尿素(0.1〜8M)、プロパノール、アセトニトリ
ル、エチレングリコールおよびグリセロールのような有
機溶媒、ならびに上記のような界面活性剤が挙げられ
る。溶離物としてのアセトニトリルの使用は、代表的に
は、逆相クロマトグラフィーである。溶離物中のエチレ
ングリコールの包含は、親硫黄吸着体との塩促進された
相互作用から免疫グロブリンを溶離することに効果的で
ある。
択され得るか、または上記の2つ以上の溶離物の組み合
わせであり得る。上記の2つ以上の溶離物を含む溶離物
は、複数の溶離特性に基づいて被分析物についての吸着
体の選択性を改変し得る。
を提供する能力、および異なる溶離物で洗浄することに
よって異なる溶離特性を提供する能力は、2つの異なる
パラメータの変動を許容し、そのそれぞれは、被分析物
が吸着体に結合される選択性を個々にもたらし得る。こ
れらの2つのパラメータが広く変化し得るという事実
は、広い範囲の結合引力および溶離条件を確実にし、そ
のため本発明の方法は、多くの異なる型の被分析物を結
合しそれにより検出するために有用であり得る。
着体および溶離物の選択は、たとえ被分析物の性質が未
知であっても、試料、および特徴づけられるべき被分析
物の特定の被分析物またはクラスの性質に依存する。代
表的には、特に分析されるべき試料の組成が未知である
場合、多様な結合特性および多様な溶離特性を示すシス
テムを提供することが有利である。広範な選択特性を示
すシステムを提供することによって、目的の被分析物が
1つ以上の吸着体によって保持される可能性が顕著に増
加する。
溶離特性を示し、そして被分析物の最良の分離を提供す
る結合および溶離特性を観察するシステムを提供するこ
とによって、特定の被分析物を保持するために有用な選
択条件を決定し得る。本発明は、広範な選択条件を含む
システムを提供するので、所定の被分析物についての最
適結合および溶離特性の当業者による決定は、過度の実
験の必要なしに容易に行われ得る。
特性を利用することによって、被分析物の種々の生物学
的、化学的、または物理化学的特性に基づく被分析物の
分離を可能にする。適切な選択条件の使用によって利用
され得る被分析物の多くの特性には、疎水性指標(すな
わち、被分析物中の疎水性残基の尺度)、等電点(すな
わち、被分析物が電荷を有さないpH)、疎水性モーメン
ト(すなわち、被分析物の両親媒性の尺度もしくは極性
および非極性残基の分布の不斉の程度)、側面双極子モ
ーメント(すなわち、被分析物中の電荷の分布における
不斉の尺度)、分子構造因子(分子の骨格に沿った大き
な側鎖の分布のような被分析物分子の表面外形における
変動の原因である)、二次構造成分(例えば、ヘリック
ス、平行および逆平行シート)、ジスルフィド結合、溶
媒に曝露された電子ドナー基(例えば、His)、芳香族
性(すなわち被分析物中の芳香族残基のうちπ−π相互
作用の尺度)、および荷電した原子間の直線距離があ
る。
択によって、試料からの所定の被分析物の分離について
利用され得る特性の型の代表的例である。試料からの特
定の被分析物の分離についての基礎を形成し得る被分析
物の他の適切な特性は、当業者に容易に公知および/ま
たは決定可能であり、そして本発明によって意図され
る。
されない。試料は、固体、液体、または気体状態であり
得るが、代表的には試料は液体状態である。固体または
気体試料は、好ましくは、当業者内に周知の技術に従っ
て液体試料を提供するように適切な溶媒に溶解される。
試料は、生物学的組成物、非生物学的有機組成物、また
は無機組成物であり得る。本発明の技術は、生物学的試
料、特に生物学的液体および抽出物において被分析物を
分離するために;ならびに、非生物学的有機組成物、特
に低有機分子および低無機分子の組成物において被分析
物を分離するために、特に有用である。
体、細胞、細胞オルガネラ、ウイルス、分子フラグメン
ト、イオン、または原子であり得る。被分析物は、試料
の単一成分、あるいは、共通して1つ以上の特徴(例え
ば、分子量、等電点、イオン電荷、疎水性/親水性相互
作用など)を有する構造的、化学的、生物学的、または
機能的に関連する成分の1つのクラスであり得る。
分離され得る被分析物の特定の例には、生物学的巨大分
子(例えば、ペプチド、タンパク質、酵素、ポリヌクレ
オチド、オリゴヌクレオチド、核酸、炭水化物、オリゴ
糖、多糖);上記の生物学的巨大分子のフラグメント
(例えば、核酸フラグメント、ペプチドフラグメント、
およびタンパク質フラグメント);上記の生物学的巨大
分子の複合体(例えば、核酸複合体、タンパク質−DNA
複合体、レセプター−リガンド複合体、酵素−基質、酵
素インヒビター、ペプチド複合体、タンパク質複合体、
炭水化物複合体、および多糖複合体);小さな生物学的
分子(例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシ
ド、糖、ステロイド、脂質、金属イオン、薬物、ホルモ
ン、アミド、アミン、カルボン酸、ビタミンおよび補酵
素、アルコール、アルデヒド、ケトン、脂肪酸、ポルフ
ィリン、カロテノイド、植物成長調節物質、リン酸エス
テルおよびヌクレオシド二リン酸−糖、合成小分子(例
えば、薬学的または治療的に有効な物質)、モノマー、
ペプチドアナログ、ステロイドアナログ、インヒビタ
ー、変異原、発ガン物質、有糸分裂阻害剤、抗生物質、
イオノホア、抗代謝物質、アミノ酸アナログ、抗菌剤、
輸送インヒビター、表面活性剤(界面活性剤)、ミトコ
ンドリアおよび葉緑体機能インヒビター、電子供子体、
電子伝達体および電子受容体、プロテアーゼについての
合成基質、ホスファターゼについての基質、エステラー
ゼおよびリパーゼについての基質、およびタンパク質改
変試薬);ならびに合成ポリマー、オリゴマー、および
コポリマー(例えば、ポリアルキレン、ポリアミド、ポ
リアクリレート、ポリメタクリレート、ポリスルホン、
ポリスチレン、ポリエーテル、ポリビニルエステル、ポ
リカーボネート、ポリビニルハライド、ポリシロキサ
ン、POMA、PEG、および上記の任意の2つ以上のコポリ
マー)が挙げられる。
は、試料中の被分析物およびその化学的特徴についての
情報を提供する。吸着は、一部は、吸着体の結合特性に
依存する:吸着体に結合する被分析物は、結合を可能に
する特徴を有する。例えば、特定のpHでカチオン性であ
る分子は、そのpHを含む溶離条件下でアニオン性吸着体
に結合する。強力なカチオン性分子は、非常に強い溶離
条件下でのみ吸着体から溶離され得る。疎水性領域を有
する分子は、疎水性吸着体に結合するが、親水性領域を
有する分子は、親水性吸着体に結合する。また、相互作
用の強度は、一部は、被分析物が疎水性または親水性領
域を含む程度に依存する。したがって、試料中の特定の
被分析物が特定の溶離条件下で吸着体に結合するという
決定は、互いから、および結合についての適切な化学的
特徴を有さない被分析物から、被分析物を分別すること
によって、混合中の被分析物を分離するだけでなく、特
定の化学的特徴を有する被分析物のクラスまたは個々の
被分析物をも同定する。種々の溶離条件下で1つ以上の
特定の吸着体での被分析物保持についての情報を収集す
ることは、混合物中の被分析物の詳細な分離だけでな
く、同一性へと導き得る被分析物自体についての化学的
情報もまた提供する。このデータは、「保持データ」と
いう。
なデジタルコンピュータの使用で最も容易に分析され
る。コンピュータプログラムは、一般的には、コードを
保存する読み取り可能な媒体を含む。あるコードは、基
材アレイの各特徴の位置、その特徴での吸着体の正体、
および吸着体を洗浄するために使用される溶離条件を含
むメモリーに充てられる。次いで、この情報を使用し
て、プログラムは、ある選択特性を定義するアレイにお
ける特徴のセットを同定し得る。コンピュータはまた、
入力として受けるコード、プローブにおける特定のアド
レス可能な位置から受けた種々の分子量でのシグナルの
強度についてのデータを含む。このデータは、必要に応
じて、検出される各被分析物についてシグナルの強度お
よび決定された分子量を含む、検出された被分析物の数
値を示し得る。
む。本発明は、データを処理するための種々の方法を意
図する。1つの実施態様では、これは、被分析物認識プ
ロファイルを生成することを包含する。例えば、分子量
によって同定された特定の被分析物の保持についてのデ
ータは、特定の結合特性、例えば、アニオン性吸着体ま
たは疎水性吸着体への結合に従って分類され得る。この
収集したデータは、特定の被分析物の化学的特性のプロ
ファイルを提供する。保持特性は、次に構造を反映する
被分析物機能を反映する。例えば、配位共有金属キレー
ターへの保持は、ポリペプチド被分析物におけるヒスチ
ジン残基の存在を反映し得る。種々のpHレベルでの溶離
下で複数のカチオン性およびアニオン性吸着体への保持
のレベルのデータを使用することで、タンパク質の等電
点を導き得る情報が明らかになる。これは、次に、タン
パク質中のイオン性アミノ酸の推定数を反映する。した
がって、コンピュータは、結合情報を構造情報に変換す
るコードを含み得る。さらに、被分析物の二次プロセシ
ング(例えば、翻訳後修飾)によって、結合および量の
差異によって反映される変化した認識プロファイルを得
る。
胞型における同じセットの選択閾値下で行われ、そして
2つのアッセイからの保持データが比較される。保持マ
ップ(例えば、任意の特徴でのシグナルの存在または強
度)における差異は、2つの細胞によって別々に発現さ
れる被分析物を示す。これは、例えば、2つの保持アッ
セイ間のシグナル強度の差異を示し、それによって被分
析物が、2つのアッセイにおいて吸着体によって増加し
てまたは減少して保持されることを示す、差異マップを
生成することを包含し得る。
マーからの指示を受けるコードを含み得る。アレイ中の
特定された、所定の位置からの被分析物の選択的脱離に
ついて進行的経路および論理的経路は、予測されそして
予めプログラムされ得る。
ットに変換し得る。データ分析は、例えば、収集したデ
ータから特徴位置の関数としてのシグナル強度を決定す
る工程、「アウトライアー」(所定の統計学的分布から
逸脱するデータ)を除去する工程、および残りのデータ
から被分析物の相対結合親和性を算出する工程を包含し
得る。
る。1つのフォーマットでは、シグナルの強度は、分子
量の関数としてグラフで表示される。「ゲルフォーマッ
ト」と呼ばれる、他のフォーマットでは、シグナルの強
度は、暗さの直線軸強度に沿って表示され、ゲルにおい
てバンドに類似の出現を得る。他のフォーマットでは、
ある閾値に達するシグナルは、分子量を表す横軸上に垂
直な線またはバーとして表示される。したがって、各バ
ーは、検出された被分析物を表示する。データはまた、
結合特性および/または溶離特性に従ってグループ分け
された被分析物についてのシグナル強度のグラフで表示
され得る。
物の検出および特徴づけを含む、組合せ的な分別方法に
関する。これらの組合せ的な方法は、多くの適用を有す
る。このような適用には、限定されることなく、標的被
分析物検出スキームを開発すること;タンパク質精製方
策を開発すること;タンパク質精製方法;相補的ファー
ジ提示ライブラリーを使用する標的エピトープ同定を含
む、標的被分析物に結合するファージ提示ライブラリー
から特定のファージを同定すること;被分析物の物理化
学的特性に基づくタンパク質同定;遺伝子発現モニタリ
ングおよび示差的なタンパク質提示;毒性学スクリーニ
ング;多数の診断マーカーの同時検出;薬物発見;多量
体タンパク質会合モニタリングおよびインビトロポリヌ
クレオチド翻訳の検出が挙げられる。
条件下での被分析物の保持の分析に関する。この方法の
1つの変更は、連続的抽出である。連続的抽出では、試
料は、2つの異なる選択条件に独立して曝露されない。
むしろ、試料は、吸着体への試料からのある被分析物を
抽出し、そして溶離物中で非吸着被分析物を放出するた
めに、第1の選択条件に曝露される。次いで、溶離物
は、第2の選択条件に曝露される。これは、さらに、溶
離物から種々の被分析物を抽出する。頻繁には、第1お
よび第2の曝露において吸着体が引力についての異なる
基礎(例えば、順相および疎水性)を有する場合、吸着
体は、溶離物から被分析物の異なるセットを抽出する。
この第2の溶離物は、次いで、第3の選択条件に曝露さ
れ、そして以下同様である。連続抽出を実施する1つの
方法では、吸着体は、試料がその上部で混合され得るよ
うに、ウェルの底部に置かれる。溶離物が、吸着物に添
加され、そして試料において被分析物間の結合を可能に
し、溶離物洗浄液が収集される。次いで、収集した洗浄
液は、第2の吸着体に曝露され、そして被分析物が結合
によって試料から抽出される。
むしろ調製である。より詳細には、目的は、試料から所
望の被分析物以外のすべてを抽出することであり得る。
この場合、試料は、通常、小さく、例えば、約数ミリメ
ーター直径のスポットでの数マイクロリットルである。
吸着体は、試料から枯渇することを望まない被分析物を
吸着しないように選択される。数回の反復の後、最後に
収集した洗浄物は、望ましくない被分析物を枯渇し、例
えば、脱離分光測定法または伝統的クロマトグラフ方法
による続いての分析のために所望の被分析物を残す。
任意の分析技法によって被分析物について分析される。
単一の保持工程の後でさえ、このプロセスによって、吸
着体に吸着される材料および吸着されない被分析物を検
査が可能になる。
料混合物からの被分析物の明確な分離である。これは、
臨床的診断、薬物発見、および機能的ゲノム学における
適用に特に重要である:これらの領域は、生物学的試料
からの1つ以上の被分析物の同定に関連し得る。本発明
は、被分析物についての改良された分離での選択条件を
同定するための方法を提供する。この方法は、被分析物
が保持される選択条件を同定する工程、および反復プロ
セスにおいて、被分析物の改良された分離を提供する追
加の結合特性または溶離特性を、この選択条件に追加す
る工程を包含する。
一般的に、試料の多くの成分からのシグナルを含む。シ
グナルの複雑性は、被分析物の明確な分離を妨害し得
る。被分析物の進行的分離の方法は、試料中の被分析物
の明確な検出のための被分析物の改良された分離で選択
条件を同定することを可能にする。選択条件は、被分析
物シグナルが他の成分のシグナルとより容易に区別可能
であるならば、他の選択条件と比較した被分析物の「改
良された分離」を示す。これは、例えば、吸着体に結合
した被分析物の数を減少させ、それによってシグナルの
総数を減少させること、または被分析物についての選択
条件の選択性を増加させ、それによって他のシグナルと
比較した被分析物シグナルを増強することを包含し得
る。もちろん、被分析物が基材に独占的に結合した場
合、検出中に単独の被分析物シグナルを生じる。
離)特性が、被分析物を保持することが公知の選択特性
の定常セットに順次追加される、反復プロセスを包含す
る。第1の工程では、一連の選択条件は、標的被分析物
を保持する条件を同定するためにテストされる。次の工
程では、選択条件の1つ以上の選択特性が、さらなる分
析についての定常セットについて選択される。
の条件のそれぞれは、定常セットにおいて選択された特
性、および定常セットにはない少なくとも1つの新しい
条件を包含する。例えば、定常セットが、アニオン性吸
着体および低塩溶離物を含むならば、新しい条件は、溶
離物のpHを変化させることを包含し得る。これらの新し
い変動のそれぞれは、被分析物の分離を改良する能力に
ついてテストされ、そして改良された分離を有する1つ
の改変された選択条件が同定される。次の工程では、改
良された分離を提供するさらなる選択条件が、定常セッ
トに追加される。
しい特性のセットを含む新しいセットの選択条件を生成
することによって、同様に再度テストされる。したがっ
て、各工程で、選択条件は、被分析物の分離が、これま
での工程で選択条件と比較して改良されるように選択さ
れる。
試料は、代表的には、数百またはおそらく数千のタンパ
ク質を含む。試料中の単一の標的タンパク質の被分析物
の明確な分離を得ることが望まれ得る。第1の工程で
は、保持マップは、複数の選択条件を使用して標的被分
析物について開発される。例えば、吸着体は、アニオン
交換体、カチオン交換体、順相吸着体、および逆相吸着
体であり得る。各吸着体でテストされた溶離条件は、種
々のpHレベル、種々のイオン強度、種々の界面活性剤条
件、および種々の疎水性に基づく条件であり得る。例え
ば、4つの異なる溶離条件が、各条件についてテストさ
れ得る。したがって、この実施例では、16の異なる選択
条件が、標的被分析物を吸着する能力についてテストさ
れる。
くとも1つの選択条件を選択する。標的が最大に結合し
た選択条件を選択し得る。しかし、この選択条件が他の
選択条件よりも標的に対してより選択的である場合、標
的が最大に結合されない条件を選択することが有利であ
り得る。この例については、保持マップの分析が、標的
はほぼ中性のpHでアニオン交換吸着体によって保持され
るが、親水性吸着体にも弱く吸着されることを示すと推
定される。
の1つの可変の吸着体または溶離物は、次いで、すべて
の後の選択条件における使用について選択される。本明
細書で使用される場合、これは、「選択条件定常のセッ
ト」に添加されるといわれる。
下で結合する能力をテストする。第2のセットでの各選
択条件は、選択条件定常セットの要素を含む。しかし、
各選択性はまた、他の可変物(選択条件に添加される異
なる吸着体または溶離物)を含む。したがって、少なく
とも定常のセットを用いる制約内で、選択条件の第2の
セットはまた、第1のセットよりさらに多様であるよう
に選択される。多様性を増加させる方法は、例えば、溶
離条件のより精細な階級付けまたは吸着体の種々の強度
をテストする工程を包含する。また、例えば、選択条件
への他の選択特性の添加を包含し得る。
に添加され得る。この条件は、現在、より広範な種々の
可変物、例えば、溶離物または吸着体とテストされる。
テストされるべき溶離物は、最初の反復でテストされる
よりも精細な階級付けで、種々の低pH緩衝液を含み得
る。例えば、最初の反復は、pH3.0、pH5.0、pH7.0、お
よびpH9.0での緩衝液をテストし、そして標的が、ほぼ
中性のpHでアニオン交換吸着体に結合したことを示し
た。第2の反復中、テストした緩衝液は、pH5.0、pH5.
