JP2000516727A - 生物学および医学に応用される被保持物クロマトグラフィーおよびタンパク質チップアレイ - Google Patents

生物学および医学に応用される被保持物クロマトグラフィーおよびタンパク質チップアレイ

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、試料中の被分析物を分離するための被保持物クロマトグラフィーの方法を提供する。この方法は、複数の異なる選択条件下で基材に被分析物を吸着させる工程、および脱離スペクトロメトリーによって基材に保持される被分析物を検出する工程を包含する。この方法は、生物学、ならびに臨床診断および薬物発見を含む医学に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学および医学に応用される被保持物クロマトグラフィーおよび タンパク質チップアレイ 関連出願の交互参照 本出願は1997年6月20日出願の同時係属出願60/054,333および1997年12月1日出 願の同時継続出願60/067,484の優先日に基づく優先権を主張する。これらの出願 の内容はその全体が本明細書中に参考として援用される。 合衆国が後援する研究または開発 適用なし 発明の背景 本発明は分別科学（separation science）および分析生化学の分野に関する。 本発明の方法は、生物学および医学(遺伝子機能の分析、示差的な遺伝子発現 、タンパク質の発見、細胞的および臨床的診断および薬物スクリーニングを包含 する)に適用される。 細胞機能は、正常機能および病理学的機能の両者とも、一部には、細胞によっ て発現される遺伝子(すなわち遺伝子機能)に依存する。遺伝子発現は定性的およ び定量的な両方の局面を有する。すなわち、細胞は、発現される特定の遺伝子に 関してと、同じ遺伝子の発現の相対レベルに関しての両方で異なり得る。示差的 な遺伝子発現は、例えば、その遺伝子によってコードされるタンパク質の発現に おける差異、または発現されるタンパク質の翻訳後調節における差異によって明 白になり得る。例えば、タンパク質は、炭水化物またはリン酸基で修飾され得、 あるいはペプチド切断を通じてプロセシングされ得る。従って、生化学レベルに おいて、細胞は生物体生体分子の複合体混合物を表す。 機能的遺伝子混合物（genomics）(「タンパク質混合物（proteomics）」)の1 つの目標は細胞型の間で示差的に発現される生物体生体分子の同定および特徴付 けである。発現を比較することによって、細胞の特定の病理学的作用の原因とな り得る分子を同定することができる。例えば、癌細胞中で発現するが正常細胞中 では発現しないタンパク質を同定することは、診断のために有用であり、そして 最終的には薬物の発見および病理学的処置のために有用である。ヒトゲノムプロ ジェクトが完了すれば、全てのヒト遺伝子はクローン化され、配列決定され、そ してデータベースとして体系化される。この「ゲノム後（post-genome）」の世 界では、示差的に発現されたタンパク質を同定する能力は、今度は、それをコー ドする遺伝子の同定に通じる。従って、遺伝学の能力は、細胞期脳の問題を有す ると考えられ得る。 遺伝子発現および機能の示差的な化学分析は、細胞中の分子の複合体混合物が 微量で存在する場合でさえも、それを分離(resolve)し得、定量し得、そして同 定し得るツールを必要とする。しかしこの目的のための現在の分析化学的ツール は、それらの分野の各々で制限されている。1つの普及した生体分子分別（separ ation）法は電気泳動である。しばしば、ゲル中での等電点電気泳動による第１ のタンパク質の分別は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気 泳動(SDS-PAGE)による第2の分別と組み合わされる。この結果は、タンパク質を 等電点(正味の電荷)およびサイズ(すなわち質量)の次元に従って分離するマップ である。しかしこの方法は有用ではあるが、いくつかの点で限界がある。第１に 、この方法は生体分子のわずか2つの性質についての情報を提供するに過ぎない 。質量および等電点(「pI)である。第2に、各次元における分離はゲルの分離性 によって制限される。例えば、その質量の差が約5％未満、または約0.5pI未満の 分子はしばしば分離が困難である。第3に、ゲルはローディング受容量（capacit y）能力が限られ、それゆえ選択性に限りがある。少量で発現される生体分子は 検出され得ない。第4に、分子量が約10〜20kDaを下回る小さいタンパク質および ペプチドは観察されない。 他の分析方法はこれらの限界の1つまたはそれ以上を克服し得るが、それらを 効率的に組み合わせることは困難である。例えば、分析クロマトグラフィーは生 体分子を種々の被分析物／吸着体相互作用に基づいて分別することができるが、 多次元分析は困難であり、かつ時間がかかる。さらに、この方法は感受性に限界 がある。 臨床的診断は疾患の既知のマーカーを特異的に検出する能力を必要とする。し かし、このような診断の発展のためには、マーカーに特異的に結合する試薬を調 製するのに必要とされる時間、または複合体混合物中のマーカーを識別し得る時 間が障害となる。 薬物の発見は、リガンド／レセプター相互作用を調節する物質を迅速にスクリ ーニングする能力を必要とする。しばしば、このようなスクリーニングにおける 律速段階はリガンド／レセプター相互作用を検出する能力である。従って、結合 事象を同定するための迅速かつ特異的な方法は当該分野における進歩となる。 現在まで、潜在的なマーカーまたはリガンド／レセプター対のメンバーを同定 するところから、このマーカーまたはメンバーに特異的に結合する物質を産生す るまでのプロセスが困難である。１つの方法では、正常組織および疾患組織を比 較して、疾患組織で上昇または減少しているmRNA種または発現配列タグ(「EST」 )を同定する。これらの種を単離し、そしてこれらがコードするポリペプチドを 組換えDNAの日常的方法を通じて産生する。次に、ポリペプチドを単離し、そし てマーカーに対して特異的な抗体を惹起する免疫原として使用する。この抗体を 例えばELISAアッセイで用いて、患者の試料中のマーカーの量を決定する。 このプロセスは、長くそして退屈である。このような抗体を産生するために９ ヶ月かから１年かかり得、その時間の大半は免疫化のためのポリペプチドの十分 量を単離するためのプロトコルを作成するために費やされる。さらに、この方法 は、RNA発現の差異はタンパク質発現の差異として表されるという希望に頼る。 しかし、この仮設は、常に信頼出来るわけではない。従って、示差的に発現され るタンパク質は直接検出される方法および特異的リガンドが優位に短い時間で産 生され得る方法は、この分野にとって非常に利益である。 従って、生物体生体分子の複合体混合物を分離し、混合物中の個々の生体分子 を同定し、そして１つまたはそれ以上の標的被分析物を含む特異的分子認識事象 を同定するためのツールが、分析生化学、生物学および医学のために所望される 。 発明の要旨 本発明は被保持物(retentate)クロマトグラフィーのための装置および方法を 提供する。被保持物クロマトグラフィーは組合せ的な方法であり、複合体混合物 中の被分析物の高度情報分離を、多次元分別方法の使用を通じて提供する。これ は生物学および医学のために統合された被分析物検出および機能的分析の可能性 を提供し、これは、遺伝子機能、タンパク質機能、細胞機能、および生物体全体 の機能に関連する被分析物発現パターンの直接検出のための単一の一体化された 操作システムによって特徴づけられる。１つの局面では、本発明は遺伝子機能、 タンパク質機能、または巨大分子アセンブリ全体、細胞、および全生物体の発見 または診断のための統合された操作システムを提供する。 より詳細には、被分析物は種々の二次元フォーマットで分離され得、それによ り多次元情報が提供される。被分析物は最初に少なくとも2つの異なる第１の次 元中で、少なくとも2つの異なる選択条件下で固定相に吸着するその能力(例えば 、アニオン性／カチオン性ポテンシャル、疎水性／親水性、または特異的生体分 子認識)に基づいて分別される。次に、被分析物は第2の次元で脱離スペクトロメ トリ(例えば、レーザー脱離質量スペクトロメトリ)により質量に基づいて分別さ れ、これにより分別された被分析物の検出がさらに提供される。被分析物が吸着 する吸着体の性質は被分析物に関する物理化学的情報を提供する。 従って、本発明は分子発見および診断装置を提供する。これは並列かつ多重な 被分析物の処理能力を含むことで特徴づけられる。被分析物が直接検出できるの で、本発明は単一の単位操作の間に、同じ「サーキット」(すなわち、アドレス 可能な「チップ」位置」から2つ以上の独立した標的被分析物シグナルを同時に 発信することが可能である。 被保持物クロマトグラフィーはいくつかの点で従来のクロマトグラフィーと異 なる。第1に、被保持物クロマトグラフィーでは、吸着体上に保持された被分析 物が検出される。従来のクロマトグラフィー法では、被分析物は検出の前に吸着 体から溶離している。従来のクロマトグラフィーにおいては、吸着体から溶離し ていない被分析物を検出するための日常的または簡便な手段は存在しない。従っ て、被保持物クロマトグラフィーは、保持された被分析物の化学的または構造的 特性に関する直接的な情報を提供する。第2に、吸着クロマトグラフィーと脱離 スペクトロメトリによる検出との組み合わせは、フェムトモルの範囲という驚く べき高感度と非常に優れた分離を提供する。第3に、一部には被分析物を直接検 出できるという理由で、被保持物クロマトグラフィーは種々の異なる選択条件で 被保持物を迅速に分析する能力を提供し、それゆえ、試料中の被分析物の迅速な 多次元の特徴付けを提供する。第4に、吸着体は、所定のアドレス可能な位置の アレイで基材に付着され得る。これにより、異なる溶離条件下でアレイ上の異な る吸着体部位(すなわち、「親和性部位」または「スポット」)に曝露される被分 析物の並列処理が可能となる。 被保持物クロマトグラフィーは生物学および医学において多くの用途を有する 。これらの用途としては、被分析物の組合せ的な生化学的分別および精製、示差 的な遺伝子発現および分子認識事象の研究、診断および薬物発見が挙げられる。 被保持物クロマトグラフィーの、分析ツールとしての１つの基本的な用途は、 試料を異なる吸着体／溶離物の組み合わせの組合せ的な取り合わせ(assortment) に曝露すること、および異なる条件下での被分析物の挙動を検出することを含む 。これにより、被分析物が精製され、そして試料中の被分析物の検出のために有 用な条件が同定される。このようにして同定された吸着体を有する基材は、１つ または複数の被分析物の特異的検出器として使用され得る。進行的な抽出法にお いては、試料を第１の吸着体／溶離物の組み合わせに曝露し、そして第１の吸着 体によって吸着された被分析物が枯渇した洗浄液を第2の吸着体に曝露して、他 の被分析物を枯渇させる。被分析物を保持するものとして同定される選択条件は また分取的精製手順にも用いられ得る。この手順では、被分析物を含む不純試料 をその被分析物を保持する吸着体に連続的に曝露し、不純物を除去し、そして保 持された被分析物を次のラウンドで吸着体から採取する。 本発明の１つの局面は、アレイ内のアドレス可能な位置の個々の選択条件によ って特徴づけられる各クラスまたは型の分子認識事象(例えば、標的吸着体−標 的被分析物の相互作用)が直接検出され、その間、関連する分子がアドレス可能 な位置にそれでもなお局在化(すなわち「保持」)されていることである。すなわ ち、直接的手段による選択および検出は、標的被分析物の溶離、回収、増幅、ま たは標識化を必要としない。 本発明の他の局面は、アドレス可能なアレイ内の１つ以上の位置での１つ以上 の所望の分子認識事象の検出が、少なからぬ量の総吸着体−被分析物の画分の除 去 または消費を必要としないことである。それゆえ、非使用の部分は、構造および 機能の解明のためにインサイチュで(すなわちアドレス可能な位置の境界内で)直 接行われる１つ以上の「二次的処理」(さらなるアセンプリ(assembly)またはジ アセンブリ(diassembly)、修飾、または増幅(直接または間接)の後に、さらに問 い合わせ(interrogate)され得る。 被分析物に対しての特異性が向上した吸着体は、「進行的分離(progressive r esolution)」と呼ばれる中間的なプロセスによって開発され得る。このプロセス では、被分析物を保持することが証明された吸着体または溶離物をさらなる変数 で試験して、より優れた結合特性の組み合わせが同定される。他の方法では、被 分析物に特異的な抗体吸着体を有する基材の迅速な作製が可能となる。この方法 は、被分析物を吸着体にドッキングすること、およびファージ提示ライブラリー を被分析物に結合するファージについてスクリーニングすることを伴う。 被保持物クロマトグラフィーはまた、分子生物学および細胞生物学における用 途も有する。2つの試料中に示差的に存在する被分析物(例えば2つの細胞抽出物 中に示差的に発現するタンパク質)は、試料を脱離スペクトロメトリによる分析 のための種々の吸着体／溶離物の組み合わせに曝露することによって同定され得 、これにより、他の分別および検出系ではかなうことができないこの系の高度情 報分離能力が利用できる。未知の標的タンパク質は、吸着体／溶離物の組み合わ せの化学的性質に基づいて物理化学的性質(分子量を包含する)を決定することに よって同定され得、そしてこの情報を用いて同様のプロファイルを有するタンパ ク質についてデータベースをスクリーニングし得る。 分別生化学における方法およびこれらの方法から生成される吸着体は診断にお いて有用である。より詳細には、化学的な吸着体または生体特異的な吸着体のい ずれかが、重要な診断的マーカーの検出のために開発され得る。特定の実施態様 において、基材は、疾患または症候群のための診断的なマーカーの組み合わせに ついて選択された吸着体スポットのアレイを有し得る。 被保持物クロマトグラフィーはまた薬物発見において有用である。レセプター ／リガンド対の1つのメンバーを吸着体にドッキングし、そして結合パートナー に結合するその能力を物質(agent)の存在下で試験する。吸着が迅速に試験され 得るので、物質の組合せ的なライブラリーは相互作用を調節するその能力につい て容易に試験され得る。 本発明の1つの局面では、試料中の少なくとも1つの被分析物の高度情報分離の ための方法を提供する。この方法は、複数の被分析物の並列な分別および検出を 含む組合せ的な分別方法である。この方法は、a)被分析物を少なくとも2つの異 なる選択条件に曝露する工程であって、各選択条件が吸着体および溶離物の組み 合わせによって規定され、この被分析物を吸着体で保持させる、工程；およびb) 異なる選択条件下で保持された被分析物を脱離スペクトロメトリで検出する工程 を包含する。異なる選択条件下での保持された被分析物の検出は、被分析物の高 度情報分離を提供する。 1つに実施態様においては、異なる選択条件の各々は、並列処理のための異な る所定のアドレス可能な位置で定義される。他の実施態様においては、この方法 は、i)被分析物を定義された位置で第1の選択条件に曝露して、被分析物を吸着 体で保持させる工程；ii)第1の選択条件下で保持された被分析物を脱離スペクト ロメトリによって検出する工程；iii)吸着体を定義された位置で第2の異なる選 択条件下で洗浄して、被分析物を吸着体で保持させる工程；およびiv)第2の選択 条件下で保持された脱離スペクトロメトリによって検出する工程を包含する。 他の実施態様において、被分析物は生物体生体分子、多量体分子複合体または 巨大分子構築物である。他の実施態様において、生物体生体分子は酵素、免疫グ ロブリン、細胞表面レセプターまたは細胞内レセプターである。 他の実施態様において、吸着体はアニオン、カチオン、疎水性相互作用吸着体 、ポリペプチド、核酸、炭水化物、レクチン、色素、還元剤、炭化水素またはそ れらの混合物を含む。他の実施態様において、吸着体は、ガラス、セラミック、 磁性材料、生物体ポリマー、伝導性ポリマー、天然バイオポリマー、金属または 生物体ポリマーでコートされた金属を含む基材に付着する。他の実施態様におい て、吸着体は、ミクロ乳濁液、ラテックス、ビーズの層の形態であり得る。他の 実施態様において、基材上の位置は線状または直交アレイに配置される。他の実 施態様において、吸着体は被分析物が選択条件に曝露される前に基材上に異なる 位置で配置される。他の実施態様において、吸着体は被分析物が選択条件に曝露 され た後に基材上に異なる位置で配置される。他の実施態様において、異なる選択条 件は異なる結合条件または異なる溶離条件を含む。 他の実施態様において、検出工程は被分析物の質量をレーザー脱離質量スペク トロメトリで検出する工程を包含する。 他の実施態様において、選択条件は吸着体による被分析物の保持を最適化すべ く選択される。他の実施態様において、少なくとも1つの被分析物は1つより多い 被分析物である。他の実施態様において、複数の選択条件が異なる吸着体および 同じ溶離物で定義される。 他の実施態様は、アドレス可能な位置に吸着体を含む基材を提供する工程をさ らに包含し、各吸着体は被分析物の保持を同定する選択条件による吸着体である 。他の実施態様において、溶離条件はpH、緩衝能、イオン強度、水構造特性、界 面活性剤の型、界面活性剤強度、疎水性または比誘電率に従って異なる。他の実 施態様において、複数の選択条件が同じ溶離物によって規定される。 他の実施態様において、本発明は試料から被分析物を系列的に抽出する方法を 提供する。これは、並列な複数の被分析物のための組合せ的な系列分別および精 製展開方法(purification development method)である。この方法は、a)被分析 物を含む試料を第1の選択条件に曝露して、被分析物を第1の吸着体に保持させ、 そして非保持試料を作製する工程；b)被分析物を含む非保持試料を採取し、非保 持試料を第2の選択条件に曝露して、被分析物を第2の吸着体に保持させ、そして 非保持試料を作製する工程；およびc)異なる選択条件下で保持された被分析物を 脱離スペクトロメトリで検出する工程を包含する。 他の局面において、本発明は脱離スペクトロメトリのための基材を提供し、こ れは吸着体を含み、この吸着体の結合特性は1つ以上の直線軸に沿う勾配で変化 する。 他の局面において、本発明は、試料中の被分析物に対する分離が改善された選 択条件を進行的に同定する方法を提供する。この方法は以下の工程を含む：(a) 試料中の被分析物を保持する選択条件を以下の工程(i)〜(iii)で同定する工程： (i)試料を選択条件のセットに曝露する工程であって、各選択条件が少なくとも1 つの結合特性および少なくとも1つの溶離特性によって定義される、工程；(ii) 各選択条件下で保持された被分析物を脱離スペクトロメトリで検出する工程；お よび(iii)被分析物を保持する選択条件を同定する工程；ならびに(b)被分析物に 対する改善された分離を有する選択条件を以下の工程(i)〜(iii)によって同定す る工程：(i)少なくとも1つの結合特性または溶離特性を同定された選択条件から 選択し、そしてそれを選択性特性の定常のセットに加える工程；(ii)改変された 選択条件のセットに試料を曝露する工程であって、ここで改変されたセット中の 各選択条件が以下を含む工程：(1)定常セットにおける選択性特性および(2)定常 セットにおいてではない結合特性または溶離特性；および(iii)改変されたセッ トからの選択条件を先に同定された選択条件と比べて改善された分離を有する被 分析物を保持する脱離スペクトロメトリによって同定する工程。1つの実施態様 は、工程(b)を少なくとも1回繰り返す工程を包含する。他の実施態様は、工程(b )を、選択条件が試料から標的被分析物のみを保持することが同定されるまで繰 り返す工程を包含する。 他の局面において、本発明は、進行的分離方法によって被分析物を分離するも のとして同定された選択条件による吸着体を含む、脱離スペクトロメトリのため の基材を提供する。1つの実施態様において、基材はキットの形態で与えられ、 このキットはさらに、選択条件による溶離物、または溶離物を吸着体と組み合わ せて使用する指示を含む。 他の局面において、本発明は不純試料からの被分析物の分取的精製のための方 法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：a)試料を複数の異なる選択 条件下で基材に曝露する工程；脱離スペクトロメトリにより異なる選択条件下で 、保持された被分析物を検出する工程；および被分析物が保持される選択条件を 同定する工程；(b)被分析物を、複数の異なる同定された選択条件について以下 のi)〜iii)を包含する一連の工程を繰り返すことによって精製する工程；i)試料 を、同定された選択条件下、吸着体に曝露して被分析物を吸着体によって保持さ せる工程；ii)被分析物を基材によって保持されない不純物から分別する工程； およびiii)被分析物を吸着体から採取する工程。 他の局面において、本発明は試料中の少なくとも1つの被分析物を検出するた めの基材を調製するための方法を提供する。この方法は、被分析物特異的吸着体 の設計および同定のための組合せ的な方法である。これは標的被分析物の検出に おいて有用である。この方法は、a)試料を少なくとも2つの異なる選択条件に曝 露する工程であって、各選択条件が吸着体と溶離物との組み合わせによって規定 され、被分析物を吸着体により保持させる工程；b)被分析物が保持されるもとで 少なくとも1つの選択条件で脱離スペクトロメトリによって同定する工程；およ びc)同定された選択条件の少なくとも1つの吸着体を含む基材を調製する工程を 包含する。1つの実施態様において、同定工程は、複数の被分析物が保持される もとで少なくとも1つの選択条件を同定する工程を包含する。他の実施態様にお いて、調製工程は、ある溶離条件下で被分析物を多重な吸着体として保持する複 数の吸着体を含む基材を調製する工程を包含する。 他の局面において、本発明は被験体において、少なくとも1つの診断マーカー で特徴づけられる疾患を診断する方法を提供する。これは、複数の診断マーカー の同時検出のための組合せ的な方法である。この方法は、a)脱離スペクトロメト リで使用するための基材を提供する工程であって、この基材が少なくとも1つの アドレス可能な位置を含み、各アドレス可能な位置が、ある溶離条件下少なくと も1つの診断マーカーを分離する吸着体を含む、工程；b)基材を、その溶離条件 下、被験体からの生物学的試料に曝露して、診断マーカーを保持させる工程；お よびc)保持された診断マーカーを脱離スペタトロメトリで検出する工程、を包含 する。保持された診断マーカーの検出は疾患の診断を提供する。 他の局面において、本発明は試料中の被分析物を検出するためのキットを提供 する。このキットは、(1)脱離スペクトロメトリで使用するための基材であって 、少なくとも1つのアドレス可能な位置を含み、各アドレス可能な位置が、吸着 体および溶離物を含む選択条件下で被分析物を分離する吸着体を含む、基材；お よび(2)試料をこの選択条件に曝露するための溶離物または指示、を含む。1つの 実施態様において、キットは、複数の診断マーカー、および複数のアドレス可能 な位置を含む基材により特徴づけられ、各アドレス可能な位置は少なくとも1つ の診断マーカーを分離する吸着体を含む。 他の局面において、本発明は、脱離スペクトロメトリのための基材を提供する 。この基材は少なくとも1つの吸着体を少なくとも1つのアドレス可能な位置に含 み、 ここでこの少なくとも1つの吸着体は、患者試料から病理学的条件についての複 数の診断マーカーを分離する。 他の局面において、本発明は、被分析タンパク質について同一候補を選択する 方法を提供する。この方法は、少なくとも2つの物理化学的特性に基づくタンパ ク質同定のための組合せ的な方法である。この方法は以下の工程を包含する：a) 試料中のタンパク質被分析物の少なくとも第1および第2の物理化学的性質につい てのマッチパラメータを特定する値のセットを、以下の工程i)およびii)によっ て決定する工程：1)被分析物を複数の異なる選択条件に曝露する工程であって、 ここでタンパク質被分析物と基材との吸着がタンパク質被分析物の物理化学的性 質を同定する引力（attraction）に基づいて媒介される、工程；およびii)異な る選択条件下、保持された被分析物を脱離スペクトロメトリによって検出する工 程；およびb)プログラム可能なデジタルコンピュータで以下の工程i)〜iii)を実 行する工程：i)参照ポリペプチドの1つのセットの各メンバーについて、この参 照ポリペプチドの少なくとも第1および第2の物理化学的性質を特定する値のセッ トを含むデータベースにアクセスする工程；ii)タンパク質被分析物の物理化学 的性質を特定する値のセットを入力する工程；iii)マッチパラメータ内の値のセ ットを有する参照ポリペプチドをデータベースからソートする工程。ソートされ た参照ポリペプチドはタンパク質被分析物についての同一候補を提供する。非ソ ートの参照ポリペプチドは同一候補から除外されたポリペプチドである。 他の局面において、本発明は、被分析物を系列的に保持するための方法を提供 する。この方法は、多量体の巨大分子または超分子アセンブリのモニタリング方 法である。これは分子認識妨害による薬物発見のための方法として有用である。 この方法は、a)第1試料を一次吸着体および溶離物に曝露して、第1被分析物をこ の吸着体によって保持させ、そして吸着した被分析物を脱離スペクトロメトリに よって検出して、これにより保持された第1被分析物が二次吸着体になる工程；b )第2試料を二次吸着体および溶離物に曝露して、第2被分析物を二次吸着体で保 持させ、そして吸着した第2被分析物を脱離スペクトロメトリによって検出して 、これにより保持された第2被分析物が三次吸着体になる工程、を包含する。 他の局面において、本発明は、試料中の酵素を検出する方法を提供する。この 方法は：a)吸着体およびこの吸着体に結合した酵素基質を含む固相を提供する工 程であって、ここで酵素基質上の酵素の活性により特徴的な分子量を有する産物 が産生される工程；b)基質を試料に曝露する工程；およびc)脱離スペクトロメト リによって産物を検出する工程、を包含する。産物の検出により酵素の検出が提 供される。 他の局面において、本発明は被分析物が第1および第2の生物学的試料中に示差 的に存在する(例えば示差的に発現される)かどうかを決定するための方法を提供 する。この方法は、示差的遺伝子発現を示差的タンパク質提示によってモニタリ ングするための組合せ的な方法として有用である。この方法は：a)第1試料中の 被分析物についての第1保持マップを少なくとも1つの選択条件について決定する 工程；b)第2試料中の被分析物についての第2保持マップを同じ選択条件について 決定する工程；およびc)第1保持マップおよび第2保持マップ間の差異を検出する 工程、を包含する。保持マップ間の差異は、被分析物が第1試料および第2試料中 で示差的に存在することの決定を提供する。 1つの実施態様において、この方法は、タンパク質が、2つの異なる細胞間、お よびこの細胞またはこの細胞由来の物質を含む第1および第2の試料間で示差的に 発現するかどうかを決定するための方法である。他の実施態様において、この方 法は、ある物質が生物学的試料中のタンパク質の発現を変化させるかどうかを決 定するための方法であるならば、この物質を第1の生物学的試料に投与するが第2 の生物学的試料に投与しない工程を包含する。他の実施態様において、第1の生 物学的試料は健康な被験体由来であり、そして第2の生物学的試料は病理学的状 態に罹患した被験体由来である。試料は、例えば、血液、尿、血清および組織か ら選択され得る。病理学的被験体由来の試料において増加することが見いだされ る被分析物が診断マーカーの候補である。一般に、診断マーカーの確認は多くの 被験体からマーカーを検出することを含む。 他の局面において、本発明はレセプターに対するリガンドを同定するための方 法を提供する。この方法は：a)吸着体を含む基材を提供する工程であって、ここ でレセプターが吸着体に結合する、工程；b)結合したレｓｅプターを、レセプタ ーとリガンドとの間を結合させる条件下、リガンドを含む試料に曝露する工程； お よびc)結合したリガンドを脱離スペクトロメトリで検出する工程、を包含する。 他の局面において、本発明はある物質が標的被分析物と吸着体との間の結合を 調節するかどうかを決定するためのスクリーニング方法を提供する。これは薬物 発見のための組合せ的な方法である。この方法は：a)ある溶離条件下で標的被分 析物が結合する吸着体を含む基材を提供する工程；b)基材を標的被分析物および 上記物質に上記溶離条件下で曝露して、標的被分析物と吸着体との間を結合させ る工程；c)標的被分析物と吸着体との間の結合の量を脱離スペクトロメトリで検 出する工程；およびd)測定した量が、基材を上記物質なしの溶離条件下、標的被 分析物に曝露した場合のコントロール結合量と異なるかどうかを決定する工程、 を包含する。測定量とコントロール量との間の差異は、この物質が結合を調節す ることを示す。 1つの局面において、本発明は、標的吸着体に特異的に結合するポリペプチド 物質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子パッケージを検出する方法を提 供する。これは、1つの局面において、被分析物特異的ファージを提示ライブラ リーから選択するための組合せ的な方法であり、被保持物マッピングによって単 離された標的タンパク質またはインビボ転写および翻訳によりインサイチュで生 成された標的タンパク質の使用を包含する。この方法は：a)標的吸着体を含む基 材を提供する工程；b)複数の異なる遺伝子パッケージを含む提示ライブラリーを 提供する工程であって、異なる遺伝子パッケージの各々がポリペプチド物質をコ ードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含み、そして異なる遺伝子 パッケージの各々が、コードされたポリペプチド物質が提示される表面を有する 、工程；c)基材を溶離条件下で提示ライブラリーに曝露して、ポリペプチド物質 と標的吸着体との間を特異的結合させる工程であって、これによりポリペプチド 物質を含む遺伝子パッケージが基材上に保持される工程；およびd)基材上に保持 された遺伝子パッケージを脱離スペクトロメトリによって検出する工程。 