JP4577083B2

JP4577083B2 - クローン病の診断方法

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Publication number: JP4577083B2
Application number: JP2005133387A
Authority: JP
Inventors: 能啓福田; 秀樹鈴木; 朗子大貫; 学鈴木
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2005-04-28
Filing date: 2005-04-28
Publication date: 2010-11-10
Anticipated expiration: 2025-04-28
Also published as: JP2006308494A

Description

本発明は、クローン病を安全かつ高感度で特異的に診断する方法、及びその診断に使用する診断用キットに関する。

クローン病は、免疫学的応答の異常に基づく局所の炎症性腸疾患と類別される疾患である。その病変は口腔から肛門までの消化管の全ての部位でも起こり得るが、主たる発症部位は小腸と大腸であり、発症（病変）部位により小腸のみ（小腸型）、大腸のみ（大腸型）、及び小腸大腸型に分類され、小腸大腸型は更に小腸に優位な病変がある小腸大腸型（小腸優位の小腸大腸型）、大腸に優位な病変がある小腸大腸型（大腸優位の小腸大腸型）に分類される。臨床症状としては、腸管粘膜や粘膜下層に潰瘍を形成し、腹痛、下痢、発熱、あるいは体重減少等の消化管疾患における一般的な症状のほか、病変の部位によっては、貧血、栄養障害、関節炎、肝障害などの全身性合併症を併発する場合がある。
しかし、クローン病の病因は未だ解明しきれていないためその診断と治療には自ずから限界があった。
例えば、その診断は、臨床所見のほか、Ｘ線造影検査、内視鏡検査、内視鏡下に採取した生検標本の組織検査などを総合的に判断して行われて来たが、これらの検査は、検査前の腸管内部清浄に時間を要し、造影剤の投与や内視鏡の腸管への挿入など、患者に対し肉体的・精神的に多大の負担を与えるものであるうえ、手技及び判別に経験と熟練した技術を必要とする。
殊に、小腸型又は小腸優位の小腸大腸型の場合、小腸の構造の複雑さ及び発症部位が内視鏡の挿入部（肛門又は口腔）から遠いことなどの理由で、Ｘ線造影検査或いは内視鏡による検査は、一層高度の技術を要する。
また、類似した病理所見を示す潰瘍性大腸炎などの他の炎症性腸疾患との鑑別が困難なケースも多く、安全で簡便、かつクローン病に特異的な診断方法が求められている。

ところで、近年になって、抗Saccharomyces cerevisiae抗体（ＡＳＣＡ）、抗Ｉ２抗体、抗外膜タンパク質Ｃ（ＯｍｐＣ）抗体、抗フラジェリン抗体、抗ＣＤＰ抗体、抗ブタアミラーゼ抗体などが、クローン病患者の血清中に特異的に増加していることの報告があり、これらの知見に基づき、該抗体を検出することによってクローン病を診断する非侵襲的診断方法が提案されている（特許文献１及び２、非特許文献１〜３）。
しかし、これらの方法はいずれも、感度（クローン病患者中の陽性率）がたかだか４０％程度に止まり、更に、Ｉ２抗原、ＯｍｐＣ抗原、フラジェリン抗原、ＣＤＰ抗原は、入手が困難であるなどの問題がある。
特開平１１−１９０７３４号公報特表２００４−５２６１２２号公報 Jpn J Electroph 1999；43：139-145 GASTROENTEROLOGY，2002；123：689-699 GASTROENTEROLOGY，2000；119：23-31