5、pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5、およびpH8.0であり得
る。さらに、これらの緩衝液のそれぞれはまた、他の溶
離特性、例えば、イオン強度、疎水性などを含むように
変化され得る。
的に、第1のラウンドで同定される選択条件よりも良好
な分離を提供した条件を同定させる。また、この選択条
件の可変物の1つが選択され、そして次の反復における
さらなる疑問についての選択条件定常のセットに添加さ
れる。
ウンドでの選択条件は、pH6.5で緩衝液を使用すると仮
定する。この溶離物は、今度は、定常のセットに添加さ
れ得、これは今度は、アニオン交換樹脂およびpH6.5緩
衝液を含む。次の反復では、選択条件は、この定常セッ
ト、および他の可変物を含む。可変物は、例えば、異な
るイオン強度のような溶離物への新しい成分の添加であ
り得;または、他の吸着体は、アニオン交換吸着体と混
合した種々の疎水性吸着体のような混合物に添加され
得;または、アニオン交換樹脂の密度を変化させ得る。
また、選択条件は、被分析物の改善された分離を示すこ
のセットから同定される。
セスは継続され得る。この場合、選択条件は、被分析物
に特異的である。
よってわかり得るように、適切な選択条件を同定するた
めに必要とされる反復の数を減少させ得る。
提供する。この方法は、被分析物を吸着するための引力
の基礎を迅速に同定するための被保持物クロマトグラフ
ィーの能力を利用する。第1の工程は、複数の選択条件
に被分析物を曝露する工程、および被保持物クロマトグ
ラフィーによってこの条件下で保持を決定する工程を包
含する。これは、被分析物の認識プロファイル特性を生
成する。被分析物が保持される選択条件は、被分析物の
調製用精製のためのプロトコルを開発するために使用さ
れる。
いて吸着され、そして被分析物を結合すると同定された
一連の吸着体/溶離物の組合せから溶離される。したが
って、例えば、認識マップは、被分析物が、順相吸着体
におよび金属キレート剤に結合することを示し得る。次
いで、被分析物は、例えば、被分析物を結合する順相吸
着体を含む、第1のクロマトグラフィーカラムと接触す
る。結合していない材料は洗い流される。次いで、被分
析物は、十分にストリンジェントな洗浄によって溶離さ
れる。次いで、溶離物は、例えば、被分析物を結合する
ために、金属キレートカラムと接触させる。結合してい
ない材料は、洗い流される。次いで、被分析物を含む結
合した材料は、金属キレートカラムから溶離される。こ
のように、被分析物は、調製量で単離される。試料の調
製量は、少なくとも10μl、少なくとも100μl、少な
くとも1ml、または少なくとも10mlである。
ロマトグラフ(溶離に基づく)タンパク質精製方策を設
計するために使用され得る。標的被分析物タンパク質に
ついての、引力についての吸着体基礎、結合条件、およ
び溶離条件(すなわち、選択条件)は、被保持物クロマ
トグラフィーによって定義される。この情報は、大量の
時間、エネルギー、およびここで適切である精製方策決
定の試行錯誤プロセス中に、他の方法では浪費される貴
重な被分析物を節約し得る。この節はまた、市販の吸着
体で行った大規模精製努力を提供する。
法 本発明は、脱離スペクトロメトリーによる1つ以上の
被分析物の特異的検出のためのプローブ、ならびにこれ
らのプローブを作製するための方法を提供する。このよ
うな被分析物を分離するプローブは、診断および分析方
法において被分析物を特異的に検出するために有用であ
る。
する第1の工程は、複数の異なる吸着体/溶離物組み合
わせ下で被分析物についての保持マップを産生すること
である。例えば、被分析物の分離は、5つの異なる溶離
物のそれぞれで洗浄した4つの異なる吸着体について決
定され得る。これは、被分析物のそれぞれについての保
持データの20のセットを提供する。得られる保持マップ
の分析は、どの1つまたは複数の選択条件が被分析物を
最もよく分離するかを示す。好ましくは、被分析物をす
べて明確に分離する1つの選択条件が選択される。次い
で、被分析物のそれぞれが少なくとも1つの吸着体スポ
ットで分離されるように被分析物が分離するプローブで
の使用について、1つ以上の選択条件が選択される。プ
ローブはまた、1つまたは複数の被分析物を結合しない
吸着体を含み得る。この吸着体スポットは、コントロー
ルとして有用である。プローブは、1つまたは複数の被
分析物を保持および分離する能力について選択されるア
ドレス可能な位置に、複数の吸着体スポットを含み得
る。この場合、単一の溶離条件下で被分析物を結合する
吸着体が、選択される。プローブ全体が検出プロセスに
おいて単一の溶離物で洗浄され得るので、これは有用で
ある。
分析物についてカスタマイズされた吸着体を生成するた
めに使用され得る。例えば、被分析物を保持する吸着体
の性質は、被分析物の引力についての基礎のセットを示
す。カスタマイズされた吸着体は、引力についてのこれ
らの基礎を提供する吸着体の要素を含む複合吸着体を調
製することによって設計され得る。このようなカスタム
吸着体は、標的被分析物について非常に選択的である。
1つまたは少数のカスタム吸着体が、被分析物について
の認識マップを生成するために十分であり得る。例え
ば、特定の溶離条件下で、被分析物が、ある程度の疎水
性、正電荷、および芳香性を有する材料を結合する吸着
体によって保持される場合、設計によって、またはこれ
らの3つの特性のそれぞれを誘引する官能基を有する組
合せ的な合成方策の使用によって、カスタム吸着体を生
成し得る。この吸着体への結合を検出することで、被分
析物を同定する。
分析物を検出するために有用である。試料は、選択条件
に曝露され、そしてプローブは、脱離分光測定法によっ
て問い合わされる。プローブが被分析物を分離するの
で、その存在は、特性認識プロファイルを捜すことによ
って検出され得る。このようなプローブは、患者試料中
で診断マーカーのセットを同定するのに特に有用であ
る。
特定のクラスをドッキング(dock)させるように設計さ
れる。これは、診断マーカーおよび機能によって定義さ
れる被分析物を含む。例えば、細胞表面タンパク質、あ
るクラスの酵素(例えば、キナーゼ)、転写因子、細胞
内レセプターなどを特異的にドッキングさせるアレイ
が、調製され得る。吸着体は、バイオポリマー、例え
ば、抗体に特異的であり得る。
ラスについてのファージ提示タンパク質リガンドのよう
な遺伝子パッケージである。この場合、ファージ提示ラ
イブラリーは、クラスに結合するファージを排除するた
めにあるクラスの分子で予備スクリーニングされ得る。
次いで、集団から差し引かれたファージは、吸着体とし
て使用される。
分子マーカーの患者試料での検出を含む。ある症状は、
単一の診断マーカーの存在によって診断され得る。他の
症状の診断は、複数の診断マーカーの検出を包含し得
る。さらに、いくつかのマーカーの検出は、診断の信頼
性を増加させ得る。したがって、本発明は、病理学的状
態の少なくとも1つの診断マーカーを分離する少なくと
も1つの吸着体を含む、脱離分光測定法のためのプロー
ブを提供する。
マーカーの選択を包含する。マーカーは、何らかな病
状、例えば、ガン、心臓病、自己免疫疾患、ウイルス感
染、アルツハイマー病、または糖尿病についてのマーカ
ーであり得る。例えば、前立腺特異的抗原(PSA)の検
出は、前立腺ガンを非常に暗示する。HIV感染は、p17、
p24、またはp55の1つ、およびp31、p51、またはp66の
1つ、およびgp41またはgp120/160の1つのような、い
くつかのHIVタンパク質に対する抗体を検出することに
よって診断され得る。脳脊髄液中のアミロイド−β42お
よびτタンパク質の検出は、アルツハイマー病を非常に
暗示する。また、マーカーは、健常被験体対病理学的状
態を有する被験体における被分析物の差異の存在を検出
する工程を包含する、本発明の方法によって同定され得
る。
着体が、開発される。好ましくは、すべてのマーカーを
分離する単一の吸着体が調製される。これは、例えば、
それぞれご所望のマーカーの1つを結合する、いくつか
の抗体を含むスポットを生成することによって、達成さ
れ得る。あるいは、プローブは、複数の吸着スポットを
含み得、各スポットは、選択条件下で少なくとも1つの
標的被分析物を分離し得る。1つの実施態様では、吸着
体は、マーカーに特異的であるリガンドを含む複合吸着
体である。例えば、吸着体は、標的被分析物を特異的に
結合する抗体、ポリペプチドリガンド、またはポリヌク
レオチドを含み得る。1つの実施態様では、抗体は、組
合せ的なライブラリーをスクリーニングすることによっ
て同定される単鎖抗体である。特定のマーカーに特異的
である単鎖抗体は、本明細書に記載の方法によってファ
ージ提示ライブラリーをスクリーニングすることによっ
て開発され得る。
に保持するか、または脱離分光測定法によって明確な分
離に十分な特異性で被分析物を保持するかのいずれか
の、非有機生体分子成分を含む。特異的被分析物の検出
のための吸着体の調製も、本明細書に記載される。
トは、単一被分析物に特異的である必要はなく、したが
って、標的と吸着体との間のバイオポリマー媒介特異的
親和性を必要とする必要はない。以前の親和性検出方法
は、主として、バイオポリマーと標的との間の特異的結
合に依存していた。これは、例えば、タンパク質に対す
る抗体、相補的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオ
チド、または炭水化物に対するレクチンの特異的親和性
を含む。これらの検出手段が間接的であるのでこのよう
な特異性が必要であった:標的は同定されなかった:し
ばしば吸着体に結合した標識が同定された。したがっ
て、吸着体が特異的であるほど、夾雑物が吸着体に結合
しそして特異的検出を妨害する可能性が少なくなる。し
かし、脱離分光測定法によって、被分析物の直接的検出
を得る。したがって、夾雑物のシグナルが標的のシグナ
ルと重複しない限り、夾雑物の存在は特異的検出を妨害
しない。
選択する工程を包含する。試料は、例えば、組織、血
液、尿、大便、または他の体液(リンパ液、脳脊髄液、
関節内液など)であり得る。次いで、試料は、診断マー
カーの保持を可能にする条件下で診断吸着体を含む基材
に曝露される。吸着体は、適切な溶離物で洗浄される。
次いで、マーカーは、脱離分光測定法(例えば、マスス
ペクトル測定)によって検出(例えば、分離)される。
条件下で少なくとも1つの診断マーカーを分離する少な
くとも1つのアドレス可能位置で少なくとも1つの吸着
体を含む脱離分光測定法における使用のための基材、お
よび(2)溶離物の調製のための溶離物または装置を含
む、診断マーカーの特異的検出のためのキットを提供す
る。吸着体に試料を曝露しそして溶離物で洗浄するこ
と、すなわち、選択条件を実行することによって、被分
析物は、十分に精製または脱離分光測定法によって分離
のために特異的に結合される。
る方法を提供する。この方法は、被保持物クロマトグラ
フィーを使用してタンパク質被分析物の物理化学的特徴
についての一致パラメータを決定する工程、および一致
パラメータを有するタンパク質を同定するためにタンパ
ク質データベースを検索する工程を包含する。被保持物
特性に基づく物理化学的情報の誘導は、上で議論され
る。データベースは、代表的には、アミノ酸配列および
/または各タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌク
レオチド配列を提供する。分子量、疎水性、pI、フラグ
メント質量などのような構造特性は、この情報から容易
に導き出せる。被分析物タンパク質は、データベースに
おいてタンパク質のサブセットのみと任意の特定の構造
特性を共有する。したがって、同一性候補物は、タンパ
ク質被分析物と共有される構造特性に従って、タンパク
質を分類することによって見いだされる。したがって、
参照物の1つ以上の物理化学的特性を同定することに固
有の不正確さ、特異性の程度、または確実性のレベルを
考えると、データベースにおけるタンパク質が、参照物
のすべての特徴に完全に一致することを予期し得ない。
したがって、一致パラメータは、例えば、タンパク質被
分析物特徴とデータベース中の参照ポリペプチドの特徴
との間の適合の近似を同定するために設定され得る。
つれて、任意のタンパク質被分析物が参照ポリペプチド
としてデータベース中に存在する機会も増加する。した
がって、この方法は、試料中の目的のタンパク質を迅速
に分離し、タンパク質についての構造情報を得、次いで
タンパク質を同定するためにこの情報を使用することを
可能にする。
チマー分子を組み立て、そしてその会合をもたらす化合
物を評価することに有用である。マルチマー分子のユニ
ットは、吸着体に結合される。次いで、これは、マルチ
マー分子の他のユニットを含む試料に曝露される。曝露
は、結合パラメータをテストするための種々の条件下で
行われ得る。サブユニットのマルチマーへの結合は、脱
離分光測定法によってモニターされ得る。次いで、その
後のサブユニットは、同様に結合についてテストされ得
る。本明細書に記載の薬物スクリーニング方法は、会合
を妨害する能力について物質をテストするために有用で
ある。したがって、プロセスの1つの段階での被分析物
は、次の段階で吸着体になる。
する。酵素アッセイは、一般的に、酵素が活性である条
件下で、酵素基質とテストされるべき試料とを曝露する
工程を包含する。酵素を基質上で作用させた後、酵素反
応の産物が検出される。定量アッセイでは、産物の量が
決定される。この量は、通常、コントロールまたは標準
曲線と比較され、それによって試料中の酵素活性の量を
得る。
含する、酵素を検出する方法を提供する。この方法は、
酵素の活性が、しばしば、質量が元の基質とは異なる産
物を産生するという事実を利用する。この方法では、基
質を結合する吸着体を含む固相が調製される。ある量の
基質が、吸着体に結合される。次いで、吸着体は、任意
の酵素が基質上で作用する条件下でおよびその時間にわ
たって試料に曝露される。次いで、何らかの結合した材
料は、脱離分光測定法によって検出される。酵素活性の
産物の分子量特性を有する被分析物の検出は、酵素の存
在の指示を提供する。シグナル強度は、試料中の酵素活
性の量の関数である。
する方法 他の局面では、本発明は、2つ以上の試料間で示差的
に発現される有機生体分子、特にタンパク質を同定する
方法を提供する。「示差的発現」とは、2つの試料間で
の被分析物の量または質の差異をいう。このような差異
は、転写から翻訳後修飾までのタンパク質発現のいずれ
かの段階で生じ得る。方法は、被保持物クロマトグラフ
ィーの並外れた分離の能力および感度を利用する。第1