本発明の1つの実施態様において、提示ライブラリーはファージ提示ライブラ リーである。他の実施態様において、ファージはM13である。他の実施態様にお いて、ポリペプチドは単鎖抗体である。他の実施態様において、標的被分析物は 、異なる表現型の細胞間で示差的に発現されるポリペプチド被分析物である。他 の 実施態様において、基材は細胞または細胞表面を含む。 1つの実施態様において、標的被分析物を含む基材を提供する工程は：i)吸着 体を含む基材を提供する工程であって、ここで吸着体が標的被分析物をある溶離 条件下で保持する、工程；およびii)吸着体を上記溶離条件下、標的被分析物に 曝露して、標的被分析物を吸着体によって保持させる工程であって、ここで標的 被分析物が標的吸着体になる工程、を包含する。1つの実施態様において、標的 被分析物は標的ポリペプチドであり、そして吸着体を曝露する工程ii)は、標的 ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのインビトロ翻訳によって標的ポリ ペプチドをインサイチュで吸着体上に産生する工程を包含し、そしてさらにポリ ヌクレオチド配列をインサイチュで基材上で増幅する工程を包含し得る。 他の実施態様において、基材は：(1)固定化(anchoring)ポリペプチドに結合す る吸着体、および(2)固定化ポリペプチドを提示する表面を有する少なくとも1つ の標的遺伝子パッケージを含み、この標的遺伝子パッケージは標的吸着体をコー ドするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含み、ここで標的遺伝子パッ ケージは固定化ポリペプチドを介して吸着体に結合する。 他の実施態様において、この方法はさらに以下の任意の工程を包含する：ポリ ペプチド物質をコードするヌクレオチド配列を配列決定する工程；保持された遺 伝子パッケージを単離する工程またはポリペプチド物質を産生する工程。 他の局面において、本発明は脱離スペクトロメトリのための基材を提供し、こ の基材は遺伝子パッケージの表面上に提示された固定化ポリペプチドに結合する 吸着体を含み、ここで遺伝子パッケージの表面はさらに標的ポリペプチドを提示 し、そしてここで遺伝子パッケージは標的ポリペプチドをコードするヌクレオチ ドを含むポリヌクレオチドを含む。 他の局面において、本発明はポリヌクレオチドの翻訳を検出するための方法を 提供する。この方法は：a)脱離スペクトロメトリで使用するための吸着体を含む 基材を提供する工程；b)基材を、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、 およびポリヌクレオチドのインビトロ翻訳のための物質と接触させる工程であっ て、ここでポリペプチドが産生される、工程；c)基材を溶離物に曝露して、ポリ ペプチドを吸着体によって保持させる工程；およびd)保持されたポリペプチドを 脱離スペクトロメトリによって検出する工程、を包含する。ポリペプチドの検出 により、ポリヌクレオチドの翻訳の検出が提供される。 図面の簡単な説明 図1は、ストリップの形状に複数の吸着スポットを含む基材を示す。このスト リップは引力(疎水性、イオン性、配位共有、および混合機能)を基準にして分類 される6つの異なるセットの吸着剤を含む。このストリップは、各型の吸着体ご とに数個のスポットを含み、これらのスポットは異なる溶離物で異なる時点に問 い合わせすることを可能とし、あるいはこれらのスポットは記録および次の分析 のためである。 図2は、所定のアドレス可能な位置での吸着体(表面相互作用ポテンシャル)の 直交アレイを示す。アレイはまたプレートの形状をとり得る。アレイは種々の吸 着体を含む。被分析物に曝露すると、各ストリップは種々の溶離物(選択性閾値 調節物)で洗浄され得る。異なる選択条件下で保持される被分析物により、保持 マップまたは認識プロファイルが得られる。 図3は、アレイ上の所与の位置からの被分析物の脱離による被分析物の定量分 析、および脱離した被分析物のレーザー脱離質量スペクトロメトリによる定量的 検出を表す。 図4Aは、本発明によって生成されるデータを分析するために使用され得るソフ トウェアを実行するために使用されるコンピュータシステムの例を示す。図4Aは コンピュータシステム1を示し、これはモニター3、スクリーン5、キャビネット7 、キーボード9、およびマウス11を含む。マウス11はマウスボタン13のような1つ 以上のボタンを有し得る。キャビネット7はCD-ROMドライブ15およびハードドラ イブ(図示せず)を収納し、これは本発明を取り入れたコードを含むコンピュータ プログラムを記録し、そして検索するために利用され得る。CD-ROM17がコンピュ ータで読みとり可能な記憶媒体として図示されるが、コンピュータで読みとり可 能な他の記憶媒体(フロッピーディスク、DRAM、ハードドライブ、フラッシュメ モリ、テープなどを包含する)も利用され得る。キャビネット7はまた、プロセッ サ、メモリなどの普通のコンピュータ構成要素(図示せず)も収納する。 図4Bは、本発明で生成するデータを分析するために使用され得るソフトウェア を実行するために使用されるコンピュータシステム1のシステムブロックダイア グラムを示す。図4Aに示すように、コンピュータシステム1は、モニター3および キーボード9を含む。コンピュータシステム1はさらに、セントラルプロセッサ10 2、システムメモリ104、I/Oコントローラ106、ディスプレイアダプタ108、リム ーバブルディスク112、固定ディスク116、ネットワークインターフェース118、 およびスピーカ120のようなサブシステムを含む。リムーバブルディスク112は、 フロッピー、テープ、CD-ROM、リムーバブルハードドライブ、フラッシュメモリ 等のようなリムーバブルなコンピュータで読みとり可能な媒体を代表する。固定 ディスク116は内部ハードドライブ、DRAMなどを表す。本発明での使用に適した 他のコンピュータシステムは、追加の、あるいはより少ないサブシステムを含み 得る。例えば、他のコンピュータシステムは1つより多くのプロセッサ102(すな わち、マルチプロセッサシステム)またはメモリキャッシュを含み得る。 図5A-5Fは、6つの異なる吸着体および数個の異なる溶離物を含む選択条件下で のリゾチームの保持マップを示す。 図6A-6Bは、固定化金属吸着体によるヒト血清中の被分析物の低分子量および 高分子量での分離を示す。 図7A-7Bは、同じ溶離物を用いての種々の吸着体によるヒト血清中の被分析物 の低分子量および高分子量での分離を示す。 図8A-8Bは、水を溶離物として用いての種々の吸着体による早期児の尿の低分 子量および高分子量での分離を示す。 図9は、疎水性フェニル吸着体および3つの異なる溶離物を用いた初期小児尿中 の被分析物の分離を示し、その結果、1つの被分析(*)物がTween洗浄条件で選択 的に保持されることが発見された。 図10A-10Dは、2つの異なる乳ガン細胞株の細胞培養培地中の被分析物の分離を 示す。 図11は、6つの異なる吸着剤および3つの異なる溶離物によって定義される選択 条件に曝露された早期児尿の複合保持マップを示す。 図12は、早期児尿の二次元ポリアクリルアミドゲル(pIおよび見かけ上の分子 量)を示す。 図13は、標的被分析物に特異的に結合する表面タンパク質を有するファージに ついてのファージ提示ライブラリーでのパニング法を示す。上に示す基材は、ほ んのわずかの特異的に結合するファージでさえも、そのファージが含む多くのコ ートタンパク質の検出によって脱離スペクトロメトリで検出され得ることを示す 。下では、いくつかの吸着体スポットを有する基材が、標的被分析物が特異的に 結合されるように開発される。ファージはこれらのスポットに曝露される。結合 したファージが脱離スペクトロメトリによって検出される。他のスポットに結合 したファージは単離され得、そして増殖され得る。 図14は、タンパク質−タンパク質相互作用の研究で使用するための標的タンパ ク質をドッキングするために、パニング法で同定されたリガンド物質(この場合 には一本鎖抗体)をどのようにして吸着体として用い得るかを示す。標的はイン サイチュで精製され(スポット2)、そしてファージ提示ライブラリーをパニング するために使用される(スポット4)。一本鎖抗体を単離し、そして基材(スポット 6)に吸着体として付着させる。次いで、標的が一本鎖抗体に吸着される。この標 的がここで、タンパク質−タンパク質相互作用の研究のためにドッキングされる (スポット8)。 図15は、薬物候補を、タンパク質のリガンド(この場合には一本鎖抗体)への結 合を妨害する能力についてスクリーニングするための方法を示す。標的タンパク 質に対して特異的な一本鎖抗体を、例えば、それ自体がタンパク質Aまたはタン パク質Gを介してドッキングされ得る抗ファージ抗体を介して、基材上のスポッ トにドッキングさせる。一本鎖抗体を標的タンパク質および薬物候補に曝露する 。薬物が被分析物タンパク質に結合する能力、およびリガンドと被分析物との結 合を妨害する能力を、脱離スペクトロメトリーでモニターする。 図16は、薬物候補を、タンパク質とリガンドとの結合を妨害する能力について スクリーニングするための方法を示す。この方法は、薬物が、それ自体がリガン ドと結合することによって被分析物の結合を妨害する能力を脱離スペクトロメト リでモニターすること以外は、前図に示した方法と同様である。 図17は、薬物候補を、標的タンパク質(標的タンパク質1)と二次的リガンド(標 的タンパク質II)との結合を妨害する能力についてスクリーニングするための方 法を示す。前の2つの図のように、標的は基材とドッキングしてそれ自体がリガ ンドの吸着体となる。この場合、被分析物は一本鎖抗体を介してドッキングされ る。次いで、標的をリガンドおよび薬物候補に曝露する。薬物が、被分析物とリ ガンドとの間の結合を(例えば、標的被分析物に結合することによって)妨害する 能力を、脱離スペクトロメトリーでモニターする。 図18は、示差的に発現されるmRNAまたはポリペプチドの同定から始まり、脱離 スペクトロメトリによる検出のためのポリペプチドを特異的に結台するための診 断プラットフォームの作製に終わる、フローチャートを示す。 図19A-19Dは、吸着体アレイ上のHemophilus溶解物の保持マップを示す。図19A ：アニオン性吸着体；図19B：順相吸着体；図19C：Ni(II)吸着体；図19D：疎水 性吸着体。 図20A-20Cは、Hemophilus溶解物中の被分析物の進行的分離を示す。各場合の 吸着体はアニオン性吸着体である。図20A：第1工程において、試料を曝露した後 、スポットを150μｌの20mMリン酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム、pH7.0で洗 浄した。第2工程において、吸着体および溶離物のリン酸ナトリウム特性を特性 の定常セットに加えた。新規の溶離特性を加えた。図20B：20mMリン酸ナトリウ ム、pH7.0に加えて、スポットを0.05％Triton X100および0.15M NaCl(全体で150 μｌ)で洗浄した。図20C：20mMリン酸ナトリウム、pH7.0に加えて、スポットを1 00mMイミダゾール、0.15MNaCl(全体で150μｌ)で洗浄した。 図21A-21Dは、正常ヒト血清および疾患血清中の成分間の比較の結果を示す。 図21A：吸着体アレイCu(II)部位上の正常血清の保持マップ。図21B：吸着体アレ イCu(II)部位上の疾患血清の保持マップ。図21C：両血清試料の保持被分析物を 重ね合わせ様式で組み合わせられる。表示を単純化するために、保持被分析物の 各ピークを直線に変換し、点線が正常血清から保持された被分析物を表し、そし て実線が疾患血清から保持された被分析物を表す。図21D：2つの試料間の差異を よりはっきりと識別するために、比較プロットを作製する。ここで試料から保持 された被分析物の比を計算し、そして示した。「*」でマークされた2つの被分析 物が、疾患血清中の有意な増加を示す(5〜10倍の増加)。 図22A-22Dは、コントロール、疾患、および薬物処置されたマウスの尿のCu(II )吸着体上での保持マップの比較、ならびに疾患および薬物処置尿中のマーカー の量の定量を示す。 図23A-23Dは、「ゲルビュー(gel view)」フォーマットで示される、4人のヒト ガン患者からの尿中の被分析物の保持マップを示す。患者1、2および3の間の示 差マップは、これらの患者において増大した量で存在する2つの共通の被分析物 を示す。 図24A-24Eは、レーザー脱離質量スペクトロメトリによる、遺伝子VIIIコート タンパク質の検出を通じてのM13ファージの検出を示す。オリジナルの1012ファ ージ／mlの希釈は1：10から1：100,000,000の範囲である。 図25A-25Bは、吸着体として抗M13抗体を用いての脱離スペクトロメトリによる M13の捕捉を示す。図22Aは遺伝子VIIIおよび遺伝子IIIタンパク質を表すピーク によるM13ファージの捕捉を示す。図22Bは、抗体吸着体(一重(singly)および二 重（doubly）チャージを示すピークを示すコントロールである。 図26A-26Dは、抗tat一本鎖抗体を有するM13ファージの、tatタンパク質吸着体 による吸着を示す。単一の強度を1：10から1：10,000のファージ希釈下で示す。 図27A-27Bは、ドッキングしたTGF-βレセプター融合タンパク質に結合したTGF -βの、１μｇ/ml(図27A)および100ng／ml(図27B)での保持マップを示す。実線 は遊離のTGF-βレセプターの非存在下での結合を示す。点線はTGF-βレセプター の存在下での結合を示す。 図28から31は、被保持物クロマトグラフィーの分離能力を示す。図28A-28Cは 、疎水性、カチオン性、およびCu(II)吸着体を用いたHenophilus溶解物からのタ ンパク質の分離を、0kDから30kDの分子量で示す。各保持被分析物は直線で示さ れ、直線の高さは保持被分析物の強度を示す。図29A-29Cは、疎水性、カチオン 性、およびCu(II)吸着体を用いたHemophilus溶解物からのタンパク質の分離を、 約30kDから約100kDの分子量で示す。図30は、3種の吸着体の各々による0kDから3 0kDのHemophilusタンパク質から組み合わせた分離を示す。図31は、3種の吸着体 の各々による20kDから100kDのHemophilusタンパク質から組み合わせた分離を示 す。 図32は、GST融合タンパク質と順相吸着体との結合を示す。 図33A-33Bは、特異的リガンドと、吸着剤アレイにドッキングしたGST融合レセ プターとの結合(図33A)、およびリガンドとGST融合レセプターを含まないコント ロールアレイとの結合が存在しないこと(図33B)を示す。 発明の詳細な説明 １．定義 特に指示のない限り、本明細書中で使用される全ての技術および科学用語は、 本発明が属する技術分野の当業者に普通に理解される意味を有する。以下の参考 文献は、当業者に、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を提供する。 Singleotnら、DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(第2版、199 4);THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCEIENCE AND TECHNOLOGY(Walker編,1988);TH E GLOSSARY OF GENETICS第5版，R．Riegerら(編),Spring Verlag(199l)；および Hale & Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY(1991)。本明細書 において、以下の用語は特に指示のない限り、これらに依る意味を有する。 「被分析物」は、望ましくは保持され、そして検出される、試料の成分をいう 。この用語は試料中の単一の成分または成分のセットをいい得る。 「吸着体」は、被分析物を吸着し得る任意の材料をいう。用語「吸着体」は本 明細書において、被分析物が曝露される単独の材料(「モノプレックス吸着体」) (例えば、化合物または官能基)、および試料が曝露される複数の異なる材料(「 マルチプレックス吸着体」)の両方をいう。マルチプレックス吸着体中の吸着体 材料を「吸着体種」という。例えば、基材上のアドレス可能な位置は、異なる結 合特性を有する多くの異なる吸着体種(例えば、アニオン交換材料、金属キレー ト剤、または抗体)で特徴づけられるマルチプレックス吸着体を含み得る。 「吸着」は、溶離物(選択性閾値調節剤)での洗浄の前または後のいずれかの、 吸着体と被分析物との間の検出可能な結合をいう。 「基材」は吸着体が付着または堆積する固体相をいう。 「結合特性」は、吸着体の被分析物に対する引力を決定する化学的および物理 的特徴をいう。2種の吸着体は、もし同一の溶離条件下で同じ被分析物を異なる 親和性の程度で結合する場合、異なる結合特性を有する。結合特性としては、例 えば、塩で促進される相互作用の程度、疎水性相互作用の程度、親水性相互作用 の程度、静電的相互作用の程度、および本明細書で記載される他のものが挙げら れる。 「結合条件」は、被分析物が曝露される結合特性をいう。 「溶離物」は、被分析物の吸着体への吸着を媒介するために使用される物質（ agent）（典型的には溶液）をいう。溶離物はまた「選択性閾値調節剤」とも称 される。 「溶離特性」は、特定の溶離物(選択性閾値調節剤)が被分析物と吸着体との間 の吸着を媒介する能力を決定する特徴をいう。2つの溶離物は、被分析物および 吸着体と接触させたときに、被分析物の吸着体に対する親和性の程度が異なる場 合、異なる溶離特性を有する。溶離特性としては、例えば、pH、イオン強度、水 構造の改変、界面活性剤強度、疎水性相互作用の改変、および本明細書で記載さ れる他のものが挙げられる。 「溶離条件」は、被分析物が曝露される溶離特性をいう。 「選択性特性」は、特定の結台特性を有する吸着剤と特定の溶離特性を有する 溶離物との組み合わせの特徴をいい、これは溶離物で洗浄した後に吸着体に保持 される被分析物の特異性を決定する。 「選択条件」は、被分析物が曝露される選択性特性をいう。 「引力（attraction）の基準」は、１つの分子が他の分子に引きつけられるこ とを生じさせる化学的および／または物理化学的特性をいう。 「引力の強度」は、他の分子に対する１つの分子の引力の強さをいう(親和性 としても知られる)。 「分離する(resolve)」、「分離(resolution)」または「被分析物の分離」は 、試料中の少なくとも１つの被分析物の検出をいう。分離は、試料中の複数の被 分析物を分別し、そして次に示差的に検出することによる検出を包含する。分離 は、被分析物を混合物中の他の被分析物から完全に分別することを必ずしも必要 としない。むしろ、少なくとも2つの被分析物の間の識別を可能とする任意の分 別であれば十分である。 「情報高度分離」は、単に被分析物のみならず、評価される被分析物の少なく とも１つの物理化学的特性(例えば、分子量)を検出する様式での被分析物の分離 をいう。 「脱離スペクトロメトリー」は、被分析物の検出方法をいう。ここで被分析物 は被分析物を固定相から気相に脱離させるエネルギーに曝露され、そして脱離し た被分析物またはその識別可能な部分は、被分析物を第2の固定相上に捕捉する 中間的工程を経ることなく、検出器で直接検出される。 「検出」は、検出されるべき目的物の存在、非存在、または量を同定すること をいう。 「保持」は、溶離物で洗浄した後に被分析物の吸着体による吸着をいう。 「保持データ」は、特定の選択条件下で保持される被分析物の検出(必要に応 じて、質量の検出を包含する)を示すデータをいう。 「保持マップ」は、複数の選択条件下で保持される被分析物についての保持デ ータを特定する値のセットをいう。 「認識プロファイル」は、複数の選択条件下での被分析物の相対的保持を特定 する値のセットをいう。 「複合体」は、2つ以上の被分析物の連合によって形成される被分析物をいう 。 「フラグメント」は、被分析物の化学的、酵素的、または物理的分解による生 成物をいう。フラグメントは中性またはイオン状態であり得る。 「示差的発現」は、被分析物の質的または量的存在における、検出可能な差異 をいう。 「生物学的試料」は、ウイルス、細胞、組織、器官または生物由来の試料であ り、細胞、組織または器官の溶解物またはホモジネート、あるいは体液試料、例 えば、血液、尿または脳脊髄液を包含するがこれらに限定されない。 「有機生体分子」は、生物学的起源の有機分子をいい、例えば、ステロイド、 アミノ酸、ヌクレオチド、糖、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、複合炭水化物 または脂質をいう。 「小有機分子」は、薬学で一般的に用いられる有機分子のサイズに匹敵するサ イズの有機分子をいう。この用語は、有機バイオポリマー(例えば、タンパク質 、 核酸など)を除外する。好ましい小有機分子は、約5000Daまで、約2000Daまで、 または約1000Daまでの範囲のサイズである。 「バイオポリマー」は、生物学的起源のポリマーをいい、例えば、ポリペプチ ド、ポリヌクレオチド、多糖またはポリグリセリド(例えば、ジグリセリドまた はトリグリセリド)をいう。 「ポリペプチド」は、アミノ酸残基から構成されるポリマー、関連する天然に 存在する構造的改変体、およびペプチド結合で連結したその合成の非天然アナロ グ、関連する天然に存在する構造的改変体、およびその合成の非天然アナログを いう。合成ポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成機を用いて合成され 得る。用語「タンパク質」は典型的には大きなポリペプチドをいう。用語「ペプ チド」は典型的には短いポリペプチドをいう。 「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位から構成されるポリマーをいう。 ポリヌクレオチドは、天然に存在する核酸、例えば、デオキシリボ核酸(「DNA」 )およびリボ核酸(「RNA」)、ならびに核酸アナログを包含する。核酸アナログは 、非天然の塩基を含むアナログ、天然に存在するホスホジエステル結合以外の他 のヌクレオチドとの結合に関与するヌクレオチド、またはホスホジエステル結合 以外の結合を介して結合する塩基を含むものを包含する。従って、ヌクレオチド アナログは、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロト リエステル、ホスホルアミデート、ボラノホスフェート、メチルホスホネート、 キラルーメチルホスホネート、2-0-メチルリボヌクレオチド、ペプチド-核酸(PN A)などを包含するが、これらに限定されない。このようなポリペプチドは、例え ば自動DNA合成機を用いて合成され得る。用語「核酸」は典型的には大きなポリ ヌクレオチドをいう。用語「オリゴヌクレオチド」は典型的には短いポリヌクレ オチドをいい、一般的には、約50ヌクレオチドを越えない。ヌクレオチド配列が DNA配列(すなわち、A、T、G、C)によって繰り返される場合、これはまた、RNA配 列(すなわち、A、U、G、C)を含み、ここで「U」が「T」を置換すると理解される 。 「検出可能な部分」または「標識」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫 化学的、または化学的手段によって検出可能な組成物をいう。例えば、有用な標 識は、32P、35S、蛍光色素、電子密度試薬、酵素(例えば、ELISAで一般に使用さ れるようなもの)、ビオチン−ストレプトアビジン、ジオキシゲニン、ハプテン 、およびタンパク質(それに対する抗血清またはモノクローナル抗体が入手可能 なもの)、または標的に対して相補的な配列を有する核酸分子を包含する。検出 可能な部分はしばしば、放射性シグナル、色素原性シグナル、または蛍光シグナ ルのような測定可能なシグナルを発生し、これは試料中の結合した検出可能な部 分の量の定量のために使用され得る。検出可能な部分は、プライマーまたはプロ ーブに、共有結合的に、またはイオン結合、ファンデルワールス結合もしくは水 素結合を介してのいずれかで取り込まれ得るか、あるいは付加し得る。例えば放 射性ヌクレオチド、またはストレプトアビジンで認識されるビオチン化ヌクレオ チドが取り込まれる。検出可能な部分は、直接的または間接的に検出され得る。 間接的検出は、この検出可能な部分に第2の直接的または間接的に検出可能な部 分の結合を伴う。例えば、検出可能な部分は、結合パートナーのリガンド（例え ばビオチン(これはストレプトアビジンに対する結合パートナーである)）、また はヌクレオチド配列(これは相補的配列の結合パートナーであり、これに対して 特異的にハイブリダイズし得る)であり得る。結合パートナーはそれ自体直接的 に検出可能であり得、例えば、抗体はそれ自体が蛍光分子で標識され得る。結合 パートナーはまた間接的に検出可能であり、例えば、相補的ヌクレオチド配列を 有する核酸は分枝DNAの一部であり得、これが次に他の標識された核酸分子との ハイブリダイゼーションによって検出可能となる。(例えば、PD．Fahrlanderお よびA.Klausner、Bio/Technology(1988)6:1165を参照のこと)。シグナルの定量 は、例えば、シンチレーション計数、デンシトメトリー、またはフローサイトメ トリーによって達成される。 「複数」は、少なくとも2つを意味する。 「精製する」または「精製」は、精製される組成物から少なくとも1つの混入 物を除去することを意味する。精製は精製された化合物が100％純粋であること を必要としない。 「リガンド」は標的分子に特異的に結合する化合物である。 「レセプター」はリガンドに特異的に結合する化合物である。 「抗体」は、１つの免疫グロブリン遺伝子もしくは複数の免疫グロブリン遺伝 子、またはそのフラグメントで実質的にコードされるポリペプチドをいい、これ はエピトープ(例えば、抗原)を特異的に結合および認識する。認識される免疫グ ロブリン遺伝子は、カッパおよびラムダ軽鎖定常領域遺伝子、アルファ、ガンマ 、デルタ、イプシロンおよびミュー重鎖定常領域遺伝子、および無数の免疫グロ ブリン可変領域遺伝子を含む。抗体は、例えば、インタクトな免疫グロブリンと して、あるいは種々のペプチダーゼでの切断によって生成する詳細に特徴づけら れる多数のフラグメントとして存在する。これは、例えば、Fab'およびF(ab)'2 フラグメントを包含する。用語「抗体」は本明細書において、また、抗体全体の 改変によって生成された抗体フラグメント、または新規に組換えDNA方法論を用 いて新規に合成されたものも包含する。これはまた、ポリクローナル抗体、モノ クローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体を包含する。抗体の「Fc」部分は 、免疫グロブリンの重鎖部分をいい、これは１つ以上の重鎖定常領域ドメイン、 CH1、CH2、およびCH3を含むが、重鎖可変領域を含まない。 リガンドまたはレセプター(例えば、抗体)は、そのリガンドまたはレセプター が、異種化合物の試料中の被分析物の存在を決定する結合反応において機能する 場合に、化合物被分析物に対して「特異的に結合する」または「特異的に免疫反 応性である」。従って、指定のアッセイ(例えば、イムノアッｔイ)条件下で、リ ガンドまたはレセプターは特定の被分析物に優先的に結合し、そして試料中に存 在する他の化合物の有意な量とは結合しない。例えば、ポリヌクレオチドはハイ ブリダイゼーション条件下で相補的配列を含む被分析物ポリヌクレオチドに特異 的に結合する；抗体は、イムノアッセイ条件下で、その抗体が惹起されたエピト ープを有する抗原被分析物に特異的に結合する；そして吸着体は、適切な溶離条 件下で被分析物に特異的に結合する。 「物質(agent)」は、化学化合物、化学化合物の混合物、未知組成物の試料、 組合せ的な小分子アレイ、生物学的巨大分子、バクテリオファージペプチド提示 ライブラリー、バクテリオファージ抗体(例えば、scFv)提示ライブラリー、ポリ ソームペプチド提示ライブラリー、あるいは細菌、植物、真菌、または動物細胞 もしくは組織のような生物学的材料から作製した抽出物をいう。適切な技術は、 ファージまたは同様のベクター中の組換え抗体のライブラリーの選択を伴う。Hu seら(1989)Science 246:1275-1281;およびWardら(1989)Nature 341：544-546を 参照のこと。Huseによって記述されるプロトコルはファージ提示技術との組み合 わせによってより効率的になる。例えばDowerら、WO 91/17271およびMcCafferty ら、WO 92/01047を参照のこと。 「組換えポリヌクレオチド」は、天然では互いに連結しない配列を有するポリ ヌクレオチドをいう。増幅または組み立てられた組換えポリヌクレオチドを適切 なベクターに入れてもよく、そしてこのベクターを用いて適切な宿主細胞を形質 転換し得る。組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を「組換え宿主細胞」とい う。次いで、遺伝子を組換え宿主細胞中で発現させて、例えば「組換えポリペプ チド」を産生する。組換えポリヌクレオチドは、また、非コーディング機能(例 えば、プロモーター、複製起点、リボソーム結合部位など)として作用し得る。 適切な単細胞宿主は、真核生物または哺乳類ポリヌクレオチドの発現において日 常的に使用される任意の単細胞宿主を包含し、例えば、E.coliのような原核生物 ；および例えば酵母のような真菌を含む真核生物；および昆虫細胞(例えばSf9) および動物細胞(例えば、CHO、R1.1、B-W、L-M、アフリカミドリザル腎臓細胞( 例えば、COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40およびBMT 10)および培養ヒト細胞)を包 含する哺乳類細胞を包含する。 