JP4577083B2 - クローン病の診断方法 - Google Patents
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しかし、クローン病の病因は未だ解明しきれていないためその診断と治療には自ずから限界があった。
例えば、その診断は、臨床所見のほか、X線造影検査、内視鏡検査、内視鏡下に採取した生検標本の組織検査などを総合的に判断して行われて来たが、これらの検査は、検査前の腸管内部清浄に時間を要し、造影剤の投与や内視鏡の腸管への挿入など、患者に対し肉体的・精神的に多大の負担を与えるものであるうえ、手技及び判別に経験と熟練した技術を必要とする。
殊に、小腸型又は小腸優位の小腸大腸型の場合、小腸の構造の複雑さ及び発症部位が内視鏡の挿入部(肛門又は口腔)から遠いことなどの理由で、X線造影検査或いは内視鏡による検査は、一層高度の技術を要する。
また、類似した病理所見を示す潰瘍性大腸炎などの他の炎症性腸疾患との鑑別が困難なケースも多く、安全で簡便、かつクローン病に特異的な診断方法が求められている。
しかし、これらの方法はいずれも、感度(クローン病患者中の陽性率)がたかだか40%程度に止まり、更に、I2抗原、OmpC抗原、フラジェリン抗原、CDP抗原は、入手が困難であるなどの問題がある。
すなわち、本発明は以下のとおりのものである。
(2)組み合わせが抗ブタアミラーゼ抗体と抗サッカロミセスセルビシエ抗体の測定である上記(1)のクローン病の診断方法。
(3)組み合わせが抗ブタアミラーゼ抗体と抗I2抗体の測定である上記(1)に記載のクローン病の診断方法。
(4)組み合わせが抗ブタアミラーゼ抗体、抗サッカロミセスセルビシエ抗体、及び抗I2抗体の測定である上記(1)に記載のクローン病の診断方法。
(5)ブタアミラーゼ抗原とサッカロミセスセルビシエ抗原及び/又はI2抗原、及び免疫学的測定に必要な試薬を含むクローン病診断用キット。
(6)ブタアミラーゼ抗原とサッカロミセスセルビシエ抗原を含む上記(5)に記載のクローン病診断用キット。
(7)ブタアミラーゼ抗原とI2抗原を含む上記(5)に記載のクローン病診断用キット。
(8)ブタアミラーゼ抗原、サッカロミセスセルビシエ抗原、及びI2抗原を含む上記(5)に記載のクローン病診断用キット。
(9)抗ブタアミラーゼ抗体を測定することからなる小腸型又は小腸に優位な病変がある小腸大腸型クローン病の診断方法。
(10)抗ブタアミラーゼ抗体がIgGである、上記(9)に記載の小腸型又は小腸に優位な病変がある小腸大腸型クローン病の診断方法。
(11)ブタアミラーゼ抗原IgGタイプ、及び免疫学的測定に必要な試薬を含む、小腸型又は小腸に優位な病変がある小腸大腸型クローン病診断用キット。
検体中の各抗体の測定方法は、免疫学的測定法として、抗体を検出し測定するために使用される方法であればいずれでもよく、酵素、蛍光物質、放射性物質、着色物資などを標識物質とする慣用の測定方法がいずれも使用可能であるが、酵素免疫測定法、イムノクロマトグラフィー法などが好ましく、さらに、検体中の抗体量を着色量や吸光度によって容易に数値化できる点で酵素免疫測定法、例えばELISA法がとくに好ましい。測定に必要な各種器具、資材、試薬類、標識方法及び測定条件は、既知のものがいずれも使用可能であるが、抗体の種類によって適宜に選択する。
標識用酵素としては、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、マイクロペルオキシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ホスホリラーゼなどが挙げられる。
酵素基質は、標識酵素の種類によって異なるが、ペルオキシダーゼを標識物質とする場合は、例えば、ABTS;2,2’−アジノ−ジ(3エチルベンツチアゾリン−6−スルホン酸)(ABTS;KPL社#50-62-00)が例示される。
同様に、抗I2抗体の測定は、I2−GST(Glutathione S-Transferase)融合蛋白に対する標識量からGSTに対する標識量を減じることにより算出できる。I2蛋白抗原としては、非特許文献3に記載されているものが例示される。該蛋白は100個のアミノ酸から構成されているが、そのうちの少なくとも80%、好ましくは90%の相同性があれば、本発明におけるI2蛋白抗原として適応する。例えば、UCLA由来のPseudomonas fluorescens株(UCLA株)のPfiT遺伝子産物の一部分から作成した2アミノ酸が異なる蛋白、或いは、Pseudomonas fluorescens ATCC 13525株のPfiT遺伝子産物の一部分から作成した4アミノ酸が異なる蛋白がI2抗原として例示される(Wei BらInfect Immun 70:6567-6575, 2002)。