本発明が解決しようとする課題は、クローン病を、安全で簡便に、かつ特異的に診断する方法、及びその診断のために使用する診断用キットを提供することにある。

本発明者らは、前記課題の解決について研究を重ねた結果、ＡＳＣＡ及び／又は抗Ｉ２抗体に対して陰性の患者の中に、相当頻度で抗ブタアミラーゼ抗体に対して陽性のものが存在すること、また、抗ブタアミラーゼ抗体が、小腸型又は小腸優位の小腸大腸型クローン病患者の血液中に特異的に増加することを見出し、この知見に基づいて、クローン病が疑われる患者の検体中の抗ブタアミラーゼ抗体とＡＳＣＡ及び／又は抗Ｉ２抗体の２種又は３種を測定することにより、クローン病を特異的に高感度で診断できること、また、抗ブタアミラーゼ抗体を測定することにより、小腸型又は小腸優位の小腸大腸型クローン病を特異的に診断できることを確認して本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下のとおりのものである。

（１）抗ブタアミラーゼ抗体と抗サッカロミセスセルビシエ抗体及び／又は抗Ｉ２抗体の測定を組み合わせることからなるクローン病の診断方法。
（２）組み合わせが抗ブタアミラーゼ抗体と抗サッカロミセスセルビシエ抗体の測定である上記（１）のクローン病の診断方法。
（３）組み合わせが抗ブタアミラーゼ抗体と抗Ｉ２抗体の測定である上記（１）に記載のクローン病の診断方法。
（４）組み合わせが抗ブタアミラーゼ抗体、抗サッカロミセスセルビシエ抗体、及び抗Ｉ２抗体の測定である上記（１）に記載のクローン病の診断方法。
（５）ブタアミラーゼ抗原とサッカロミセスセルビシエ抗原及び／又はＩ２抗原、及び免疫学的測定に必要な試薬を含むクローン病診断用キット。
（６）ブタアミラーゼ抗原とサッカロミセスセルビシエ抗原を含む上記（５）に記載のクローン病診断用キット。
（７）ブタアミラーゼ抗原とＩ２抗原を含む上記（５）に記載のクローン病診断用キット。
（８）ブタアミラーゼ抗原、サッカロミセスセルビシエ抗原、及びＩ２抗原を含む上記（５）に記載のクローン病診断用キット。
（９）抗ブタアミラーゼ抗体を測定することからなる小腸型又は小腸に優位な病変がある小腸大腸型クローン病の診断方法。
（１０）抗ブタアミラーゼ抗体がＩｇＧである、上記（９）に記載の小腸型又は小腸に優位な病変がある小腸大腸型クローン病の診断方法。
（１１）ブタアミラーゼ抗原ＩｇＧタイプ、及び免疫学的測定に必要な試薬を含む、小腸型又は小腸に優位な病変がある小腸大腸型クローン病診断用キット。

本発明の診断方法は、クローン病に特異的な抗体の測定を組み合わせることによって、診断の感度を格段に向上させ、高度の技術を要し患者への負担も大きい内視鏡などの侵襲的処方による診断の適応範囲を限定することができる点で、顕著な効果を有する。また、本発明の診断方法において測定対象とする抗体のうち、抗ブタアミラーゼ抗体、特にＩｇＧタイプは小腸型又は小腸優位の小腸大腸型クローン病に特異的であるため、従来の内視鏡検査では特に困難であった小腸型又は小腸優位の小腸大腸型クローン病の診断に有益である。

本発明の診断方法において、診断対象は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、又はマウスなど、クローン病に罹患し得る任意の動物とする。以下、ヒトを対象として説明するが、他の動物においても同様である。

診断対象とする検体は、クローン病患者の血液（全血、血清、血漿）、唾液、その他の体液、各種組織どのいずれでもよいが、血清又は血漿が好ましい。参考のための潰瘍性大腸炎患者及び対象とする健常人の検体も同様である。
検体中の各抗体の測定方法は、免疫学的測定法として、抗体を検出し測定するために使用される方法であればいずれでもよく、酵素、蛍光物質、放射性物質、着色物資などを標識物質とする慣用の測定方法がいずれも使用可能であるが、酵素免疫測定法、イムノクロマトグラフィー法などが好ましく、さらに、検体中の抗体量を着色量や吸光度によって容易に数値化できる点で酵素免疫測定法、例えばＥＬＩＳＡ法がとくに好ましい。測定に必要な各種器具、資材、試薬類、標識方法及び測定条件は、既知のものがいずれも使用可能であるが、抗体の種類によって適宜に選択する。