に、選択条件の同じセットを使用する認識プロファイル
は、2つの生物学的試料からの被分析物について調製さ
れる。使用される選択条件の数が多いほど、試料中の被
分析物の分離が大きく、したがって、比較され得る被分
析物の数が大きい。次いで、認識マップは、2つのセッ
トの吸着体によって示差的に保持される被分析物を同定
するために比較される。示差的保持は、定量的保持を含
む。これは、例えば、発現のアップレギュレーションま
たはダウンレギュレーションを示す。示差的保持はま
た、非分石仏中の定性的差異も包含する。例えば、タン
パク質の翻訳後修飾の差異は、結合特性の差(例えば、
タンパク質がグリコシル化されるならば、レクチン吸着
体に異なって結合する)、または質量の差異(例えば、
翻訳後切断の差異の結果として)として検出可能な認識
マップの差異を生じ得る。分析は、プログラム可能なデ
ジタルコンピュータによって行われ得る。
伝子を検出するために特に有用である。2つの細胞型
は、正常対病的細胞、例えば、ガン細胞、または種々の
レベルの細胞、または発生または分化の異なる段階で
の、あるいは細胞周期の異なる部分での細胞であり得
る。しかし、この方法はまた、異なる条件に曝露された
同じ型の2つの細胞を検査することに有用である。例え
ば、この方法は、細胞での遺伝子発現を調節する能力に
ついて薬剤を毒性スクリーニングおよびテストすること
に有用である。このような方法では、1つの生物学的試
料は、テスト薬剤に曝露され、そして他の細胞は曝露さ
れない。次いで、試料の被保持物質試料が比較される。
この方法は、タンパク質または他の生体分子が、発現を
増加または減少し、あるいは異なる被保持物特徴または
異なる質量に基づいて何らかの形で変化する。
質の物理化学的特性についての情報を使用して、これら
のタンパク質についての同一性候補は、本明細書に記載
の方法を使用して決定され得る。
用である。または正常試料もしくは細胞と比較して、患
者試料または疾患培養細胞で、示差的に発現されるタン
パク質は、診断マーカーであり得る。一般的に、統計学
的に有意な患者集団からの試料を正常試料と比較するた
めに最良である。このように、情報は、その病状を示す
個体のすべてまたは著しい数に普通の診断マーカーを同
定するために蓄積され得る。
ば、分化発現から生じる)を検出する感度は、大きなタ
ンパク質をより小さな小片にフラグメント化すること、
およびより小さな小片を検出することによって顕著に増
加され得る。増加した感度は、いくつかの因子に起因す
る。第1に、試料中のタンパク質すべてが、例えば、酵
素的切断によってフラグメント化される場合、大きなタ
ンパク質は、小さなタンパク質よりも多くのフラグメン
トを産生するようである。第2に、脱離スペクトロメト
リーの全体の感度は、より高分子量よりも低分子量で大
きい。第3に、タンパク質をフラグメント化すると、標
的からのシグナルの数が増加し、それによって標的を検
出する可能性を増加させる。第4に、タンパク質をフラ
グメント化すると、捕獲の可能性が増加し、したがっ
て、タンパク質の少なくとも1つのフラグメントを検出
する。第5に、タンパク質が、2つの試料に別々に存在
するならば、タンパク質からのシグナルの数を増加させ
ることによって、量の差は、さらに検出されるようであ
る。
被分析物混合物の複雑性を減少させようと努める。フラ
グメント化は、複雑性を増加させる。
を検出する感度は、検出前に被分析物をより低分子量フ
ラグメントに変換することによって増加する。フラグメ
ント化は、当該技術分野で公知の何らかの手段によって
達成され得る。例えば、タンパク質被分析物は、エンド
プロテアーゼを使用してフラグメント化され得る。炭水
化物被分析物は、グリコシダーゼを使用してフラグメン
ト化され得る。核酸は、エンドヌクレアーゼを使用して
フラグメント化され得る。試料は、吸着体とのドッキン
グの前または後にフラグメント化に供せられ得る。
ターとリガンドとの間の相互作用を含む。例えば、転写
活性化間の結合は、しばしば、リガンドの転写因子との
先の結合を包含する。多くの病理学的状態は、レセプタ
ーとそのリガンドとの間の異常な相互作用に関連する。
レセプターとリガンドとの間の結合の中断は、薬物発見
の頻繁な標的である。しかし、レセプターに対するリガ
ンドの同定は、しばしば未知である;レセプターは「オ
ーファン」レセプターである。
めに被保持物クロマトグラフィーを使用する方法を提供
する。この方法は、吸着体にレセプターをドッキングさ
せる工程を包含する。次いで、レセプターに対するリガ
ンドを含むと推測される思われる試料は、レセプターと
リガンドとの間の結合に適切な溶離条件下で、ドッキン
グしたレセプターに曝露される。次いで、レセプターに
結合しているリガンドは、脱離スペクトロメトリーによ
って検出される。この方法のパワーは、一部は、吸着体
にドッキングした少量の材料を検出するために、脱離ス
ペクトロメトリーに対する感度に由来する。
ターを保持、および好ましくはレセプターに特異的に結
合する吸着体を同定することを必要とする。タンパク質
を特異的に結合する吸着体を同定する方法は、本明細書
に記載される。1つの方法では、吸着体は、レセプター
に特異的な抗体を含む。別の実施態様では、レセプター
は、特異的結合のための部分を含む組換え融合タンパク
質として産生される。例えば、レセプターは、抗体のFc
部分と融合され得る。このような部分は、吸着体に組み
込まれ得るプロテインAに結合する。
自由である。例えば、レセプターが核レセプターである
ならば、試料は、核抽出物であり得る。レセプターが細
胞質レセプターであるならば、試料は、細胞質抽出物で
あり得る。レセプターが細胞表面レセプターであるなら
ば、試料は、細胞が曝露される表面からの液体、例え
ば、上皮細胞表面レセプターに対する血清であり得る。
理学的条件下で、例えば、37℃にて数時間、レセプター
とともにインキュベートする。次いで、結合していない
材料が洗い流される。この方法は、従来の技術が同定す
るために数カ月を必要とするリガンドを、迅速に同定し
得る。
ット上の試料の並行処理を可能にする。したがって、こ
の方法は、リガンドの存在について複数の異なる試料を
試験する工程、ならびに複数のインキュベーションおよ
び溶離条件下で単一の試料を試験する工程を包含し得
る。
性を決定することによって、リガンドは、ゲノムデータ
ベースからの情報を使用して明確に同定され得る。
細胞からのタンパク質をドッキングしたプローブのセッ
トが調製される。このプローブは、それ自体、ドッキン
グした分子に結合する細胞からの分子を同定するため
に、二次プローブとして有用である。第2にプローブか
らの被保持物マップを調製した後、プローブは、一般的
に、二次プローブを調製するために使用されるよりも低
いストリンジェント条件下で、試験材料に曝露され、そ
してアドレス可能位置が分析される。新しくプローブに
ドッキングされる分子は、既にドッキングした分子に結
合された分子である。
子を同定することは、薬物を開発することに重要な工程
である。本発明は、吸着体および被分析物を試験化合物
に曝露する工程、ならびに吸着体および被分析物との間
の結合を脱離スペクトロメトリーによって検出する工程
によって、吸着体および被分析物との間の結合(例え
ば、レセプター吸着体およびリガンド被分析物)を調節
する能力について、化合物をスクリーニングする方法を
提供する。
なスクリーニングは、数千の薬物に標的相互作用を曝露
し、そして相互作用を妨害または促進する物質を同定す
る能力を必要とする。被保持物クロマトグラフィーは、
リガンド/レセプター対の1つのメンバーを基材にドッ
キングし、そして二次吸着体としてそれを使用すること
が可能である。次いで、メンバーをそのパートナーにお
よび物質に曝露した後、パートナーが結合したかどうか
そしてどの程度結合したかを、脱離スペクトロメトリー
によって決定し得る。スクリーニング方法における被保
持物クロマトグラフィーの有利点は、レセプターを吸着
体によって基材に特異的にドッキングさせる能力、並行
処理について多くの吸着体スポット上のレセプターを迅
速に展開する能力、および脱離スペクトロメトリーによ
る読み出し結果によって可能である処理能力のスピード
を含む。
件下で物質の存在および非存在下で標的被分析物と吸着
体を接触させる工程、ならびに物質とのおよび物質なし
のいずれかの結合の量を決定する工程を包含する。結合
の量は、被保持物クロマトグラフィーによって(例え
ば、認識プロファイルを調製することによって)決定さ
れる。実験は、物質が添加されないコントロール、また
は物質の異なる量もしくは型が添加されそしてゼロ量が
外挿によって決定されるコントロールで行われ得る。結
合の量の統計学的に有意な差(p<0.05)は、試験物質
が結合を調節することを示す。
ば、タンパク質)をスクリーニングすることに特に有用
である。血清または他の標的細胞型からのタンパク質保
持マップまたは認識プロファイルの開発の後、物質は、
そのアドレス可能位置で保持された被分析物のアレイに
曝露される。結合をさせた後、結合していない物質は溶
離または洗い流される。物質自体が保持マップ中の新し
い成分として現れるので、特定された選択条件下で結合
物質を保持したその被分析物は、脱離マススペクトロメ
トリーによって直接同定される(すなわち、物質は直接
脱離そして検出される)。この方法は、被分析物を結合
するまたは1つ以上の生物学的プロセスを調節する能力
について、薬物候補物、アゴニストおよびアンタゴニス
トの両方をスクリーニングするために特に有用である。
要がない。しかし、特に有用な方法では、吸着体および
標的被分析物は、リガンド/レセプター対である。
ルモンおよび細胞表面レセプターまたは細胞内レセプタ
ーである。吸着体は、細胞全体、または膜結合レセプタ
ーの場合は細胞膜であり得る。タンパク質レセプターま
たは他の薬物標的候補物は、組合せ的な薬物ライブラリ
ーをスクリーニングするために吸着体として使用され得
る。数百または数千の薬物候補物は、単一のレセプター
型またはアドレス可能位置に適用され得る。非結合およ
び弱く結合した薬物候補物(すなわち、物質)の除去の
後、結合した物質は、脱離スペクトロメトリーによって
検出および同定される。
て改変する酵素である。物質は、被分析物の酵素的形質
転換を調節する能力についてスクリーニングされる。例
えば、被分析物の認識プロファイルは、酵素活性の産物
のプロファイルとは異なり得るので、酵素活性が検出さ
れ得る。分化保持は、物質が結合を変化させることを示
す。
持され得る。1つの方法では、レセプター/リガンド
は、非特異的吸着体によって直接保持される。別の方法
では、吸着体は、レセプター/リガンドに特異的であ
る。例えば、吸着体は、レセプター/リガンドに特異的
な抗体を含み得る。レセプター/リガンドは、融合部分
が、例えば、FcフラグメントがプロテインAを結合する
ように、吸着体を特異的に結合する融合タンパク質であ
り得る。1つの方法では、レセプター/リガンドを特異
的に結合するポリペプチドをその表面上に有する、ファ
ージ提示ライブラリーからのファージのような、遺伝子
パッケージは、基材に結合される。リガンドは、ポリペ
プチドによって捕獲される。また、吸着体は、基材にす
でにドッキングされた被分析物であり得、すなわち、こ
れは二次吸着体、三次吸着体などであり得る。
直接的および間接的の両方の結果を評価するために特に
有用な方法を提供する。標的細胞型のタンパク質から生
成された被保持物マップにおける1つ以上の被分析物の
検出は、1)その標的タンパク質自体、2)いくつかの
他の被分析物(薬物結合タンパク質ではない)、または
3)遺伝子発現(アップまたはダウンレギュレーショ
ン)において物質(例えば、薬物候補物)の作用に起因
して変更され得る。これは、これらの変化を検出するた
めに被保持物クロマトグラフィーの高分離および情報生
成力、すなわち、この方法を、プロテオミクス(proteo
mics)、機能的ゲノミクス(genomics)、薬物発見、治
療薬物モニタリング、および臨床診断学に利用可能な最
も強力なツールの1つにする、薬物ありおよびなしで観
察される遺伝子被保持物マップまたは認識プロファイル
の薬物誘導される差である。
ついてスクリーニングされるべき試験物質が、試験動物
またはインビトロで培養された細胞に投与される。試験
されるべき物質の選択は、実施者の裁量にゆだねられ
る。しかし、薬剤としての投与の多様性および容易さの
ため、低分子が、試験物質として好ましい。
る。例えば、分子の組合せ的なライブラリーは、スクリ
ーニングに利用可能である。このようなライブラリーを
使用して、数千の分子が、調節活性についてスクリーニ
ングされ得る。1つの好ましい実施態様では、高処理能
スクリーニング方法は、多数の潜在的治療化合物(候補
化合物)を含むライブラリーを提供する工程を包含す
る。次いで、このような「組合せ的な化学ライブラリ
ー」は、所望の特徴的活性を提示するライブラリーメン
バー(特定の化学種またはサブクラス)を同定するため
に、本明細書に記載のように、1つ以上のアッセイでス
クリーニングされる。従って同定された化合物は、従来
の「リード化合物」として作用し得るか、または潜在的
または実際の治療剤としてそれ自体が使用され得る。
ングは、当業者に周知である。このような組合せ的な化
学ライブラリーには、ペプチドライブラリー(例えば、
米国特許第5,010,175号、Furka(1991)Int.J.Pept.Pro
t.Res.,37:487−493、Houghtonら(1991)Nature,354:8
4−88を参照のこと)が挙げられるが、これらに限定さ
れない。ペプチド合成は、決して、本発明での使用につ
いて予想および意図されるアプローチのみではない。化
学的に異なるライブラリーを生成するための他の化学も
使用され得る。このような化学には、異化が挙げられる
が、これらに限定されない:ペプトイド(PCT公開番号W
O 91/19735,1991年12月26日)、コードされたペプチド
(PC公開WO 93/20242,1993年10月14日)、ランダムバイ
オオリゴマー(PCT公開WO 92/00091,1992年1月9
日)、ベンゾジアゼピン(米国特許第5,288,514号)、
ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドの
ようなジベルソマー(diversomer)(Hobbsら,(199
3)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6909−6913)、ビニル
様ポリペプチド(Hagiharaら(1992)J.Amer.Chem.Soc.