「発現制御配列」は、ポリヌクレオチド中のヌクレオチド配列であって、それ に作動可能に連結したヌクレオチド配列の発現(転写および／または翻訳)を調節 する配列をいう。「作動可能に連結した」は、2つの部分の機能的関係であって 、1つの部分の活性(例えば、転写を調節する能力)の結果、他の部分が作用する( 例えば、配列の転写)ものをいう。発現調節配列は、例えば、プロモータ−(例え ば、誘導性、抑制性、または構成的)、エンハンサー、転写ターミネーター、開 始コドン(すなわちATG)、イントロンのためのスプライシングシグナル、および 終止コドンの配列を包含し得るが、これらに限定されない。 「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現 制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターをいう。発現ベクターは 、発現のための十分なシス作動性要素を含む；発現のための他の要素は宿主細胞 ま たはインビトロ発現系によって補充され得る。発現ベクターは当該分野で公知の 全てのベクター、例えば、コスミド、プラスミド(例えば、裸の、あるいはリポ ソーム中に含まれた)および組換えポリヌクレオチドを取り込んだウイルスであ る。 「コードする」は、ポリヌクレオチド(例えば、遺伝子、cDNA、またはmRNA)中 の特定のヌクレオチド配列が、定義されたヌクレオチドの配列(すなわち、rRNA 、tRNAおよびmRNA)または定義されたアミノ酸の配列のいずれかを有し、そして その結果得られる生物学的特性を有する他のポリマーまたは巨大分子の生物学的 プロセスにおける合成のための鋳型として働く固有の特性をいう。従って、遺伝 子によって産生されるmRNAの転写または翻訳によって、細胞中または他の生物学 的系中でタンパク質が産生される場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。 遺伝子またはcDNAのコード鎖(そのヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であり、 そして通常、配列表として提供される)および非コード鎖(転写の鋳型として使用 される)の両方が、タンパク質、あるいはその遺伝子またはcDNAの他の産物をコ ードすると称され得る。特に指示のない限り、「アミノ酸配列をコードするヌク レオチド配列」は、互いに縮重したバージョンであって、同じアミノ酸配列をコ ードする、全てのヌクレオチド配列を包含する。タンパク質およびRNAをコード するヌクレオチド配列はイントロンを含み得る。 「エネルギー吸収分子」は、脱離スペクトロメトリのエネルギー源からエネル ギーを吸収して、それによりプローブ表面からの被分析物の脱離を可能とする分 子をいう。MALDIで使用されるエネルギー吸収分子はしばしば「マトリクス」と 称される。ケイ皮酸誘導体、シナピン酸（cinapinic acid）、およびジヒドロキ シ安息香酸が、生体有機分子のレーザー脱離におけるエネルギー吸収分子として しばしば使用される。 II.被保持物クロマトグラフィー 被保持物クロマトグラフィーは試料中の被分析物の多次元分離のための方法で ある。この方法は、(1)複数の異なる吸着体／溶離物の組み合わせ(「選択条件」 )下で、試料中から被分析物を基材に選択的に吸着する工程、および(2)吸着 された被分析物の保持を脱離スペクトロメトリによって検出する工程を包含する 。各選択条件は、第1の分別の次元を提供し、吸着されない被分析物から、吸着 された被分析物を分別する。脱離質量スペクトロメトリは、第2の分別の次元を 提供し、吸着した被分析物を質量に従って互いに分別する。被保持物クロマトグ ラフィーは複数の異なる選択条件の使用を伴うので、多くの分別の次元が達成さ れる。1つ以上の被分析物の2つの選択条件下での相対的な吸着もまた決定され得 る。この多次元分別は被分析物の分離およびその特徴付けの両方を提供する。 さらに、このようにして分別された被分析物は被保持物マップにドッキングし たままであり、これは試験(例えば、被分析物の構造および／または機能)のため のさらなる操作をし易い。また、ドッキングした被分析物はそれ自体、基材に曝 露される他の被分析物をドッキングするための吸着体として使用され得る。要約 すれば、本発明は、被分析物の迅速、多次元かつ高度情報分離を提供する。 この方法はいくつかの形態をとり得る。1つの実施態様において、被分析物は2 つの物理的に異なる位置で2つの異なる吸着体に吸着され、そして各吸着体は同 じ溶離物(選択閾値調節物)で洗浄される。別の実施態様において、被分析物は2 つの物理的に異なる位置で同一の吸着体に吸着され、そして2つの異なる溶離物 で洗浄される。別の実施態様において、被分析物は物理的に異なる位置で2つの 異なる吸着体に吸着され、そして2つの異なる溶離物で洗浄される。別の実施態 様において、被分析物は吸着体に吸着され、そして第1の溶離物で洗浄され、そ して保持が検出される。次いで、吸着された被分析物は第2の異なる溶離物で洗 浄され、そして次に保持が検出される。 A．被保持物クロマトグラフィーの実施方法 1.選択条件への被分析物の曝露 a．基材の調製 被保持物クロマトグラフィーの実施において、吸着体に保持される被分析物は 基材上でエネルギー源に対して提示される。被分析物を含む試料を、吸着体を基 材(これは被分析物を脱離手段に提示するのに役立つ)に添加する前または後に、 吸着体に接触させ得る。接触の目的のために、吸着体は液体形態または固体形態 (すなわち基材または固相上)であり得る。詳細には、吸着体は、溶液、懸濁液、 分散液、油中水型乳濁液、水中油型乳濁液、またはミクロ乳濁液の形態であり得 る。吸着体が懸濁液、分散液、乳濁液またはミクロ乳濁液の形態で提供される場 合、適切な界面活性剤もまた存在し得る。この実施態様において、試料は、液体 試料が液体吸着体と混合されることによって吸着体と接触され得る。あるいは、 試料は固体支持体上に提供され得、そして接触は、試料を含む固体支持体を液体 吸着体中に浸漬(bathlng)、ソーキング、またはディッピングすることによって 達成される。さらに、試料は、固体支持体に液体吸着体を吹き付けるか、または 固体支持体を液体吸着体で洗うことによって接触され得る。この実施態様におい て、異なる吸着体は異なる容器中に提供され得る。 1つの実施態様において、吸着体は基材上に提供される。基材は吸着体を結合 または保持し得る任意の材料であり得る。代表的には、基材は、ガラス；セラミ リマー；天然バイオポリマー；金属(例えば、ニッケル、真鍮、鋼またはアルミ ニウム)；フィルム；多孔質および非多孔質の架橋ポリマーのビーズ(例えば、ア ガロース、セルロースまたはデキストラン)；他の不溶性ポリマー；またはそれ らの組み合わせから構成される。 1つの実施態様において、基材は、脱離検出器に挿入されるプローブまたは試 料提示手段の形態をとる。例えば、図1を参照すると、基材はストリップの形態 でをとり得る。吸着体は基材にスポットの線状アレイの形態で付着され得、これ らの各々が被分析物に曝露され得る。いくつかのストリップが互いに連結され、 その結果複数の吸着体が定義された列に不連続のスポットを有するアレイ30を形 成し得る。基材はまた、吸着体の水平および垂直の列のアレイを有するプレート の形態であり得、これは正方形、長方形または円のような規則的な幾何学的パタ ーンを形成する。 プローブは以下のように作製され得る。基材は任意の固体材料、例えば、ステ ンレス鋼、アルミニウムまたはケイ素ウエハであり得る。次いで、金属基材は表 面が誘導体化され得る材料でコートされ得る。例えば、金属表面は酸化ケイ素、 酸化チタンまたは金でコートされ得る。 次に表面を二官能性リンカーで誘導体化する。リンカーは1つの端に、表面上 の官能基と共有結合し得る官能基を含む。従って、官能基は無機酸化物または金 のためにはスルフヒドリル基であり得る。リンカーの他の端は一般にアミノ官能 基を有する。有用な二官能性リンカーとしては、アミノプロピルトリエトキシシ ランまたはアミノエチルジスルフィドが挙げられる。 一旦表面に結合したら、リンカーは吸着体として作用する基でさらに誘導体化 される。一般に、吸着体はプローブ上のアドレス可能な位置に付加される。1つ のプローブの型では、直径約3mmのスポットが直交アレイで配置される。吸着体 はそれ自体が、利用可能なアミノ基と反応する基および吸着体として作用する官 能基を含む二官能性分子の一部であり得る。官能基は、例えば、順相(酸化ケイ 素)、逆相(C18脂肪族炭化水素)、第四級アミンおよびスルホネートを包含する。 また、表面はさらにカルボジイミドおよびN-ヒドロキシスクシンイミドのような 他の二官能性分子で誘導体化され得、予備活性化ブランクを作製する。これらの ブランクは生体有機吸着体(例えば、核酸、抗体および他のタンパク質リガンド) で官能化され得る。バイオポリマーが、アミン残基またはスルフヒドリル残基を 通じてブランク上の官能基に結合し得る。1つの実施態様において、吸着体は架 橋ポリマー(例えばフィルム)に結合し、架橋ポリマーはそれ自体は、利用可能な 官能基を通じてプローブの表面に結合する。このようなポリマーは、例えば、セ ルロース、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアクリルアミド およびこれらの混合物を包含する。付着した吸着体を有するプローブは使用の準 備ができている。 別の実施態様において、吸着体を第1の基材に付着させて固相(例えば、ポリマ ーまたはガラスのビーズ)を提供し、これを次に第2の基材上に配置し、第2の基 材は、脱離検出器の脱離エネルギーに試料を提示する手段として働く。例えば、 第2の基材は、所定のアドレス可能な位置に一連のウェルを有するプレートの形 状であり得る。ウェルは吸着体で誘導体化された第1の基材(例えば、吸着体で誘 導体化されたポリマー性ビーズ)のための容器として働き得る。この実施態様の1 つの利点は、被分析物が第1の基材に1つの物理的状況で吸着され得、そして脱離 スペクトロメトリによる分析のために試料を提示する基材に移され得ることであ る。 代表的には、基材は、吸着体に結合しそして保持された被分析物を検出するた めに本発明の方法で使用される検出器での使用に適合する。1つの実施態様にお いて、基材は脱離検出器中に取り外し可能に挿入され得、脱離検出器中でエネル ギー源がスポットに当たり、そして被分析物を脱離させ得る。基材は水平および ／または垂直に移動できるキャリッジへの装着に適切であり得、このキャリッジ が水平および／または垂直に基材を動かし、エネルギー源の呼びかけおよびそこ に結合した被分析物の検出のためのパス中の吸着体の各所定のアドレス可能な位 置に連続的に配置する。基材は従来の質量スペクトロメトリプローブの形状であ り得る。 基材のストリップ、プレート、またはプローブは従来の技術を用いて作製され 得る。その後、被分析物を含む試料と接触させる前に、吸着体を基材上に直接的 または間接的にカップリング、取り付け、または堆積し得る。吸着体を、付着ま たは固定化に適切な任意な手段により、基材上に直接的または間接的にカップリ ングし得る。例えば、吸着体は、基材を吸着体で誘導体化して、吸着体が共有結 合または非共有結合を通じて基材に直接結合するようにすることによって、基材 と直接カップリングし得る。 吸着体の基材への付着は、種々の機構を通じて達成され得る。基材は、予め調 製された吸着体分子を基材に付着することによって、完全に調製された吸着体分 子で誘導体化され得る。あるいは、吸着体は、前駆体分子を基材に付着させ、そ して次に第1の前駆体分子によって基材に結合した成長中の鎖にさらなる前駆体 分子を付加することによって、基材上に形成され得る。基材上に吸着体を構築す るこの機構は、吸着体がポリマー、特にDNAまたはRNA分子のようなバイオポリマ ーである場合、特に有用である。バイオポリマー吸着体は、オリゴヌクレオチド チップ技術の分野で公知の方法を用いて、基材に付着した最初の塩基に連続的に 塩基を付加することによって提供され得る。例えば、米国特許第5,445,934号(Fo dorら)を参照のこと。 図2に示され得るように、2個程度の少ない吸着体、および10、100、1000、10, 000個以上の程度の多くの吸着体が単一の基材にカップリングされ得る。吸着体 部位のサイズは、実験設計および目的に応じて変化し得る。しかし、衝突エネル ギー源の直径(例えば、レーザースポット直径)より大きい必要はない。スポット は同じまたは異なる吸着体に続き得る。いくつかの場合においては、同じ吸着体 を基材上の複数の位置に提供して、複数の異なる溶離物に対する評価を可能にす るか、あるいはその結果、結合した被分析物を将来の使用、またはおそらく二次 処理における参照のために保存し得ることが有利である。複数の異なる吸着体を 有する基材を提供することによって、単一の試料に関して異なる吸着体の組み合 わせによって提供される複数の結台特性を利用し、そしてそれによって、より広 範囲の異なる被分析物を結合し、かつ検出することが可能である。単一の試料の 評価のために基材上の複数の異なる吸着体を使用することは、各々異なるクロマ トグラフィーカラムを用いる複数のクロマトグラフィー実験を同時に行うことと 本質的に等価であるが、本発明はただ一つの系のみが必要とされるという利点を 有する。 基材が複数の吸着体を含む場合、吸着体を所定のアドレス可能な位置に提供す ることが特に有用である。所定のアドレス可能な位置に吸着体を提供することに よって、第1の所定のアドレス可能な位置の吸着体を第1の溶離物で洗浄し、そし て第2の所定のアドレス可能な位置の吸着体を第2の溶離物で洗浄することが可能 となる。この様式において、被分析物に対する単一の吸着体の結合特性を複数の 溶離物の存在下で評価することができる。複数の溶離物の各々は吸着体の結合特 性を異なる仕方で選択的に改変する。アドレス可能な位置は任意のパターンに配 列され得るが、好ましくは、規則的なパターン、例えば、線、直交アレイ、また は円のような規則的な曲線で配置される。同様に、基材が複数の異なる吸着体を 含む場合、溶離物の存在下で所定の吸着体の結台特性を評価するために、異なる 各吸着体に関して単一の溶離物を評価することが可能である。異なる溶離物の存 在下で異なる吸着体の結合特性を評価することもまた可能である。 (1)増分または勾配の吸着体表面 異なる結合特性を有する一連の吸着体は、基材上に複数の異なるポリマー吸着 体を合成することによって提供され得る。異なるポリマー吸着体は、前駆体分子 を基材に付着し、重合反応を開始し、そして各吸着体について異なる完了程度で 重合反応を停止することによって提供され得る。また、ポリマーの末端官能基は 、 異なる親和性試薬(例えば、-NH3、またはCOO-)で異なる程度までこれらを化学的 に誘導体化するように反応され得る。重合または誘導体化反応を停止することに よって、異なる重合度または誘導体化度の吸着体が生成される。異なる重合度ま たは誘導体化度は異なる各ポリマー吸着体について異なる結合特性を提供する。 この実施態様は、複数の異なるバイオポリマー吸着体を基材上に提供するために 特に有用である。 所望であれば、重合反応は基材自体の上ではなく反応容器中で行われ得る。例 えば、異なる結合特性のポリマー吸着体が、重合／誘導体化反応が進行するにつ れ反応容器から生成物のアリコートを抽出することによって提供され得る。重合 ／誘導体化反応の間の種々の時点で抽出されたアリコートは、種々の重合／誘導 体化の程度を示し、複数の異なる吸着体を生じる。次に、生成物の異なるアリコ ートを、異なる結合特性を有する吸着体として利用し得る。あるいは、反応の停 止工程、生成物のアリコートを抜き取る工程、および重合／誘導体化反応を再度 開始する工程を連続的に繰り返すことによって、複数の異なる吸着体を提供し得 る。各停止時点で抽出された生成物は異なる程度の重合／誘導体化を示し、そし てその結果、異なる結合特性を有する複数の吸着体が提供される。 1つの実施態様において、基材はストリップまたはプレートの形状で提供され 、基材は1つ以上の結合特性が一次元または二次元の勾配で変化した吸着体でコ ートされる。例えば、一端では疎水性が弱い、他の一端では疎水性が強い吸着体 を有するストリップが提供される。あるいは、1つの角では疎水性およびアニオ ン性が弱く、そして対角線上に対向する角では疎水性およびアニオン性が強いプ レートが提供される。このような吸着勾配は、被分析物の定量分析に有用である 。吸着勾配は、制御された吹き付け塗布によって、あるいは材料を、時間の経過 につれて勾配の次元に対する反応の完了の漸増を可能にするような様式で表面に 流すことによって作製され得る。このプロセスを正しい角度で繰り返して、異な る結合特性を有する同じまたは異なる吸着体の直交勾配を提供し得る。 被分析物を含む試料を、吸着体を基材上に配置する前または後のどちらかに、 被分析物と吸着体との間の結合を可能とする任意の適切な方法を用いて吸着体と 接触させ得る。吸着体は試料と単に混台または台わされ得る。試料は、基材を試 料中に浸漬もしくはソーキングすることにより、または基材を試料中にディッピ ングすることにより、または試料を基材上に吹き付けることにより、試料を基材 上で洗浄することにより、または試料もしくは被分析物を吸着体と接触させるこ とによって、吸着体と接触し得る。さらに、試料は、試料を溶離物中に溶解する か、あるいは試料を溶離物と混合し、そしてこの溶離物および試料の溶液を任意 の上記の技術(すなわち、浸漬、ソーキング、ディッピング、吹き付け、または 洗浄)を用いて吸着体と接触させることによって、吸着体と接触し得る。 b．被分析物と吸着体との接触 被分析物を吸着体と結合させる前に試料を溶離物に曝露することは、吸着体の 選択性を改変し、同時に試料を吸着体に接触させる効果を有する。吸着体に結合 し、それにより保持される試料の成分は、吸着体の選択性を改変する溶離特性の 非存在下で吸着体に結台する全ての成分ではなく、むしろ試料と合わされた特定 の溶離物の存在下で吸着体に結合する成分のみを含む。 試料は、被分析物を吸着体に結合させるに十分な時間、吸着体に接触させるべ きである。代表的には、試料を、約30秒から約12時間の間、吸着体に接触させる 。好ましくは、試料を、約30秒から約15分間の間、吸着体に接触させる。 試料を吸着体に接触させる温度は、特定の試料および選択される吸着体の関数 である。代表的には、試料を周囲の温度および圧カ条件下で吸着体と接触させる が、いくつかの試料については、改変された温度(代表的には4℃から37℃)およ び圧カ条件が所望され得、そしてこれは当業者によって容易に決定され得る。 従来の検出技術に対する本発明の別の利点は、本発明が数多くの異なる実験を 非常に少量の試料で行うことを可能とすることである。一般に、吸着体の結合の ためには、１μｌから500μｌ中に数原子モルから100ピコモルの被分析物を含む 容量の試料で十分である。被分析物は、吸着体に結台させた後、将来の実験のた めに保存され得る。なぜなら保持された被分析物の全ての脱離工程および検出工 程に供されなかった任意の吸着体位置は、その上に被分析物を保持するからであ る。従って、試料の非常に少量しか分析のために利用できない場合、本発明は、 試料を無駄にすることなく、異なる回数で行われる異なる吸着体および／または 溶離物を用いる多数の実験を可能とするという利点を提供する。 c.溶離物による吸着体の洗浄 試料を被分析物と接触させて、その結果、被分析物が吸着体に結合した後、吸 着体を溶離物で洗浄する。代表的には、多次元分析を提供するために、各吸着体 位置を少なくとも第１および第２の異なる溶離物で洗浄する。溶離物による洗浄 は、特定された吸着体上に保持された被分析物の集団を改変する。吸着体の結合 特性と溶離物の溶離特性との組み合わせが、洗浄後に吸着体によって保持される 被分析物を制御する選択条件を提供する。したがって、洗浄工程は吸着体から試 料成分を選択的に除去する。 洗浄工程は種々の技術を用いて行われ得る。例えば、上述のように、試料を吸 着体に接触させる前に、試料を第1の溶離物中に溶解するか、あるいは試料を第1 の溶離物と混合し得る。試料を吸着体に接触させる前またはそれと同時に、試料 を第1の溶離物に曝露することは、被分析物を吸着体と結合させ、そして次に吸 着体を第1の溶離物で洗浄することと同じ正味の効果を一次近似の程度まで有す る。合わせた溶液を吸着体に接触させた後、吸着体を第2のまたは次の溶離物で 洗浄し得る。 結合した被分析物を有する吸着体の洗浄は、吸着体およびその上に結合した被 分析物を有する基材を溶離物中に浸漬、ソーキング、またはディッピングする事 によって達成され得る。または基材を溶離物でリンスし、基材に溶離物を吹き付 け、もしくは溶離物で洗浄することによって達成され得る。親和性試薬の直径の 小さなスポットに溶離物を導入することは、ミクロ流体工学(microfluidics)プ ロセスによって最もよく達成される。 被分析物が吸着体にただ1つの位置で結合し、そして複数の異なる溶離物が洗 浄工程で用いられる場合、各溶離物の存在下での吸着体の選択性に関する情報が 独立して得られ得る。1つの位置で吸着体に結合した被分析物は、溶離物による 各洗浄の後、第1の溶離物による洗浄、保持された被分析物の脱離および検出、 次いで第2の溶離物による洗浄、および保持された被分析物の脱離および検出の 繰り返しパターンに従って決定され得る。洗浄とその後の脱離および検出の工程 は、同じ吸着体を用いて複数の異なる溶離物について連続的に繰り返され得る。 この様式において、単一の位置に保持された被分析物を有する吸着体は、複数の 異なる溶離物で再試験されて、個々の各洗浄の後に保持された被分析物に関する 一群の情報が提供され得る。 上記の方法はまた、吸着体が複数の所定のアドレス可能な位置に提供される場 合(吸着体が全て同一の場合、または異なる場合のいずれでも)にも有用である。 しかし、被分析物が複数の位置の同じまたは異なる吸着体のいずれかに結合する 場合、洗浄工程は、代わりに、より平行処理を伴う系統的かつ効率的なアプロー チを用いて行われ得る。すなわち、洗浄工程は、第1の位置で溶離物で吸着体を 洗浄し、次に第2の吸着体を溶離物で洗浄し、次に第1の吸着体に保持された被分 析物を脱離および検出し、そしてその後第2の吸着体で保持された被分析物を脱 離および検出することによって行われ得る。換言すれば、全ての吸着体を溶離物 で洗浄し、そしてその後、各々によって保持された被分析物を吸着体の各々の位 置について脱離および検出する。所望であれば、各吸着体位置での検出の後、各 吸着体位置について第2の洗浄段階を実行し得、次いで第2の脱離および検出段階 を実行し得る。全ての吸着体位置の洗浄、次いで各吸着体位置での脱離および検 出の工程が、複数の異なる溶離物について繰り返され得る。この様式で、アレイ 全体が試料中の被分析物の性質の効率的な決定のために利用され得る。この方法 は、全ての吸着体位置を第1の洗浄段階で同じ溶離物で洗浄する場合でも、ある いは複数の吸着体を第1の洗浄段階で複数の異なる溶離物で洗浄する場合でも、 有用である。 2．検出 洗浄後吸着体により保持される被分析物は、基材に吸着される。基材上に保持 される被分析物は、以下の脱離スペクトロメトリにより検出される：吸着体から 被分析物を脱離する工程および脱離した被分析物を直接検出する工程。 a．脱離のための方法 吸着体からの被分析物の脱離は、被分析物を適切なエネルギー源に曝露するこ とを伴う。通常、このことは、被分析物に放射エネルギーまたはエネルギー粒子 を衝突させることを意味する。例えば、エネルギーはレーザーエネルギー(例え ばUVレーザー)またはフラッシュランプからのエネルギーの形態の光エネルギー であり得る。あるいは、エネルギーは高速原子の流れであり得る。熱もまた、脱 離の誘導／補助のために使用され得る。 直接分析のために被分析物を脱離および／または電離する方法が当該分野で周 知である。このような方法の1つはマトリクス補助(matrix-assisted)レーザー脱 離／電離、すなわちMALDIと呼ばれる。MALDIでは、被分析物溶液をマトリクス溶 液と混合し、そして混合物を不活性プローブ表面上に堆積させた後に結晶化させ 、被分析物を結晶中にトラップすることで脱離が可能となり得る。マトリクスは 、レーザーエネルギーを吸収し、そしてそのエネルギーを被分析物に明らかに与 え、その結果脱離および電離が生じるように選択される。一般に、マトリクスは UV範囲で吸収する。大きいタンパク質のためのMALDIは、例えば、米国特許第5,1 18,937号(Hillenkampら)および米国特許第5,045,694号(BeavisおよびChait)に記 載される。 表面増強(surface-enhanced)レーザー脱離／電離(すなわちSELDI)は、特異性 、選択性および感度の点で、MALDIに対して顕著な進歩を示す。SELDIは米国特許 第5,719,060号(HutchensおよびYip)に記載される。SELDIは脱離のための固相法 であり、ここで被分析物は表面上でエネルギー流に対して提示され、これが被分 析物の捕捉および／または脱離を増強する。対照的に、MALDIは液相法であり、 ここで被分析物は液体材料と混合され、この液体材料が被分析物の周囲に結晶化 する。 SEAC(表面増強親和性捕捉)と呼ばれるSELDIの1つのバーションは、被分析物を 親和性捕捉装置(すなわち吸着体)とともに脱離エネルギーに対して提示すること を伴う。被分析物がそのように吸着される場合、被分析物は、脱離エネルギー源 に対して、標的被分析物の脱離を達成する機会がより増すように提示され得るこ とが見いだされた。エネルギーを吸収する材料が、プローブに付加されて脱離を 補助し得る。次にプローブを、被分析物を脱離するためのエネルギー源に対して 提示する。 SEND(表面増強ニート脱離)と呼ばれるSELDIの別のバージョンは、被分析物が その上に配置されるエネルギー吸収材料の層の使用を伴う。基材表面は、その表 面に化学的に結合し、そして／あるいは本質的に結晶を含まないエネルギー吸収 分子の層を含む。次に被分析物を単独(すなわちニート)で層の表面に付与し、実 質的にこれと混合しない。エネルギー吸収分子は、マトリクスのように脱離エネ ルギーを吸収し、そして被分析物の脱離が引き起こされる。この改良は、実質的 なものである。なぜなら、被分析物がここでエネルギー源に対してより単純かつ より均一な様式で提示され得るからである。なぜなら、溶液混合物の性能および ランダムな結晶化が除外されるからである。これにより、より均一かつ予想可能 な結果が提供され、これによりプロセスの自動化が可能となる。エネルギー吸収 材料は古典的なマトリクス材料であり得るか、またはそのpHが中和されたかもし くは塩基性範囲にされたマトリクス材料であり得る。エネルギー吸収分子は、共 有結合的または非共有結合的手段を通じてプローブに結合し得る。 SEPAR(表面増強感光性結合および放出)と呼ばれるSELDIの別のバージョンは感 光性結合分子の使用を伴う。感光性結合分子は、固相(例えば、平板なプローブ 表面またはプローブの一部を構成し得る別の固相(例えばビーズ))に共有結合す る1つの部位、および親和性試薬または被分析物に共有結合し得る第2の部位を有 する二価分子である。感光性結合分子は、表面および被分析物の両方に結合する 場合、光に曝露したときに親和性試薬または被分析物を放出し得る感光性結合も 含む。感光性結台は、結合分子内にあり得るか、または被分析物(または親和性 試薬)もしくはプローブ表面のいずれかに対する結合部位にあり得る。 b.被分析物の直接検出のための方法 脱離した被分析物は、任意のいくつかの手段で検出され得る。被分析物が脱離 プロセス(例えばレーザー脱離／電離質量スペクトロメトリ)で電離される場合、 検出器はイオン検出器であり得る。質量スペクトロメトリは、一般に、脱離イオ ンの飛行時間を決定する手段を含む。この情報は質量に変換される。しかし、脱 離イオンを分離および検出するために脱離イオンの質量を決定する必要はない。 電離した被分析物が検出器に異なる時間で衝突する事実により、それらの検出お よび分離が提供される。 あるいは、被分析物は、例えば、蛍光部分または放射性部分で検出可能に標識 され得る。これらの場合、検出器は蛍光検出器または放射能検出器であり得る。 複数の検出手段を連続して実行して、被分析物成分および被保持物に関連する 機能をアレイの各位置で十分に呼びかけし得る。 c．脱離検出器 脱離検出器は、被分析物を吸着体から脱離するための手段、および脱離した被 分析物を直接検出する手段を含む。すなわち、脱離検出器は、別の固相中に被分 析物を捕捉する中間工程およびそれを次の分析に供する工程を伴わずに、脱離し た被分析物を検出する。被分析物の検出は通常、シグナル強度の検出を伴う。こ れは、次には、吸着体に吸着した被分析物の量を反映する。 これらの2つの要素の他に、脱離検出器は他の要素もまた有し得る。このよう な要素の1つは、脱離した被分析物を検出器に向かって加速する手段である。別 の要素は、脱離から検出器による検出までの被分析物の飛行時間を決定するため の手段である。 好ましい脱離検出器はレーザー脱離／電離質量スペクトロメーターであり、こ れは当該分野で周知である。質量スペクトロメーターは、吸着した被分析物を運 ぶ基材（例えば、プローブ）を挿入するポートを含む。脱離は、被分析物にレー ザーエネルギーのようなエネルギーを衝突させることによって達成される。装置 は、アレイ上の任意のスポットがレーザービームのライン中に運ばれるように、 表面を移動する手段を含み得る。被分析物にレーザーを当てると、その結果、無 傷の被分析物が飛行管中に脱離し、そして電離する。飛行管は一般に真空スペー スを規定する。真空管中の一部にある帯電したプレートが電位を形成し、これが 電離した被分析物を検出器に向けて加速する。時計により飛行時間を測定し、そ して系のエレクトロニクスにより被分析物の速度を決定し、そしてこれを質量に 変換する。当業者が理解するように、任意のこれらの要素が、脱離、加速、検出 、時間測定などの種々の手段を使用する脱離検出器のアセンブリ中で、本明細書 に記載される他の要素と組み合わされ得る。 