したがって、本発明の診断方法によれば、クローン病の効率的な診断が可能であり、内視鏡検査など高度の経験と技術を要し、しかも患者に身体的・精神的苦痛与える侵襲的手法を経ないでも、確定診断が可能となる範囲が格段に拡張する。
とくに、抗ブタアミラーゼ抗体IgGは小腸型又は小腸優位の小腸大腸型のクローン病患者の検体に対し高感度に反応することから、内視鏡検査が一層困難であった小腸型又は小腸優位の小腸大腸型クローン病の診断に有益である。
また、標識物質に応じた基質、又は標識物質と基質との反応を検出するための検出試薬が含まれていてもよく、さらに測定の実施の便宜のために適当な検体希釈液、二次抗体希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄液、酵素基質液、反応停止液などが含まれていてもよい。
クローン病患者、及び健常人の採血は、兵庫医科大学、或いは味の素(株)にて文書を用いた同意の下採取し、血清或いは血漿を得た。検体は番号等で表示し、匿名化した。
Coating buffer (0.1M NaHCO3(pH9.6), 0.02% NaN3)でブタアミラーゼ(シグマA6255)を10μg/mlとなるように希釈し、ELISAプレートに添加して、4℃で一晩反応させた。抗原液を除去した後、4倍希釈したブロックエース(大日本製薬(株)製)を添加し、室温で2時間以上静置することにより、ブロッキングを行った。10倍希釈ブロックエースで160倍希釈した血清或いは血漿を添加し、室温で2時間反応させた。0.05%Tween20-PBSで3回洗浄後、HRP(Horseradish Peroxidase)化マウス抗ヒトIgGモノクローナル抗体(Zymed#05-4220)を10倍希釈ブロックエースで、1000倍希釈して添加し、室温で1時間反応させた。3回洗浄後、ペルオキシダーゼ基質(ABTS;KPL社#50-62-00)を0.3g/l添加し、25分間程度室温で反応させた。モレキュラー・ディバイス社のマイクロプレートリーダー(Vmax)を用いて405nmにおける吸光度(OD)を測定した。結果は、健常人のOD値の平均+2SDを基準として、それを超えるものを陽性とした。陽性検体は、全数105に対し39(陽性率37.1)であった。
上記HRP(Horseradish Peroxidase)化マウス抗ヒトIgGモノクローナル抗体(Zymed#05-4220)を、それぞれ、HRP(Horseradish Peroxidase)化マウス抗ヒトIgG1モノクローナル抗体(Zymed#05-3320)、HRP(Horseradish Peroxidase)化マウス抗ヒトIgG2モノクローナル抗体(Zymed#05-0520)、HRP(Horseradish Peroxidase)化マウス抗ヒトIgG3モノクローナル抗体(Zymed#05-3620)、HRP(Horseradish Peroxidase)化マウス抗ヒトIgG4モノクローナル抗体(Zymed#05-3820)に代え、血清或いは血漿の希釈倍率を20〜80倍に代える以外は同様に実施した結果、抗ブタアミラーゼ抗体価(IgG1〜4)に陽性の検体は、全数105に対し、IgG1が20(陽性率19.0)、IgG2が10(陽性率9.5)、IgG3が6(陽性率5.7)、IgG4が33(陽性率31.4)であった。
上記HRP化マウス抗ヒトIgGモノクローナル抗体(Zymed#05-4220)をHRP化マウス抗ヒトIgAモノクローナル抗体(Zymed#05-5220)に代え、血清或いは血漿の希釈倍率を20倍に代える以外は同様に実施した結果、陽性検体は、全数105に対し30(陽性率28.6)であった。
市販のELISAキット(Medizyme ASCA IgG; Medipan社)を用い測定した。キットの指定する方法に準じて行った。キット付属のSample Diluentで51倍希釈した血清或いは血漿をプレートに添加し、37度で1時間反応させた。キット付属のWash bufferで3回洗浄後、キット付属のHRP化ヒツジ抗ヒトIgG抗体を添加し、37度で30分間反応させた。3回洗浄後、キット付属のペルキシダーゼ基質(TMB;3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン)を添加し、室温で10分間反応させた。キット付属のStop solutionを添加後、モレキュラー・ディバイス社のマイクロプレートリーダー(Vmax)を用いて450nmにおける吸光度を、690nmにおける吸光度を対照として測定した。キット付属のカットオフ値決定用サンプルを用い同様に測定し、その値を超えるものを陽性とした。