114:6568)、β−D−グルコースを足場とした非ペプチ
ド性ペプチド模倣物(Hirschmannら,(1992)J.Amer.C
hem.Soc.114:9217−9218)、小化合物ライブラリーの類
似有機合成物(Chenら(1994)J.Amer.Chem.Soc.116:26
61)、オリゴカルバメート(Choら,(1993)Science 2
61:1303)、および/またはペプチジルホスホネート(C
ampbellら(1994)J.Org.Chem.59:658)。一般的には、
Gordonら(1994)J.Med.Chem.37:1385、核酸ライブラリ
ー、ペプチド核酸ライブラリー)例えば、米国特許第5,
539,083号を参照のこと)、抗体ライブラリー(例え
ば、Vaughnら(1996)Nature Biotechnology,14(3):
309−314、およびPCT/US96/10287を参照のこと)、炭水
化物ライブラリー(例えば、Liangら(1996)Science,2
74:1520−1522、および米国特許第5,593,853号を参照の
こと)、および低有機分子ライブラリー(例えば、ベン
ソジアゼピン,Baum(1993)C&EN,1月18日,33頁、イソ
プレノイド米国特許第5,569,588号、チアゾリジノンお
よびメタチアザノン米国特許第5,549,974号、ピロリジ
ン米国特許第5,525,735号および同第5,519,134号、モル
ホリノ化合物米国特許第5,506,337号、ベンゾジアゼピ
ン同第5,288,514号などを参照のこと)を参照のこと。
市販されている(例えば、357 MPS,390 MPS,Advanced C
hem Tech,Louisville KY,Symphony,Rainin,Woburn,MA,4
33A Applied Biosystems,Foster City,CA,9050および,M
illipore,Bedford,MAを参照のこと)。
法 本発明は、標的被分析物に特異的に結合する物質、例
えば、単鎖抗体を生成するための方法を提供する。これ
らの物質は、例えば、リガンド/レセプター相互作用の
研究において標的をドッキングさせるために特異的な診
断物質として有用である。この方法は、動物を免疫する
ことによって抗体を生成する可能でないかまたは実際的
でないような少量で単離され得るのみである標的に対す
る物質を生成するために特に有用である。この方法は、
そこに付着された標的を有する基材を提供する工程;ス
クリーニングされるべき物質を提示する遺伝子パッケー
ジの提示ライブラリーを提供する工程;標的と相互作用
によって遺伝子パッケージを特異的に保持するために、
ライブラリーを標的に曝露する工程;および脱離スペク
トロメトリーによって保持された遺伝子パッケージを検
出する工程、を包含する。
段に関連する標識方策を含む、分別選択および検出手順
と関連する損失および曖昧さを移すことなく、多数の複
合集団内の吸着体−被分析物候補物について並行で行わ
れ得る。
提示ライブラリーのポリペプチド物質について標的とし
て作用する吸着体を含む基材を提供する工程を包含す
る。1つの実施態様では、既に標的吸着体が付着された
基材が、提供される。別の実施態様では、基材は、標的
被分析物を結合する吸着体を有する基材を提供する工
程、被分析物の保持を可能にする溶離条件下で吸着体を
被分析物に曝露する工程、および提示ライブラリーにつ
いての標的として標的吸着体を使用する工程によって提
供される。1つの実施態様では、標的は、比較される2
つの細胞型間で分化発現される。例えば、標的は、分化
発現したmRNAに由来し得るか、または分化発現したポリ
ペプチドであり得る。被保持物クロマトグラフィー法に
よるこのような分化発現したタンパク質を同定する方法
は、上に記載される。
と、被分析物を明確に分離する選択条件を開発し得る。
より好ましくは、被分析物の保持は、特異的または排他
的である。上記の被分析物の進行的分離の方法は、複合
試料から標的被分析物を特異的に結合する選択条件を同
定することを可能にする。1つの実施態様では、結合し
た標的は、例えば、酵素への曝露によって改変され得
る。
得る。この方法では、分化発現したmRNAまたはESTは、
ルーチンの方法によって同定される。次いで、これらの
分子は、ドッキングのための吸着体上でインビトロおよ
びインサイチュで転写および翻訳される。例えば、複数
の吸着体スポットを有する脱離スペクトロメトリーのた
めの基材が調製される。この基材は、円柱管に重層さ
れ、それによってウェルの底に吸着体を有するウェルを
作製する。ウェルにおいて、分化発現したmRNA(通常
は、cDNAの形態で)のインビトロ転写および翻訳のため
の試薬を置く。(方法については、例えば、Sambrook
ら,Molecular Cloning−−A Laboratory Manual,Cold S
pring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,(19
89)、およびCurrent Protocols in Molecular Biolog
y,F.M.Ausubelら編(Current Protocols,Greene Publis
hing Associates Inc.およびJohn Wiley & Sons,Incと
の間の共同投機)を参照のこと)。mRNAまたはESTの翻
訳は、吸着されるポリペプチドを産生する。円柱管が除
去され、そして、ポリペプチド被分析物を保持する選択
条件を同定するように、吸着体スポットは、溶離物で洗
浄される。
含する。提示ライブラリーは、ペプチドの組合せ的なラ
イブラリー(「ポリペプチド物質」)の任意の分類を、
その表面上で提示する、遺伝子パッケージから構成され
る。しかし、単鎖抗体は、その後のイムノアッセイに使
用され得るので、魅力的である。
該技術分野で公知である。提示方法の基礎概念は、スク
リーニングされるべきポリペプチドリガンドと、ポリペ
プチドをコードする回収可能なポリヌクレオチドとの間
の物理的会合の確立である。この物理的会合は、マルチ
マー分子複合体によって提供され、この場合、遺伝子パ
ッケージ、例えば、ファージ粒子は、ポリペプチドをコ
ードするファージゲノムを封入するキャプシドの一部と
してポリペプチドを提示する。ポリペプチドとその遺伝
物質との間の物理的会合の確立は、異なるポリペプチド
を有する非常に多数の遺伝子パッケージの同時質量スク
リーニングを可能にする。標的への親和性を有するポリ
ペプチドを提示する遺伝子パッケージは、標的に結合
し、そしてこれらのパッケージは、標的へのアフィニテ
ィースクリーニングによって富化される。これらのパッ
ケージから提示されるポリペプチドの同一性は、それぞ
れのゲノムから決定され得る。これらの方法を使用し
て、所望の標的についての結合親和性を有すると同定さ
れたポリペプチドは、次いで、従来の手段によってバル
クで合成され得る。
ケージは、バクテリオファージ、特に線状ファージ、お
よび特にファージM13、Fd、およびF1である。ほとんど
の研究は、融合タンパク質を形成するこれらのファージ
のgIIIまたはgVIIIのいずれかに、提示されるべきポリ
ペプチドをコードするライブラリーを挿入した。例え
ば、Dower WO 91/19818;Devlin,WO 91/18989;MacCaffer
ty,WO 92/01047(遺伝子VIII);Huse,WO92/06204;Kang,
WO92/18619(遺伝子VIII)を参照のこと。Cwirlaら,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 87,6378−6382(1990);Devlin
ら,Science 249,404−406(1990);ScottおよびSmith,S
cience 249,386−388(1990);Ladnerら,米国特許第5,
223,409号;およびLadnerら,米国特許5,571,698も参照
のこと。このような融合タンパク質は、通常はファージ
コートタンパク質以外の分泌されるタンパク質からのシ
グナル配列、提示されるべきポリペプチド、および遺伝
子IIIまたは遺伝子VIIIのタンパク質またはそのフラグ
メントのいずれかを含む。外因性コード配列は、しばし
ば、遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIのN末端にまたはその
近くに挿入されるが、他の挿入部位が可能である。いく
つかのフィラメント状ファージベクターは、遺伝子III
または遺伝子VIIIのいずれかの第2のコピーを産生する
ように操作されている。このようなベクターでは、外因
性配列は、2つのコピーの1つのみに挿入される。他の
コピーの発現は、ファージ粒子に組み込まれる融合タン
パク質の比率を効果的に希釈し、そしてファージ増殖に
有害なポリペプチドに対する選択を減少させることに有
利であり得る。細菌(バクテリオファージまたはファー
ジ)を感染させるウイルスの表面上の抗体フラグメント
の提示は、広い範囲の親和性および動力学的特徴を有す
るヒトsFvを産生することを可能にする。
コートタンパク質およびファージパッケージング配列を
コードするが複製し得ないファージミドベクターにクロ
ーニングされる。ファージミドは、細胞にトランスフェ
クトされ、そしてヘルパーファージでの感染によってパ
ッケージされる。ファージミド系の使用はまた、コート
タンパク質から形成される融合タンパク質を希釈する効
果を有し、そしてヘルパーファージから発現されるコー
トタンパク質の野生型コピーを有するポリペプチドを提
示した。例えば、Garrard,WO 92/09690を参照のこと。
示するために使用され得る。例えば、モロニーマウス白
血病ウイルスのgp70に融合したヒトヘレグリンの提示
は、Hanら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,9747−9751(19
95)によって報告されている。胞子はまた、複製可能な
遺伝子パッケージとして使用され得る。この場合、ポリ
ペプチドは、胞子の外表面から提示される。例えば、B.
subtilisからの胞子は、適切であると報告されている。
これらの胞子のコートタンパク質の配列は、Donovanら,
J.Mol.Biol.196,1−10(1987)によって提供される。
され得る。提示されるべきポリペプチドは、細胞表面で
発現される細胞タンパク質をコードする遺伝子に挿入さ
れる。Salmonella typhimurium、Bacillus subtilis、P
seudomonas aeruginosa、Vibrio Cholerae、Klebsiella
pneumonia、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria menin
gitidis、Bacteroides nodosus、Moraxella bovis、お
よび特にEscherichia coliを含む細菌細胞が好ましい。
外表面タンパク質の詳細は、Ladnerら,米国特許5,571,
698、およびGeorgiouら,Nature Biotechnology 15,29−
34(1997)、およびそこに引用される参考文献によって
議論される。例えば、E.coliのlamBタンパク質が適切で
ある。
定するために提示ライブラリーをスクリーニングする工
程を包含する。標的を有する基材は、ポリペプチドと標
的分子との間の特異的結合に適切な溶離条件下で、ポリ
ペプチド物質を提示する提示ライブラリーに曝露され
る。標的を認識する物質を有する遺伝子パッケージは、
基材に既に付着された標的に結合する。結合していない
粒子を除去することおよび結合した粒子の保持によっ
て、溶離条件への曝露を得る。
成単位(pfu)を示す、遺伝子パッケージの集団は、結
合した標的吸着体(例えば、タンパク質)のアドレス可
能なアレイとともに基材に導入される。接触の際、標的
吸着体について最適化される選択条件(すなわち、選択
閾値改変剤または溶離物)が選択され、そのため、総フ
ァージ遺伝子型の小サブセットのみが、選択的に保持さ
れ、好ましくは5〜10より小さい。結合していないファ
ージ(すなわち、標的吸着体に結合しないファージ)お
よび標的吸着体に緩く結合したファージは、ほとんどの
選択的被分析物−標的吸着体相互作用以外のすべてを中
断させる溶離物への曝露によって排除されることに注目
されたい。標的吸着体への最も高い親和性を有するファ
ージ提示ポリペプチドは、選択的に保持される。
ッケージを検出する工程 第4の工程では、遺伝子パッケージの標的への結合
は、脱離スペクトロメトリーによって検出される。例え
ば、M13ファージは、単一のコートタンパク質の数千の
コピーを有する。脱離スペクトロメトリーにおいてレー
ザーでファージを打つ際に、コートタンパク質は除去さ
れ、そして検出可能である。このように、ライブラリー
が、標的に結合した物質を有するファージを含むかどう
かを決定し得る。その後の分析について遺伝子パッケー
ジを得るために、スクリーニング工程は、プローブにつ
いて異なる位置で並行に行い得、または基材は、レーザ
ーが表面に結合した遺伝子パッケージすべてを除去しな
いように十分に大きな物理学的次元を有し得る。この方
法は、被分析物に結合した少数のファージでさえ検出さ
れ得るので、特に強力である。
メトリーによって、「マーカー」タンパク質シグナルと
して遺伝子VIIIコートタンパク質の出現をモニターする
ことである。この様式では、結合した5ファージ粒子
(pfu)(既知の希釈物からの算出によって推定される
ファージ粒子数)くらい少ない「陽性」標的吸着体を検
出した。好ましさの順で、他のファージマーカーには、
遺伝子V、遺伝子X、および遺伝子III(それらの融合
産物を含む)が含まれる。
選択条件(すなわち、ストリンジェント溶離物)への曝
露後に保持される最少のファージとのアレイ内の位置の
検出後、結合したパッケージは、現在、他の使用のため
の出発点(junp−off point)として使用され得る。
めに遺伝子パッケージを単離する工程をさらに包含す
る。この分析は、遺伝子パッケージを再生する工程、お
よびそれからポリヌクレオチドを単離する工程を包含し
得る。単離されたファージは、通常の方法によって再生
される。例えば、保持されたファージは、その後の分析
のための遺伝子パッケージを増殖させるために、生物学
的増幅ビヒクル、例えば、E.coliおよび栄養培地に曝露
され得る。単一クローンは、基材に保持される被分析物
に結合する能力についてさらに試験され得る。
列決定する工程 結合した遺伝子パッケージのポリペプチド物質をコー
ドするヌクレオチド配列を配列決定する工程は、ポリペ
プチド物質を産生するための情報を提供する。配列決定
は、吸着体から遺伝子パッケージを単離する工程、それ
を再生する工程、ポリヌクレオチドを単離する工程、お
よび任意の利用可能な手段によってヌクレオチド配列を
配列決定する工程を包含し得る。別の方法では、遺伝子
パッケージは、基材を、遺伝子パッケージによって感染
を受ける細胞のような適切な材料と接触させる工程によ
って、インサイチュで再生され得る。別の実施態様で
は、配列決定は、インサイチュで行われる。この方法
は、遺伝子パッケージを溶解する工程、および任意の公
知の手段、例えば、PCRによってヌクレオチド配列を増
幅する工程を包含し得る。いくつかの異なる遺伝子パッ
ケージは、表面で利用可能な異なるエピトープに結合し
得る。この場合には、ある種のみのファージがエピトー
プに結合するように溶離条件を変更し得る。
生する工程を包含する。単離された物質は、例えば、診
断における標的の特異的検出のための、またはリガンド
/レセプター相互作用の研究のための、吸着体として使
用され得る。
初に、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を配
列決定する工程を包含する。アミノ酸配列は、ヌクレオ
チド配列に由来し得る。配列決定は、上記のような方法
によって達成され得る。配列は、ポリペプチド物質の組
換えまたは化学合成に基づき得る。
再生することによって産生され得る。これは、遺伝子パ
ッケージがポリペプチド物質の多くのコピーを含む場
合、特に効果的である。遺伝子パッケージは、インサイ
チュでまたは単離後に再生され得る。
行い得る。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
は、配列決定されるか、または議論されるような任意の
手段によって単離されるかのいずれかである。次いで、
ヌクレオチド配列は、発現ベクターに含まれる。発現ベ
クターは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
に作動可能に連結される発現制御配列を含む。次いで、
発現ベクターは、当該技術分野で周知の手段によって、
ポリペプチド物質を組換え発現するために使用され得
る。
解される。したがって、この方法は、標的に特異的な1
つより多くのポリペプチド物質を産生し得る。
に使用されるプローブのための吸着体として使用され得
る。すなわち、このようなプローブが、標的を特異的に
結合する物質をその表面上に含むので、これらは、生物
学的試料のような複合混合物から標的を単離するため
に、および脱離スペクトロメトリーによって標的を検出
するために使用され得る。さらに、物質と標的との間の
相互作用が、生体特異的であり得るので、上記の進行的
分離方法によって展開される吸着体よりも2つの間によ
り大きい親和性を含む確率が高い。
エピトープを単離することを可能にする。この方法は、
「抗イディオ型」様アプローチを用いる。まとめると、
標的被分析物のエピトープは、例えば、ファージ提示ラ
イブラリーでスクリーニングされる。単離されたファー
ジは、例えば、被分析物のエピトープを認識する単鎖抗
体を含む。これらのファージは、次に、第2の提示ライ
ブラリーをスクリーニングするために使用される。第1
の単鎖抗体に結合する第2のライブラリーからのファー
ジは、単鎖抗体によって認識されるエピトープの構造を
模倣する提示されたポリペプチドを含む。
するポリペプチド物質をコードするヌクレオチド配列
は、物質が遺伝子VIIIとの融合物として提示されるM13
ファージを産生するために使用される。したがって、こ
のファージは、その表面上に標的ペプチドの数百のコピ
ーとともにコートを有する。このファージは、次いで、
吸着体にドッキングされる。ドッキングは、例えば、遺
伝子IIIを結合するリガンドによって達成され得、また
は遺伝子IIIは、基材上のリガンドについてのレセプタ
ーを含むように改変され得る。次いで、ファージは、第
2の提示ライブラリーに曝露される。ドッキングしたフ
ァージ結合するライブラリーからの遺伝子パッケージ
は、検出され、そして記載のように単離される。好まし
くは、第2の提示ライブラリーは、その遺伝子VIIIタン
パク質が基材にドッキングしたファージの遺伝子VIIIと
区別され得るように、いくつかの分類の質量(mass)標
識を含む。したがって、「被分析物標的」としてまたは
吸着体としての物質の固定は、結合した物質が、その
後、別の物質を結合するために使用されるかどうかに依
存し得る。わかり得るように、既にドッキングした物質
に物質を結合する能力は、最後に結合した物質を選択的
に除去する条件を同定する方法であり得るので、持続し
得る。
限定の手段によって提供されない。
られる。ニワトリ卵白リゾチーム(10ピコモル/μl水
に希釈される1μl)は、Sigma Chemical Company,St.