Ｂ．選択条件 本発明の１つの利点は、被分析物の上昇した分離および認識プロファイルの形 態での被分析物についての情報の両方を提供する、種々の異なる結合および溶離 条件に被分析物を曝露する能力である。従来のクロマトグラフ方法におけるよう に、吸着体が被分析物を保持する能力は、溶離物に対する被分析物のまたは吸着 体に対する溶離物の引力または親和性と比較した、吸着体に対する被分析物の引 力または親和性に直接関連する。試料のいくつかの成分は吸着体への親和性を有 し得ず、したがって試料が吸着体に接触する場合に吸着体に結合しない。吸着体 に結合することが不可能であるため、これらの成分は、分離されるべき被分析物 からすぐに分別される。しかし、試料および利用される特定の吸着体の性質に依 存して、多くの異なる成分は、最初に吸着体に結合し得る。 １．吸着体 吸着体は、被分析物を結合する物質である。多数の吸着体は、被保持物クロマ トグラフィーに用いられ得る。異なる吸着体は、大きく異なる結合特性、幾分異 なる結合特性、または微妙に異なる結合特性を示し得る。大きく異なる結合特性 を示す吸着体は、代表的には、引力の基礎または相互作用の態様が異なる。引力 の基礎は、一般的に、化学的または生物学的分子認識の機能である。吸着体と被 分析物との間の引力についての基礎は、例えば、(1)塩促進された相互作用、例 えば、疎水性相互作用、親硫黄性相互作用、および固定された染料相互作用；(2 )水素結合および／またはファンデルワールス力相互作用、および電荷移動相互 作用、例えば、親水性相互作用の場合；(3)静電相互作用、例えば、イオン電荷 相互作用、特に陽または陰イオン電荷相互作用；(4)被分析物が吸着体の金属イ オンと配位共有結合（すなわち、配位複合体形成）を形成する能力；(5)酵素活 性部位結合；(6)可逆的共有相互作用、例えば、ジスルフィド交換相互作用；(7) 糖タンパク質相互作用；(8)生物特異的相互作用；または(9)相互作用の上記の態 様の２つ以上の組み合わせ、を含む。すなわち、吸着体は、吸着力の２つ以上の 基礎を示し得、したがって「混合機能性」吸着体として公知である。 ａ．塩促進された相互作用吸着体 塩促進された相互作用を観察するために有用である吸着体には、疎水性相互作 用吸着体を含む。疎水性相互作用吸着体の例には、脂肪族炭化水素、特にC1-C18 脂肪族炭化水素を有するマトリクス；およびフェニル基のような芳香族炭化水素 官能基を有するマトリクスが含まれる。疎水性相互作用吸着体は、非荷電溶媒 に曝露されたアミノ酸残基、そして詳細には、フェニルアラニンおよびトリプト ファンのような非極性、芳香族、および疎水性アミノ酸残基と普通呼ばれるアミ ノ酸残基を含む、被分析物を結合する。疎水性相互作用吸着体に結合する被分析 物の特定の例には、リゾチームおよびDNAが挙げられる。特定の理論により拘束 されることは望まないが、DNAが、DNA中の芳香族ヌクレオチド、詳細にはプリン およびピリミジン基によって、疎水性相互作用吸着体に結合すると考えられる。 塩促進された相互作用を観察するために有用な他の吸着体には、例えば、Pier のような、親硫黄相互作用吸着体が挙げられる。親硫黄相互作用吸着体は、例え カニズムは、完全には知られていないが、溶媒に曝露されたtrp残基は、役割を 果たすと思われる。 塩促進されたイオン相互作用および疎水性相互作用にも関連する第３の吸着体 は、固定された染料相互作用吸着体を含む。固定された染料相互作用吸着体には 、例えば、Pharmacia Biotech，Piscataway，New Jerseyから入手可能な、例え ば、CIBACHRONTMブルーのような固定された染料のマトリクスが挙げられる。固 定された染料相互作用吸着体は、一般的に、タンパク質およびDNAを結合する。 固定された染料相互作用吸着体に結合するタンパク質の１つの特定の例は、ウシ 血清アルブミン（BSA）である。 ｂ．親水性相互作用吸着体 親水性相互作用に基づく水素結合および／またはファンデルワールス力を観察 するために有用である吸着体は、ケイ素酸化物（すなわち、ガラス）のような順 相吸着体を含む表面を含む。順相またはケイ素酸化物表面は、官能基として作用 する。さらに、ポリエチレングリコール、デキストラン、アガロース、またはセ ルロースのような親水性ポリマーで改変された表面を含む吸着体はまた、親水性 相互作用吸着体として機能し得る。ほとんどのタンパク質は、水素結合またはフ ァンデルワールス力を含む親水性相互作用によって結合するアミノ酸残基（すな わち、親水性アミノ酸残基）の基または組み合わせのため、親水性相互作用吸着 体を結合する。親水性相互作用吸着体を結合するタンパク質の例には、ミオグロ ビン、インスリン、およびシトクロムＣが挙げられる。 一般的に、高い比率の極性または荷電アミノ酸を有するタンパク質は、親水性 表面に保持される。あるいは、表面に曝露された親水性糖部分を有する糖タンパ ク質はまた、親水性吸着体に高い親和性を有する。 ｃ．静電相互作用吸着体 静電またはイオン電荷相互作用を観察するために有用である吸着体には、例え ば、硫酸アニオン（すなわち、SO3 -）のマトリクス、およびカルボン酸アニオン （すなわち、COO-）またはリン酸アニオン（OPO3 -）のマトリクスのようなアニ オン性吸着体が挙げられる。硫酸アニオンを有するマトリクスは、永続して負に 荷電する。しかし、カルボン酸アニオンを有するマトリクスは、そのpKaより高 いpHでのみ負電荷を有する。pKa以下のpHでは、マトリクスは、実質的に中性の 電荷を示す。適切なアニオン性吸着体はまた、硫酸およびカルボン酸アニオンな らびにリン酸アニオンの組み合わせを有するマトリクスであるアニオン性吸着体 を含む。組み合わせは、pHの機能として連続して変化し得る負電荷の強度を提供 する。これらの吸着体は、例えば、リボヌクレアーゼおよびラクトフェリンのよ うな正電荷を有するタンパク質および巨大分子を誘引および結合する。特定の理 論に拘束されることは望まないが、吸着体と正荷電アミノ酸残基（リジン残基、 アルギニン残基、およびヒスチジル残基を含む）との間の静電相互作用は、結合 相互作用を担うと考えられる。 静電またはイオン電荷相互作用を観察するために有用である他の吸着体には、 カチオン性吸着体が含まれる。カチオン性吸着体の特定の例には、二級、三級、 または四級アミンのマトリクスが含まれる。四級アミンは、永続して正に荷電す る。しかし、二級および三級アミンは、pH依存的である電荷を有する。pKa以下 のpHでは、二級および三級アミンは、正に荷電し、そしてそのpKa以上のpHでは 、負に荷電する。適切なカチオン性吸着体はまた、異なる二級、三級、および四 級アミンの組み合わせを有するマトリクスであるカチオン性吸着体を含む。組み 合わせは、pHの機能として連続して変化し得る正電荷の強度を提供する。カチオ ン 性相互作用吸着体は、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基のような、溶媒に 曝露されたアミノ酸残基を有するタンパク質を含む分子上の、アニオン性部位を 結合する。 イオン相互作用吸着体（アニオン性およびカチオン性の両方）の場合、アニオ ンおよびカチオンの両方を含む混合態様イオン性吸着体を使用することが、しば しば所望される。このような吸着体は、pHの機能として連続緩衝化能力を提供す る。連続緩衝化能力は、特に２〜11のpH範囲で異なる緩衝化成分を有する溶離物 への、被分析物の組み合わせの曝露を可能にする。これによって、固定された滴 定可能なプロトン交換基によって定義される吸着体の局所的pH環境を生成する。 このようなシステムは、クロマトフォーカシングとして公知の固相分別技術と等 価である。濾胞刺激ホルモンイソ形態は、主に荷電した炭水化物成分で異なり、 これは、クロマトフォーカシング吸着体で分別される。 静電相互作用を観察するために有用であるさらに他の吸着体には、相互作用が 静電的であるが、形式電荷または滴定可能タンパク質ドナーまたはアクセプター が関与しない、双極子-双極子相互作用吸着体が挙げられる。 ｄ．配位共有相互作用吸着体 金属イオンと配位共有結合を形成する能力を観察するために有用である吸着体 には、例えば、二価および三価金属イオンを有するマトリクスが挙げられる。固 定された金属イオンキレーターのマトリクスは、遷移金属イオンとの配位共有結 合相互作用の基礎を形成する１つ以上の電子ドナー基を有する固定された合成有 機分子を提供する。固定された金属イオンキレーターとして機能する一次電子ド ナー基には、酸素、窒素、および硫黄が挙げられる。金属イオンは、被分析物の 電子ドナー基との相互作用のためのいくつかの数の残存する部位を有する金属イ オン複合体を生じる固定された金属イオンキレーターに結合される。適切な金属 イオンには、一般的に、銅、ニッケル、コバルト、亜鉛、鉄のような遷移金属イ オン、ならびにアルミニウムおよびカルシウムのような他の金属イオンが挙げら れる。何らかの特定の理論に拘束されることは望まないが、金属イオンは、ペプ チド、タンパク質、または核酸において特定のアミノ酸残基と選択的に相互作用 すると考えられる。代表的には、このような相互作用に関与するアミノ酸残基に は、ヒスチジン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、システイン残基、な らびにアスパラギン酸およびグルタミン酸のような酸素基を有するアミノ酸残基 が挙げられる。例えば、固定された三価鉄イオンは、タンパク質上のホスホセリ ン、ホスホチロシン、およびホスホトレオニン残基と相互作用する。固定された 金属イオンに依存して、上記のアミノ酸残基の十分な局所密度を有するそれらの タンパク質のみが、吸着体によって保持される。金属イオンとタンパク質との間 のいくつかの相互作用は、非常に強いので、タンパク質は従来の手段によって複 合体から切断され得ない。高度にリン酸化されるヒトβカゼインは、固定された Fe(III)に非常に強く結合する。6-ヒスチジンタグと発現される組換えタンパク 質は、固定されたCu(II)およびNi(II)に非常に強く結合する。 ｅ．酵素活性部位相互作用吸着体 酵素活性部位結合相互作用を観察するために有用である吸着体には、プロテア ーゼ（例えば、トリプシン）、ホスファターゼ、キナーゼ、およびヌクレアーゼ が挙げられる。相互作用は、被分析物（代表的には、バイオポリマー）の酵素結 合部位と酵素の触媒結合部位との配列特異的相互作用である。この型の酵素結合 部位には、例えば、配列にリジン-リジンまたはリジン-アルギニン対を有するタ ンパク質およびペプチドと相互作用するトリプシンの活性部位が含まれる。より 詳細には、大豆トリプシンインヒビターは、固定されたトリプシンの吸着体と相 互作用しそして結合する。あるいは、セリンプロテアーゼは、固定されたL-アル ギニン吸着体に選択的に保持される。 ｆ．可逆的共有相互作用吸着体 可逆的共有相互作用を観察するために有用である吸着体には、ジスルフィド交 換相互作用吸着体が含まれる。ジスルフィド交換相互作用吸着体には、固定され たスルフィドリル基、例えば、メルカプトエタノールまたは固定されたジチオト レイトールを含む吸着体が含まれる。相互作用は、吸着体と被分析物上の溶媒に 曝露されたシステイン残基との間の共有ジスルフィド結合の形成に基づく。この ような吸着体は、システイン残基、および還元された硫黄化合物を含むように改 変された塩基を含む核酸を有するタンパク質またはペプチドを結合する。 ｇ．糖タンパク質相互作用吸着体 糖タンパク質相互作用を観察するために有用である吸着体には、そこに固定し たレクチン（すなわち、オリゴ糖を有するタンパク質）を有する吸着体のような 糖タンパク質相互作用吸着体が含まれ、その例は、Pharmacia Biotech of Pisca taway，New Jerseyから市販されるCONCONAVALINTMである。このような吸着体は 、巨大分子の炭水化物部分の分子認識に関連する相互作用に基づいて機能する。 糖タンパク質相互作用吸着体と相互作用しそして結合する被分析物の例には、糖 タンパク質、特にヒスチジンリッチ糖タンパク質、全細胞および単離された細胞 下画分が挙げられる。 ｈ．生物特異的相互作用吸着体 生物特異的相互作用を観察するために有用である吸着体は、一般的に「生物特 異的親和性吸着体」と呼ばれる。吸着は、選択的でありそして親和性（平衡解離 定数、Kd）が少なくとも10-3M（例えば、10-5M、10-7M、10-9M）であるならば、 生物特異的と考えられる。生物特異的親和性吸着体の例には、特定の生体分子と 特異的に相互作用しそして結合する任意の吸着体が挙げられる。生物特異的親和 性吸着体には、例えば、抗原に結合する固定された抗体；DNA結合タンパク質、D NA、およびRNAに結合する固定されたDNA；タンパク質および酵素に結合する固定 された基質またはインヒビター；薬物結合タンパク質に結合する固定された薬物 ；レセプターに結合する固定されたリガンド；リガンドに結合する固定されたレ セプター；DNAおよびRNA結合タンパク質に結合する固定されたRNA；ビオチンお よびビオチン化分子を結合する固定されたアビジンまたはストレプトアビジン； 脂質結合タンパク質を結合する固定されたリン脂質メンブランおよびベシクルが 挙げられる。酵素は、そこへの被分析物吸着体を改変し得る有用な吸着体である 。細胞は、吸着体として有用である。その表面は、複合結合特性を提示する。細 胞への吸着は、例えば、表面レセプターに結合するリガンドまたはシグナル分 子を同定するために有用である。ウイルスまたはファージも、吸着体として有用 である。ウイルスは、しばしば、細胞表面レセプターへのリガンド（例えば、CD 4に対するgp120）を有する。また、ファージ提示ライブラリーの形態では、ファ ージコートタンパク質は、標的への結合を試験するための因子として作用する。 生物特異的相互作用吸着体は、上記のような公知の特異的相互作用に頼る。吸着 体が利用され得る生物特異的相互作用の他の例は、当業者に容易に理解され、そ して本発明によって意図される。 １つの実施熊様では、生物特異的吸着体は、標的被分析物を結合することに直 接関与しない補助または「ヘルパー」分子をさらに含み得る。 ｉ．結合特異性の程度 相互作用の種々の態様を有する吸着体への曝露によって、試料の成分は、種々 の吸着体との相互作用に基づいて大きく分離され得る。したがって、種々の態様 の相互作用を有する吸着体に対する被分析物の引力は、第１の分別パラメータを 提供する。例えば、疎水性に関する引力に基づく第１の吸着体およびイオン電荷 に関する引力に基づく第２の吸着体に、被分析物を含む試料を曝露することによ って、疎水性吸着体に結合する被分析物を試料から分別すること、および特定の イオン電荷を有する吸着体に結合する被分析物を分別することが可能である。 引力の異なる基礎を有する吸着体は、吸着体が、被分析物だけでなく、引力の 同じ基礎によって吸着体に対する引力を示す試料中の何らかの他の成分も結合す るので、低い程度の特異性で被分析物の分離を提供する。例えば、疎水性吸着体 は、疎水性被分析物だけでなく、試料中の任意の他の疎水性成分も結台し；負に 荷電した吸着体は、正に荷電した被分析物だけでなく、試料中の任意の他の正に 荷電した成分も結合するなどである。 吸着体に対する被分析物の引力の基礎に基づく被分析物の分離は、比較的中間 の特異性または変化した引力の強度の結合特性を利用することによって、さらに 洗練され得る。中間の特異性の結合特性を基礎とする被分析物の分離は、例えば 、混合した機能性吸着体を利用することによって、達成され得る。被分析物の分 離が比較的低い特異性で達成されると、目的の被分析物を誘引することが見いだ さ れる結合特性は、さらに多くの望ましくない成分を除去し、それによって被分析 物を分離するために、種々の他の結合および溶離特性と組み合わせて利用され得 る。 例えば、被分析物が疎水性吸着体に結合するならば、被分析物は、引力の１つ の基礎として疎水性相互作用を示し、そしてまた引力の第２の異なる基礎を示す 、混合された機能性吸着体を提供することによって、他の疎水性試料成分からさ らに分離され得る。混合された機能性吸着体は、正に荷電した疎水性被分析物を 結合するように、疎水性相互作用および負に荷電したイオン相互作用を示し得る 。あるいは、混合された機能性吸着体は、吸着体において金属イオンとの配位複 合体を形成する能力を有する疎水性被分析物を結合するように、疎水性相互作用 および金属イオンとの配位共有結合を形成する能力を示し得る。中間の特異性の 結合特性を示す吸着体のなおさらなる例は、上記の開示および例に基づいて当業 者に容易に理解される。 中間の特異性の結合特性を基礎とする被分析物の分離は、比較的高い特異性の 結合特性を利用することによって、さらに洗練され得る。比較的高い特異性の結 合特性は、引力の同じ基礎であるが引力の異なる強度を示す種々の吸着体を利用 することによって利用され得る。言い換えれば、引力の基礎は同じであるが、他 の試料成分からの被分析物のさらなる分離は、被分析物についての親和性の異な る程度を有する吸着体を利用することによって達成され得る。 例えば、被分析物の酸性性質に基づく吸着体を結合する被分析物は、特定の酸 性pH範囲における被分析物への親和性を有する吸着体を利用することによって、 他の酸性試料成分からさらに分離され得る。したがって、被分析物は、pH１〜２ の試料成分に誘引される１つの吸着体、pH３〜４の試料成分に誘引される別の吸 着体、およびpH５〜６の試料成分に誘引される第３の吸着体を使用して分離され 得る。このように、５〜６のpHの被分析物を結合する吸着体への特異的親和性を 有する被分析物は、１〜４のpHの試料成分から分離される。特異性が増加した吸 着体は、引力の間隔、すなわち、引力の同じ基礎を示す吸着体の結合特性間の差 を減少させることによって利用され得る。 一次吸着体に吸着した一次被分析物は、それ自体、吸着体特性を有し得る。こ の場合、基材に吸着した一次被分析物は、二次被分析物を単離するための二次吸 着体になり得る。次に、保持された二次被分析物は、試料から三次被分析物を単 離するために三次吸着体として機能し得る。このプロセスは、数回の反復によっ て持続し得る。 ２．溶離物 溶離物、または洗浄溶液は、被分析物と吸着体との間の吸収の閾値を選択的に 改変する。溶離物が結合した被分析物を脱離および溶離する能力は、溶離特性の 機能である。異なる溶離物は、大きく異なる溶離特性、幾分異なる溶離特性、ま たは微妙に異なる溶離特性を示し得る。 溶離物が吸着体に接触する温度は、選択される特定の試料および吸着体の機能 である。代表的には、溶離物は、０℃と100℃との間、好ましくは４℃と37℃と の間の温度で、吸着体に接触する。しかし、いくつかの溶離物については、改変 された温度は、所望の温度であり得、そして当業者によって容易に決定される。 吸着体の場合のように、大きく異なる溶離特性を示す溶離物は、一般的に、引 力の基礎で異なる。例えば、溶離物と被分析物との間の引力の種々の基礎には、 電荷またはpH、イオン強度、水構造、特異的競合結合試薬の濃度、表面張力、誘 電率、および上記の２つ以上の組み合わせが挙げられる。 ａ．pHに基づく溶離物 pH（すなわち、電荷）に基づく吸着体の選択性を改変する溶離物には、公知の pH緩衝液、酸性溶液、および塩基性溶液が挙げられる。特定のpH緩衝液で所定の 吸着体に結合した被分析物を洗浄することによって、電荷は改変され得、したが って特定のpH緩衝液の存在における吸着体と被分析物との間の結合の強度がチャ レンジされ得る。溶離物のpHで吸着体について他のものよりも低い競合であるこ の被分析物は、吸着体から脱離されそして溶離し、溶離物のpHで吸着体により強 く結合する被分析物のみを結合させておく。 ｂ．イオン強度に基づく溶離物 イオン強度に関して吸着体の選択性を改変する溶離物には、種々の型および濃 度の塩溶液が挙げられる。溶離溶液に溶解された塩の量は、溶離物のイオン強度 に影響を及ぼし、そして対応して吸着体結合能力を改変する。低濃度の塩を含む 溶離物は、イオン強度に関して吸着体結合能力のわずかな改変を提供する。高濃 度の塩を含む溶離物は、イオン強度に関して吸着体結合能力のより大きな改変を 提供する。 ｃ．水構造に基づく溶離物 水構造または濃度の変更によって吸着体の選択性を改変する溶離物には、尿素 およびカオトロピック塩溶液が挙げられる。代表的には、尿素溶液は、例えば、 0.1〜8Mの濃度の範囲の溶液を含む。溶離物を提供するために使用され得るカオ トロピック塩には、チオシアン酸ナトリウムが挙げられる。水構造に基づく溶離 物は、水和または結合水構造の変化に起因して被分析物を結合する吸着体の能力 を改変する。この型の溶離物には、例えば、グリセロール、エチレングリコール 、および有機溶媒が挙げられる。カオトロピックアニオンは、非極性部分の水溶 解度を増加させ、それによって被分析物と吸着体との間の疎水性相互作用を減少 させる。 ｄ．界面活性剤に基づく溶離物 表面張力および被分析物構造に関する吸着体の選択性を改変する溶離物には、 界面活性剤（detergent）および界面活性剤(surfactant)が挙げられる。溶離物 としての使用に適切な界面活性剤には、CHAPS、TWEEN、およびNP-40のようなイ オン性および非イオン性界面活性剤が挙げられる。界面活性剤の疎水性および親 水性基が導入される場合、疎水性相互作用が改変されるので、界面活性剤に基づ く溶離物は、吸着体が被分析物を結合する能力を改変する。被分析物と吸着体と の間、および被分析物内の疎水性相互作用は改変され、そして荷電基が導入され る（例えば、SDSのようなイオン性界面活性剤を用いるタンパク質変性）。 ｅ．疎水性に基づく溶離物 誘電率に関して吸着体の選択性を改変する溶離物は、疎水性相互作用に関して 吸着体の選択性を改変する溶離物である。この能力において機能する適切な溶離 物の例には、尿素(0.1〜8M)、プロパノール、アセトニトリル、エチレングリコ ールおよびグリセロールのような有機溶媒、ならびに上記のような界面活性剤が 挙げられる。溶離物としてのアセトニトリルの使用は、代表的には、逆相クロマ トグラフィーである。溶離物中のエチレングリコールの包含は、親硫黄吸着体と の塩促進された相互作用から免疫グロブリンを溶離することに効果的である。 ｆ．溶離物の組み合わせ 適切な溶離物は、上記のカテゴリーのいずれかから選択され得るか、または上 記の２つ以上の溶離物の組み合わせであり得る。上記の２つ以上の溶離物を含む 溶離物は、複数の溶離特性に基づいて被分析物についての吸着体の選択性を改変 し得る。 ３．２つのパラメータの変動性 異なる吸着体を選択することによって異なる結合特性を提供する能力、および 異なる溶離物で洗浄することによって異なる溶離特性を提供する能力は、２つの 異なるパラメータの変動を許容し、そのそれぞれは、被分析物が吸着体に結合さ れる選択性を個々にもたらし得る。これらの２つのパラメータが広く変化し得る という事実は、広い範囲の結合引力および溶離条件を確実にし、そのため本発明 の方法は、多くの異なる型の被分析物を結合しそれにより検出するために有用で あり得る。 特定の試料を分析することにおける使用についての吸着体および溶離物の選択 は、たとえ被分析物の性質が未知であっても、試料、および特徴づけられるべき 被分析物の特定の被分析物またはクラスの性質に依存する。代表的には、特に分 析されるべき試料の組成が未知である場合、多様な結合特性および多様な溶離特 性を示すシステムを提供することが有利である。広範な選択特性を示すシステム を提供することによって、目的の被分析物が１つ以上の吸着体によって保持され る可能性が顕著に増加する。 化学または生化学分析の当業者は、広範な結合および溶離特性を示し、そして 被分析物の最良の分離を提供する結合および溶離特性を観察するシステムを提供 することによって、特定の被分析物を保持するために有用な選択条件を決定し得 る。本発明は、広範な選択条件を含むシステムを提供するので、所定の被分析物 についての最適結合および溶離特性の当業者による決定は、過度の実験の必要な しに容易に行われ得る。 Ｃ．被分析物 本発明は、適切な選択条件の使用によって被分析物の特性を利用することによ って、被分析物の種々の生物学的、化学的、または物理化学的特性に基づく被分 析物の分離を可能にする。適切な選択条件の使用によって利用され得る被分析物 の多くの特性には、疎水性指標（すなわち、被分析物中の疎水性残基の尺度）、 等電点（すなわち、被分析物が電荷を有さないpH）、疎水性モーメント（すなわ ち、被分析物の両親媒性の尺度もしくは極性および非極性残基の分布の不斉の程 度）、側面双極子モーメント（すなわち、被分析物中の電荷の分布における不斉 の尺度）、分子構造因子（分子の骨格に沿った大きな側鎖の分布のような被分析 物分子の表面外形における変動の原因である）、二次構造成分（例えば、ヘリッ クス、平行および逆平行シート）、ジスルフィド結合、溶媒に曝露された電子ド ナー基（例えば、His）、芳香族性（すなわち被分析物中の芳香族残基のうちπ- π相互作用の尺度）、および荷電した原子間の直線距離がある。 これらは、本発明の方法において適切な選択特性の選択によって、試料からの 所定の被分析物の分離について利用され得る特性の型の代表的例である。試料か らの特定の被分析物の分離についての基礎を形成し得る被分析物の他の適切な特 性は、当業者に容易に公知および／または決定可能であり、そして本発明によっ て意図される。 本発明の方法は、分析され得る試料の型に関して限定されない。試料は、固体 、液体、または気体状態であり得るが、代表的には試料は液体状態である。固体 または気体試料は、好ましくは、当業者内に周知の技術に従って液体試料を提供 するように適切な溶媒に溶解される。試料は、生物学的組成物、非生物学的有機 組 成物、または無機組成物であり得る。本発明の技術は、生物学的試料、特に生物 学的液体および抽出物において被分析物を分離するために；ならびに、非生物学 的有機組成物、特に低有機分子および低無機分子の組成物において被分析物を分 離するために、特に有用である。 被分析物は、分子、多量体分子複合体、巨大分子凝集体、細胞、細胞オルガネ ラ、ウイルス、分子フラグメント、イオン、または原子であり得る。被分析物は 、試料の単一成分、あるいは、共通して１つ以上の特徴（例えば、分子量、等電 点、イオン電荷、疎水性／親水性相互作用など）を有する構造的、化学的、生物 学的、または機能的に関連する成分の１つのクラスであり得る。 本発明の被保持物クロマトグラフィー方法を使用して分離され得る被分析物の 特定の例には、生物学的巨大分子（例えば、ペプチド、タンパク質、酵素、ポリ ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、炭水化物、オリゴ糖、多糖）；上記 の生物学的巨大分子のフラグメント（例えば、核酸フラグメント、ペプチドフラ グメント、およびタンパク質フラグメント）；上記の生物学的巨大分子の複合体 （例えば、核酸複合体、タンパク質-DNA複合体、レセプター-リガンド複合体、 酵素-基質、酵素インヒビター、ペプチド複合体、タンパク質複合体、炭水化物 複合体、および多糖複合体）；小さな生物学的分子（例えば、アミノ酸、ヌクレ オチド、ヌクレオシド、糖、ステロイド、脂質、金属イオン、薬物、ホルモン、 アミド、アミン、カルボン酸、ビタミンおよび補酵素、アルコール、アルデヒド 、ケトン、脂肪酸、ポルフィリン、カロテノイド、植物成長調節物質、リン酸エ ステルおよびヌクレオシド二リン酸-糖、合成小分子（例えば、薬学的または治 療的に有効な物質）、モノマー、ペプチドアナログ、ステロイドアナログ、イン ヒビター、変異原、発ガン物質、有糸分裂阻害剤、抗生物質、イオノホア、抗代 謝物質、アミノ酸アナログ、抗菌剤、輸送インヒビター、表面活性剤（界面活性 剤）、ミトコンドリアおよび葉緑体機能インヒビター、電子供子体、電子伝達体 および電子受容体、プロテアーゼについての合成基質、ホスフアターゼについて の基質、エステラーゼおよびリパーゼについての基質、およびタンパク質改変試 薬）；ならびに合成ポリマー、オリゴマー、およびコポリマー（例えば、ポリア ルキレン、ポリアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリスルホン 、 ポリスチレン、ポリエーテル、ポリビニルエステル、ポリカーボネート、ポリビ ニルハライド、ポリシロキサン、POMA、PEG、および上記の任意の２つ以上のコ ポリマー）が挙げられる。 III．情報処理 特定の溶離条件下で吸着体に吸着した被分析物の検出は、試料中の被分析物お よびその化学的特徴についての情報を提供する。吸着は、一部は、吸着体の結合 特性に依存する：吸着体に結合する被分析物は、結合を可能にする特徴を有する 。例えば、特定のpHでカチオン性である分子は、そのpHを含む溶離条件下でアニ オン性吸着体に結合する。強力なカチオン性分子は、非常に強い溶離条件下での み吸着体から溶離され得る。疎水性領域を有する分子は、疎水性吸着体に結合す るが、親水性領域を有する分子は、親水性吸着体に結合する。また、相互作用の 強度は、一部は、被分析物が疎水性または親水性領域を含む程度に依存する。し たがって、試料中の特定の被分析物が特定の溶離条件下で吸着体に結合するとい う決定は、互いから、および結合についての適切な化学的特徴を有さない被分析 物から、被分析物を分別することによって、混合中の被分析物を分離するだけで なく、特定の化学的特徴を有する被分析物のクラスまたは個々の被分析物をも同 定する。種々の溶離条件下で１つ以上の特定の吸着体での被分析物保持について の情報を収集することは、混合物中の被分析物の詳細な分離だけでなく、同一性 へと導き得る被分析物自体についての化学的情報もまた提供する。このデータは 、「保持データ」という。 保持アッセイで生成されるデータは、プログラム可能なデジタルコンピュータ の使用で最も容易に分析される。コンピュータプログラムは、一般的には、コー ドを保存する読み取り可能な媒体を含む。あるコードは、基材アレイの各特徴の 位置、その特徴での吸着体の正体、および吸着体を洗浄するために使用される溶 離条件を含むメモリーに充てられる。