陽性検体は、全数105に対し34(陽性率32.4)であった。
上記HRP化ヒツジ抗ヒトIgG抗体をHRP化ヒツジ抗ヒトIgA抗体に代える以外は同様に実施した結果、陽性検体は、全数105に対し24(陽性率22.9)であった。
I2-GST としてPseudomonas fluorescens ATCC 13525株より遺伝子をクローニングしたI2-GST (Glutathione S-Transferase) (Wei BらInfect Immun 70:6567-6575, 2002)を用い、Sutton CLらの方法(Gastroenterology 119:23-31, 2000)に従って、GST融合蛋白(I2-GST)に対する反応からGSTに対する反応を引き算する事により抗I2抗体価を算出した。
I2-GST或いはGSTをCoating buffer;0.1M NaHCO3(pH9.6), 0.02% NaN3にて希釈してELISAプレートに添加し、4℃にて一晩反応させた。濃度は、モル数を同じにするためにI2-GST(分子量37.1kDa)は5μg/ml、GST(分子量26kDa)は3.5μg/mlとした。抗原液を除去した後、4倍希釈したブロックエースを添加し、室温で2時間以上静置することにより、ブロッキングを行った。10倍希釈ブロックエースにて50倍希釈した血清或いは血漿を添加し、室温で2時間反応させた。0.05%Tween20-PBSで3回洗浄後、10倍希釈ブロックエースで1000倍希釈したHRP化マウス抗ヒトIgAモノクローナル抗体(Zymed#05-5220)を、室温で1時間反応させた。3回洗浄後、ペルオキシダーゼ基質(ABTS;KPL社#50-62-00)を0.3g/lで添加し、25分間程度室温で反応させた。モレキュラー・ディバイス社のマイクロプレートリーダー(Vmax)を用いて405nmにて吸光度を測定した。結果は、健常人のOD値の平均+2SDを基準として、それを超えるものを陽性とした。陽性検体は、全数105に対し48(陽性率45.7)であった。
HRP化マウス抗ヒトIgAモノクローナル抗体(Zymed#05-5220)をHRP化マウス抗ヒトIgGモノクローナル抗体(Zymed#05-4220)に代え、血清或いは血漿の希釈倍率を1000倍に代える以外は同様に実施した結果、陽性検体は、全数105に対し42(陽性率40.0)であった。
各測定によって得られた陽性検体及び陰性検体の数、クローン病(CD)患者における感度(Sensitivity陽性率:陽性検体/クローン病患者検体(CD)全数)、健常人における特異度(Specificity陰性率:陰性検体/健常人検体の全数)、及び診断効率(感度×特異度)を表1に示す。
表1中、[抗ブタアミラーゼ抗体+ASCA(又は抗I2抗体)]は、抗ブタアミラーゼ抗体陽性検体数に、ASCA(又は抗I2抗体)の陽性検体数から抗ブタアミラーゼ抗体にも陽性反応する検体を除いた検体数を加えたものであり、[抗ブタアミラーゼ抗体+ASCA+抗I2抗体]は、[抗ブタアミラーゼ抗体+ASCA(又は抗I2抗体)]の陽性検体数に、抗I2抗体(又はASCA)の陽性検体から抗ブタアミラーゼ抗体及びASCA(又は抗I2抗体)にも陽性反応する検体を除いた検体数を加えたものである。
また、抗ブタアミラーゼ抗体及びASCAはIgGタイプが、抗I2抗体はIgAタイプが感度良好であり有利であることがわかった。
抗ブタアミラーゼ抗体に関しては、IgG1〜4を比較すると、IgG4が最も感度が良好であり、IgG4の利用も有効である。
結果は表2に示したとおりである。
したがって、内視鏡検査の適用がとくに困難であった小腸型又は小腸優位の小腸大腸型クローン病の診断が、抗ブタアミラーゼ抗体を測定することによって、安全かつ高感度で実施可能となった。
抗ブタアミラーゼ抗体はIgGタイプ、及びIgAタイプのいずれも小腸型又は小腸優位の小腸大腸型に特異的に反応するが、感度が良好である点で、IgGタイプが好ましい。
Claims (1)
- ブタアミラーゼ抗原、及び免疫学的測定に必要な試薬を含む小腸型又は小腸に優位な病変がある小腸大腸型クローン病診断用キット。
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