例えば、抗ブタアミラーゼ抗体の測定は、検体を抗原に相当するブタアミラーゼと反応させて抗原−抗体複合体を生成させ、ついで、抗ブタアミラーゼ抗体と反応する物質である抗免疫グロブリン抗体、プロテインＡ、プロテインＧ及びジャッカリンから選ばれるいずれか１種を添加し、さらに酵素基質を添加して反応生成物の標識量を酵素活性により測定する方法が適する。前記抗ブタアミラーゼ抗体と反応する物質としては、抗免疫グロブリン抗体、特に抗ＩｇＧ抗体又は抗ＩｇＡ抗体が好ましい。また、抗免疫グロブリン抗体は酵素で標識されていることが好ましいが、予め標識された抗原を使用することも可能である。
標識用酵素としては、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、マイクロペルオキシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ホスホリラーゼなどが挙げられる。
酵素基質は、標識酵素の種類によって異なるが、ペルオキシダーゼを標識物質とする場合は、例えば、ＡＢＴＳ；２，２’−アジノ−ジ（３エチルベンツチアゾリン−６−スルホン酸）（ABTS；KPL社#50-62-00）が例示される。

ＡＳＣＡの測定も、サッカロミセスセルビシエ抗原を用いて同様の酵素免疫測定法で行う。抗原は、定法により酵母から調製してもよいが、市販のＥＬＩＳＡキット（Medizyme ASCA IgG; Medipan社など）を用いるのが有利である。
同様に、抗Ｉ２抗体の測定は、Ｉ２−ＧＳＴ（Glutathione S-Transferase）融合蛋白に対する標識量からＧＳＴに対する標識量を減じることにより算出できる。Ｉ２蛋白抗原としては、非特許文献３に記載されているものが例示される。該蛋白は１００個のアミノ酸から構成されているが、そのうちの少なくとも８０％、好ましくは９０％の相同性があれば、本発明におけるＩ２蛋白抗原として適応する。例えば、ＵＣＬＡ由来のPseudomonas fluorescens株（ＵＣＬＡ株）のPfiT遺伝子産物の一部分から作成した２アミノ酸が異なる蛋白、或いは、Pseudomonas fluorescens ATCC 13525株のPfiT遺伝子産物の一部分から作成した４アミノ酸が異なる蛋白がＩ２抗原として例示される（Wei BらInfect Immun 70:6567-6575, 2002）。

標識された抗体量の測定は、標識物質の種類に応じて慣用の方法が選択され、例えば、酵素を標識物質とする場合には基質の分解を分光光度計により吸光度として測定するのが有利である。例えば、ＥＬＩＳＡ法により、標識酵素としてペルオキシダーゼを使用した場合には、マイクロプレートリーダーを用い、測定波長４０５ｎｍにおける吸光度によって抗体量を測定する。

各測定によって得られた吸光度（抗体量）から、各抗体単独及び本発明における抗体を２種又は３種組み合わせた場合における、感度（クローン病患者の全検体に対し陽性と判定された検体数；陽性率）及び特異度（健常人の全検体に対し陰性と判定された検体数；陰性率）を算出したところ、本発明における抗体測定の組み合わせはいずれも、単独抗体の場合に比較して感度が有意に向上した。また、感度と特異度を掛け合わせて算出した診断効率も同様に、本発明における抗体測定の組み合わせにおいて顕著に向上した。
したがって、本発明の診断方法によれば、クローン病の効率的な診断が可能であり、内視鏡検査など高度の経験と技術を要し、しかも患者に身体的・精神的苦痛与える侵襲的手法を経ないでも、確定診断が可能となる範囲が格段に拡張する。
とくに、抗ブタアミラーゼ抗体ＩｇＧは小腸型又は小腸優位の小腸大腸型のクローン病患者の検体に対し高感度に反応することから、内視鏡検査が一層困難であった小腸型又は小腸優位の小腸大腸型クローン病の診断に有益である。