次いで、この情報を使用して、プログラム は、ある選択特性を定義するアレイにおける特徴のセットを同定し得る。コンピ ュータはまた、入力として受けるコード、プローブにおける特定のアドレス可能 な位置から受けた種々の分子量でのシグナルの強度についてのデータを含む。こ のデータは、必要に応じて、検出される各被分析物についてシグナルの強度およ び決定された分子量を含む、検出された被分析物の数値を示し得る。 コンピュータはまた、データを処理するコードを含む。本発明は、データを処 理するための種々の方法を意図する。１つの実施態様では、これは、被分析物認 識プロファイルを生成することを包含する。例えば、分子量によって同定された 特定の被分析物の保持についてのデータは、特定の結合特性、例えば、アニオン 性吸着体または疎水性吸着体への結合に従って分類され得る。この収集したデー タは、特定の被分析物の化学的特性のプロファイルを提供する。保持特性は、次 に構造を反映する被分析物機能を反映する。例えば、配位共有金属キレーターへ の保持は、ポリペプチド被分析物におけるヒスチジン残基の存在を反映し得る。 種々のpHレベルでの溶離下で複数のカチオン性およびアニオン性吸着体への保持 のレベルのデータを使用することで、タンパク質の等電点を導き得る情報が明ら かになる。これは、次に、タンパク質中のイオン性アミノ酸の推定数を反映する 。したがって、コンピュータは、結合情報を構造情報に変換するコードを含み得 る。さらに、被分析物の二次プロセシング（例えば、翻訳後修飾）によって、結 合および量の差異によって反映される変化した認識プロファイルを得る。 他の実施態様では、保持アッセイは、２つの異なる細胞型における同じセット の選択閾値下で行われ、そして２つのアッセイからの保持データが比較される。 保持マップ（例えば、任意の特徴でのシグナルの存在または強度）における差異 は、２つの細胞によって別々に発現される被分析物を示す。これは、例えば、２ つの保持アッセイ間のシグナル強度の差異を示し、それによって被分析物が、２ つのアッセイにおいて吸着体によって増加してまたは減少して保持されることを 示す、差異マップを生成することを包含し得る。 コンピュータプログラムはまた、入力としてプログラマーからの指示を受ける コードを含み得る。アレイ中の特定された、所定の位置からの被分析物の選択的 脱離について進行的経路および論理的経路は、予測されそして予めプログラムさ れ得る。 コンピュータは、データを表示のための他のフォーマットに変換し得る。デー タ分析は、例えば、収集したデータから特徴位置の関数としてのシグナル強度を 決定する工程、「アウトライアー」（所定の統計学的分布から逸脱するデータ） を除去する工程、および残りのデータから被分析物の相対結合親和性を算出する 工程を包含し得る。 得られるデータは、種々のフォーマットで表示され得る。１つのフォーマット では、シグナルの強度は、分子量の関数としてグラフで表示される。「ゲルフォ ーマット」と呼ばれる、他のフォーマットでは、シグナルの強度は、暗さの直線 軸強度に沿って表示され、ゲルにおいてバンドに類似の出現を得る。他のフォー マットでは、ある閾値に達するシグナルは、分子量を表す横軸上に垂直な線また バーとして表示される。したがって、各バーは、検出された被分析物を表示する 。データはまた、結合特性および／または溶離特性に従ってグループ分けされた 被分析物についてのシグナル強度のグラフで表示され得る。 IV．被保持物クロマトグラフィーの適用 被保持物クロマトグラフィーは、同時に多数の被分析物の検出および特徴づけ を含む、組合せ的な分別方法に関する。これらの組合せ的な方法は、多くの適用 を有する。このような適用には、限定されることなく、標的被分析物検出スキー ムを開発すること；タンパク質精製方策を開発すること；タンパク質精製方法； 相補的ファージ提示ライブラリーを使用する標的エピトープ同定を含む、標的被 分析物に結合するファージ提示ライブラリーから特定のファージを同定すること ；被分析物の物理化学的特性に基づくタンパク質同定；遺伝子発現モニタリング および示差的なタンパク質提示；毒性学スクリーニング；多数の診断マーカーの 同時検出；薬物発見；多量体タンパク質会合モニタリングおよびインビトロポリ ヌクレオチド翻訳の検出が挙げられる。 Ａ．試料から被分析物を連続的に抽出する方法 被保持物クロマトグラフィーは、複数の吸着体/溶離条件下での被分析物の保 持の分析に関する。この方法の１つの変更は、連続的抽出である。連続的抽出で は、試料は、２つの異なる選択条件に独立して曝露されない。むしろ、試料は、 吸着体への試料からのある被分析物を抽出し、そして溶離物中で非吸着被分析物 を放出するために、第１の選択条件に曝露される。次いで、溶離物は、第２の選 択条件に曝露される。これは、さらに、溶離物から種々の被分析物を抽出する。 頻繁には、第１および第２の曝露において吸着体が引力についての異なる基礎（ 例えば、順相および疎水性）を有する場合、吸着体は、溶離物から被分析物の異 なるセットを抽出する。この第２の溶離物は、次いで、第３の選択条件に曝露さ れ、そして以下同様である。連続抽出を実施する１つの方法では、吸着体は、試 料がその上部で混合され得るように、ウェルの底部に置かれる。溶離物が、吸着 物に添加され、そして試料において被分析物間の結合を可能にし、溶離物洗浄液 が収集される。次いで、収集した洗浄液は、第２の吸着体に曝露され、そして被 分析物が結合によって試料から抽出される。 １つの実施態様では、連続抽出の目的は、分析よりもむしろ調製である。より 詳細には、目的は、試料から所望の被分析物以外のすべてを抽出することであり 得る。この場合、試料は、通常、小さく、例えば、約数ミリメーター直径のスポ ットでの数マイクロリットルである。吸着体は、試料から枯渇することを望まな い被分析物を吸着しないように選択される。数回の反復の後、最後に収集した洗 浄物は、望ましくない被分析物を枯渇し、例えば、脱離分光測定法または伝統的 クロマトグラフ方法による続いての分析のために所望の被分析物を残す。 他の実施態様では、保持されない試料は、それ自体、任意の分析技法によって 被分析物について分析される。単一の保持工程の後でさえ、このプロセスによっ て、吸着体に吸着される材料および吸着されない被分析物を検査が可能になる。 Ｂ．試料中の被分析物の進行的分離のための方法 被保持物クロマトグラフィーの１つの目的は、複合試料混合からの被分析物の 明確な分離である。これは、臨床的診断、薬物発見、および機能的ゲノム学にお ける適用に特に重要である：これらの領域は、生物学的試料からの１つ以上の被 分析物の同定に関連し得る。本発明は、被分析物についての改良された分離での 選択条件を同定するための方法を提供する。この方法は、被分析物が保持される 選択条件を同定する工程、および反復プロセスにおいて、被分析物の改良された 分離を提供する追加の結合特性または溶離特性を、この選択条件に追加する工 程を包含する。 選択条件に曝露された複合試料のマススペクトルは、一般的に、試料の多くの 成分からのシグナルを含む。シグナルの複雑性は、被分析物の明確な分離を妨害 し得る。被分析物の進行的分離の方法は、試料中の被分析物の明確な検出のため の被分析物の改良された分離で選択条件を同定することを可能にする。選択条件 は、被分析物シグナルが他の成分のシグナルとより容易に区別可能であるならば 、他の選択条件と比較した被分析物の「改良された分離」を示す。これは、例え ば、吸着体に結合した被分析物の数を減少させ、それによってシグナルの総数を 減少させること、または被分析物についての選択条件の選択性を増加させ、それ によって他のシグナルと比較した被分析物シグナルを増強することを包含し得る 。もちろん、被分析物が基材に独占的に結合した場合、検出中に単独の被分析物 シグナルを生じる。 進行的分離の方法は、さらなる選択（結合または溶離）特性が、被分析物を保 持することが公知の選択特性の定常セットに順次追加される、反復プロセスを包 含する。第１の工程では、一連の選択条件は、標的被分析物を保持する条件を同 定するためにテストされる。次の工程では、選択条件の１つ以上の選択特性が、 さらなる分析についての定常セットについて選択される。 新しいセットの選択条件が生成される。新しいセットの条件のそれぞれは、定 常セットにおいて選択された特性、および定常セットにはない少なくとも１つの 新しい条件を包含する。例えば、定常セットが、アニオン性吸着体および低塩溶 離物を含むならば、新しい条件は、溶離物のpHを変化させることを包含し得る。 これらの新しい変動のそれぞれは、被分析物の分離を改良する能力についてテス トされ、そして改良された分離を有する１つの改変された選択条件が同定される 。次の工程では、改良された分離を提供するさらなる選択条件が、定常セットに 迫加される。 改変された定常セットは、定常セットの特性および新しい特性のセットを含む 新しセットの選択条件を生成することによって、同様に再度テストされる。した がって、各工程で、選択条件は、被分析物の分離が、これまでの工程で選択条件 と比較して改良されるように選択される。 この方法は、実施例によって十分に記載される。細胞試料は、代表的には、数 百またはおそらく数千のタンパク質を含む。試料中の単一の標的タンパク質の被 分析物の明確な分離を得ることが望まれ得る。第１の工程では、保持マップは、 複数の選択条件を使用して標的被分析物について開発される。例えば、吸着体は 、アニオン交換体、カチオン交換体、順相吸着体、および逆相吸着体であり得る 。各吸着体でテストされた溶離条件は、種々のpHレベル、種々のイオン強度、種 々の界面活性剤条件、および種々の疎水性に基づく条件であり得る。例えば、４ つの異なる溶離条件が、各条件についてテストされ得る。したがって、この実施 例では、16の異なる選択条件が、標的被分析物を吸着する能力についてテストさ れる。 この保持マップから、標的被分析物が保持される少なくとも１つの選択条件を 選択する。標的が最大に結合した選択条件を選択し得る。しかし、この選択条件 が他の選択条件よりも標的に対してより選択的である場合、標的が最大に結合さ れない条件を選択することが有利であり得る。この例については、保持マップの 分析が、標的はほぼ中性のpHでアニオン交換吸着体によって保持されるが、親水 性吸着体にも弱く吸着されることを示すと推定される。 被分析物の保持を得ることが同定された選択条件からの１つの可変の吸着体ま たは溶離物は、次いで、すべての後の選択条件における使用について選択される 。本明細書で使用される場合、これは、「選択条件定常のセット」に添加される といわれる。 次の反復では、標的被分析物が第２の複数の選択条件下で結合する能力をテス トする。第２のセットでの各選択条件は、選択条件定常セットの要素を含む。し かし、各選択性はまた、他の可変物（選択条件に添加される異なる吸着体または 溶離物）を含む。したがって、少なくとも定常のセットを用いる制約内で、選択 条件の第２のセットはまた、第１のセットよりさらに多様であるように選択され る。多様性を増加させる方法は、例えば、溶離条件のより精細な階級付けまたは 吸着体の種々の強度をテストする工程を包含する。また、例えば、選択条件への 他の選択特性の添加を包含し得る。 例を続けると、アニオン交換吸着体は、定常のセットに添加され得る。この条 件は、現在、より広範な種々の可変物、例えば、溶離物または吸着体とテストさ れる。テストされるべき溶離物は、最初の反復でテストされるよりも精細な階級 付けで、種々の低pH緩衝液を含み得る。例えば、最初の反復は、pH3.0、pH5.0、 pH7.0、およびpH9.0での緩衝液をテストし、そして標的が、ほぼ中性のpHでアニ オン交換吸着体に結合したことを示した。第２の反復中、テストした緩衝液は、 pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5、およびpH8.0であり得る。さらに 、これらの緩衝液のそれぞれはまた、他の溶離特性、例えば、イオン強度、疎水 性などを含むように変化され得る。 この段階で得られる第２の保持マップの分析は、一般的に、第１のラウンドで 同定される選択条件よりも良好な分離を提供した条件を同定させる。また、この 選択条件の可変物の１つが選択され、そして次の反復におけるさらなる疑問につ いての選択条件定常のセットに添加される。 例を続けると、被分析物を最もよく分離する第２のラウンドでの選択条件は、 pH6.5で緩衝液を使用すると仮定する。この溶離物は、今度は、定常のセットに 添加され得、これは今度は、アニオン交換樹脂およびpH6.5緩衝液を含む。次の 反復では、選択条件は、この定常セット、および他の可変物を含む。可変物は、 例えば、異なるイオン強度のような溶離物への新しい成分の添加であり得；また は、他の吸着体は、アニオン交換吸着体と混合した種々の疎水性吸着体のような 混合物に添加され得；または、アニオン交換樹脂の密度を変化させ得る。また、 選択条件は、被分析物の改善された分離を示すこのセットから同定される。 被分析物が本質的に均一に精製されるまで、このプロセスは継続され得る。こ の場合、選択条件は、被分析物に特異的である。 各工程でテストされる可変物の数を増加させることによってわかり得るように 、適切な選択条件を同定するために必要とされる反復の数を減少させ得る。 Ｃ．被分析物の調製用精製の方法 他の局面では、本発明は、被分析物を精製する方法を提供する。この方法は、 被分析物を吸着するための引力の基礎を迅速に同定するための被保持物クロマト グラフィーの能力を利用する。第１の工程は、複数の選択条件に被分析物を曝露 する工程、および被保持物クロマトグラフィーによってこの条件下で保持を決定 する工程を包含する。これは、被分析物の認識プロファイル特性を生成する。被 分析物が保持される選択条件は、被分析物の調製用精製のためのプロトコルを開 発するために使用される。 被分析物の調製用精製について、被分析物は、引き続いて吸着され、そして被 分析物を結合すると同定された一連の吸着体／溶離物の組合せから溶離される。 したがって、例えば、認識マップは、被分析物が、順相吸着体におよび金属キレ ート剤に結合することを示し得る。次いで、被分析物は、例えば、被分析物を結 合する順相吸着体を含む、第１のクロマトグラフィーカラムと接触する。結合し ていない材料は洗い流される。次いで、被分析物は、十分にストリンジェントな 洗浄によって溶離される。次いで、溶離物は、例えば、被分析物を結合するため に、金属キレートカラムと接触させる。結合していない材料は、洗い流される。 次いで、被分析物を含む結合した材料は、金属キレートカラムから溶離される。 このように、被分析物は、調製量で単離される。試料の調製量は、少なくとも10 μｌ、少なくとも100μｌ、少なくとも１mlまたは少なくとも10mlである。 被分析物の進行的分離中に生成した情報は、大規模クロマトグラフ（溶離に基 づく）タンパク質精製方策を設計するために使用され得る。標的被分析物タンパ ク質についての、引力についての吸着体基礎、結合条件、および溶離条件（すな わち、選択条件）は、被保持物クロマトグラフィーによって定義される。この情 報は、大量の時間、エネルギー、およびここで適切である精製方策決定の試行錯 誤プロセス中に、他の方法では浪費される貴重な被分析物を節約し得る。この節 はまた、市販の吸着体で行った大規模精製努力を提供する。 Ｄ．被分析物の特異的検出のためのプローブを作製する方法 本発明は、脱離スペクトロメトリーによる１つ以上の被分析物の特異的検出の ためのプローブ、ならびにこれらのプローブを作製するための方法を提供する。 このような被分析物を分離するプローブは、診断および分析方法において被分析 物を特異的に検出するために有用である。 １つ以上の被分析物を分離するためのプローブを作製する第１の工程は、複数 の異なる吸着体／溶離物組み合わせ下で被分析物についての保持マップを産生す ることである。例えば、被分析物の分離は、５つの異なる溶離物のそれぞれで洗 浄した４つの異なる吸着体について決定され得る。これは、被分析物のそれぞれ についての保持データの20のセットを提供する。得られる保持マップの分析は、 どの１つまたは複数の選択条件が被分析物を最もよく分離するかを示す。好まし くは、被分析物をすべて明確に分離する１つの選択条件が選択される。次いで、 被分析物のそれぞれが少なくとも１つの吸着体スポットで分離されるように被分 析物が分離するプローブでの使用について、１つ以上の選択条件が選択される。 プローブはまた、１つまたは複数の被分析物を結合しない吸着体を含み得る。こ の吸着体スポットは、コントロールとして有用である。プローブは、１つまたは 複数の被分析物を保持および分離する能力ついて選択されるアドレス可能な位置 に、複数の吸着体スポットを含み得る。この場合、単一の溶離条件下で被分析物 を結合する吸着体が、選択される。プローブ全体が検出プロセスにおいて単一の 溶離物で洗浄され得るので、これは有用である。 特定の被分析物について生成される保持マップは、被分析物についてカスタマ イズされた吸着体を生成するために使用され得る。例えば、被分析物を保持する 吸着体の性質は、被分析物の引力についての基礎のセットを示す。カスタマイズ された吸着体は、引力についてのこれらの基礎を提供する吸着体の要素を含む複 合吸着体を調製することによって設計され得る。このようなカスタム吸着体は、 標的被分析物について非常に選択的である。１つまたは少数のカスタム吸着体が 、被分析物についての認識マップを生成するために十分であり得る。例えば、特 定の溶離条件下で、被分析物が、ある程度の疎水性、正電荷、および芳香性を有 する材料を結合する吸着体によって保持される場合、設計によって、またはこれ らの３つの特性のそれぞれを誘引する官能基を有する組合せ的な合成方策の使用 によって、カスタム吸着体を生成し得る。この吸着体への結合を検出することで 、被分析物を同定する。 このようなプローブは、試料中の１つまたは複数の被分析物を検出するために 有用である。試料は、選択条件に曝露され、そしてプローブは、脱離分光測定法 によって問い合わされる。プローブが被分析物を分離するので、その存在は、特 性認識プロファイルを捜すことによって検出され得る。このようなプローブは、 患者試料中で診断マーカーのセットを同定するのに特に有用である。 １つの実施態様では、アレイは、目的のタンパク質の特定のクラスをドッキン グ（dock）させるように設計される。これは、診断マーカーおよび機能によって 定義される被分析物を含む。例えば、細胞表面タンパク質、あるクラスの酵素（ 例えば、キナーゼ）、転写因子、細胞内レセプターなどを特異的にドッキングさ せるアレイが、調製され得る。吸着体は、バイオポリマー、例えば、抗体に特異 的であり得る。 １つの実施態様では、吸着体は、タンパク質のあるクラスについてのファージ 提示タンパク質リガンドのような遺伝子パッケージである。この場合、ファージ 提示ライブラリーは、クラスに結合するファージを排除するためにあるクラスの 分子で予備スクリーニングされ得る。次いで、集団から差し引かれたファージは 、吸着体として使用される。 Ｅ．診断プローブおよび診断方法 病理学的状態の診断は、しばしば、病気の１つ以上の分子マーカーの患者試料 での検出を含む。ある症状は、単一の診断マーカーの存在によって診断され得る 。他の症状の診断は、複数の診断マーカーの検出を包含し得る。さらに、いくつ かのマーカーの検出は、診断の信頼性を増加させ得る。したがって、本発明は、 病理学的状態の少なくとも１つの診断マーカーを分離する少なくとも１つの吸着 体を含む、脱離分光測定法のためのプローブを提供する。 このようなプローブの調製は、まず、検出されるべきマーカーの選択を包含す る。マーカーは、何らかの病状、例えば、ガン、心臓病、自己免疫疾患、ウイル ス感染、アルツハイマー病、または糖尿病についてのマーカーであり得る。例え ば、前立腺特異的抗原（PSA）の検出は、前立腺ガンを非常に暗示する。HIV感染 は、p17、p24、またはp55の１つ、およびp31、p51、またはp66の１つ、およびgp 41またはgpl20/160の１つのような、いくつかのHIVタンパク質に対する抗体を検 出することによって診断され得る。脳脊髄液中のアミロイド-β42およびτタン パク質の検出は、アルツハイマー病を非常に暗示する。また、マーカーは、健常 被験体対病理学的状態を有する被験体における被分析物の差異の存在を検出する 工程を包含する、本発明の方法によって同定され得る。 次の工程では、１つ以上の診断マーカーを保持する吸着体が、開発される。好 ましくは、すべてのマーカーを分離する単一の吸着体が調製される。これは、例 えば、それぞれが所望のマーカーの１つを結合する、いくつかの抗体を含むスポ ットを生成することによって、達成され得る。あるいは、プローブは、複数の吸 着スポットを含み得、各スポットは、選択条件下で少なくとも１つの標的被分析 物を分離し得る。１つの実施態様では、吸着体は、マーカーに特異的であるリガ ンドを含む複合吸着体である。例えば、吸着体は、標的被分析物を特異的に結合 する抗体、ポリペプチドリガンド、またはポリヌクレオチドを含み得る。１つの 実施態様では、抗体は、組合せ的なライブラリーをスクリーニングすることによ って同定される単鎖抗体である。特定のマーカーに特異的である単鎖抗体は、本 明細書に記載の方法によってファージ提示ライブラリーをスクリーニングするこ とによって開発され得る。 他の実施態様では、吸着体は、標的被分析物を特異的に保持するか、または脱 離分光測定法よって明確な分離に十分な特異性で被分析物を保持するかのいずれ かの、非有機生体分子成分を含む。特異的被分析物の検出のための吸着体の調製 も、本明細書に記載される。 顕著には、これらの方法に使用される単一吸着スポットは、単一被分析物に特 異的である必要はなく、したがって、標的と吸着体との間のバイオポリマー媒介 特異的親和性を必要とする必要はない。以前の親和性検出方法は、主として、バ イオポリマーと標的との間の特異的結合に依存していた。これは、例えば、タン パク質に対する抗体、相補的ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド、また は炭水化物に対するレクチンの特異的親和性を含む。これらの検出手段が間接的 であるのでこのような特異性が必要であった：標的は同定されなかった；しばし ば吸着体に結合した標識が同定された。したがって、吸着体が特異的であるほど 、夾雑物が吸着体に結合しそして特異的検出を妨害する可能性が少なくなる。し かし、脱離分光測定法によって、被分析物の直接的検出を得る。したがって、夾 雑物のシグナルが標的のシグナルと重複しない限り、夾雑物の存在は特異的検出 を 妨害しない。 診断の方法は、第１に、テストされるべき患者試料を選択する工程を包含する 。試料は、例えば、組織、血液、尿、大便、または他の体液（リンパ液、脳脊髄 液、関節内液など）であり得る。次いで、試料は、診断マーカーの保持を可能に する条件下で診断吸着体を含む基材に曝露される。吸着体は、適切な溶離物で洗 浄される。次いで、マーカーは、脱離分光測定法（例えば、マススペクトル測定 ）によって検出（例えば、分離）される。 本発明はまた、(1)吸着体および溶離物を含む選択条件下で少なくとも１つの 診断マーカーを分離する少なくとも１つのアドレス可能位置で少なくとも１つの 吸着体を含む脱離分光測定法における使用のための基材、および(2)溶離物の調 製のための溶離物または装置を含む、診断マーカーの特異的検出のためのキット を提供する。吸着体に試料を曝露しそして溶離物で洗浄すること、すなわち、選 択条件を実行することによって、被分析物は、十分に精製または脱離分光測定法 によって分離のために特異的に結合される。 Ｆ．タンパク質を同定する方法 他の局面では、本発明は、タンパク質の同定を援助する方法を提供する。この 方法は、被保持物クロマトグラフィーを使用してタンパク質被分析物の物理化学 的特徴についての一致パラメータを決定する工程、および一致パラメータを有す るタンパク質を同定するためにタンパク質データベースを検索する工程を包含す る。被保持物特性に基づく物理化学的情報の誘導は、上で論議される。データベ ースは、代表的には、アミノ酸配列および／または各タンパク質のアミノ酸配列 をコードするヌクレオチド配列を提供する。分子量、疎水性、pI、フラグメント 質量などのような構造特性は、この情報から容易に導き出せる。被分析物タンパ ク質は、データベースにおいてタンパク質のサブセットのみと任意の特定の構造 特性を共有する。したがって、同一性候補物は、タンパク質被分析物と共有され る構造特性に従って、タンパク質を分類することによって見いだされる。したが って、参照物の１つ以上の物理化学的特性を同定することに固有の不正確さ、特 異性の程度、または確実性のレベルを考えると、データベースにおけるタンパク 質が、参照物のすべての特徴に完全に一致することを予期し得ない。したがって 、一致パラメータは、例えば、タンパク質被分析物特徴とデータベース中の参照 ポリペプチドの特徴との間の適合の近似を同定するために設定され得る。 本発明者らの、ゲノム中の遺伝子の同定が増加するにつれて、任意のタンパク 質被分析物が参照ポリペプチドとしてデータベース中に存在する機会も増加する 。したがって、この方法は、試料中の目的のタンパク質を迅速に分離し、タンパ ク質についての構造情報を得、次いでタンパク質を同定するためにこの情報を使 用することを可能にする。 Ｇ．マルチマー分子を会合させる方法 吸着体が所望の分子をドッキングさせる能力は、マルチマー分子を組み立て、 そしてその会合をもたらす化合物を評価することに有用である。マルチマー分子 のユニットは、吸着体に結合される。次いで、これは、マルチマー分子の他のユ ニットを含む試料に曝露される。曝露は、結合パラメータをテストするための種 々の条件下で行われ得る。サブユニットのマルチマーへの結合は、脱離分光測定 法によってモニターされ得る。次いで、その後のサブユニットは、同様に結合に ついてテストされ得る。本明細書に記載の薬物スクリーニング方法は、会合を妨 害する能力について物質をテストするために有用である。したがって、プロセス の１つの段階での被分析物は、次の段階で吸着体になる。 Ｈ．酵素アッセイを行うための方法 本発明はまた、酵素アッセイを行うための方法を提供する。酵素アッセイは、 一般的に、酵素が活性である条件下で、酵素基質とテストされるべき試料とを曝 露する工程を包含する。酵素を基質上で作用させた後、酵素反応の産物が検出さ れる。定量アッセイでは、産物の量が決定される。この量は、通常、コントロー ルまたは標準曲線と比較され、それによって試料中の酵素活性の量を得る。 本発明は、試料中で酵素活性の量を検出する工程を包含する、酵素を検出する 方法を提供する。この方法は、酵素の活性が、しばしば、質量が元の基質とは異 なる産物を産生するという事実を利用する。この方法では、基質を結合する吸着 体を含む固相が調製される。ある量の基質が、吸着体に結合される。次いで、吸 着体は、任意の酵素が基質上で作用する条件下でおよびその時間にわたって試料 に曝露される。次いで、何らかの結合した材料は、脱離分光測定法によって検出 される。酵素活性の産物の分子量特性を有する被分析物の検出は、酵素の存在の 指示を提供する。シグナル強度は、試料中の酵素活性の量の関数である。 Ｉ．生物学的材料間で示差的に発現される被分析物を同定する方法 他の局面では、本発明は、２つ以上の試料間で示差的に発現される有機生体分 子、特にタンパク質を同定する方法を提供する。「示差的発現」とは、２つの試 料間での被分析物の量または質の差異をいう。このような差異は、転写から翻訳 後修飾までのタンパク質発現のいずれかの段階で生じ得る。方法は、被保持物ク ロマトグラフィーの並外れた分離の能力および感度を利用する。第１に、選択条 件の同じセットを使用する認識プロファイルは、２つの生物学的試料からの被分 析物について調製される。使用される選択条件の数が多いほど、試料中の被分析 物の分離が大きく、したがって、比較され得る被分析物の数が大きい。次いで、 認識マップは、２つのセットの吸着体によって示差的に保持される被分析物を同 定するために比較される。示差的保持は、定量的保持を含む。これは、例えば、 発現のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを示す。示差的保 持はまた、非分石仏中の定性的差異も包含する。例えば、タンパク質の翻訳後修 飾の差異は、結合特性の差（例えば、タンパク質がグリコシル化されるならば、 レクチン吸着体に異なって結合する）、または質量の差異（例えば、翻訳後切断 の差異の結果として）として検出可能な認識マップの差異を生じ得る。分析は、 プログラム可能なデジタルコンピュータによって行われ得る。 この方法は、２つの細胞型間で示差的に発現される遺伝子を検出するために特 に有用である。２つの細胞型は、正常対病的細胞、例えば、ガン細胞、または種 々のレベルの細胞、または発生または分化の異なる段階での、あるいは細胞周期 の異なる部分での細胞であり得る。しかし、この方法はまた、異なる条件に曝露 された同じ型の２つの細胞を検査することに有用である。例えば、この方法は、 細胞での遺伝子発現を調節する能力について薬剤を毒性スクリーニングおよびテ ストすることに有用である。このような方法では、１つの生物学的試料は、テス ト薬剤に曝露され、そして他の細胞は曝露されない。次いで、試料の被保持物質 試料が比較される。この方法は、タンパク質または他の生体分子が、発現を増加 または減少し、あるいは異なる被保持物特徴または異なる質量に基づいて何らか の形で変化する。 保持マップから得られる、示差的に発現したタンパク質の物理化学的特性につ いての情報を使用して、これらのタンパク質についての同一性候補は、本明細書 に記載の方法を使用して決定され得る。 この方法は、病気の診断マーカーを同定するために有用である。または正常試 料もしくは細胞と比較して、患者試料または疾患培養細胞で、示差的に発現され るタンパク質は、診断マーカーであり得る。一般的に、統計学的に有意な患者集 団からの試料を正常試料と比較するために最良である。このように、情報は、そ の病状を示す個体のすべてまたは著しい数に普通の診断マーカーを同定するため に蓄積され得る。 １．