Louis,MOから利用可能である。「ヒト血清」は、20mMリ
ン酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH7.0中に1:5に希
釈されたヒト血清の1μlの組成物をいう。
ムを意味し;「ml」は、ミリリットルを意味し;「μ
l」は、マイクロリットルを意味し;「cm」はセンチメ
ートルを意味し;「nm」は、ナノメータトルを意味し;
「M」は、モルを意味し;「mM」は、ミリモルを意味
し;「min」は、分を意味し;「%」あるいは「パーセ
ント」は、他で詳述しない限り重量パーセントであり;
「NaCl」は、塩化ナトリウムを意味し;「TFA」は、ト
リフルオロ酢酸を意味する。
行うための手順の例である。
グラフィー連続アレイを使用する) 1.試料処理 HEPESまたは20mMリン酸ナトリウム、pH7.2中の0.01%
Triton X100に、生物学的試料(例えば、血清、尿、細
胞抽出物、または細胞培養培地)を希釈する。必要であ
れば、試料を清澄化するために遠心分離する。
レイのスポットに、試料(1〜5μl)を添加する。疎
水性の吸着体アレイについて、0.5%TFAを含有する0.5
μlアセトニトリルで、各スポットを予め湿潤する。ア
セトニトリルが乾燥する前に、スポットに試料を添加す
る。試料をスポット上で(ほとんど乾燥まで)濃縮させ
る。
pH7.2で洗浄する。試料が完全に乾燥する前に、スポッ
トに、最初の2μlの洗浄溶液を添加する。洗浄溶液
を、少なくとも15秒間、スポット上に置かせる。ピペッ
トで10回出し入れする。最初の洗浄を完全に除去し、2
μlの溶液の第2洗浄を用いて反復する。
M NaClでスポット2を洗浄する。
NaClでスポット3を洗浄する。
を洗浄する。
ット5を洗浄する。
pH7.2中の0.05%Triton X100で、スポット6を洗浄す
る。
pH7.2中の3M尿素で、スポット7を洗浄する。
ト8を洗浄する。
トリル、0.5%トリフルオロ酢酸中に調製された飽和化
溶液)を添加する。
で、各スポット上に保持されたタンパク質を分析する。
全に乾燥する前に、スポットに、最初の2μlの洗浄溶
液を添加する。洗浄溶液を、少なくとも15秒間、スポッ
ト上に置く。ピペットで10回、出し入れする。最初の洗
浄を完全に除去し、2μlの溶液の第2洗浄を用いて反
復する。
pH7.2でスポット2を洗浄する。
pH7.2でスポット3を洗浄する。
ット4を洗浄する。
pH7.2中で0.05%Triton X100にて、スポット5を洗浄す
る。
pH7.2中で3M尿素にて、スポット6を洗浄する。
ニトリル(1:2)で、スポット8を洗浄する。
トリル、0.5%トリフルオロ酢酸中に調製された飽和化
溶液)を添加する。
で、各スポット上に保持されたタンパク質を分析する。
H7.2で洗浄する。試料が完全に乾燥する前に、スポット
に、最初の2μlの洗浄溶液を添加する。洗浄溶液を、
少なくとも15秒間、スポット上に置かせる。ピペット
で、10回出し入れする。最初の洗浄を完全に除去し、2
μlの溶液の第2洗浄を用いて反復する。
H7.2中の20Mイミダゾールでスポット2を洗浄する。
H7.2中の100mMイミダゾールでスポット3を洗浄する。
4.0で、スポット4を洗浄する。
pH7.2中の0.05%Triton X100で、スポット5を洗浄す
る。
pH7.2中の3M尿素で、スポット6を洗浄する。
ト8を洗浄する。
トリル、0.5%トリフルオロ酢酸中に調製された飽和化
溶液)を添加する。
で、各スポット上に保持されたタンパク質を分析する。
浄する。試料が完全に乾燥する前に、スポットに、最初
の2μlの洗浄溶液を添加する。洗浄溶液を、少なくと
も15秒間、スポット上に置かせる。ピペットで10回出し
入れする。最初の洗浄を完全に除去し、2μlの溶液の
第2洗浄を用いて反復する。
ポット2を洗浄する。
pH7.2中の0.05%Triton X100でスポット3を洗浄する。
l、pH7.2中の3M尿素で、スポット4を洗浄する。
トリル、0.5%トリフルオロ酢酸中に調製された飽和化
溶液)を添加する。
で、各スポット上に保持されたタンパク質を分析する。
ついてのプロトコル(予め活性化された吸着体アレイを
使用する) 1.予め活性化された吸着体アレイ上への抗体の固定 平らで清潔な表面に予め活性化した吸着体アレイを置
く。0.5μlのイソプロパノールで予め湿潤された予め
活性化された吸着体アレイの各スポット上に、抗体また
はレセプターまたはコントロールの溶液をスポットする
(イソプロパノールが乾燥する前に、1μlの抗体/ス
ポットを添加する)。
たは室温、2〜18時間)。
去する。
チップにわたって添加することによって、スポット上の
残余の活性部位をブロックし、そして加湿チャンバーに
おいてインキュベートする(室温、30分間)。
る。15mlのコニカルプラスチックチューブにおいて、約
9mlの洗浄溶液中にチップを沈め、そして少なくとも約1
5分間、卓上振とう器上で振動する。
NaClで洗浄する。
洗浄する。
を覆い、そして使用する準備ができるまで、4℃で保存
する。
る 各スポットに1〜5μlの試料を添加する。非常に低
い抗原またはリガンドの濃度を有する試料について、バ
イオプロセッサー中に吸着体アレイを置く。200μl PBS
で、2回、チップ上のスポットおよびバイオプロセッサ
ーウェルを洗浄する。最大300μlの試料を、各ウェル
に添加する。
温、1〜18時間)。
%Triton X100(pH7.2)で各スポットを2回洗浄する。
最初の2μlの洗浄溶液を、スポットに添加する。洗浄
溶液を、少なくとも15秒間、スポット上に置かせる。ピ
ペットで、10回出し入れする。最初の洗浄を完全に除去
し、2μlの溶液の第2の洗浄を用いて反復する。この
後、0.1M HEPES、pH7.4中の0.5M NaClで洗浄した。
トリル、0.5%トリフルオロ酢酸中に調製されたシナピ
ン酸(sinapinic acid)またはEAMIまたはCHCAの飽和溶
液)を添加する。
で、各スポット上に保持されたタンパク質を分析する。
フィーを使用して、リゾチームについて認識プロファイ
ルを作製した。プロファイルは、それぞれ、多様な異な
る選択性閾値調節物下の、6つの吸着体でのリゾチーム
の分別を含む。結果は、リゾチームの物理化学プロファ
イルを、異なって特徴付ける40個の異なるスペクトルグ
ラフである。
ファイル ニワトリ卵白リゾチームを、ステンレススチール基材
上の酸化ケイ素吸着体のクロマトグラフィー連続吸着体
アレイの種々のスポットに添加する。室温にて、15分
間、加湿チャンバーにおけるインキュベーション後、吸
着体の各異なるスポットを、以下の溶離物(選択性閾値
調節物)の1つで洗浄する: (1)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0、 (2)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中の0.2M Na
Cl、 (3)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中の0.4M Na
Cl、 (4)25mM酢酸ナトリウム緩衝液、0.125M NaCl、pH4.
5、 (5)1%TFA、 (6)水中の10%アセトニトリル、 (7)水中の20%アセトニトリル、 (8)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH7.
0中の0.05%Tween20、および (9)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中の3M尿
素。
溶液でピペッティングする工程を包含する。このプロセ
スは、洗浄溶液の新鮮なアリコートを用いて反復する。
その後、吸着体のスポットを、1μlの水で2回洗浄す
る。シナピン酸の0.3μlのアリコート(5mg/ml 50%ア
セトニトリル:0.5%TFA)を添加し、そして風乾させ
る。アレイを、窒素レーザー(355nm)および60cmフラ
イトチューブを使用して、質量分析器で分析する。デー
タを、コンピューターによって分析し、そしてデータオ
ーバーレイ表示について、GRAMS/32c(Galactic Indust
ries Corporationから利用可能)にエクスポートする。
イに対するリゾチーム認識プロファイルの合成マススペ
クトルを示す。下部のプロファイルは、pH7緩衝液単独
での洗浄後の、酸化ケイ素吸着体に保持されたリゾチー
ムシグナル強度を示す。選択性閾値調節物中の塩化ナト
リウム(0.2〜0.4M)の包含は、リゾチームの保持を減
少する。これは、酸化ケイ素(pH7で負に荷電される)
吸着体とリゾチーム(塩基性タンパク質)との相互作用
が、イオン交換機構を含むことを示す。選択性閾値調節
物のpHを、例えば、酢酸ナトリウム緩衝液中でpH4.5
に、または1%TFA中で2未満に低下すると、酸化ケイ
素吸着体における負電荷をほとんど完全に排除し、そし
てリゾチームは、もはや保持されない。選択性閾値調節
物中に、極性調節化剤(例えば、有機溶媒(例えば、ア
セトニトリル)、または界面活性剤(例えば、Tween2
0)、または尿素を包含することはまた、シリコーン酸
化吸着体とリゾチームとの相互作用を減少する。このこ
とは、他の相互作用機構が、親水性相互作用を含むこと
を示す。
ァイル ニワトリ卵白リゾチームを、酸化ケイ素でコートされ
たステンレススチール基材上にコートされたポリプロピ
レン(C3疎水性)吸着体のクロマトグラフィー連続吸着
体アレイの種々のスポットに添加する。室温で、15分
間、加湿チャンバーにおけるインキュベーション後、吸
着体の各異なるスポットを、以下の溶離物(選択性閾値
調節物)の1つで洗浄する: (1)0.1%TFA、 (2)0.1%TFA中の10%アセトニトリル、 (3)0.1%TFA中の20%アセトニトリル (4)0.1%TFA中の50%アセトニトリル (5)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH7.
0、中の0.05%Tween20、および (6)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH7.
0中の3M尿素。
の洗浄溶液でピペッティングする工程を包含する。この
プロセスは、洗浄溶液の新鮮なアリコートを用いて反復
する。その後、吸着体のスポットを、1μlの水で2回
洗浄する。シナピン酸の0.3μlのアリコート(5mg/ml
50%アセトニトリル:0.5%TFA)を添加し、そして風乾
させる。アレイを、窒素レーザー(355nm)および60cm
フライトチューブを使用して、質量分析器で分析する。
データを、コンピューターによって分析し、そしてデー
タオーバーレイ表示について、GRAMS/32cにエクスポー
トする。
イに対するリゾチーム認識プロファイルの合成マススペ
クトルを示す。下部のプロファイルは、0.1%TFA単独で
の洗浄後の、疎水性C3吸着体に保持されたリゾチームシ
グナル強度を示す。選択性閾値調節物中の極性調節化剤
(例えば、アセトニトリル)の包含は、疎水性C3吸着体
におけるリゾチームの保持を減少する。疎水性C3吸着体
からのリゾチームの溶出についてのアセトニトリル濃度
の範囲は、20〜50%の間である。選択性閾値調節物中
の、界面活性剤(Tween20)、または尿素の包含は、疎
水性C3吸着体におけるリゾチームの保持を有意には減少
しない。
識プロファイル ニワトリ卵白リゾチームを、酸化ケイ素でコートされ
たステンレススチール基材上にコートされたポリスチレ
ン(フェニル疎水性)吸着体の吸着体アレイの種々のス
ポットに添加する。室温で、15分間、加湿チャンバーに
おけるインキュベーション後、吸着体の1つのスポット
を、以下の溶離物(選択性閾値調節物)の1つで洗浄す
る: (1)0.1%TFA、 (2)0.1%TFA中の10%アセトニトリル、 (3)0.1%TFA中の20%アセトニトリル (4)0.1%TFA中の50%アセトニトリル (5)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH7.
0、中の0.05%Tween20、および (6)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH7.
0中の3M尿素。
の洗浄溶液でピペッティングする工程を包含する。この
プロセスは、洗浄溶液の新鮮なアリコートを用いて反復
する。その後、吸着体のスポットを、1μlの水で2回
洗浄する。シナピン酸の0.3μlのアリコート(5mg/ml
50%アセトニトリル:0.5%TFA)を添加し、そして風乾
させる。アレイを、窒素レーザー(355nm)および60cm
フライトチューブを使用して、質量分析器で分析する。
データを、コンピューターによって分析し、そしてデー
タオーバーレイ表示について、GRAMS/32cにエクスポー
トする。
体アレイに対するリゾチーム認識プロファイルの合成マ
ススペクトルを示す。下部のプロファイルは、0.1%TFA
単独での洗浄後の、疎水性フェニル吸着体に保持された
リゾチームシグナル強度を示す。選択性閾値調節物中の
極性調節化剤(例えば、アセトニトリル)の包含は、リ
ゾチームの保持を減少する。疎水性C3吸着体からのリゾ
チームの溶出についてのアセトニトリル濃度の範囲は、
20〜50%の間であるが、C3およびフェニル表面に対して
保持されるリゾチームピーク強度を、同じ20%アセトニ
トリル洗浄条件下で比較する場合、フェニル吸着体との
リゾチールの相互作用は、あまり強力ではない。選択性
閾値調節物中の、界面活性剤(例えば、Tween20)、ま
たは尿素の包含はまた、疎水性フェニル吸着体における
リゾチームの保持を有意に減少する。
ロファイル ニワトリ卵白リゾチームを、酸化ケイ素でコートされ
たステンレススチール基材上にコートされたアニオン基
(SO3 -)吸着体(すなわち、カチオン性交換吸着体)の
吸着体アレイの種々のスポットに添加する。室温で、15
分間、加湿チャンバーにおけるインキュベーション後、
吸着体の各異なるスポットを、以下の溶離物(選択性閾
値調節物)の1つで洗浄する: (1)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0、 (2)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中の0.1M Na
Cl、 (3)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中の0.2M Na
Cl、 (4)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中の0.4M Na
Cl、 (5)25mM酢酸ナトリウム緩衝液、0.125M NaCl、pH4.
5、 (6)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH7.
0中の0.05%Tween20、および (7)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中の3M尿
素。
の洗浄溶液でピペッティングする工程を包含する。この
プロセスを、洗浄溶液の新鮮なアリコートを用いて反復
する。その後、吸着体のスポットを、1μlの水で2回
洗浄する。シナピン酸の0.3μlのアリコート(5mg/ml
50%アセトニトリル:0.5%TFA)を添加し、そして風乾
させる。アレイを、窒素レーザー(355nm)および60cm
フライトチューブを使用して、質量分析器で分析する。
データを、コンピューターによって分析し、そしてデー
タオーバーレイ表示のために、GRAMS/32cにエクスポー
トする。
に対するリゾチーム認識プロファイルの合成マススペク
トルを示す。下部のプロファイルは、pH7緩衝液単独で
の洗浄後の、アニオン性吸着体に保持されたリゾチーム
シグナル強度を示す。選択性閾値調節物中の漸増濃度の
塩化ナトリウム(0.1〜0.4M)の包含は、リゾチームの
保持を減少する。これは、アニオン性吸着体とリゾチー
ム(塩基性タンパク質)との相互作用が、イオン交換機
構を含むことを示す。0.4M NaCl濃度が、リゾチームを
溶出するために必要とされる。選択性閾値調節物のpH
を、酢酸ナトリウム緩衝液中でpH4.5に低下すること
は、強力なアニオン性吸着体におけるリゾチームの保持
を影響しない。選択性閾値調節物中に、極性調節化剤
(例えば、界面活性剤(例えば、Tween20)、または尿
素)を包含することde、アニオン性吸着体とリゾチーム
との相互作用ga減少する。このことは、アニオン性吸着
体と疎水性リゾチームタンパク質との相互作用が、溶離
物の極性によって調節されることを示す。
ロファイル ニワトリ卵白リゾチームを、酸化ケイ素でコートされ
たステンレススチール基板上にコートされたカチオン性
(第4級アミン)吸着体の吸着体アレイの種々のスポッ
トに添加する。室温で、15分間、加湿チャンバーにおけ
るインキュベーション後、吸着体の各異なるスポット
を、以下の溶離物(選択性閾値調節物)の1つで洗浄す
る: (1)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0、 (2)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中の0.1M Na
Cl、 (3)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中の0.2M Na
Cl、 (4)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中の0.4M Na
Cl、 (5)25mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.125M NaCl、pH
4.5、 (6)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH7.