本発明の診断用キットは、ブタアミラーゼ抗原／サッカロミセスセルビシエ抗原、ブタアミラーゼ抗原／Ｉ２抗原、又はブタアミラーゼ抗原／サッカロミセスセルビシエ抗原／Ｉ２抗原の各組み合わせを含み、他の成分として、免疫学的測定方法の種類や採用される検出手段に応じて、必要とされる試薬類を任意に包含させることができる。好ましくは、各抗体と反応する二次抗体（例えば抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＡ抗体）を含めることができる。二次抗体は、標識物質で標識化されていてもよいし、あるいは予め任意の支持体（固相）に固定化されていてもよい。二次抗体が、標識又は固定化されていない場合は、別途、標識物質或いは支持体を含めることもできる。
また、標識物質に応じた基質、又は標識物質と基質との反応を検出するための検出試薬が含まれていてもよく、さらに測定の実施の便宜のために適当な検体希釈液、二次抗体希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄液、酵素基質液、反応停止液などが含まれていてもよい。

以下に、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって何ら限定されるものではない。

［ヒト血清或いは血漿の取得］
クローン病患者、及び健常人の採血は、兵庫医科大学、或いは味の素（株）にて文書を用いた同意の下採取し、血清或いは血漿を得た。検体は番号等で表示し、匿名化した。

［抗ブタアミラーゼ抗体価（ＩｇＧ）の測定］
Coating buffer (0.1M NaHCO₃(pH9.6), 0.02% NaN₃)でブタアミラーゼ（シグマA6255）を10μg/mlとなるように希釈し、ELISAプレートに添加して、4℃で一晩反応させた。抗原液を除去した後、4倍希釈したブロックエース（大日本製薬（株）製）を添加し、室温で2時間以上静置することにより、ブロッキングを行った。10倍希釈ブロックエースで160倍希釈した血清或いは血漿を添加し、室温で2時間反応させた。0.05%Tween20-PBSで3回洗浄後、HRP（Horseradish Peroxidase）化マウス抗ヒトIgGモノクローナル抗体(Zymed#05-4220)を10倍希釈ブロックエースで、1000倍希釈して添加し、室温で1時間反応させた。3回洗浄後、ペルオキシダーゼ基質（ABTS；KPL社#50-62-00）を0.3g/l添加し、25分間程度室温で反応させた。モレキュラー・ディバイス社のマイクロプレートリーダー（Vmax）を用いて405nmにおける吸光度（OD）を測定した。結果は、健常人のOD値の平均＋2SDを基準として、それを超えるものを陽性とした。陽性検体は、全数１０５に対し３９（陽性率３７．１）であった。

［抗ブタアミラーゼ抗体価（ＩｇＧ１〜４）の測定］
上記HRP（Horseradish Peroxidase）化マウス抗ヒトIgGモノクローナル抗体(Zymed#05-4220)を、それぞれ、HRP（Horseradish Peroxidase）化マウス抗ヒトIgG１モノクローナル抗体(Zymed#05-3320)、HRP（Horseradish Peroxidase）化マウス抗ヒトIgG２モノクローナル抗体(Zymed#05-0520)、HRP（Horseradish Peroxidase）化マウス抗ヒトIgG３モノクローナル抗体(Zymed#05-3620)、HRP（Horseradish Peroxidase）化マウス抗ヒトIgG４モノクローナル抗体(Zymed#05-3820)に代え、血清或いは血漿の希釈倍率を20〜80倍に代える以外は同様に実施した結果、抗ブタアミラーゼ抗体価（ＩｇＧ１〜４）に陽性の検体は、全数１０５に対し、ＩｇＧ１が２０（陽性率１９．０）、ＩｇＧ２が１０（陽性率９．５）、ＩｇＧ３が６（陽性率５．７）、ＩｇＧ４が３３（陽性率３１．４）であった。