異化シグナル増幅による漸増感度 複合混合物中の大きなタンパク質の分化存在（例えば、分化発現から生じる） を検出する感度は、大きなタンパク質をより小さな小片にフラグメント化するこ と、およびより小さな小片を検出することによって顕著に増加され得る。増加し た感度は、いくつかの因子に起因する。第１に、試料中のタンパク質すべてが、 例えば、酵素的切断によってフラグメント化される場合、大きなタンパク質は、 小さなタンパク質よりも多くのフラグメントを産生するようである。第２に、脱 離スペクトロメトリーの全体の感度は、より高分子量よりも低分子量で大きい。 第３に、タンパク質をフラグメント化すると、標的からのシグナルの数が増加し 、それによって標的を検出する可能性を増加させる。第４に、タンパク質をフラ グメント化すると、捕獲の可能性が増加し、したがって、タンパク質の少なくと も１つのフラグメントを検出する。第５に、タンパク質が、２つの試料に別々に 存在するならば、タンパク質からのシグナルの数を増加させることによって、量 の差は、さらに検出されるようである。 また、この方法は直感に反する。一般的に、分析前に被分析物混合物の複雑性 を減少させようと努める。フラグメント化は、複雑性を増加させる。 したがって、本発明の１つの実施態様では、被分析物を検出する感度は、検出 前に被分析物をより低分子量フラグメントに変換することによって増加する。フ ラグメント化は、当該技術分野で公知の何らかの手段によって達成され得る。例 えば、タンパク質被分析物は、エンドプロテアーゼを使用してフラグメント化さ れ得る。炭水化物被分析物は、グリコシダーゼを使用してフラグメント化され得 る。核酸は、エンドヌクレアーゼを使用してフラグメント化され得る。試料は、 吸着体とのドッキングの前または後にフラグメント化に供せられ得る。 Ｊ．レセプターに対するリガンドを同定する方法 生物学的系における機能的経路は、しばしば、レセプターとリガンドとの間の 相互作用を含む。例えば、転写活性化間の結合は、しばしば、リガンドの転写因 子との先の結合を包含する。多くの病理学的状態は、レセプターとそのリガンド との間の異常な相互作用に関連する。レセプターとリガンドとの間の結合の中断 は、薬物発見の頻繁な標的である。しかし、レセプターに対するリガンドの同定 は、しばしば未知である；レセプターは「オーファン」レセプターである。 本発明は、レセプターに対するリガンドを同定するために被保持物クロマトグ ラフィーを使用する方法を提供する。この方法は、吸着体にレセプターをドッキ ングさせる工程を包含する。次いで、レセプターに対するリガンドを含むと推測 される思われる試料は、レセプターとリガンドとの間の結合に適切な溶離条件下 で、ドッキングしたレセプターに曝露される。次いで、レセプターに結合してい るリガンドは、脱離スペクトロメトリーによって検出される。この方法のパワー は、一部は、吸着体にドッキングした少量の材料を検出するために、脱離スペク トロメトリーに対する感度に由来する。 レセプターを吸着体にドッキングすることは、レセプターを保持、および好ま しくはレセプターに特異的に結合する吸着体を同定することを必要とする。タン パク質を特異的に結合する吸着体を同定する方法は、本明細書に記載される。１ つの方法では、吸着体は、レセプターに特異的な抗体を含む。別の実施態様では 、 レセプターは、特異的結合のための部分を含む組換え融合タンパク質として産生 される。例えば、レセプターは、抗体のFc部分と融合され得る。このような部分 は、吸着体に組み込まれ得るプロテインＡに結合する。 リガンドの存在について試験される試料は、実施者の自由である。例えば、レ セプターが核レセプターであるならば、試料は、核抽出物であり得る。レセプタ 一が細胞質レセプターであるならば、試料は、細胞質抽出物であり得る。レセプ ターが細胞表面レセプターであるならば、試料は、細胞が曝露される表面からの 液体、例えば、上皮細胞表面レセプターに対する血清であり得る。 試料は、一般的に、結合させるために十分な時間、生理学的条件下で、例えば 、37℃にて数時間、レセプターとともにインキュベートする。次いで、結合して いない材料が洗い流される。この方法は、従来の技術が同定するために数カ月を 必要とするリガンドを、迅速に同定し得る。 被保持物クロマトグラフィーは、いくつかの吸着スポット上の試料の並行処理 を可能にする。したがって、この方法は、リガンドの存在について複数の異なる 試料を試験する工程、ならびに複数のインキュベーションおよび溶離条件下で単 一の試料を試験する工程を包含し得る。 同定されたリガンドの質量および種々の物理化学的特性を決定することによっ て、リガンドは、ゲノムデータベースからの情報を使用して明確に同定され得る 。 この方法の別の実施態様では、細胞に曝露されそして細胞からのタンパク質を ドッキングしたプローブのセットが調製される。このプローブは、それ自体、ド ッキングした分子に結合する細胞からの分子を同定するために、二次プローブと して有用である。第２にプローブからの被保持物マップを調製した後、プローブ は、一般的に、二次プローブを調製するために使用されるよりも低いストリンジ ェント条件下で、試験材料に曝露され、そしてアドレス可能位置が分析される。 新しくプローブにドッキングされる分子は、既にドッキングした分子に結合され た分子である。 Ｋ．薬物発見の方法 レセプターとそのリガンドとの間の結合に介在する分子を同定することは、薬 物を開発することに重要な工程である。本発明は、吸着体および被分析物を試験 化合物に曝露する工程、ならびに吸着体および被分析物との間の結合を脱離スペ クトロメトリーによって検出する工程によって、吸着体および被分析物との間の 結合（例えば、レセプター吸着体およびリガンド被分析物）を調節する能力につ いて、化合物をスクリーニングする方法を提供する。 薬物候補物についての組合せ的なライブラリーの迅速なスクリーニングは、数 千の薬物に標的相互作用を曝露し、そして相互作用を妨害または促進する物質を 同定する能力を必要とする。被保持物クロマトグラフィーは、リガンド／レセプ ター対の１つのメンバーを基材にドッキングし、そして二次吸着体としてそれを 使用することが可能である。次いで、メンバーをそのパートナーにおよび物質に 曝露した後、パートナーが結合したかどうかそしてどの程度結合したかを、脱離 スペクトロメトリーによって決定し得る。スクリーニング方法における被保持物 クロマトグラフィーの有利点は、レセプターを吸着体によって基材に特異的にド ッキングさせる能力、並行処理について多くの吸着体スポット上のレセプターを 迅速に展開する能力、および脱離スペクトロメトリーによる読み出し結果によっ て可能である処理能力のスピードを含む。 １．スクリーニングアッセイ この方法は、吸着体を提供する工程；１つ以上の選択条件下で物質の存在およ び非存在下で標的被分析物と吸着体を接触させる工程、ならびに物質とのおよび 物質なしのいずれかの結合の量を決定する工程を包含する。結合の量は、被保持 物クロマトグラフィーによって（例えば、認識プロファイルを調製することによ って）決定される。実験は、物質が添加されないコントロール、または物質の異 なる量もしくは型が添加されそしてゼロ量が外挿によって決定されるコントロー ルで行われ得る。結合の量の統計学的に有意な差（ｐ＜0.05）は、試験物質が結 合を調節することを示す。 この方法は、薬物標的候補物として被分析物（例えば、タンパク質）をスクリ ーニングすることに特に有用である。血清または他の標的細胞型からのタンパク 質保持マップまたは認識プロファイルの開発の後、物質は、そのアドレス可能位 置で保持された被分析物のアレイに曝露される。結合をさせた後、結合していな い物質は溶離または洗い流される。物質自体が保持マップ中の新しい成分として 現れるので、特定された選択条件下で結合物質を保持したその被分析物は、脱離 マススペクトロメトリーによって直接同定される（すなわち、物質は直接脱離そ して検出される）。この方法は、被分析物を結合するまたは１つ以上の生物学的 プロセスを調節する能力について、薬物候補物、アゴニストおよびアンタゴニス トの両方をスクリーニングするために特に有用である。 ２．レセプターおよびリガンド 吸着体および標的被分析物は、特異的結合に携わる必要がない。しかし、特に 有用は方法では、吸着体および標的被分析物は、リガンド／レセプター対である 。 １つの実施態様では、リガンド／レセプター対は、ホルモンおよび細胞表面レ セプターまたは細胞内レセプターである。吸着体は、細胞全体、または膜結合レ セプターの場合は細胞膜であり得る。タンパク質レセプターまたは他の薬物標的 候補物は、組合せ的な薬物ライブラリーをスクリーニングするために吸着体とし て使用され得る。数百または数千の薬物候補物は、単一のレセプター型またはア ドレス可能位置に適用され得る。非結合および弱く結合した薬物候補物（すなわ ち、物質）の除去の後、結合した物質は、脱離スペクトロメトリーによって検出 および同定される。 別の実施態様では、吸着体は、標的基質を結合しそして改変する酵素である。 物質は、被分析物の酵素的形質転換を調節する能力についてスクリーニングされ る。例えば、被分析物の認識プロファイルは、酵素活性の産物のプロファイルと は異なり得るので、酵素活性が検出され得る。分化保持は、物質が結台を変化さ せることを示す。 レセプター／レセプターは、種々の方法で基材上に保持され得る。１つの方法 では、レセプター／リガンドは、非特異的吸着体によって直接保持される。別の 方法では、吸着体は、レセプター／リガンドに特異的である。例えば、吸着体は 、レセプター／リガンドに特異的な抗体を含み得る。レセプター／リガンドは、 融合部分が、例えば、FcフラグメントがプロテインＡを結合するように、吸着体 を 特異的に結合する融合タンパク質であり得る。１つの方法では、レセプター／リ ガンドを特異的に結合するポリペプチドをその表面上に有する、ファージ提示ラ イブラリーからのファージのような、遺伝子パッケージは、基材に結合される。 リガンドは、ポリペプチドによって捕獲される。また、吸着体は、基材にすでに ドッキングされた被分析物であり得、すなわち、これは二次吸着体、三次吸着体 などであり得る。 本発明は、標的に結合する薬物（または他の物質）の直接的および間接的の両 方の結果を評価するために特に有用な方法を提供する。標的細胞型のタンパク質 から生成された被保持物マップにおける１つ以上の被分析物の検出は、1)その標 的タンパク質自体、2)いくつかの他の被分析物（薬物結合タンパク質ではない） 、または3)遺伝子発現（アップまたはダウンレギュレーション）において物質（ 例えば、薬物候補物）の作用に起因して変更され得る。これは、これらの変化を 検出するために被保持物クロマトグラフィーの高分離および情報生成力、すなわ ち、この方法を、プロテオミクス(proteomics)、機能的ゲノミクス(genomics)、 薬物発見、治療薬物モニタリング、および臨床診断学に利用可能な最も強力なツ ールの１つにする、薬物ありおよびなしで観察される遺伝子被保持物マップまた は認識プロファイルの薬物誘導される差である。 ３．試験物質 プロチモシン(prothymosin)発現を調節する能力についてスクリーニングされ るべき試験物質が、試験動物またはインビトロで培養された細胞に投与される。 試験されるべき物質の選択は、実施者の裁量にゆだねられる。しかし、薬剤とし ての投与の多様性および容易さのため、低分子が、試験物質として好ましい。 ａ．化学 試験されるべき物質は、多くの供給源から選択され得る。例えば、分子の組合 せ的なライブラリーは、スクリーニングに利用可能である。このようなライブラ リーを使用して、数千の分子が、調節活性についてスクリーニングされ得る。１ つの好ましい実施態様では、高処理能スクリーニング方法は、多数の潜在的治療 化合物（候補化合物）を含むライブラリーを提供する工程を包含する。次いで、 このような「組合せ的な化学ライブラリー」は、所望の特徴的活性を提示するラ イブラリーメンバー（特定の化学種またはサブクラス）を同定するために、本明 細書に記載のように、１つ以上のアッセイでスクリーニングされる。従って同定 された化合物は、従来の「リード化合物」として作用し得るか、または潜在的ま たは実際の治療剤としてそれ自体が使用され得る。 組合せ的な化学ライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者に周知で ある。このような組合せ的な化学ライブラリーには、ペプチドライブラリー（例 えば、米国特許第5,010,175号、Furka（1991）Int．J．Pept．Prot．Res.，37:4 87-493、Houghtonら（1991）Nature，354:84-88を参照のこと）が挙げられるが 、これらに限定されない。ペプチド合成は、決して、本発明での使用について予 想および意図されるアプローチのみではない。化学的に異なるライブラリーを生 成するための他の化学も使用され得る。このような化学には、以下が挙げられる が、これらに限定されない：ペプトイド（PCT公開番号WO 91/19735，1991年12月 26日）、コードされたペプチド（PCT公開WO 93/20242，1993年10月14日）、ラン ダムバイオオリゴマー（PCT公開WO 92/00091，1992年1月9日）、ベンゾジアゼピ ン（米国特許第5,288,514号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペ プチドのようなジベルソマー(diversomer)(Hobbsら，（1993）Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 90:6909-6913）、ビニル様ポリペプチド（Hagiharaら（1992）J．Am er．Chem．Soc．114:6568）、β-D-グルコースを足場とした非ペプチド性ペプチ ド模倣物（Hirschmannら，（1992）J．Amer．Chem．Soc．114:9217-9218）、小 化合物ライブラリーの類似有機合成物（Chenら（1994）J．Amer．Chem．Soc．11 6:2661）、オリゴカルバメート（Choら，（1993）Science 261:1303）、および ／またはペプチジルホスホネート（Campbellら（1994）J．Org．Chem．59:658） 。一般的には、Gordonら（1994）J．Med．Chem．37:1385、核酸ライブラリー、 ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第5,539,083号を参照のこと）、 抗体ライブラリー（例えば、Vaughnら（1996）Nature Biotechnology，14(3):30 9-314、およびPCT/US96/10287を参照のこと）、炭水化物ライブラリー（例えば 、Liangら（1996）Science，274:1520-1522、および米国特許第5,593,853号を参 照 のこと）、および低有機分子ライブラリー（例えば、ベンソジアゼピン，Baum（ 1993）C&EN，1月18日，33頁、イソプレノイド米国特許第5,569,588号、チアゾリ ジノンおよびメタチアザノン米国特許第5,549,974号、ピロリジン米国特許第5,5 25,735号および同第5,519,134号、モルホリノ化合物米国特許第5,506,337号、ベ ンゾジアゼピン同第5,288,514号などを参照のこと）を参照のこと。 組合せ的なライブラリーの調製のためのデバイスは、市販されている（例えば 、357 MPS，390 MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin ，Woburn，MA，433A Applied Biosystems，Foster City，CA，9050および，Mill ipore，Bedford，MAを参照のこと）。 Ｌ．被分析物を特異的に結合する物質を生成するための方法 本発明は、標的被分析物に特異的に結合する物質、例えば、単鎖抗体を生成す るための方法を提供する。これらの物質は、例えば、リガンド／レセプター相互 作用の研究において標的をドッキングさせるために特異的な診断物質として有用 である。この方法は、動物を免疫することによって抗体を生成する可能でないか または実際的でないような少量で単離され得るのみである標的に対する物質を生 成するために特に有用である。この方法は、そこに付着された標的を有する基材 を提供する工程；スクリーニングされるべき物質を提示する遺伝子パッケージの 提示ライブラリーを提供する工程；標的との相互作用によって遺伝子パッケージ を特異的に保持するために、ライブラリーを標的に曝露する工程；および脱離ス ペクトロメトリーによって保持された遺伝子パッケージを検出する工程、を包含 する。 これらの工程は、オフライン増幅および間接的検出手段に関連する標識方策を 含む、分別選択および検出手順と関連する損失および曖昧さを移すことなく、多 数の複合集団内の吸着体-被分析物候補物について並行で行われ得る。 １．基材を提供する工程 この方法の第１の工程は、スクリーニングされるべき提示ライブラリーのポリ ペプチド物質について標的として作用する吸着体を含む基材を提供する工程を包 含する。１つの実施態様では、既に標的吸着体が付着された基材が、提供される 。別の実施態様では、基材は、標的被分析物を結合する吸着体を有する基材を提 供する工程、被分析物の保持を可能にする溶離条件下で吸着体を被分析物に曝露 する工程、および提示ライブラリーについての標的として標的吸着体を使用する 工程によって提供される。１つの実施態様では、標的は、比較される２つの細胞 型間で分化発現される。例えば、標的は、分化発現したmRNAに由来し得るか、ま たは分化発現したポリペプチドであり得る。被保持物クロマトグラフィー法によ るこのような分化発現したタンパク質を同定する方法は、上に記載される。 分化発現したタンパク質被分析物が一旦同定されると、被分析物を明確に分離 する選択条件を開発し得る。より好ましくは、被分析物の保持は、特異的または 排他的である。上記の被分析物の進行的分離の方法は、複合試料から標的被分析 物を特異的に結合する選択条件を同定することを可能にする。１つの実施態様で は、結合した標的は、例えば、酵素への曝露によって改変され得る。 あるいは、この方法は、mRNAまたはEST段階で開始し得る。この方法では、分 化発現したmRNAまたはESTは、ルーチンの方法によって同定される。次いで、こ れらの分子は、ドッキングのための吸着体上でインビトロおよびインサイチュで 転写および翻訳される。例えば、複数の吸着体スポットを有する脱離スペクトロ メトリーのための基材が調製される。この基材は、円柱管に重層され、それによ ってウェルの底に吸着体を有するウェルを作製する。ウェルにおいて、分化発現 したmRNA（通常は、cDNAの形態で）のインビトロ転写および翻訳のための試薬を 置く。（方法については、例えば、Sambrookら，Molecular Cloning--A Laborat ory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY,(1989) 、およびCurrent Protocols in Molecular Biology，F.M．Ausubelら編(Current Protocols，Greene Publishing Associates Inc.およびJohn Wiley & Sons，In cとの間の共同投機)を参照のこと）。mRNAまたはESTの翻訳は、吸着されるポリ ペプチドを産生する。円柱管が除去され、そして、ポリペプチド被分析物を保持 する選択条件を同定するように、吸着体スポットは、溶離物で洗浄される。 ２．提示ライブラリーを提供する工程 第２の工程は、提示ライブラリーを提供する工程を包含する。提示ライブラリ ーは、ペプチドの組合せ的なライブラリー（「ポリペプチド物質」）の任意の分 類を、その表面上で提示する、遺伝子パッケージから構成される。しかし、単鎖 抗体は、その後のイムノアッセイに使用され得るので、魅力的である。 多くの種類の提示ライブラリーおよびその使用は、当該技術分野で公知である 。提示方法の基礎概念は、スクリーニングされるべきポリペプチドリガンドと、 ポリペプチドをコードする回収可能なポリヌクレオチドとの間の物理的会合の確 立である。この物理的会合は、マルチマー分子複合体によって提供され、この場 合、遺伝子パッケージ、例えば、ファージ粒子は、ポリペプチドをコードするフ ァージゲノムを封入するキャプシドの一部としてポリペプチドを提示する。ポリ ペプチドとその遺伝物質との間の物理的会合の確立は、異なるポリペプチドを有 する非常に多数の遺伝子バッケージの同時質量スクリーニングを可能にする。標 的への親和性を有するポリペプチドを提示する遺伝子パッケージは、標的に結合 し、そしてこれらのパッケージは、標的へのアフィニティースクリーニングによ って富化される。これらのパッケージから提示されるポリペプチドの同一性は、 それぞれのゲノムから決定され得る。これらの方法を使用して、所望の標的につ いての結合親和性を有すると同定されたポリペプチドは、次いで、従来の手段に よってバルクで合成され得る。 提示ライブラリーに最も頻繁に使用される遺伝子パッケージは、バクテリオフ ァージ、特に線状ファージ、および特にファージM13、Fd、およびF1である。ほ とんどの研究は、融合タンパク質を形成するこれらのファージのgIIIまたはgVII Iのいずれかに、提示されるべきポリペプチドをコードするライブラリーを挿入 した。例えば、Dower，WO 91/19818；Devlin，WO 91/18989；MacCafferty，WO 9 2/01047（遺伝子VIII）；Huse，WO92/06204；Kang，WO92/18619（遺伝子VIII） を参照のこと。Cwirlaら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87，6378-6382(1990)； Devlinら，Science 249,404-406(1990)；ScottおよびSmith，Science 249，386- 388(1990)；Ladnerら，米国特許第5,223,409号；およびLadnerら，米国特許5,57 1,698も参照のこと。このような融合タンパク質は、通常はファージコートタン パク質以外の分泌されるタンパク質からのシグナル配列、提示されるべき ポリペプチド、および遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIのタンパク質またはそのフラ グメントのいずれかを含む。外因性コード配列は、しばしば、遺伝子IIIまたは 遺伝子VIIIのＮ末端にまたはその近くに挿入されるが、他の挿入部位が可能であ る。いくつかのフィラメント状ファージベクターは、遺伝子IIIまたは遺伝子VII Iのいずれかの第２のコピーを産生するように操作されている。このようなベク ターでは、外因性配列は、２つのコピーの１つのみに挿入される。他のコピーの 発現は、ファージ粒子に組み込まれる融合タンパク質の比率を効果的に希釈し、 そしてファージ増殖に有害なポリペプチドに対する選択を減少させることに有利 であり得る。細菌（バクテリオファージまたはファージ）を感染させるウイルス の表面上の抗体フラグメントの提示は、広い範囲の親和性および動力学的特徴を 有するヒトsFvを産生することを可能にする。 他の変更では、外因性ポリペプチド配列は、ファージコートタンパク質および ファージパッケージング配列をコードするが複製し得ないファージミドベクター にクローニングされる。ファージミドは、細胞にトランスフェクトされ、そして ヘルパーファージでの感染によってパッケージされる。ファージミド系の使用は また、コートタンパク質から形成される融合タンパク質を希釈する効果を有し、 そしてヘルパーファージから発現されるコートタンパク質の野生型コピーを有す るポリペプチドを提示した。例えば、Garrard，WO 92/09690を参照のこと。 真核生物ウイルスは、類似の様式でポリペプチドを提示するために使用され得 る。例えば、モロニーマウス白血病ウイルスのgp70に融合したヒトヘレグリンの 提示は、Hanら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92，9747-9751(1995)によって報 告されている。胞子はまた、複製可能な遺伝子パッケージとして使用され得る。 この場合、ポリペプチドは、胞子の外表面から提示される。例えば、B．subtili sからの胞子は、適切であると報告されている。これらの胞子のコートタンパク 質の配列は、Donovanら，J．Mol．Biol．196，1-10(1987)によって提供される。 細胞はまた、複製可能な遺伝子パッケージとして使用され得る。提示されるべ きポリペプチドは、細胞表面で発現される細胞タンパク質をコードする遺伝子に 挿入される。Salmonella typhimurium、Bacillus subtilis、Pseudomonas aerug inosa,Vibrio Cholerae、Klebsiella pneumonia、Neisseria gonorrhoeae、Nei sseria meningitidis，Bacteroides nodosus、Moraxella bovis、および特にEsc herichia coliを含む細菌細胞が好ましい。外表面タンパク質の詳細は、Ladner ら，米国特許5,571,698、およびGeorgiouら，Nature Biotechnology 15，29-34( 1997)、およびそこに引用される参考文献によって議論される。例えば、E．coli のlamBタンパク質が適切である。 ３．提示ライブラリーをスクリーニングする工程 第３の工程は、標的を特異的に結合するリガンドを同定するために提示ライブ ラリーをスクリーニングする工程を包含する。標的を有する基材は、ポリペプチ ドと標的分子との間の特異的結合に適切な溶離条件下で、ポリペプチド物質を提 示する提示ライブラリーに曝露される。標的を認識する物質を有する遺伝子パッ ケージは、基材に既に付着された標的に結合する。結合していない粒子を除去す ることおよび結合した粒子の保持によって、溶離条件への曝露を得る。 このM13ファージの場合、１mL当たり約1011プラーク形成単位（pfu）を示す、 遺伝子パッケージの集団は、結合した標的吸着体（例えば、タンパク質）のアド レス可能なアレイとともに基材に導入される。接触の際、標的吸着体について最 適化される選択条件（すなわち、選択閾値改変剤または溶離物）が選択され、そ のため、総ファージ遺伝子型の小サブセットのみが、選択的に保持され、好まし くは５〜10より小さい。結合していないファージ（すなわち、標的吸着体に結合 しないファージ）および標的吸着体に緩く結合したファージは、ほとんどの選択 的被分析物-標的吸着体相互作用以外のすべてを中断させる溶離物への曝露によ って排除されることに注目されたい。標的吸着体への最も高い親和性を有するフ ァージ提示ポリペプチドは、選択的に保持される。 ４．標的を特異的に結合する物質を含む結合した遺伝子パッケージを検出す る工程 第４の工程では、遺伝子パッケージの標的への結合は、脱離スペクトロメトリ ーによって検出される。例えば、M13ファージは、単一のコートタンパク質の数 千のコピーを有する。脱離スペクトロメトリーにおいてレーザーでファージを打 つ際に、コートタンパク質は除去され、そして検出可能である。このように、ラ イブラリーが、標的に結合した物質を有するファージを含むかどうかを決定し得 る。その後の分析について遺伝子パッケージを得るために、スクリーニング工程 は、プローブについて異なる位置で並行に行い得、または基材は、レーザーが表 面に結合した遺伝子パッケージすべてを除去しないように十分に大きな物理学的 次元を有し得る。この方法は、被分析物に結合した少数のファージでさえ検出さ れ得るので、特に強力である。 M13の場合に、好ましい検出方法は、脱離スペクトロメトリーによって、「マ ーカー」タンパク質シグナルとして遺伝子VIIIコートタンパク質の出現をモニタ ーすることである。この様式では、結合した５ファージ粒子（pfu）（既知の希 釈物からの算出によって推定されるファージ粒子数）くらい少ない「陽性」標的 吸着体を検出した。好ましさの順で、他のファージマーカーには、遺伝子V、遺 伝子X、および遺伝子III（それらの融合産物を含む）が含まれる。 最高の親和性吸着体との吸着体位置、すなわち、高い選択条件（すなわち、ス トリンジェント溶離物）への曝露後に保持される最少のファージとのアレイ内の 位置の検出後、結合したパッケージは、現在、他の使用のための出発点(junp-of f point)として使用され得る。 ５．遺伝子パッケージを単離する工程 １つの実施態様では、この方法は、さらなる分析のために遺伝子パッケージを 単離する工程をさらに包含する。この分析は、遺伝子パッケージを再生する工程 、およびそれからポリヌクレオチドを単離する工程を包含し得る。単離されたフ ァージは、通常の方法によって再生される。例えば、保持されたファージは、そ の後の分析のための遺伝子パッケージを増殖させるために、生物学的増幅ビヒク ル、例えば、E．coliおよび栄養培地に曝露され得る。単一クローンは、基材に 保持される被分析物に結合する能力についてさらに試験され得る。 ６．ポリペプチド物質をコードするヌクレオチド配列を配列決定する工程 結合した遺伝子パッケージのポリペプチド物質をコードするヌクレオチド配列 を配列決定する工程は、ポリペプチド物質を産生するための情報を提供する。配 列決定は、吸着体から遺伝子パッケージを単離する工程、それを再生する工程、 ポリヌクレオチドを単離する工程、および任意の利用可能な手段によってヌクレ オチド配列を配列決定する工程を包含し得る。別の方法では、遺伝子パッケージ は、基材を、遺伝子パッケージによって感染を受ける細胞のような適切な材料と 接触させる工程によって、インサイチュで再生され得る。別の実施態様では、配 列決定は、インサイチュで行われる。