0中の0.05%Tween20、または (7)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中の3M尿
素。
溶液でピペッティングする工程を包含する。このプロセ
スは、洗浄溶液の新鮮なアリコートを用いて反復する。
その後、吸着体のスポットを、1μlの水で2回洗浄す
る。シナピン酸の0.3μlのアリコート(5mg/ml 50%ア
セトニトリル:0.5%TFA)を添加し、そして風乾させ
る。アレイを、窒素レーザー(355nm)および60cmフラ
イトチューブを使用して、質量分析器で分析する。デー
タを、コンピューターによって分析し、そしてデータオ
ーバーレイ表示のために、GRAMS/32cにエクスポートす
る。
トグラフィー連続吸着体アレイに対するリゾチーム認識
プロファイルの合成マススペクトルを示す。カチオン性
吸着体における塩基性リゾチームタンパク質の保持は非
常に弱い。リゾチーム保持に対する選択性閾値調節物を
調節する効果は、極小さい。
ーム認識プロファイル ニワトリ卵白リゾチームを、酸化ケイ素でコートされ
たステンレススチール基材上にコートされた固定化金属
(イミノジアセテート−Cu)吸着体の吸着体アレイの種
々のスポットに添加する。室温で、15分間、加湿チャン
バーにおけるインキュベーション後、吸着体の各異なる
スポットを、以下の溶離物(選択性閾値調節物)の1つ
で洗浄する: (1)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、、0.5M NaCl、pH
7.0、 (2)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、、0.5M NaCl、pH
7.0中の5mMイミダゾール、 (3)0.1M酢酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH4.5、 (4)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH7.
0中の0.05%Tween20、または、 (5)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH7.0
中の3M尿素。
溶液でピペッティングする工程を包含する。このプロセ
スは、洗浄溶液の新鮮なアリコートを用いて反復する。
その後、吸着体のスポットの内外を、1μlの水で2回
洗浄する。シナピン酸の0.3μlのアリコート(5mg/ml
50%アセトニトリル:0.5%TFA)を添加し、そして風乾
させる。アレイを、窒素レーザー(355nm)および60cm
フライトチューブを使用して、質量分析器で分析する。
データを、コンピューターによって分析し、そしてデー
タオーバーレイ表示について、GRAMS/32cにエクスポー
トする。
レイに対するリゾチーム認識プロファイルの合成マスス
ペクトルを示す。下部のプロフールは、pH7緩衝液単独
での洗浄後の固定化銅イオン吸着体に対して保持される
リゾチームシグナル強度を示す。選択性閾値調節物中の
ヒスチジン結合拮抗性アフィニティーリガンド(例え
ば、イミダゾール)の包含は、リゾチームの保持を排除
する。これは、固定化銅イオン吸着体とリゾチーム(こ
れは、配列中に単一のヒスチジン残基を有する)との相
互作用が、配位的な共有結合機構を含むことを示す。選
択性閾値調節物のpHを、酢酸ナトリウム緩衝液中でpH4.
5に低下することはまた、固定化銅吸着体におけるリゾ
チームの保持を減少する。これは、配位的な共有結合相
互作用を阻害する、リゾチームにおけるヒスチジン残基
の水素付加の結果であると考えられる。界面活性剤(す
なわち、Tween20)、の包含は、相互作用を影響しな
い。尿素の包含は、固定化銅吸着体におけるリゾチーム
の保持を完全に排除する。
て、ヒト血清中の被分析物を分別した。これらの結果
は、被分析物が異なる吸着体によって異なって保持され
ること、ならびに被保持物クロマトグラフィーが、低い
および高い分子量の両方で情報を提供し得ることを示
す。
ンパク質認識プロファイル ヒト血清を、酸化ケイ素でコートされたステンレスス
チール基材上にコートされた固定化金属イオン(トリス
(カルボキシメチル)エチレンジアミン−Cu)吸着体の
吸着体アレイの種々のスポットに添加する。室温で、15
分間、加湿チャンバーにおけるインキュベーション後、
吸着体の各異なるスポットを、以下の溶離物(選択性閾
値調節物)の1つで洗浄する: (1)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH7.
0、 (2)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH7.0
中の5mMイミダゾール、 (3)0.1M酢酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH4.5、 (4)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH7.
0中の0.05%Tween20、および (5)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH7.0
中の3M尿素。
溶液でピペッティングする工程を包含する。このプロセ
スは、洗浄溶液の新鮮なアリコートを用いて反復する。
その後、吸着体のスポットを、1μlの水で2回洗浄す
る。シナピン酸の0.3μlのアリコート(5mg/ml 50%ア
セトニトリル:0.5%TFA)を添加し、そして風乾させ
る。アレイを、窒素レーザー(355nm)および60cmフラ
イトチューブを使用して、質量分析器で分析する。デー
タを、コンピューターによって分析し、そしてデータオ
ーバーレイ表示について、GRAMS/32cにエクスポートす
る。
吸着体アレイに対する血清タンパク質認識プロファイル
の、低いおよび高い分子量での合成マススペクトルを示
す。下部のプロファイルは、pH7緩衝液単独での洗浄後
の固定化銅吸着体に保持される血清タンパク質を示す。
選択性閾値調節物中のヒスチジン結合拮抗性アフィニテ
ィーリガンド(例えば、イミダゾール)、または界面活
性剤(例えば、Tween20)、もしくは尿素の包含、また
は選択性閾値調節物のpHの4.5への低下は、同じ吸着体
における複雑なタンパク質混合物の異なる成分の保持
を、異なって増強または減少する。
認識プロファイル ヒト血清を、以下の異なる吸着体の吸着体アレイの種
々のスポットに添加する: (1)C3疎水性、 (2)フェニル疎水性 (3)アニオン交換 (4)カチオン交換、および (5)固定化金属(トリス(カルボキシメチル)エチレ
ンジアミン−Cu)。
ール基材上にコートする。室温で、15分間、加湿チャン
バーにおけるインキュベーション後、吸着体の各スポッ
トを、選択性閾値調節物として20mMリン酸ナトリウム緩
衝液、0.15M NaCl、pH7.0中の0.05%Tween20で洗浄す
る。
溶液でピペッティングする工程を包含する。このプロセ
スは、洗浄溶液の新鮮なアリコートを用いて反復する。
その後、吸着体のスポットを、1μlの水で2回洗浄す
る。シナピン酸の0.3μlのアリコート(5mg/ml 50%ア
セトニトリル:0.5%TFA)を添加し、そして風乾させ
る。アレイを、窒素レーザー(355nm)および60cmフラ
イトチューブを使用して、質量分析器で分析する。デー
タを、コンピューターによって分析し、そしてデータオ
ーバーレイ表示について、GRAMS/32cにエクスポートす
る。
イの種々の吸着体に対する血清タンパク質認識プロファ
イルの合成マススペクトルを示す。複数の異なる吸着体
(異なる結合特性を有する)に対する単一の選択性閾値
調節物の使用は、異なる吸着体における複雑なタンパク
質混合物の異なる成分の保持を、異なって増強または減
少する。
て、早生児尿中の被分析物を分離した。これらの結果
は、吸着体が被分析物を示差的に保持するので、種々の
吸着体の使用が、大きな分離能力を提供することを示
す。これらの結果はまた、精製スキームを開発するため
に有用である、特異的な被分析物を優先的に保持する吸
着体を同定する能力を示す。
生児尿中の被分析物の分離 早生児尿(2μl)を、以下の異なる吸着体でコート
された、炭素処理されたPEEKポリマー基質の種々のスポ
ットに添加する: (1)C8疎水性(Octyl Sepharose、Sigmaから入手可
能)、 (2)フェニル疎水性(Phenyl Sepharose、Sigmaから
入手可能)、 (3)アニオン交換(Q Sepharose、Sigmaから入手可
能)、 (4)カチオン交換(S Sepharose、Sigmaから入手可
能) (5)固定化金属(IDA−Cu、Chelating Sepharose、Ph
armaciaから入手可能)、および (6)固定化金属(トリス(カルボキシメチル)エチレ
ンジアミン−Cu Sepharose)。
ーションの後、吸着体の各スポットを、選択性閾値調節
物として水で洗浄する。各洗浄は、吸着体のスポット
に、3回、1μlの洗浄溶液をピペットで出し入れする
工程を包含する。このプロセスを、洗浄溶液の新鮮なア
リコートを用いて反復する。シナピン酸の0.3μlのア
リコート(5mg/ml 50%アセトニトリル:0.5%TFA)を添
加し、そして風乾させる。アレイを、窒素レーザー(35
5nm)および150cmフライトチューブを使用する、Hewlet
t Packard(Model 2030)からのレーザー脱着/イオン
化飛行時間型質量分析器で分析する。データを、HP MAL
DI TOFソフトウェアによって分析し、そしてデータオー
バーレイ表示について、GRAMS/32cにエクスポートす
る。
の吸着体に対する早生児尿タンパク質認識プロファイル
の、低いまたは高い分子量での混成マススペクトルを示
す。種々の吸着体(それぞれ異なる結合特性を有する)
に対する単一の選択性閾値調節物(すなわち、水)の使
用は、異なる吸着体におけるような複合タンパク質混合
物の異なる成分の保持を、示差的に増強または減少す
る。
よび3つの異なる溶離物を使用する、早生児尿中の被分
析物の分離 早生児尿(2μl)を、フェニル疎水性吸着体(Phen
yl Sepharose、Sigmaから入手可能)でコートされた、
炭素処理されたPEEKポリマー基質の種々のスポットに添
加する。室温で、15分間の、加湿チャンバーにおけるイ
ンキュベーション後、吸着体の各スポットを、以下の溶
離物(選択性閾値調節物)の1つで洗浄する: (1)水、 (2)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH7.
0中の2M尿素、および (3)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH7.
0中の0.1%Tween20。
溶液をピペットで出し入れする工程を包含する。このプ
ロセスを、洗浄溶液の新鮮なアリコートを用いて反復す
る。その後、吸着体のスポットを、1μlの水で2回洗
浄する。シナピン酸溶液の0.3μlのアリコート(5mg/m
l 50%アセトニトリル:0.5%TFA)を添加し、そして風
乾させる。アレイを、窒素レーザー(355nm)および150
cmフライトチューブを使用する、Hewlett Packard(Mod
el 2030)からのレーザー脱着/イオン化飛行時間型質
量分析器で分析する。データを、HP MALDI TOFソフトウ
ェアによって分析し、そしてデータオーバーレイ表示に
ついて、GRAMS/32cにエクスポートする。
ル吸着体に対する早生児尿タンパク質認識プロファイル
の混成マススペクトルを示す。単一の吸着体に対する、
異なる溶出特性を有する種々の溶離物の適用は、複合タ
ンパク質混合物の異なる成分の保持を、示差的に増強ま
たは減少する。成分の1つ(*によって記される)は、
PBS中の01%Tween20が、溶離物として使用される場合、
疎水性フェニル吸着剤に選択的に保持される。
の同定 この実施例は、細胞中で示差的に発現されるタンパク
質の、吸着体アレイ:クロマトグラフィーシリーズでの
同定を説明する。
おいて、同じ期間、培養する。濾過ユニットでの濃縮
後、各培養培地の1μlのアリコートを、基質として
の、酸化ケイ素でコートされたステンレススチールに対
してコートされる固定化金属(トリス(カルボキシメチ
ル)エチレンジアミン−Cu)吸着体の吸着体アレイ(Ci
phergen Biosystems,Inc.Palo Alto,CA)の種々のスポ
ットに添加する。室温で、15分間の、加湿チャンバーに
おけるインキュベーションの後、吸着体のスポットを、
以下の溶離物(選択性閾値調節物)のいずれか1つで洗
浄する: (1)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH7.
0、 (2)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、05M NaCl、pH7.0
中の20mMイミダゾール、 (3)0.1M酢酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH4.5、 (4)20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH7.