［抗ブタアミラーゼ抗体価（ＩｇＡ）の測定］
上記HRP化マウス抗ヒトIgGモノクローナル抗体(Zymed#05-4220)をHRP化マウス抗ヒトIgAモノクローナル抗体（Zymed#05-5220）に代え、血清或いは血漿の希釈倍率を20倍に代える以外は同様に実施した結果、陽性検体は、全数１０５に対し３０（陽性率２８．６）であった。

［ＡＳＣＡ（ＩｇＧ）の測定］
市販のＥＬＩＳＡキット（Medizyme ASCA IgG; Medipan社）を用い測定した。キットの指定する方法に準じて行った。キット付属のSample Diluentで５１倍希釈した血清或いは血漿をプレートに添加し、３７度で１時間反応させた。キット付属のWash bufferで３回洗浄後、キット付属のHRP化ヒツジ抗ヒトIgG抗体を添加し、３７度で３０分間反応させた。３回洗浄後、キット付属のペルキシダーゼ基質（TMB;３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）を添加し、室温で１０分間反応させた。キット付属のStop solutionを添加後、モレキュラー・ディバイス社のマイクロプレートリーダー（Vmax）を用いて４５０nmにおける吸光度を、６９０nmにおける吸光度を対照として測定した。キット付属のカットオフ値決定用サンプルを用い同様に測定し、その値を超えるものを陽性とした。
陽性検体は、全数１０５に対し３４（陽性率３２．４）であった。

［ＡＳＣＡ（ＩｇＡ）の測定］
上記HRP化ヒツジ抗ヒトIgG抗体をHRP化ヒツジ抗ヒトIgA抗体に代える以外は同様に実施した結果、陽性検体は、全数１０５に対し２４（陽性率２２．９）であった。

［抗Ｉ２抗体価（ＩｇＡ）の測定］
I2-GST としてPseudomonas fluorescens ATCC 13525株より遺伝子をクローニングしたI2-GST (Glutathione S-Transferase) (Wei BらInfect Immun 70:6567-6575, 2002)を用い、Sutton CLらの方法（Gastroenterology 119:23-31, 2000）に従って、GST融合蛋白（I2-GST）に対する反応からGSTに対する反応を引き算する事により抗Ｉ２抗体価を算出した。
I2-GST或いはGSTをCoating buffer；0.1M NaHCO₃(pH9.6), 0.02% NaN₃にて希釈してELISAプレートに添加し、4℃にて一晩反応させた。濃度は、モル数を同じにするためにI2-GST（分子量37.1kDa）は5μg/ml、GST（分子量26kDa）は3.5μg/mlとした。抗原液を除去した後、4倍希釈したブロックエースを添加し、室温で2時間以上静置することにより、ブロッキングを行った。10倍希釈ブロックエースにて50倍希釈した血清或いは血漿を添加し、室温で2時間反応させた。0.05%Tween20-PBSで3回洗浄後、10倍希釈ブロックエースで1000倍希釈したHRP化マウス抗ヒトIgAモノクローナル抗体(Zymed#05-5220)を、室温で1時間反応させた。3回洗浄後、ペルオキシダーゼ基質（ABTS；KPL社#50-62-00）を0.3g/lで添加し、25分間程度室温で反応させた。モレキュラー・ディバイス社のマイクロプレートリーダー（Vmax）を用いて405nmにて吸光度を測定した。結果は、健常人のOD値の平均＋2SDを基準として、それを超えるものを陽性とした。陽性検体は、全数１０５に対し４８（陽性率４５．７）であった。