この方法は、遺伝子パッケージを溶解する 工程、および任意の公知の手段、例えば、PCRによってヌクレオチド配列を増幅 する工程を包含し得る。いくつかの異なる遺伝子パッケージは、表面で利用可能 な異なるエピトープに結合し得る。この場合には、ある種のみのファージがエピ トープに結合するように溶離条件を変更し得る。 ７．ポリペプチド物質を産生する工程 １つの価値のある次の工程は、ポリペプチド物質を産生する工程を包含する。 単離された物質は、例えば、診断における標的の特異的検出のための、またはリ ガンド／レセプター相互作用の研究のための、吸着体として使用され得る。 １つの方法では、ポリペプチドを産生する工程は、最初に、ポリペプチドをコ ードするヌクレオチド配列を配列決定する工程を包含する。アミノ酸配列は、ヌ クレオチド配列に由来し得る。配列決定は、上記のような方法によって達成され 得る。配列は、ポリペプチド物質の組換えまたは化学合成に基づき得る。 別の方法では、ポリペプチドは、遺伝子パッケージを再生することによって産 生され得る。これは、遺伝子パッケージがポリペプチド物質の多くのコピーを含 む場合、特に効果的である。遺伝子パッケージは、インサイチュでまたは単離後 に再生され得る。 ポリペプチドを組換え産生する方法は、以下のように行い得る。ポリペプチド をコードするヌクレオチド配列は、配列決定されるか、または議論されるような 任意の手段によって単離されるかのいずれかである。次いで、ヌクレオチド配列 は、発現ベクターに含まれる。発現ベクターは、ポリペプチドをコードするヌク レオチド配列に作動可能に連結される発現制御配列を含む。次いで、発現ベクタ ーは、当該技術分野で周知の手段によって、ポリペプチド物質を組換え発現する ために使用され得る。 標的が１つより多くのエピトープを含み得ることが理解される。したがって、 この方法は、標的に特異的な１つより多くのポリペプチド物質を産生し得る。 次いで、標的特異的物質は、臨床診断または薬物発見に使用されるプローブの ための吸着体として使用され得る。すなわち、このようなプローブが、標的を特 異的に結合する物質をその表面上に含むので、これらは、生物学的試料のような 複合混合物から標的を単離するために、および脱離スペクトロメトリーによって 標的を検出するために使用され得る。さらに、物質と標的との間の相互作用が、 生体特異的であり得るので、上記の進行的分離方法によって展開される吸着体よ りも２つの間により大きい親和性を含む確率が高い。 ８．標的のペプチドエピトープを単離する工程 １つの型では、この方法は、標的被分析物のペプチドエピトープを単離するこ とを可能にする。この方法は、「抗イディオ型」様アプローチを用いる。まとめ ると、標的被分析物のエピトープは、例えば、ファージ提示ライブラリーでスク リーニングされる。単離されたファージは、例えば、被分析物のエピトープを認 識する単鎖抗体を含む。これらのファージは、次に、第２の提示ライブラリーを スクリーニングするために使用される。第１の単鎖抗体に結合する第２のライブ ラリーからのファージは、単鎖抗体によって認識されるエピトープの構造を模倣 する提示されたポリペプチドを含む。 この方法の１つの実施態様では、標的被分析物を結合するポリペプチド物質を コードするヌクレオチド配列は、物質が遺伝子VIIIとの融合物として提示される M13ファージを産生するために使用される。したがって、このファージは、その 表面上に標的ペプチドの数百のコピーとともにコートを有する。このファージは 、次いで、吸着体にドッキングされる。ドッキングは、例えば、遺伝子IIIを結 合するリガンドによって達成され得、または遺伝子IIIは、基材上のリガンドに ついてのレセプターを含むように改変され得る。次いで、ファージは、第２の提 示ライブラリーに曝露される。ドッキングしたファージに結合するライブラリー か らの遺伝子パッケージは、検出され、そして記載のように単離される。好ましく は、第２の提示ライブラリーは、その遺伝子VIIIタンパク質が基材にドッキング したファージの遺伝子VIIIと区別され得るように、いくつかの分類の質量（mass ）標識を含む。したがって、「被分析物標的」としてまたは吸着体としての物質 の同定は、結合した物質が、その後、別の物質を結合するために使用されるかど うかに依存し得る。わかり得るように、既にドッキングした物質に物質を結合す る能力は、最後に結合した物質を選択的に除去する条件を同定する方法であり得 るので、持続し得る。 実施例 以下の実施例は、例示の手段によって提供されるが、限定の手段によって提供 されない。 以下の実施例において、以下の製品および用語が用いられる。ニワトリ卵白リ ゾチーム（10ピコモル／μｌ水に希釈される１μl）は、Sigma Chemical Compan y，St．Louis，MOから利用可能である。「ヒト血清」は、20mM リン酸ナトリウ ム緩衝液、0.5M NaCl、pH7.0中に1:5に希釈されたヒト血清の１μｌの組成物を いう。 本明細書中で使用されるように、「mg」は、ミリグラムを意味し；「ml」は、ミ リリットルを意味し；「μｌ」は、マイクロリットルを意味し；「cm」はセンチ メートルを意味し；「nm」は、ナノメータトルを意味し；「M」は、モルを意味 し；「mM」は、ミリモルを意味し；「min」は、分を意味し；「％」あるいは「 パーセント」は、他で詳述しない限り重量パーセントであり；「NaCl」は、塩化 ナトリウムを意味し；「TFA」は、トリフルオロ酢酸を意味する。 Ｉ．被保持物クロマトグラフィーについてのプロトコル 以下のプロトコルは、被保持物クロマトグラフィーを行うための手順の例であ る。 Ａ．被保持物マッピングについてのプロトコル（クロマトグラフィー連続アレイ を使用する） １．試料処理 HEPESまたは20mMリン酸ナトリウム、pH7.2中の0.01％ Triton X100に、生物学 的試料（例えば、血清、尿、細胞抽出物、または細胞培養培地）を希釈する。必 要であれば、試料を清澄化するために遠心分離する。 ２．試料適用 アニオン性、通常相、またはTED-Cu(II)吸着体アレイのスポットに、試料（１ 〜5μｌ）を添加する。疎水性の吸着体アレイについて、0.5% TFAを含有する0.5 μｌアセトニトリルで、各スポットを予め湿潤する。アセトニトリルが乾燥する 前に、スポットに試料を添加する。試料をスポット上で（ほとんど乾燥まで）濃 縮させる。 ３．洗浄 ａ．アニオン性の吸着体アレイ スポット１を、20mM HEPESまたはリン酸ナトリウム、pH7.2で洗浄する。試料 が完全に乾燥する前に、スポットに、最初の２μｌの洗浄溶液を添加する。洗浄 溶液を、少なくとも15秒間、スポット上に置かせる。ピペットで10回出し入れす る。最初の洗浄を完全に除去し、2μｌの溶液の第２洗浄を用いて反復する。 上述のように、20mMリン酸ナトリウム、pH7.2中の0.2M NaClでスポット２を洗 浄する。 上述のように、20mMリン酸ナトリウム、pH7.2中の１M NaClでスポット３を洗 浄する。 上述のように、20mM Tris HCl、pH8.5で、スポット４を洗浄する。 上述のように、0.1M酢酸ナトリウム、pH4.5で、スポット５を洗浄する。 上述のように、20mM HEPESまたはリン酸ナトリウム、pH7.2中の0.05% Triton X100で、スポット６を洗浄する。 上述のように、20mM HEPESまたはリン酸ナトリウム、pH7.2中の３M尿素で、ス ポット７を洗浄する。 上述のように、水中の10%アセトニトリルで、スポット８を洗浄する。 水で、徹底的に、全アレイを洗浄する。 チップを風乾する。 0.3μｌのEnergy Absorbing Molecule（50%アセトニトリル、0.5%トリフルオ ロ 酢酸中に調製された飽和化溶液）を添加する。 チップを風乾する。 レーザー脱着／イオン化時間のフライト質量分析器で、各スポット上に保持さ れたタンパク質を分析する。 ｂ．通常相の吸着体アレイ スポット１を、５mM HEPES、pH７で洗浄する。試料が完全に乾燥する前に、ス ポットに、最初の2μｌの洗浄溶液を添加する。洗浄溶液を、少なくとも15秒間 、スポット上に置く。ピペットで10回、出し入れする。最初の洗浄を完全に除去 し、2μｌの溶液の第２洗浄を用いて反復する。 上述のように、20mMリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、pH7.2でスポット２を洗 浄する。 上述のように、20mMリン酸ナトリウム、0.5M NaCl、pH7.2でスポット３を洗浄 する。 上述のように、0.1M酢酸ナトリウム、pH4.0で、スポット４を洗浄する。 上述のように、20mMリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、pH7.2中で0.05% TritonX 100にて、スポット５を洗浄する。 上述のように、20mMリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、pH7.2中で３M尿素にて、 スポット６を洗浄する。 上述のように、1％ TFAでスポット７を洗浄する。 上述のように、水中の30%イソプロパノール：アセトニトリル（１：２）で、 スポット８を洗浄する。 水で、徹底的に、全アレイを洗浄する。 チップを風乾する。 0.3μｌのEnergy Absorbing Molecule（50%アセトニトリル、0.5%トリフルオ ロ酢酸中に調製された飽和化溶液）を添加する。 チップを風乾する。 レーザー脱着／イオン化時間のフライト質量分析器で、各スポット上に保持さ れたタンパク質を分析する。 ｃ．TED-Cu(II)吸着アレイ スポット１を、20mMリン酸ナトリウム、0.5M NaCl、pH7.2で洗浄する。試料が 完全に乾燥する前に、スポットに、最初の２μｌの洗浄溶液を添加する。洗浄溶 液を、少なくとも15秒間、スポット上に置かせる。ピペットで、10回出し入れす る。最初の洗浄を完全に除去し、２μｌの溶液の第２洗浄を用いて反復する。 上述のように、20mMリン酸ナトリウム、0.5M NaCl、pH7.2中の20mMイミダゾー ルでスポット２を洗浄する。 上述のように、20mMリン酸ナトリウム、0.5M NaCl、pH7.2中の100mMイミダゾ ールでスポット３を洗浄する。 上述のように、0.1M酢酸ナトリウム、0.5M NaCl、pH4.0で、スポット４を洗浄 する。 上述のように、20mMリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、pH7.2中の0.05％ Triton X100で、スポット５を洗浄する。 上述のように、20mMリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、pH7.2中の３M尿素で、ス ポット６を洗浄する。 上述のように、1% TFAでスポット７を洗浄する。 上述のように、水中の10%アセトニトリルで、スポット８を洗浄する。 水で、徹底的に、全アレイを洗浄する。 チップを風乾する。 0.3μｌのEnergy Absorbing Molecule（50%アセトニトリル、0.5%トリフルオ ロ酢酸中に調製された飽和化溶液）を添加する。 チップを風乾する。 レーザー脱着／イオン化時間のフライト質量分析器で、各スポット上に保持さ れたタンパク質を分析する。 ｄ．疎水性の吸着体アレイ スポット１を、0.1％TFA中の５%アセトニトリルで洗浄する。試料が完全に乾 燥する前に、スポットに、最初の２μｌの洗浄溶液を添加する。洗浄溶液を、少 なくとも15秒間、スポット上に置かせる。ピペットで、10回出し入れする。最初 の洗浄を完全に除去し、２μｌの溶液の第２洗浄を用いて反復する。 上述のように、0.1%TFA中の50%アセトニトリルでスポット２を洗浄する。 上述のように、20mMリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、pH7.2中の0.05% Triton X100でスポット３を洗浄する。 上述のように、20mMリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、pH7.2中の３M尿素で、ス ポット４を洗浄する。 水で、徹底的に、全アレイを洗浄する。 チップを風乾する。 0.3μｌのEnergy Absorbing Molecule（50%アセトニトリル、0.5%トリフルオ ロ酢酸中に調製された飽和化溶液）を添加する。 チップを風乾する。 レーザー脱着／イオン化時間のフライト質量分析器で、各スポット上に保持さ れたタンパク質を分析する。 Ｂ．抗体−抗原アッセイ：レセプターリガンドアッセイについてのプロトコル （予め活性化された吸着体アレイを使用する） １．予め活性化された吸着体アレイ上への抗体の固定 平らで清潔な表面に予め活性化した吸着体アレイを置く。0.5μｌのイソプロ パノールで予め湿潤された予め活性化された吸着体アレイの各スポット上に、抗 体またはレセプターまたはコントロールの溶液をスポットする（イソプロパノー ルが乾燥する前に、１μｌの抗体／スポットを添加する）。 加湿チャンバーにおいてインキュベートする（４℃または室温、２〜18時間） 。 ピペットを使用して、スポットから、残余の溶液を除去する。 PBS中の１mlの１Mエタノールアミン、pH7.4を、全体のチップにわたって添加 することによって、スポット上の残余の活性部位をブロックし、そして加湿チャ ンバーにおいてインキュベートする（室温、30分間）。 PBS中の１%Triton X-100で、チップを２回洗浄する。15mlのコニカルプラスチ ックチューブにおいて、約９mlの洗浄溶液中にチップを沈め、そして少なくと も約15分間、卓上振とう器上で振動する。 上述のように、0.1M酢酸ナトリウム、pH4.0中の0.5M NaClで洗浄する。 上述のように、0.1M TrisHCl、pH8.0中の0.5M NaClで洗浄する。 上述のようにPBSでリンスする。次いで、PBSでチップを覆い、そして使用する 準備ができるまで、４℃で保存する。 ２．抗原またはリガンドの結合 穏やかに浸透するか、またはチップ上のPBSを吸い取る 各スポットに１〜５μｌの試料を添加する。非常に低い抗原またはリガンドの 濃度を有する試料について、バイオプロセッサー中に吸着体アレイを置く。200 μｌPBSで、２回、チップ上のスポットおよびバイオプロセッサーウェルを洗浄 する。最大300μｌの試料を、各ウェルに添加する。 接着性テープでシールする。 浸透しながら、インキュベートする（４℃または室温、１〜18時間）。 ３．洗浄 スポットから試料を取り出し、2μｌの、PBS中の0.1%Triton X100(pH7.2)で各 スポットを２回洗浄する。最初の2μｌの洗浄溶液を、スポットに添加する。洗 浄溶液を、少なくとも15秒間、スポット上に置かせる。ピペットで、10回出し入 れする。最初の洗浄を完全に除去し、2μｌの溶液の第２の洗浄を用いて反復す る。この後、0.1M HEPES、pH7.4中の0.5M NaClで洗浄した。 水で、徹底的に、全アレイを洗浄する。 ４．保持されたタンパク質の分析 チップを風乾する。 0.3μｌのEnergy Absorbing Molecule（50%アセトニトリル、0.5%トリフルオ ロ酢酸中に調製されたシナピン酸（sinapinic acid）またはEAMIまたはCHCAの飽 和溶液）を添加する。 チップを風乾する。 レーザー脱着／イオン化時間のフライト質量分析器で、各スポット上に保持さ れたタンパク質を分析する。 II．リゾチーム認識プロファイル 本発明者らは、高情報分別度の被保持物クロマトグラフィーを使用して、リゾ チームについて認識プロファイルを作製した。プロファイルは、それぞれ、多様 な異なる選択性閾値調節物下の、６つの吸着体でのリゾチームの分別を含む。結 果は、リゾチームの物理化学プロファイルを、異なって特徴付ける40個の異なる スペクトルグラフである。 Ａ.親水性吸着体アレイを使用する、リゾチーム認識プロファイル ニワトリ卵白リゾチームを、ステンレススチール基材上の酸化ケイ素吸着体の クロマトグラフィー連続吸着体アレイの種々のスポットに添加する。室温にて、 15分間、加湿チャンバーにおけるインキュベーション後、吸着体の各異なるスポ ットを、以下の溶離物（選択性閾値調節物）の１つで洗浄する： （１）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0、 （２）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中の0.2M NaCl、 （３）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中の0.4M NaCl、 （４）25mlM酢酸ナトリウム緩衝液、0.125M NaCl、pH4.5、 （５）１% TFA、 （６）水中の10%アセトニトリル、 （７）水中の20%アセトニトリル、 （８）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH7.0中の0.05% Tween20、お よび （９）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中の３M尿素。 各洗浄は、吸着体のスポットを、３回、１μｌの洗浄溶液でピペッティングす る工程を包含する。このプロセスは、洗浄溶液の新鮮なアリコートを用いて反復 する。その後、吸着体のスポットを、１μｌの水で２回洗浄する。シナピン酸の 0.3μｌのアリコート（5mg/ml 50%アセトニトリル：0.5% TFA）を添加し、そし て 風乾させる。アレイを、窒素レーザー（355nm）および60cmフライトチューブを 使用して、質量分析器で分析する。データを、コンピューターによって分析し、 そしてデータオーバーレイ表示について、GRAMS/32c（Galactic Industries Cor porationから利用可能）にエクスポートする。 図５Ａは、通常相のクロマトグラフィー連続吸着体アレイに対するリゾチーム 認識プロファイルの合成マススペクトルを示す。下部のプロファイルは、pH７緩 衝液単独での洗浄後の、酸化ケイ素吸着体に保持されたリゾチームシグナル強度 を示す。選択性閾値調節物中の塩化ナトリウム（0.2〜0.4M）の包含は、リゾチ ームの保持を減少する。これは、酸化ケイ素（pH７で負に荷電される）吸着体と リゾチーム（塩基性タンパク質）との相互作用が、イオン交換機構を含むことを 示す。選択性閾値調節物のpHを、例えば、酢酸ナトリウム緩衝液中でpH4.5に、 または1% TFA中で２未満に低下すると、酸化ケイ素吸着体における負電荷をほと んど完全に排除し、そしてリゾチームは、もはや保持されない。選択性閾値調節 物中に、極性調節化剤（例えば、有機溶媒（例えば、アセトニトリル）、または 界面活性剤（例えば、Tween20）、または尿素を包含することはまた、シリコー ン酸化吸着体とリゾチームとの相互作用を減少する。このことは、他の相互作用 機構が、親水性相互作用を含むことを示す。 Ｂ．疎水性吸着体アレイを使用するリゾチーム認識プロファイル ニワトリ卵白リゾチームを、酸化ケイ素でコートされたステンレススチール基 材上にコートされたポリプロピレン（Ｃ3疎水性）吸着体のクロマトグラフィー 連続吸着体アレイの種々のスポットに添加する。室温で、15分間、加湿チャンバ ーにおけるインキュベーション後、吸着体の各異なるスポットを、以下の溶離物 （選択性閾値調節物）の１つで洗浄する： （１）0.1% TFA、 （２）0.1% TFA中の10%アセトニトリル、 （３）0.1% TFA中の20%アセトニトリル （４）0.1% TFA中の50%アセトニトリル （５）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH7.0、中の0.05% Tween20、 および （６）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH7.0中の３M尿素。 各洗浄は、吸着体のスポットの内外を、３回、１μｌの洗浄溶液でピペッティ ングする工程を包含する。このプロセスは、洗浄溶液の新鮮なアリコートを用い て反復する。その後、吸着体のスポットを、１μｌの水で２回洗浄する。シナピ ン酸の0.3μｌのアリコート（５mg/ml 50%アセトニトリル：0.5%TFA）を添加し 、そして風乾させる。アレイを、窒素レーザー（355nm）および60cmフライトチ ューブを使用して、質量分析器で分析する。データを、コンピューターによって 分析し、そしてデータオーバーレイ表示について、GRAMS/32cにエクスポートす る。 図5Bは、疎水性Ｃ3クロマトグラフィー連続吸着体アレイに対するリゾチーム 認識プロファイルの合成マススペクトルを示す。下部のプロファイルは、0.1% T FA単独での洗浄後の、疎水性Ｃ3吸着体に保持されたリゾチームシグナル強度を 示す。選択性閾値調節物中の極性調節化剤（例えば、アセトニトリル）の包含は 、疎水性Ｃ3吸着体におけるリゾチームの保持を減少する。疎水性Ｃ3吸着体から のリゾチームの溶出についてのアセトニトリル濃度の範囲は、20〜50%の間であ る。選択性閾値調節物中の、界面活性剤（Tween20）、または尿素の包含は、疎 水性Ｃ3吸着体におけるリゾチームの保持を有意には減少しない。 Ｃ．フェニル疎水性吸着体アレイを使用するリゾチーム認識プロファイル ニワトリ卵白リゾチームを、酸化ケイ素でコートされたステンレススチール基 材上にコートされたポリスチレン（フェニル疎水性）吸着体の吸着体アレイの種 々のスポットに添加する。室温で、15分間、加湿チャンバーにおけるインキュベ ーション後、吸着体の1つのスポットを、以下の溶離物（選択性閾値調節物）の １つで洗浄する： （１）0.1% TFA、 （２）0.1% TFA中の10%アセトニトリル、 （３）0.1% TFA中の20%アセトニトリル （４）0.1%TFA中の50%アセトニトリル （５）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH17.0、中の0.05% Tween20 、 および （６）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH7.0中の３M尿素。 各洗浄は、吸着体のスポットの内外を、３回、１μｌの洗浄溶液でピペッティ ングする工程を包含する。このプロセスは、洗浄溶液の新鮮なアリコートを用い て反復する。その後、吸着体のスポットを、１μｌの水で２回洗浄する。シナピ ン酸の0.3μｌのアリコート（５mg/ml 50%アセトニトリル：0.5% TFA）を添加し 、そして風乾させる。アレイを、窒素レーザー（355nm）および60cmフライトチ ューブを使用して、質量分析器で分析する。データを、コンピューターによって 分析し、そしてデータオーバーレイ表示について、GRAMS/32cにエクスポートす る。 図５Ｃは、疎水性フェニルクロマトグラフィー連続吸着体アレイに対するリゾ チーム認識プロファイルの合成マススペクトルを示す。下部のプロファイルは、 0.1%TFA単独での洗浄後の、疎水性フェニル吸着体に保持されたリゾチームシグ ナル強度を示す。選択性閾値調節物中の極性調節化剤（例えば、アセトニトリル ）の包含は、リゾチームの保持を減少する。疎水性Ｃ3吸着体からのリゾチーム の溶出についてのアセトニトリル濃度の範囲は、20〜50%の間であるが、Ｃ3およ びフェニル表面に対して保持されるリゾチームピーク強度を、同じ20%アセトニ トリル洗浄条件下で比較する場合、フェニル吸着体とのリゾチームの相互作用は 、あまり強力ではない。選択性閾値調節物中の、界面活性剤（例えば、Tween20 ）、または尿素の包含はまた、疎水性フェニル吸着体におけるリゾチームの保持 を有意に減少する。 Ｄ．アニオン性吸着体アレイを使用するリゾチーム認識プロファイル ニワトリ卵白リゾチームを、酸化ケイ素でコートされたステンレススチール基 板上にコートされたアニオン基（SO3 -）吸着体（すなわち、カチオン性交換吸着 体）の吸着体アレイの種々のスポットに添加する。室温で、15分間、加湿チャン バーにおけるインキュベーション後、吸着体の各異なるスポットを、以下の溶離 物（選択性閾値調節物）の１つで洗浄する： （１）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0、 （２）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中の0.1M NaCl、 （３）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中の0.2M NaCl、 （４）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中の0.4M NaCl、 （５）25mM酢酸ナトリウム緩衝液、0.125M NaCl、pH4.5、 （６）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH7.0中の0.05% Tween20、お よび （７）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中の３M尿素。 各洗浄は、吸着体のスポットの内外を、３回、１μｌの洗浄溶液でピペッティ ングする工程を包含する。このプロセスを、洗浄溶液の新鮮なアリコートを用い て反復する。その後、吸着体のスポットを、１μｌの水で２回洗浄する。シナピ ン酸の0.3μｌのアリコート（５mg/ml 50%アセトニトリル：0.5% TFA）を添加し 、そして風乾させる。アレイを、窒素レーザー（355nm）および60cmフライトチ ューブを使用して、質量分析器で分析する。データを、コンピューターによって 分析し、そしてデータオーバーレイ表示のために、GRAMS/32cにエクスポートす る。 図5Dは、カチオン交換クロマトグラフィー連続アレイに対するリゾチーム認識 プロファイルの合成マススペクトルを示す。下部のプロファイルは、pH7の緩衝 液単独での洗浄後の、アニオン性吸着体に保持されたリゾチームシグナル強度を 示す。選択性閾値調節物中の漸増濃度の塩化ナトリウム（0.1〜0.4M）の包含は 、リゾチームの保持を減少する。これは、アニオン性吸着体とリゾチーム（塩基 性タンパク質）との相互作用が、イオン交換機構を含むことを示す。0.4M NaCl 濃度が、リゾチームを溶出するために必要とされる。選択性閾値調節物のpHを、 酢酸ナトリウム緩衝液中でpH4.5に低下することは、強力なアニオン性吸着体に おけるリゾチームの保持を影響しない。選択性閾値調節物中に、極性調節化剤（ 例えば、界面活性剤（例えば、Tween20）、または尿素）を包含することｄｅ、 アニオン性吸着体とリゾチームとの相互作用ｇａ減少する。このことは、アニオ ン性吸着体と疎水性リゾチームタンパク質との相互作用が、溶離物の極性によっ て調節されることを示す。 Ｅ．カチオン性吸着体アレイを使用するリゾチーム認識プロファイル ニワトリ卵白リゾチームを、酸化ケイ素でコートされたステンレススチール基 板上にコートされたカチオン性（第４級アミン）吸着体の吸着体アレイの種々の スポットに添加する。室温で、15分間、加湿チャンバーにおけるインキュベーシ ョン後、吸着体の各異なるスポットを、以下の溶離物（選択性閾値調節物）の１ つで洗浄する： （１）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0、 （２）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中の0.1M NaCl、 （３）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中の0.2M NaCl、 （４）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中の0.4M NaCl、 （５）25mM酢酸ナトリウム緩衝液、0.125M NaCl、pH4.5、 （６）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH7.0中の0.05% Tween20、ま たは （７）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中の３M尿素。 各洗浄は、吸着体のスポットを、３回、１μｌの洗浄溶液でピペッティングす る工程を包含する。このプロセスは、洗浄溶液の新鮮なアリコートを用いて反復 する。その後、吸着体のスポットを、１μｌの水で２回洗浄する。シナピン酸の 0.3μｌのアリコート（５mg/ml 50%アセトニトリル：0.5% TFA）を添加し、そし て風乾させる。アレイを、窒素レーザー（355nm）および60cmフライトチューブ を使用して、質量分析器で分析する。データを、コンピューターによって分析し 、そしてデータオーバーレイ表示のために、GRAMS/32cにエクスポートする。 図5Eは、カチオン性（アニオン交換）吸着体クロマトグラフィー連続吸着体ア レイに対するリゾチーム認識プロファイルの合成マススペクトルを示す。カチオ ン性吸着体における塩基性リゾチームタンパク質の保持は非常に弱い。リゾチー ム保持に対する選択性閾値調節物を調節する効果は、極小さい。 Ｆ．固定化された金属イオン吸着体アレイを使用すリゾチーム認識プロファイ ル ニワトリ卵白リゾチームを、酸化ケイ素でコートされたステンレススチール基 材上にコートされた固定化金属（イミノジアセテート-Cu）吸着体の吸着体アレ イの種々のスポットに添加する。室温で、15分間、加湿チャンバーにおけるイン キュベーション後、吸着体の各異なるスポットを、以下の溶離物（選択性閾値調 節物）の１つで洗浄する： （１）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、、0.5M NaCl、pH7.0、 （２）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、、0.5M NaCl、pH7.0中の5mMイミダゾール 、 （３）0.1M酢酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH4.5、 （４）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH7.0中の0.05% Tween20、ま たは、 （５）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH7.0中の３M尿素。 