0中の0.1%Tween20、 (5)10mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH7.0
中の3M尿素、または (6)1%TFA。
溶液をピペットで出し入れする工程を包含する。このプ
ロセスを、洗浄溶液の新鮮なアリコートを用いて反復す
る。その後、吸着体のスポットを、1μlの水で2回洗
浄する。シナピン酸の0.3μlのアリコート(5mg/ml 50
%アセトニトリル:0.5%トリフルオロ酢酸)を添加し、
そして風乾させる。アレイを、窒素レーザー(355nm)
および60cmフライトチューブを使用する、レーザー脱着
/イオン化飛行時間型質量分析器で分析する。データ
を、コンピューターによって分析し、そしてデータオー
バーレイ表示について、GRAMS/32c(Galactic Industri
es Corporation)にエクスポートする。
リーズ吸着体アレイに対する細胞株1の細胞分泌タンパ
ク質認識プロファイルの混成マススペクトルを示す。単
一の吸着体に対する、異なる選択性閾値の種々の溶離物
の適用は、細胞培養培地のような複合タンパク質混合物
の異なる成分の保持を、示差的に増強または減少する。
リーズ吸着体アレイに対する両方の細胞株の細胞分泌タ
ンパク質認識プロファイルの混成マススペクトルを示
す。同じ溶離物、10mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.5M N
aCl、pH7.0中の0.1%Tween20+3M尿素を使用して、未保
持の物質を洗浄して取り除く。7532Daを示すピークは、
細胞株2において発現されない細胞株1の分泌タンパク
質において、主要な保持されたピークである。
リーズ吸着体アレイに対する細胞株1の細胞分泌タンパ
ク質認識プロファイルの混成マススペクトルを示す。同
じ溶離物、10mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、p
H7.0中の0.1%Tween20+3M尿素を使用するが、異なる表
面相互作用ポテンシャルの吸着体(すなわち、固定化Ni
金属対固定化Cu金属)を用いて、7532Daピークは、全て
の細胞株1の分泌タンパク質の間で唯一保持されるタン
パク質である。挿入図は、拡張された尺度における、同
じマススペクトルを示す。3766Daでのより小さなピーク
は、同じタンパク質の二重に荷電された種である。
方のプロファイル)および後(最上部のプロファイル)
の、固定化金属(Ni)のクロマトグラフィーシリーズ吸
着体アレイに対する細胞株1の細胞分泌タンパク質認識
プロファイルの混成マススペクトルを示す。純粋なタン
パク質について作製されたペプチドマップは、そのタン
パク質のフィンガープリントであり、そして同定のため
に使用され得る。
比較 被保持物クロマトグラフィーの1つの利点は、多様な
次元において被分析物を迅速に分離する能力であり、多
様な物理化学特性についての高い情報量を得ることであ
る。対照的に、2Dゲル電気泳動は、2次元のみにおける
分離を提供する。
性吸着体に対する早生児尿タンパク質認識プロファイル
を示す。種々の溶離物および吸着体の適用は、多次元の
情報を与える。異なる選択条件の使用は、複合タンパク
質混合物(例えば、早生児尿)の種々の成分の保持を、
示差的に増強または減少し、被分析物の詳細な分離を生
じる。
中のタンパク質の2次元分別を示す。被保持物クロマト
グラフィーにおいて吸着体として使用される6次元に比
較して、ゲルは、2次元についてのみの情報を提供す
る。スポットはまた、質量分析方法によって分離され
ず、そして非常に高いおよび非常に低い分子量での分離
は制限される。
で未保持の試料を回収することによって、試料から連続
的に抽出され得る。
ロール50mM EDTA中に調製した。遠心分離後、上清を、2
5mM HEPES、pH7.4中の0.01%Triton X100に、1:3に希釈
した。希釈した試料の2μlのアリコートを、吸着体ア
レイのアニオン性部位のスポットに添加した。室温での
30分間のインキュベーション後、アニオン性部位におけ
る残余の試料を、吸着体アレイの正常相部位のスポット
に移した。アニオン性部位のスポットを、2μlの0.01
%Triton X100 25mM HEPESで、2回、洗浄した。各洗浄
は、10回、スポットに洗浄溶液をピペットで出し入れす
ることによって達成した。洗浄液を、正常相スポットに
最初に添加した試料と合わせた。
ける残余の試料を、吸着体アレイNi(II)部位のスポッ
トに移した。正常相部位のスポットを、2μlのリン酸
緩衝化生理食塩水で、2回、洗浄した。各洗浄を、10
回、スポットに洗浄溶液をピペットで出し入れすること
によって達成した。洗浄液を、Ni(II)スポットに最初
に添加した試料と合わせた。
濃縮したのち、未結合の被分析物を、2μlの、リン酸
緩衝化生理食塩水中の100mMイミダゾールで、2回、洗
浄することによって回収した。各洗浄を、10回、スポッ
トに洗浄溶液をピペットで出し入れすることによって達
成した。洗浄液を、吸着体アレイ脂肪族疎水性部位のス
ポットに移した。
濃縮させ、未結合の被分析物を、2μlの、0.1%トリ
フルオロ酢酸中の5%アセトニトリルで、2回、洗浄す
ることによって除去した。各洗浄を、10回、スポットに
洗浄溶液をピペットで出し入れすることによって達成し
た。
各スポットを、2μlの水で洗浄して、残余の緩衝液を
除去した。50%アセトニトリル0.5%トリフルオロ酢酸
中のシナピン酸溶液の0.3μlのアリコートを、各スポ
ットに添加した。各部位に保持された被分析物を、レー
ザー脱着/イオン化飛行時間型質量分析器で分析した。
物の保持マップを示す。質量範囲3000〜25000Daにおけ
る複数のピークを、吸着体において観察した。各吸着体
が、試料中のそれぞれの被分析物について、異なる保持
を示すことに注意のこと。
結合特性または溶出特性を付加することによって、被分
析物の改善された分離を提供する選択条件を開発し得
る。この例において、試料を、Cu(II)吸着体に結合
し、そして1つの第1の溶離剤および2つの第2の溶離
物に曝露した。第2の溶離物は、別の溶出条件の付加に
よって、第1の溶離物とは異なる。各付加された条件
は、被分析物の分離を改善した。
定常状態の溶解物を、20mMリン酸ナトリウム、0.5M塩化
ナトリウム、pH7.0中に1:1希釈した。遠心分離後、上清
の150μlのアリコートを、バイオプロセッサーにおい
て、吸着体アレイCu(II)部位の各スポットとともに、
インキュベートした。30分間低温で混合した後、試料を
取り出した。各スポットを、異なる溶解物で洗浄した。
最初のスポットを、150μlの20mMリン酸ナトリウム、
0.5M塩化ナトリウム、pH7.0で洗浄した。第2のスポッ
トを、20mMリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、pH7.0に加
えた150μlの0.05%Triton X100の150μlで洗浄し
た。第3のスポットを、20mMリン酸ナトリウム、0.15M
NaCl、pH7.0に加えた150μlの100mMイミダゾールで洗
浄した。各洗浄を、混合しながら、5分間、スポットと
ともに洗浄溶液をインキュベートすることによって達成
した。洗浄を、2回、反復した。各スポットを水で洗浄
して、界面活性剤および緩衝液を除去した。
50%アセトニトリル0.5%トリフルオロ酢酸中のシナピ
ン酸溶液の0.3μlのアリコートを、各スポットに添加
した。各スポットに保持された被分析物を、レーザー脱
着/イオン化飛行時間型質量分析器で分析した。
吸着体アレイCu(II)部位におけるHemophilus溶解物の
保持マップを示す。質量範囲2000〜18000Daにおける複
数のピークが観察された。「*」で記されるタンパク質
は、図20Aの保持マップにおけるごく少数の成分であ
る。選択条件が、界面活性剤であるTriton X100の同じ
緩衝液への添加によって改変された場合(図20B)、同
じタンパク質「*」は、他の被分析物よりも良好に保持
され、そして良好に分離された。選択条件が、アフィニ
ティー排除物質であるイミダゾールの同じ緩衝液への添
加によって改変された場合(図20C)、タンパク
質「*」は、被保持物マップにおいて他の被分析物から
高度に分離された。
前進的な同定のこのストラテジーは、全Hemophilus溶解
物からこのタンパク質を調製的に精製するための方法を
開発するために採用され得る。
見。
リコートを、等容量の20mMリン酸緩衝液、0.5M NaCl、p
H7.0で希釈した。それぞれ、吸着体アレイCu(II)部位
における異なるスポットに適用した。4℃で1時間のイ
ンキュベーション後、各スポットを2μlの20mMリン酸
ナトリウム、0.5M NaCl、pH7.0で、2回洗浄した。各洗
浄は、10回、スポットに洗浄溶液をピペットで出し入れ
することによって達成した。各スポットを最終的に2μ
lの水で洗浄して、残余の緩衝液を除去した。50%アセ
トニトリル0.5%トリフルオロ酢酸中のシナピン酸溶液
の0.3μlのアリコートを、各スポットに添加した。各
スポットに保持された被分析物を、レーザー脱着/イオ
ン化飛行時間型質量分析器で分析した。
常な血清におけるよりも疾患の血清において有意に多い
量で存在する。結果は、臨床的診断に使用され得る疾患
マーカーの発見のための方法を説明する。
たマウス尿の1μlのアリコートを、吸着体アレイCu
(II)部位の異なるスポットに適用した。室温で10分間
のインキュベーション後、各スポットを、20mMリン酸ナ
トリウム、0.15M NaCl、pH7.0中の2μlの100mMイミダ
ゾールで、2回洗浄した、各洗浄は、10回、スポットに
洗浄溶液をピペットで出し入れすることによって達成し
た。各スポットを最終的に2μlの水で洗浄して、残余
の緩衝液を除去した。50%アセトニトリル0.5%トリフ
ルオロ酢酸中のシナピン酸溶液の0.3μlのアリコート
を、各スポットに添加した。各スポットに保持された被
分析物を、レーザー脱着/イオン化飛行時間型質量分析
器で分析した。
よび薬物処置したマウス尿の被保持物マップを、図1に
示す。1つの被分析物は、疾患のマウス尿において非常
に高い量で存在することが見出され(真ん中のパネ
ル)、同じ被分析物は、正常なマウス尿においては見出
されず(上部のパネル)、そして非常に減少された量
で、薬物処置したマウス尿において見出された(下部の
パネル)。この被分析物は、潜在的な疾患マーカーとし
て使用され得る。定量的な診断アッセイの実行可能性を
説明するために、保持されたマーカータンパク質のピー
ク下の面積を算定し、そして表において示す。明らかな
定量的差異が、疾患マウス尿と薬物処理されたマウス尿
との間に観察される。実験の変動性について補正するた
めに、内部標準被分析物を使用した。各尿試料について
の正規化された疾患マーカーのピーク面積(すなわち、
内部標準のピーク面積で割ったマーカーのピーク面積)
を、下部のパネルに示す。薬物処置後に、疾患尿マーカ
ーの少なくとも10倍の減少が存在する。
生理食塩水中の0.01%Triton X100中に1:2に希釈した。
正常なヒト尿または疾患のヒト尿の1.5μlのアリコー
トを、0.5μlのイソプロパノール/アセトニトリル
(1:2)0.1%トリフルオロ酢酸で予め湿潤した吸着体ア
レイ脂肪族疎水性部位の異なるスポットに適用した。4
℃で30分間のインキュベーション後、各スポットを、2
μlの、10mM TrisHCl、0.05M NaCl、pH7.5中の50%エ
チレングリコールで、2回洗浄した。各洗浄は、10回、
スポットに洗浄溶液をピペットで出し入れすることによ
って達成した。各スポットを最終的に2μlの水で洗浄
して、残余のエチレングリコールおよび緩衝液を除去し
た。50%アセトニトリル0.5%トリフルオロ酢酸中のシ
ナピン酸溶液の0.3μlのアリコートを、各スポットに
添加した。各スポットに保持された被分析物を、レーザ
ー脱着/イオン化飛行時間型質量分析器で分析した。
プを、図23Aに示す。複数のタンパク質ピークが、Tris/
NaCl緩衝液中の50%エチレングリコールでの洗浄後に、
吸着体アレイ疎水性部位において保持された。可変な疾
患マーカーを同定するために、個々の患者の尿と正常な
尿との間の差異マップをプロットした。ベースラインを
超える差異プロットにおける各棒は、患者の尿により高
い量で存在する被分析物を示す。(図23B〜23D)。患者
の差異マップのパターンにおける変化は、集団における
個々の変動を反映する。しかし、約5000Da(*で記す)
の1つの被分析物、および約75000Da(*で示す)の被
分析物の塊は、全ての患者においてより高い量で一貫し
て存在することが見出され、それゆえ、これらは、潜在
的な疾患マーカーとして同定され得る。
着分光測定法によって検出され得る。吸着体として使用
される、ウイルスコートタンパク質に対する抗体は、ウ
イルスを捕獲し得る。吸着体として使用される標的タン
パク質は、標的に対して1本鎖抗体を示すファージを捕
獲し枝る。
EPES、pH7.4中の0.01%Triton X100に連続希釈した。そ
れぞれの希釈したファージ懸濁液の0.25μlのアリコー
トを、吸着体アレイ脂肪族疎水性部位のスポットに添加
した。50%アセトニトリル、0.5%トリフルオロ酢酸中
のCHCAの0.3μlのアリコートを添加した。試料を、レ
ーザー脱着/イオン化飛行時間型質量分析器によって分
析した。
て高い感度で検出した。図24A〜24E。検出可能なシグナ
ル(シグナル/ノイズ>2)が、ファージ懸濁液を、1
0,000,000倍に希釈した場合に、得られた。
D(BioSepra)上に固定化し、そしてリン酸緩衝化生理
食塩水、pH7で、広範囲に洗浄した。増殖培地中のM13フ
ァージ(1012粒子/ml)の1〜10μl懸濁液のアリコー
トを、4℃にて一晩、固定化された抗M13抗体の1μl
のアリコートとともにインキュベートした。リン酸緩衝
化生理食塩水、pH7中の0.05%Tween20で洗浄し、次いで
水で洗浄して界面活性剤および緩衝液を除去した後、捕
獲されたファージのアリコートを、シナピン酸の存在
下、レーザー脱着/イオン化飛行時間型質量分析器で分
析した。
gly)におよび二重(doubly)に荷電された)のみを示
す。図25A。M13ファージが、抗体によって捕獲される場
合、ファージからの最も容易に固定され得るタンパク質
ピークは、遺伝子VIIIタンパク質、および1本鎖抗体と
の遺伝子IIIタンパク質の融合物である。図25B。M13フ
ァージ遺伝子VIIIタンパク質は、この方法によって非常
に高い効率で検出されるので、この方法は、ファージ捕
獲の感度の高いモニターとして使用され得る。
予め活性化した基質に結合させた。エタノールアミンで
のブロッキング後、アレイを、リン酸緩衝化生理食塩
水、pH7中の0.005%Tween20、次いでリン酸緩衝化生理
食塩水、pH7中の0.1%BSAで洗浄した。Tatタンパク質に
対して1本鎖抗体を示すM13ファージの連続希釈を、4
℃で一晩、Tatタンパク質吸着体アレイとともにインキ
ュベートした。Tatタンパク質に対して1本鎖抗体を示
さないM13ファージの連続希釈のネガティブコントロー
ルもまた、同じ方法で、Tatタンパク質吸着体アレイと
ともにインキュベートした。アレイを、リン酸緩衝化生
理食塩水中の0.05%Tween20で洗浄し、次いで、リン酸
緩衝化生理食塩水、pH7.0中の1M尿素で洗浄し、そして
最後に水で洗浄して緩衝液および尿素を除去した。50%
アセトニトリル0.5%トリフルオロ酢酸中のCHCAの0.3μ
lのアリコートを、添加した。保持されたファージを、
レーザー脱着/イオン化飛行時間型質量分析器で分析す
る。
の特異的な結合を、濃度依存性の様式において観察した
(実線)。図26A〜26D。非特異的なM13ファージによる
非特異的な結合は、吸着体アレイにおいて最小であった
(破線)。これらの結果は、標的被分析物を特異的に認
識する1本鎖抗体をコードする遺伝子を含むファージを
検出する、非常に感度が高い方法を説明する。
するか否かを決定するためのスクリーニング 本発明の方法は、試験因子が、レセプターに対するリ
ガンドの結合を調節するか否かを決定するために使用さ
れ得る。この例において、本発明者らは、被保持物クロ
マトグラフィーが、TGF−βと、遊離TGF−βレセプター
による吸着体として使用される結合したTGF−βレセプ
ターとの間の結合の阻害を検出し得ることを示す。
&D、Minnesota)を、プロテインG吸着体アレイ上に
特異的に結合した。TGF−β(R&D、Minnesota)を、
細胞馴化培地(2.5×濃縮化)に連続希釈し、そして4
℃で一晩、レセプター−FcプロテインG吸着体アレイと
ともにインキュベートした。細胞馴化培地中の連続希釈
したTGF−βの別のセットを、調節化剤の存在下、レセ
プター−FcプロテインG吸着体アレイとともにインキュ
ベートした。この説明において、調節化剤は、遊離のTG
F−βレセプターであった。同じ条件下でのインキュベ
ーション後、チップを、PBS中の0.05%Triton X100、次
いでPBS中の3M尿素で洗浄した。シナピン酸の0.3μlの
アリコートを、各スポットに添加し、そしてレーザー脱
着/イオン化飛行時間型質量分析法によって分析した。
への、1μg/ml TGF−βの特異的な結合を示す(実
線)。細胞馴化培地中のタンパク質は、結合されること
が、ほとんどまたは全く見出されなかった。図27Bは、
レセプター−FcプロテインG吸着体アレイへの、100ng/
mlのTGF−βの特異的な結合を示す(実線)。TGF−βお
よびレセプター−FcプロテインG吸着体アレイのインキ
ュベーションが、調節化剤(遊離のTGF−βレセプタ
ー)の存在下で行われた場合、100ng/mlのTGF−βが存
在する場合、結合は完全に排除され(図27A、破線)、
そして1μg/mlのTGF−βが存在した場合、僅かな結合
のみであった(図27B、破線)。この説明において、調
節化剤(同じレセプター)は、リガンドに対して高い特
異的な結合親和性を有し、従って標的被分析物結合事象
の非常に効果的な拮抗を提供する。他の場合において、
調節化剤の存在下および不在下で吸着体に結合される標
的被分析物の比率は、調節化剤の抗力の指標を与える。
る選択条件下での試料のその平行な(Parallel)工程
で、試料中のタンパク質を分離する能力を実証する。
ール中に調製した。遠心分離後、上清を、25mM HEPES、
pH7.4中の0.01%Triton X100中で、1:3に希釈した。希
釈した試料の2μlのアリコートを、吸着体アレイのカ
チオン性部位のスポットに添加した。室温で30分間のイ
ンキュベーション後、スポットを25mM HEPES、pH7.4で
洗浄した。希釈物試料の2μlの第2のアリコートを、
吸着体アレイ脂肪族疎水性部位のスポットに添加した。
室温で30分間のインキュベーション後、スポットを水で
洗浄した。希釈した試料の2μlの第3のアリコート
を、吸着体アレイCu(II)部位のスポットに添加した。
室温で30分間のインキュベーション後、リン酸緩衝化生
理食塩水、pH7.4中の0.05%Triton X100で、スポットを
洗浄した。50%アセトニトリル0.5%トリフルオロ酢酸
中のシナピン酸溶液の0.3μlのアリコートを、各スポ
ットに添加した。各部位に保持された被分析物を、レー
ザー脱着/イオン化飛行時間型質量分析器で分析した。
の計数は、約550であった。結果は、平行する複数の被
分析物の分別および検出を包含する、組合せ的な分別に
ついての方法を説明する。
する方法を例示する。次いで、二次吸着体は、標的被分
析物についての特異的な吸着体として作用する。
2中で希釈されたGST融合レセプターの0.5μlのアリコ
ートを、吸着体アレイの通常の部位のスポットに添加し
た。溶液を、ほとんど乾燥するまでスポット上で濃縮さ
せた。スポットを、2μlの10mM Tris、50mM塩化ナト
リウム、pH7.2で、3回、洗浄した。各洗浄は、吸着体
のスポットに、洗浄溶液を5回、ピペットで出し入れす
ることによって達成された。このスポットを、最終的に
2μlの水で2回洗浄して、残余の緩衝液を除去した。
50%アセトニトリル、0.5%トリフルオロ酢酸中のシナ
ピン酸溶液の0.3μlのアリコートをスポットに添加し
た。保持されたGST融合レセプターを、レーザー脱着/
イオン化飛行時間型質量分析器で分析した。(図32。) 20mM Tris、100mM塩化ナトリウム、0.4%NP40、pH7.2
中のGST融合レセプターの0.5μlのアリコートを、吸着
体アレイの通常の部位のスポットに添加した。GSTタン
パク質のみを含有する試料(レセプターを含有しない)
を、ネガティブコントロールとして、別のスポットに適
用した。溶液を、ほとんど乾燥するまでスポット上で濃
縮させた。10mM Tris、50mM塩化ナトリウム、pH7.2の0.