［抗Ｉ２抗体価（ＩｇＧ）の測定］
HRP化マウス抗ヒトIgAモノクローナル抗体(Zymed#05-5220)をHRP化マウス抗ヒトIgGモノクローナル抗体(Zymed#05-4220)に代え、血清或いは血漿の希釈倍率を1000倍に代える以外は同様に実施した結果、陽性検体は、全数１０５に対し４２（陽性率４０．０）であった。

［結果］
各測定によって得られた陽性検体及び陰性検体の数、クローン病（CD）患者における感度（Sensitivity陽性率：陽性検体／クローン病患者検体（CD）全数）、健常人における特異度（Specificity陰性率：陰性検体／健常人検体の全数）、及び診断効率（感度×特異度）を表１に示す。
表１中、［抗ブタアミラーゼ抗体＋ＡＳＣＡ（又は抗Ｉ２抗体）］は、抗ブタアミラーゼ抗体陽性検体数に、ＡＳＣＡ（又は抗Ｉ２抗体）の陽性検体数から抗ブタアミラーゼ抗体にも陽性反応する検体を除いた検体数を加えたものであり、［抗ブタアミラーゼ抗体＋ＡＳＣＡ＋抗Ｉ２抗体］は、［抗ブタアミラーゼ抗体＋ＡＳＣＡ（又は抗Ｉ２抗体）］の陽性検体数に、抗Ｉ２抗体（又はＡＳＣＡ）の陽性検体から抗ブタアミラーゼ抗体及びＡＳＣＡ（又は抗Ｉ２抗体）にも陽性反応する検体を除いた検体数を加えたものである。

表１から明らかなとおり、各抗体単独による測定に比較して、２種及び３種の抗体による測定を組み合わせた場合に感度が格段に向上し、その結果、診断効率を顕著に向上させることができる。
また、抗ブタアミラーゼ抗体及びＡＳＣＡはＩｇＧタイプが、抗Ｉ２抗体はＩｇＡタイプが感度良好であり有利であることがわかった。
抗ブタアミラーゼ抗体に関しては、ＩｇＧ１〜４を比較すると、ＩｇＧ４が最も感度が良好であり、ＩｇＧ４の利用も有効である。

病変部が小腸のみ（小腸型）、小腸優位な小腸大腸型、大腸優位な小腸大腸型、及び大腸のみ（大腸型）にある患者の各検体（血清或いは血漿）を、実施例1の［抗ブタアミラーゼ抗体価（ＩｇＧ）の測定］、［抗ブタアミラーゼ抗体価（ＩｇＡ）の測定］、［ＡＳＣＡ（ＩｇＧ）の測定］、及び［抗Ｉ２抗体価（ＩｇＡ）の測定］に従って判定し、それぞれの感度（陽性率）を算出した。
結果は表２に示したとおりである。

上記結果から、ＡＳＣＡ及び抗I2抗体は、小腸型又は小腸優位の小腸大腸型と大腸型又は大腸優位の小腸大腸型に対する感度に大差がないのに対し、抗ブタアミラーゼ抗体は、小腸型又は小腸優位の小腸大腸型の検体に対する感度が大腸型又は大腸優位の小腸大腸型の検体に対する感度よりはるかに優れることが明らかとなった。
したがって、内視鏡検査の適用がとくに困難であった小腸型又は小腸優位の小腸大腸型クローン病の診断が、抗ブタアミラーゼ抗体を測定することによって、安全かつ高感度で実施可能となった。
抗ブタアミラーゼ抗体はＩｇＧタイプ、及びＩｇＡタイプのいずれも小腸型又は小腸優位の小腸大腸型に特異的に反応するが、感度が良好である点で、ＩｇＧタイプが好ましい。

Claims

ブタアミラーゼ抗原、及び免疫学的測定に必要な試薬を含む小腸型又は小腸に優位な病変がある小腸大腸型クローン病診断用キット。