5μlを、各スポットに添加した。溶液を、室温にて10
秒間の放置後、ピペットを使用して取り出した。
異的なリガンドを含有する溶液の1μlのアリコート
を、各スポットに即座に添加した。吸着体アレイを、室
温で1時間、加湿チャンバーにおいてインキュベートし
た。各スポットを2μlの、水中の30%イソプロパノー
ル:アセトニトリル(1:2)で、2回洗浄した。各洗浄
は、10回、スポットに洗浄溶液をピペットで出し入れす
ることによって達成した。50%アセトニトリル、0.5%
トリフルオロ酢酸中のα−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮
酸溶液の0.3μlのアリコートを、スポットに添加し
た。レセプター上に捕獲されたリガンドを、レーザー脱
着/イオン化飛行時間型質量分析器で分析した。
捕獲するGST融合レセプターへの、96個の他のリガンド
のライブラリー以外の特異的なリガンドの結合を示す。
図33Bは、実験のネガティブコントロールとして作用す
る同じアレイに捕獲されたGSTタンパク質単独(レセプ
ターを含有しない)へのリガンドの結合は存在しないこ
とを示す。
規な物質および方法を提供する。特定の例が提供された
が、上述の記載は、例示的なものであって、限定的なも
のではない。本発明の多くの変形が、本明細書を検討す
る際に、当業者に明らかになる。それゆえ、本発明の範
囲は、上述の記載を参照して決定されるべきでないが、
その代わりに添付の請求の範囲に沿って、それらの十分
な範囲の等価物とともに参照することによって決定され
るべきである。
類は、各個々の刊行物または特許書類が、個々に記載さ
れるのと同じ程度に、全ての目的のためにそれらの全体
が参考として援用される。この書類における種々の参考
文献のこれらの引用により、出願人らは、任意の特定の
参考文献が出願人らの発明に対する「先行技術」である
ことを認めない。
Claims (47)
- 【請求項1】第1の生物学的試料および第2の生物学的
試料中に示差的に存在する被分析物を同定するための方
法であって、以下の工程: (a)該第1の試料および該第2の試料が曝露される、
複数の異なる選択条件を選択する工程であって、ここ
で: i)各々の該選択条件は、吸着体および溶離物によって
定義され; ii)各々の該異なる選択条件は、異なる吸着体および、
同じかまたは異なる溶離物を含み;そして iii)選択条件に試料を曝露することが、試料を基材結
合吸着体に接触させること、および溶離物で該吸着体を
洗浄して、該試料中の被分析物を該吸着体によって保持
させることを含む、 工程; (b)該第1の試料中の被分析物を: i)該第1の試料を、並行して、該異なる選択条件の各
々に曝露すること、および ii)該吸着体によって保持された該被分析物を、質量分
析、ここで該質量分析が、エネルギー源を用いての被分
析物の該吸着体からの脱離およびイオン化、および検出
器を用いる脱離およびイオン化した被分析物の検出を含
む、によって検出すること、 によって検出する工程; (c)該第2の試料中の被分析物を: i)該第2の試料を、並行して、該異なる選択条件の各
々に曝露すること、および ii)該吸着体によって保持された該被分析物を、質量分
析によって検出すること、 によって検出する工程;ならびに (d)該第1の生物学的試料中で検出された被分析物
を、該第2の生物学的試料中で検出した被分析物と比較
して、該第1の生物学的試料中および該第2の生物学的
試料中に示差的に存在する被分析物を同定する、工程、 を包含する、方法。 - 【請求項2】請求項1に記載の方法であって、前記第1
の生物学的試料が健常被験体に由来し、そして前記第2
の生物学的試料が病理学的状態に罹患している被験体に
由来する、方法。 - 【請求項3】前記生物学的試料が、第1の細胞抽出物お
よび第2の細胞抽出物を含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】前記第1の試料および第2の試料中で検出
された被分析物を比較する工程が、プログラム可能なデ
ジタルコンピュータで実行される、請求項1に記載の方
法。 - 【請求項5】請求項1に記載の方法であって、ここで前
記異なる吸着体が引力のための異なる基礎を有し、そし
て該引力の基礎が、疎水性相互作用吸着体;親水性相互
作用吸着体;アニオン性相互作用吸着体;カチオン性相
互作用吸着体;配位共有結合相互作用吸着体;親硫黄性
相互作用吸着体;および糖タンパク質相互作用吸着体か
らなる群より選択される、方法。 - 【請求項6】前記異なる吸着体が、異なる生体特異的吸
着体である、請求項1に記載の方法。 - 【請求項7】前記溶離物が同一である、請求項1に記載
の方法。 - 【請求項8】請求項1に記載の方法であって、前記溶離
物が、pHに基づく溶離物、イオン強度に基づく溶離物、
水の構造に基づく溶離物、界面活性剤に基づく溶離物、
および疎水性に基づく溶離物、からなる群より選択され
る、方法。 - 【請求項9】少なくとも4つの異なる選択条件を選択す
ることを包含する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項10】工程(a)の前に、前記第1の生物学的
試料に薬剤を与えるが前記第2の生物学的試料には該薬
剤を与えない工程をさらに包含する、請求項1に記載の
方法。 - 【請求項11】工程(b)および(c)における吸着体
と同じ吸着体を含むが該工程(b)および(c)におけ
る溶離物と異なる溶離物を含む選択条件の並行セットを
使用して、工程(b)および(c)を反復することを包
含する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項12】検出工程の前に、被分析物を、該被分析
物の分子量よりも小さい分子量を有する少なくとも1つ
のフラグメントに転換する工程を包含する、請求項1に
記載の方法。 - 【請求項13】前記試料が、血液、尿、血清、および組
織からなる群より選択される、請求項2に記載の方法。 - 【請求項14】前記第1の生物学的試料中におけるより
も前記第2の生物学的試料中により大量に存在する被分
析物を同定する工程をさらに包含し、それによって該被
分析物が病理学的状態についての候補診断マーカーとし
て同定される、請求項2に記載の方法。 - 【請求項15】前記第1の細胞抽出物が健常細胞に由来
し、そして前記第2の細胞抽出物がガン細胞に由来す
る、請求項3に記載の方法。 - 【請求項16】前記第1の細胞抽出物が健常細胞に由来
し、そして前記第2の細胞抽出物が病理学的細胞に由来
する、請求項3に記載の方法。 - 【請求項17】請求項9に記載の方法であって、ここで
前記少なくとも4つの異なる選択条件が、引力について
の異なる基礎を有する吸着体によって規定され、そして
該引力の基礎が、疎水性相互作用吸着体;親水性相互作
用吸着体;アニオン性相互作用吸着体;カチオン性相互
作用吸着体;配位共有結合相互作用吸着体;親硫黄性相
互作用吸着体;および糖タンパク質相互作用吸着体から
なる群より選択される、方法。 - 【請求項18】前記被分析物が核酸を含む、請求項1〜
17のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項19】前記被分析物が炭水化物を含む、請求項
1〜17のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項20】前記被分析物がポリペプチドを含む、請
求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項21】請求項1〜20のいずれか1項に記載の方
法であって、前記吸着体が、着脱可能に挿入可能なプロ
ーブの形態で質量分析装置中に提供され、ここで該プロ
ーブが表面を有する基材を含み、かつ該吸着体が、エネ
ルギー源によってアドレス可能なあらかじめ決定された
位置で該表面に付着される、方法。 - 【請求項22】請求項1〜20のいずれか1項に記載の方
法であって、前記吸着体が、該吸着体が付着される固相
を含むビーズの形態で供給され、そして前記試料を該吸
着体に接触させる工程の後で、該ビーズが、質量分析装
置中に着脱可能に挿入可能であるプローブの表面に、エ
ネルギー源によってアドレス可能な表面上のあらかじめ
決定された位置に配置される、方法。 - 【請求項23】前記質量分析がレーザー脱離/イオン化
質量分析である、請求項1〜22のいずれか1項に記載の
方法。 - 【請求項24】質量分析の前に、前記被分析物をエネル
ギー吸収分子と接触させる工程をさらに包含する、請求
項23に記載の方法。 - 【請求項25】第1の生物学的試料および第2の生物学
的試料中に示差的に存在する被分析物を同定するための
方法であって、以下の工程: (a)該第1の試料および該第2の試料が曝露される、
複数の異なる選択条件を選択する工程であって、ここ
で: i)各々の該選択条件は、吸着体および溶離物によって
定義され; ii)各々の該異なる選択条件は、同じ吸着体および異な
る溶離物を含み;そして iii)選択条件に試料を曝露することが、試料を基材結
合吸着体に接触させること、および溶離物で該吸着体を
洗浄して、該試料中の被分析物を該吸着体によって保持
させることを含む、 工程; (b)該第1の試料中の被分析物を: i)該第1の試料を、並行して、該異なる選択条件の各
々に曝露すること、および ii)該吸着体によって保持された該被分析物を、質量分
析、ここで該質量分析が、エネルギー源を用いての被分
析物の該吸着体からの脱離およびイオン化、および検出
器を用いる脱離およびイオン化した被分析物の検出を含
む、によって検出すること、 によって検出する工程; (c)該第2の試料中の被分析物を: i)該第2の試料を、並行して、該異なる選択条件の各
々に曝露すること、および ii)該吸着体によって保持された該被分析物を、質量分
析によって検出すること、 によって検出する工程;ならびに (d)該第1の生物学的試料中で検出された被分析物
を、該第2の生物学的試料中で検出した被分析物と比較
して、該第1の生物学的試料中および該第2の生物学的
試料中に示差的に存在する被分析物を同定する、工程、 を包含する、方法。 - 【請求項26】請求項25に記載の方法であって、前記第
1の生物学的試料が健常被験体に由来し、そして前記第
2の生物学的試料が病理学的状態に罹患している被験体
に由来する、方法。 - 【請求項27】前記生物学的試料が、第1の細胞抽出物
および第2の細胞抽出物を含む、請求項25に記載の方
法。 - 【請求項28】前記第1の試料および第2の試料中で検
出された被分析物を比較する工程が、プログラム可能な
デジタルコンピュータで実行される、請求項25に記載の
方法。 - 【請求項29】請求項25に記載の方法であって、ここで
前記吸着体が、疎水性相互作用吸着体;親水性相互作用
吸着体;アニオン性相互作用吸着体;カチオン性相互作
用吸着体;配位共有結合相互作用吸着体;親硫黄性相互
作用吸着体;および糖タンパク質相互作用吸着体からな
る群より選択される、引力についての基礎を有する、方
法。 - 【請求項30】前記吸着体が生体特異性吸着体である、
請求項25に記載の方法。 - 【請求項31】請求項25に記載の方法であって、前記異
なる溶離物が異なる溶離特性を有し、そして該溶離特性
が、pHに基づく溶離物、イオン強度に基づく溶離物、水
の構造に基づく溶離物、界面活性剤に基づく溶離物、お
よび疎水性に基づく溶離物、からなる群より選択され
る、方法。 - 【請求項32】少なくとも4つの異なる選択条件を選択
する、請求項25に記載の方法。 - 【請求項33】工程(a)の前に、前記第1の生物学的
試料に薬剤を与えるが前記第2の生物学的試料には該薬
剤を与えない工程を包含する、請求項25に記載の方法。 - 【請求項34】工程(b)および(c)における吸着体
と同じ吸着体を含むが該工程(b)および(c)におけ
る溶離物と異なる溶離物を含む選択条件の並行セットを
使用して、工程(b)および(c)を反復する、請求項
25に記載の方法。 - 【請求項35】検出工程の前に、被分析物を、該被分析
物の分子量よりも小さい分子量を有する少なくとも1つ
のフラグメントに転換する工程を包含する、請求項25に
記載の方法。 - 【請求項36】前記試料が、血液、尿、血清、および組
織からなる群より選択される、請求項26に記載の方法。 - 【請求項37】前記第1の生物学的試料中におけるより
も前記第2の生物学的試料中により大量に存在する被分
析物を同定する工程を包含し、それによって該被分析物
が病理学的状態についての候補診断マーカーとして同定
される、請求項26に記載の方法。 - 【請求項38】前記第1の細胞抽出物が健常細胞に由来
し、そして前記第2の細胞抽出物がガン細胞に由来す
る、請求項27に記載の方法。 - 【請求項39】前記第1の細胞抽出物が健常細胞に由来
し、そして前記第2の細胞抽出物が病理学的細胞に由来
する、請求項27に記載の方法。 - 【請求項40】請求項32に記載の方法であって、ここで
前記少なくとも4つの異なる選択条件が異なる溶離特性
を有する規定された溶離物であり、そして該溶離特性
は、pHに基づく溶離物、イオン強度に基づく溶離物、水
の構造に基づく溶離物、界面活性剤に基づく溶離物、お
よび疎水性に基づく溶離物、からなる群より選択され
る、方法。 - 【請求項41】前記被分析物が核酸を含む、請求項25〜
40のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項42】前記被分析物が炭水化物を含む、請求項
25〜40のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項43】前記被分析物がポリペプチドを含む、請
求項25〜40のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項44】請求項25〜43のいずれか1項に記載の方
法であって、前記吸着体が、着脱可能に挿入可能なプロ
ーブの形態で質量分析装置中に提供され、ここで該プロ
ーブが表面を有する基材を含み、かつ該吸着体が、エネ
ルギー源によってアドレス可能なあらかじめ決定された
位置で該表面に付着される、方法。 - 【請求項45】請求項25〜43のいずれか1項に記載の方
法であって、ここで前記吸着体が、該吸着体が付着され
る固相を含むビーズの形態で供給され、そして前記試料
を該吸着体に接触させる工程の後で、該ビーズが質量分
析装置中に着脱可能に挿入可能であるプローブの表面
に、エネルギー源によってアドレス可能な表面上のあら
かじめ決定された位置に配置される、方法。 - 【請求項46】前記質量分析がレーザー脱離/イオン化
質量分析である、請求項25〜43のいずれか1項に記載の
方法。 - 【請求項47】質量分析の前に、前記被分析物をエネル
ギー吸収分子と接触させる工程をさらに包含する、請求
項46に記載の方法。
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