各洗浄は、吸着体のスポットを、３回、１μｌの洗浄溶液でピペッティングす る工程を包含する。このプロセスは、洗浄溶液の新鮮なアリコートを用いて反復 する。その後、吸着体のスポットの内外を、１μｌの水で２回洗浄する。シナピ ン酸の0.3μｌのアリコート（５mg/ml 50%アセトニトリル：0.5%TFA）を添加し 、そして風乾させる。アレイを、窒素レーザー（355nm）および60cmフライトチ ューブを使用して、質量分析器で分析する。データを、コンピューターによって 分析し、そしてデータオーバーレイ表示について、GRAMS/32cにエクスポートす る。 図5Fは、固定化金属クロマトグラフィー連続吸着体アレイに対するリゾチーム 認識プロファイルの合成マススペクトルを示す。下部のプロフールは、pH７緩衝 液単独での洗浄後の固定化銅イオン吸着体に対して保持されるリゾチームシグナ ル強度を示す。選択性閾値調節物中のヒスチジン結合拮抗性アフィニティーリガ ンド（例えば、イミダゾール）の包含は、リゾチームの保持を排除する。これは 、固定化銅イオン吸着体とリゾチーム（これは、配列中に単一のヒスチジン残基 を有する）との相互作用が、配位的な共有結合機構を含むことを示す。選択性閾 値調節物のpHを、酢酸ナトリウム緩衝液中でpH4.5に低下することはまた、固定 化銅吸着体におけるリゾチームの保持を減少する。これは、配位的な共有結合相 互作用を阻害する、リゾチームにおけるヒスチジン残基の水素付加の結果である と考えられる。界面活性剤（すなわち、Tween20）の包含は、相互作用を影響し ない。尿素の包含は、固定化銅吸着体におけるリゾチームの保持を完全に排除す る。 III．ヒト血清中の被分析物の分別能 本発明者らは、多様な吸着体および溶離物を使用して、ヒト血清中の被分析物 を分別した。これらの結果は、被分析物が異なる吸着体によって異なって保持さ れること、ならびに被保持物クロマトグラフィーが、低いおよび高い分子量の両 方で情報を提供し得ることを示す。 Ａ．固定化金属イオン吸着体アレイを使用するヒト血清タンパク質認識プロフ ァイル ヒト血清を、酸化ケイ素でコートされたステンレススチール基材上にコートさ れた固定化金属イオン（トリス(カルボキシメチル)エチレンジアミン-Cu）吸着 体の吸着体アレイの種々のスポットに添加する。室温で、15分間、加湿チャンバ ーにおけるインキュベーション後、吸着体の各異なるスポットを、以下の溶離物 （選択性閾値調節物）の１つで洗浄する： （１）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH7.0 （２）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH7.0中の５mMイミダゾール、 （３）0.1M酢酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH4.5、 （４）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH7.0中の0.05% Tween20、お よび （５）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH7.0中の３M尿素。 各洗浄は、吸着体のスポットを、３回、１μｌの洗浄溶液でピペッティングす る工程を包含する。このプロセスは、洗浄溶液の新鮮なアリコートを用いて反復 する。その後、吸着体のスポットを、１μｌの水で２回洗浄する。シナピン酸の 0.3μｌのアリコート（５mg/ml 50%アセトニトリル：0.5% TFA）を添加し、そし て風乾させる。アレイを、窒素レーザー（355nm）および60cmフライトチューブ を使用して、質量分析器で分析する。データを、コンピューターによって分析し 、そしてデータオーバーレイ表示について、GRAMS/32cにエクスポートする。 図6Aおよび6Bは、固定化金属クロマトグラフィー連続吸着体アレイに対する血 清タンパク質認識プロファイルの、低いおよび高い分子量での合成マススペクト ルを示す。下部のプロファイルは、pH７緩衝液単独での洗浄後の固定化銅吸着体 に保持される血清タンパク質を示す。選択性閾値調節物中のヒスチジン結合拮抗 性アフィニティーリガンド（例えば、イミダゾール）、または界面活性剤（例え ば、Tween20）、もしくは尿素の包含、または選択性閾値調節物のpHの4.5への低 下は、同じ吸着体における複雑なタンパク質混合物の異なる成分の保持を、異な って増強または減少する。 Ｂ．複数の異なる吸着体を使用する、ヒト血清タンパク質認識プロファイル ヒト血清を、以下の異なる吸着体の吸着体アレイの種々のスポットに添加する ： （１）Ｃ3疎水性、 （２）フェニル疎水性 （３）アニオン交換 （４）カチオン交換、および （５）固定化金属（トリス(カルボキシメチル)エチレンジアミン-Cu）。 各吸着体を、酸化ケイ素でコートしたステンレススチール基材上にコートする 。室温で、15分間、加湿チャンバーにおけるインキュベーション後、吸着体の各 スポットを、選択性閾値調節物として20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl 、pH7.0中の0.05% Tween20で洗浄する。 各洗浄は、吸着体のスポットを、３回、１μｌの洗浄溶液でピペッティングす る工程を包含する。このプロセスは、洗浄溶液の新鮮なアリコートを用いて反復 する。その後、吸着体のスポットを、１μｌの水で２回洗浄する。シナピン酸の 0.3μｌのアリコート（５mg/ml 50％アセトニトリル：0.5% TFA）を添加し、そ して風乾させる。アレイを、窒素レーザー（355nm）および60cmフライトチュー ブを使用して、質量分析器で分析する。データを、コンピューターによって分析 し、そしてデータオーバーレイ表示について、GRAMS/32cにエクスポートする。 図７Ａおよび７Ｂは、クロマトグラフィー連続吸着体アレイの種々の吸着体に 対する血清タンパク質認識プロファイルの合成マススペクトルを示す。複数の異 なる吸着体（異なる結合特性を有する）に対する単一の選択性閾値調節物の使用 は、異なる吸着体における複雑なタンパク質混合物の異なる成分の保持を、異な って増強または減少する。 IV.早生児（preterm infant）尿中の被分析物の分離 本発明者らは、様々な吸着体および溶離物を使用して、早生児尿中の被分析物 を分離した。これらの結果は、吸着体が被分析物を示差的に保持するので、種々 の吸着体の使用が、大きな分離能力を提供することを示す。これらの結果はまた 、精製スキームを開発するために有用である、特異的な被分析物を優先的に保持 する吸着体を同定する能力を示す。 Ａ．種々の吸着体および同じ溶離物（水）を使用する、早生児尿中の被分析物 の分離 早生児尿（２μｌ）を、以下の異なる吸着体でコートされた、炭素処理された PEEKポリマー基質の種々のスポットに添加する： （１）Ｃ8疎水性（Octyl Sepharose、Sigmaから入手可能）、 （２）フェニル疎水性（Phenyl Sepharose、Sigmaから入手可能）、 （３）アニオン交換（Q Sepharose、Sigmaから入手可能）、 （４）カチオン交換（S Sepharose、Sigmaから入手可能） （５）固定化金属（IDA-Cu、Chelating Sepharose、Pharmaciaから入手可能）、 および （６）固定化金属（トリス(カルボキシメチル)エチレンジアミン-Cu Sepharose ）。 室温での15分間の加湿チャンバーにおけるインキュベーションの後、吸着体の 各スポットを、選択性閾値調節物として水で洗浄する。各洗浄は、吸着体のスポ ットに、３回、１μｌの洗浄溶液をピペットで出し入れする工程を包含する。こ のプロセスを、洗浄溶液の新鮮なアリコートを用いて反復する。シナピン酸の0. 3μｌのアリコート（５mg/ml 50%アセトニトリル：0.5% TFA）を添加し、そして 風乾させる。アレイを、窒素レーザー（355nm）および150cmフライトチューブを 使用する、Hewlett Packard（Model 2030）からのレーザー脱着／イオン化飛行 時間型質量分析器で分析する。データを、HP MALDI TOFソフトウェアによって分 析し、そしてデータオーバーレイ表示について、GRAMS/32cにエクスポートする 。 図８Ａおよび８Ｂは、クロマトグラフィーシリーズの種々の吸着体に対する早 生児尿タンパク質認識プロファイルの、低いまたは高い分子量での混成マススペ クトルを示す。種々の吸着体（それぞれ異なる結合特性を有する）に対する単一 の選択性閾値調節物（すなわち、水）の使用は、異なる吸着体におけるような複 合タンパク質混合物の異なる成分の保持を、示差的に増強または減少する。 Ｂ．基質に間接的に結合される疎水性フェニル吸着体、および３つの異なる溶 離物を使用する、早生児尿中の被分析物の分離 早生児尿（２μｌ）を、フェニル疎水性吸着体（Phenyl Sepharose、Sigmaか ら入手可能）でコートされた、炭素処理されたPEEKポリマー基質の種々のスポッ トに添加する。室温で、15分間の、加湿チャンバーにおけるインキュベーション 後、吸着体の各スポットを、以下の溶離物（選択性閾値調節物）の１つで洗浄す る： （１）水、 （２）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH7.0中の２M尿素、および （３）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH7.0中の0.1％ Tween20。 各洗浄は、吸着体のスポットに、３回、１μｌの洗浄溶液をピペットで出し入 れする工程を包含する。このプロセスを、洗浄溶液の新鮮なアリコートを用いて 反復する。その後、吸着体のスポットを、１μｌの水で２回洗浄する。シナピン 酸溶液の0.3μｌのアリコート（５mg/ml 50%アセトニトリル：0.5%TFA）を添加 し、そして風乾させる。アレイを、窒素レーザー（355nm）および150cmフライト チューブを使用する、Hewlett Packard（Model 2030）からのレーザー脱着／イ オン化飛行時間型質量分析器で分析する。データを、HP MALDI TOFソフトウェア によって分析し、そしてデータオーバーレイ表示について、GRAMS/32cにエクス ポートする。 図９は、クロマトグラフィーシリーズの疎水性フェニル吸着体に対する早生児 尿タンパク質認識プロファイルの混成マススペクトルを示す。単一の吸着体に対 する、異なる溶出特性を有する種々の溶離物の適用は、複合タンパク質混合物の 異なる成分の保持を、示差的に増強または減少する。成分の１つ（*によって記 される）は、PBS中の01％ Tween20が、溶離物として使用される場合、疎水性フ ェニル吸着剤に選択的に保持される。 Ｖ．２つの異なる細胞生物からの培養培地中のタンパク質の同定 この実施例は、細胞中で示差的に発現されるタンパク質の、吸着体アレイ：ク ロマトグラフィーシリーズでの同定を説明する。 ２つの異なる乳ガン細胞株を、一定組成の培養培地において、同じ期間、培養 する。濾過ユニットでの濃縮後、各培養培地の１μｌのアリコートを、基質とし ての、酸化ケイ素でコートされたステンレススチールに対してコートされる固定 化金属（トリス(カルボキシメチル)エチレンジアミン-Cu）吸着体の吸着体アレ イ（Ciphergen Biosystems，Inc．Palo Alto，CA）の種々のスポットに添加する 。室温で、15分間の、加湿チャンバーにおけるインキュベーションの後、吸着体 のスポットを、以下の溶離物（選択性閾値調節物）のいずれか１つで洗浄する： （１）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH7.0、 （２）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、05M NaCl、pH7.0中の20mMイミダゾール、 （３）0.1M酢酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH4.5、 （４）20mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.15M NaCl、pH7.0中の0.1％ Tween20、 （５）10mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH7.0中の３M尿素、または （６）１% TFA。 各洗浄は、吸着体のスポットに、３回、１μｌの洗浄溶液をピペットで出し入 れする工程を包含する。このプロセスを、洗浄溶液の新鮮なアリコートを用いて 反復する。その後、吸着体のスポットを、１μｌの水で２回洗浄する。シナピン 酸の0.3μｌのアリコート（５mg/ml 50%アセトニトリル：0.5%トリフルオロ酢酸 ）を添加し、そして風乾させる。アレイを、窒素レーザー（355nm）および60cm フライトチューブを使用する、レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析器で 分析する。データを、コンピューターによって分析し、そしてデータオーバーレ イ表示について、GRAMS/32c（Galactic Industries Corporation）にエクスポー トする。 図10Ａは、固定化金属（Cu）のクロマトグラフィーシリーズ吸着体アレイに対 する細胞株１の細胞分泌タンパク質認識プロファイルの混成マススペクトルを示 す。単一の吸着体に対する、異なる選択性閾値の種々の溶離物の適用は、細胞培 養培地のような複合タンパク質混合物の異なる成分の保持を、示差的に増強また は減少する。 図10Ｂは、固定化金属（Cu）のクロマトグラフィーシリーズ吸着体アレイに対 する両方の細胞株の細胞分泌タンパク質認識プロファイルの混成マススペクトル を示す。同じ溶離物、10mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH7.0中の0.1% Tween20＋３M尿素を使用して、未保持の物質を洗浄して取り除く。7532Daを示 すピークは、細胞株２において発現されない細胞株１の分泌タンパク質において 、主要な保持されたピークである。 図10Ｃは、固定化金属（Ni）のクロマトグラフィーシリーズ吸着体アレイに対 する細胞株１の細胞分泌タンパク質認識プロファイルの混成マススペクトルを示 す。同じ溶離物、10mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH7.0中の0.1% Twe en20＋３M尿素を使用するが、異なる表面相互作用ポテンシャルの吸着体（すな わち、固定化Ni金属対固定化Cu金属）を用いて、7532Daピークは、全ての細胞株 １の分泌タンパク質の間で唯一保持されるタンパク質である。挿入図は、拡張さ れた尺度における、同じマススペクトルを示す。3766Daでのより小さなピークは 、同じタンパク質の二重に荷電された種である。 図10Dは、インサイチュトリプトファン消化の前（下方のプロファイル）およ び後（最上部のプロファイル）の、固定化金属（Ni）のクロマトグラフィーシリ ーズ吸着体アレイに対する細胞株１の細胞分泌タンパク質認識プロファイルの混 成マススペクトルを示す。純粋なタンパク質について作製されたペプチドマップ は、そのタンパク質のフィンガープリントであり、そして同定のために使用され 得る。 VI．2Dゲル電気泳動と被保持物クロマトグラフィーとの比較 被保持物クロマトグラフィーの１つの利点は、多様な次元において被分析物を 迅速に分離する能力であり、多様な物理化学特性についての高い情報量を得るこ とである。対照的に、2Dゲル電気泳動は、２次元のみにおける分離を提供する。 図11は、クロマトグラフィーシリーズのフェニル疎水性吸着体に対する早生児 尿タンパク質認識プロファイルを示す。種々の溶離物および吸着体の適用は、多 次元の情報を与える。異なる選択条件の使用は、複合タンパク質混合物（例えば 、早生児尿）の種々の成分の保持を、示差的に増強または減少し、被分析物の詳 細な分離を生じる。 対照的に、図12は、pIおよび分子量に従う、早生児尿中のタンパク質の２次元 分別を示す。被保持物クロマトグラフィーにおいて吸着体として使用される６次 元に比較して、ゲルは、2次元についてのみの情報を提供する。スポットはまた 、質量分析法によって分離されず、そして非常に高いおよび非常に低い分子量で の分離は制限される。 VII．試料からの被分析物の連続的な抽出 被分析物は、試料を選択条件に連続的に曝露し、次いで未保持の試料を回収す ることによって、試料から連続的に抽出され得る。 Hemophilusノックアウト変異体溶解物を、10%グリセロール50mM EDTA中に調製 した。遠心分離後、上清を、25mM HEPES、pH7.4中の0.01% Triton X100に、１： ３に希釈した。希釈した試料の２μｌのアリコートを、吸着体アレイのアニオン 性部位のスポットに添加した。室温での30分間のインキュベーション後、アニオ ン性部位における残余の試料を、吸着体アレイの正常相部位のスポットに移した 。アニオン性部位のスポットを、２μｌの0.01%Triton X100 25mM HEPESで、２ 回、洗浄した。各洗浄は、10回、スポットに洗浄溶液をピペットで出し入れする ことによって達成した。洗浄液を、正常相スポットに最初に添加した試料と合わ せた。 室温で30分間のインキュベーション後、正常相部位における残余の試料を、吸 着体アレイNi(II)部位のスポットに移した。正常相部位のスポットを、２μｌの リン酸緩衝化生理食塩水で、２回、洗浄した。各洗浄を、10回、スポットに洗浄 溶液をピペットで出し入れすることによって達成した。洗浄液を、Ni(II)スポッ トに最初に添加した試料と合わせた。 試料を、Ni(II)スポット上でほとんど乾燥するまで濃縮したのち、未結合の被 分析物を、２μｌの、リン酸緩衝化生理食塩水中の100mMイミダゾールで、２回 、 洗浄することによって回収した。各洗浄を、10回、スポットに洗浄溶液をピペッ トで出し入れすることによって達成した。洗浄液を、吸着体アレイ脂肪族疎水性 部位のスポットに移した。 試料を、疎水性部位においてでほとんど乾燥するまで濃縮させ、未結合の被分 析物を、２μｌの、0.1%トリフルオロ酢酸中の５%アセトニトリルで、２回、洗 浄することによって除去した。各洗浄を、10回、スポットに洗浄溶液をピペット で出し入れすることによって達成した。 アニオン性、正常相、Ni(II)、および疎水性部位の各スポットを、２μｌの水 で洗浄して、残余の緩衝液を除去した。50%アセトニトリル0.5%トリフルオロ酢 酸中のシナピン酸溶液の0.3μｌのアリコートを、各スポットに添加した。各部 位に保持された被分析物を、レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析器で分 析した。 図19Ａ〜19Ｄは、吸着体アレイにおけるHemophilus溶解物の保持マップを示す 。質量範囲3000〜25000Daにおける複数のピークを、吸着体において観察した。 各吸着体が、試料中のそれぞれの被分析物について、異なる保持を示すことに注 意のこと。 VIII．被分析物の漸進的分離 被分析物を分離する選択条件に対する特徴に、新規な結合特性または溶出特性 を付加することによって、被分析物の改善された分離を提供する選択条件を開発 し得る。この例において、試料を、Cu(II)吸着体に結合し、そして１つの第１の 溶離剤および２つの第２の溶離物に曝露した。第２の溶離物は、別の溶出条件の 付加によって、第１の溶離物とは異なる。各付加された条件は、被分析物の分離 を改善した。 10%グリセロール中に調製された、Hemophilus野生型定常状態の溶解物を、20m Mリン酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム、pH7.0中に１：１希釈した。遠心分離 後、上清の150μｌのアリコートを、バイオプロセッサーにおいて、吸着体アレ イCu(II)部位の各スポットとともに、インキュベートした。30分間低温で混合し た後、試料を取り出した。各スポットを、異なる溶解物で洗浄した。最初のスポ ッ トを、150μｌの20mMリン酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム、pH7.0で洗浄した 。第２のスポットを、20mMリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、pH7.0に加えた150μ ｌの0.05% Triton X100の150μｌで洗浄した。第３のスポットを、20mMリン酸ナ トリウム、0.15M NaCl、pH7.0に加えた150μｌの100mMイミダゾールで洗浄した 。各洗浄を、混合しながら、５分間、スポットとともに洗浄溶液をインキュベー トすることによって達成した。洗浄を、２回、反復した。各スポットを水で洗浄 して、界面活性剤および緩衝液を除去した。 吸着体アレイを、バイオプロセッサーから除去した。50%アセトニトリル0.5% トリフルオロ酢酸中のシナピン酸溶液の0.3μｌのアリコートを、各スポットに 添加した。各スポットに保持された被分析物を、レーザー脱着／イオン化飛行時 間型質量分析器で分析した。 図20Ａ〜20Ｃは、上記の３つの溶出条件下での洗浄後の、吸着体アレイCu(II) 部位におけるHemophilus溶解物の保持マップを示す。質量範囲2000〜18000Daに おける複数のピークが観察された。「*」で記されるタンパク質は、図20Aの保持 マップにおけるごく少数の成分である。選択条件が、界面活性剤であるTriton X 100の同じ緩衝液への添加によって改変された場合（図20Ｂ）、同じタンパク質 「*」は、他の被分析物よりも良好に保持され、そして良好に分離された。選択 条件が、アフィニティー排除物質であるイミダゾールの同じ緩衝液への添加によ って改変された場合（図20Ｃ）、タンパク質「*」は、被保持物マップにおいて 他の被分析物から高度に分離された。 被分析物についての改善された分離を伴う選択条件の前進的な同定のこのスト ラテジーは、全Hemophilus溶解物からこのタンパク質を調製的に精製するための 方法を開発するために採用され得る。 IX．被分析物の示差的な発現：マーカータンパク質の発見。 Ａ．ヒト血清 正常なヒト血清または疾患のヒト血清の0.5μｌのアリコートを、等容量の20m Mリン酸緩衝液、0.5M NaCl、pH7.0で希釈した。それぞれ、吸着体アレイCu(II) 部位における異なるスポットに適用した。４℃で１時間のインキュベーション後 、 各スポットを２μｌの20mMリン酸ナトリウム、0.5M NaCl、pH7.0で、２回洗浄し た。各洗浄は、10回、スポットに洗浄溶液をピペットで出し入れすることによっ て達成した。各スポットを最終的に２μｌの水で洗浄して、残余の緩衝液を除去 した。50%アセトニトリル0.5%トリフルオロ酢酸中のシナピン酸溶液の0.3μＬの アリコートを、各スポットに添加した。各スポットに保持された被分析物を、レ ーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析器で分析した。 図21Dにおいて、「*」で記されるタンパク質は、正常な血清におけるよりも疾患 の血清において有意に多い量で存在する。結果は、臨床的診断に使用され得る疾 患マーカーの発見のための方法を説明する。 Ｂ．マウス尿 正常なマウス尿、疾患のマウス尿、または薬物処置したマウス尿の１μｌのア リコートを、吸着体アレイCu(II)部位の異なるスポットに適用した。室温で10分 間のインキュベーション後、各スポットを、20mMリン酸ナトリウム、0.15M NaCl 、pH7.0中の２μｌの100mMイミダゾールで、２回洗浄した。各洗浄は、10回、ス ポットに洗浄溶液をピペットで出し入れすることによって達成した。各スポット を最終的に２μｌの水で洗浄して、残余の緩衝液を除去した。50%アセトニトリ ル0.5%トリフルオロ酢酸中のシナピン酸溶液の0.3μｌのアリコートを、各スポ ットに添加した。各スポットに保持された被分析物を、レーザー脱着／イオン化 飛行時間型質量分析器で分析した。 正常マウス尿（コントロール）、疾患のマウス尿、および薬物処置したマウス 尿の被保持物マップを、図１に示す。１つの被分析物は、疾患のマウス尿におい て非常に高い量で存在することが見出され（真ん中のパネル）、同じ被分析物は 、正常なマウス尿においては見出されず（上部のパネル）、そして非常に減少さ れた量で、薬物処置したマウス尿において見出された（下部のパネル）。この被 分析物は、潜在的な疾患マーカーとして使用され得る。定量的な診断アッセイの 実行可能性を説明するために、保持されたマーカータンパク質のピーク下の面積 を算定し、そして表において示す。明らかな定量的差異が、疾患マウス尿と薬物 処理されたマウス尿との間に観察される。実験の変動性について補正するために 、 内部標準被分析物を使用した。各尿試料についての正規化された疾患マーカーの ピーク面積（すなわち、内部標準のピーク面積で割ったマーカーのピーク面積） を、下部のパネルに示す。薬物処置後に、疾患尿マーカーの少なくとも10倍の減 少が存在する。 Ｃ．ヒト尿 正常なヒトおよびガン患者からの尿を、リン酸緩衝化生理食塩水中の0.01% Tr iton X100中に1:2に希釈した。正常なヒト尿または疾患のヒト尿の1.5μｌのア リコートを、0.5μｌのイソプロパノール／アセトニトリル（１：２）0.1％トリ フルオロ酢酸で予め湿潤した吸着体アレイ脂肪族疎水性部位の異なるスポットに 適用した。４℃で30分間のインキュベーション後、各スポットを、２μｌの、10 mM Tris HCl、0.05M NaCl、pH7.5中の50%エチレングリコールで、２回洗浄した 。各洗浄は、10回、スポットに洗浄溶液をピペットで出し入れすることによって 達成した。各スポットを最終的に２μｌの水で洗浄して、残余のエチレングリコ ールおよび緩衝液を除去した。50%アセトニトリル0.5%トリフルオロ酢酸中のシ ナピン酸溶液の0.3μｌのアリコートを、各スポットに添加した。各スポットに 保持された被分析物を、レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析器で分析し た。 ４人のガン患者および正常なヒトの尿の被保持物マップを、図23Ａに示す。複 数のタンパク質ピークが、Tris/NaCl緩衝液中の50%エチレングリコールでの洗浄 後に、吸着体アレイ疎水性部位において保持された。可能な疾患マーカーを同定 するために、個々の患者の尿と正常な尿との間の差異マップをプロットした。ベ ースラインを超える差異プロットにおける各棒は、患者の尿により高い量で存在 する被分析物を示す。（図23Ｂ〜23Ｄ。）患者の差異マップのパターンにおける 変化は、集団における個々の変動を反映する。しかし、約5000Da（*で記す）の １つの被分析物、および約75000Da（*で示す）の被分析物の塊は、全ての患者に おいてより高い量で一貫して存在することが見出され、それゆえ、これらは、潜 在的な疾患マーカーとして同定され得る。 Ｘ．ファージ提示ライブラリーからのファージの捕獲 タンパク質チップの表面に吸着されるウイルスは、脱着分光測定法によって検 出され得る。吸着体として使用される、ウイルスコートタンパク質に対する抗体 は、ウイルスを捕獲し得る。吸着体として使用される標的タンパク質は、標的に 対して１本鎖抗体を示すファージを捕獲し枝る。 Ａ．吸着体基質によるファージ提示抗体の検出感受性 増殖培地中のM13ファージ（1012粒子/ml）を、25mM HEPES、pH7.4中の0.01％T riton X100に連続希釈した。それぞれの希釈したファージ懸濁液の0.25μｌのア リコートを、吸着体アレイ脂肪族疎水性部位のスポットに添加した。50%アセト ニトリル、0.5%トリフルオロ酢酸中のCHCAの0.3μｌのアリコートを添加した。 試料を、レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析器によって分析した。 M13ファージ遺伝子VIIIタンパク質を、アレイにおいて高い感度で検出した。 図24A〜24E。検出可能なシグナル（シグナル／ノイズ＞２）が、ファージ懸濁液 を、10,000,000倍に希釈した場合に、得られた。 Ｂ．吸着体アレイによるM13ファージの同定 ウサギ抗M13抗体（Strategene）を、Protein A Hyper D（BioSepra）上に固定 化し、そしてリン酸緩衝化生理食塩水、pH７で、広範囲に洗浄した。増殖培地中 のM13ファージ（1012粒子/ml）の１〜10μｌ懸濁液のアリコートを、４℃にて一 晩、固定化された抗M13抗体の１μｌのアリコートとともにインキュベートした 。リン酸緩衝化生理食塩水、pH７中の0.05% Tween20で洗浄し、次いで水で洗浄 して界面活性剤および緩衝液を除去した後、捕獲されたファージのアリコートを 、シナピン酸の存在下、レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析器で分析し た。 抗M13抗体コントロールは、抗体シグナル（一重（singly）におよび二重（dou bly）に荷電された）のみを示す。図25Ａ。M13ファージが、抗体によって捕獲さ れる場合、ファージからの最も容易に同定され得るタンパク質ピークは、遺伝子 VIIIタンパク質、および１本鎖抗体との遺伝子IIIタンパク質の融合物である。 図25Ｂ。M13ファージ遺伝子VIIIタンパク質は、この方法によって非常に高い効 率で検出されるので、この方法は、ファージ捕獲の感度の高いモニターとして使 用され得る。 Ｃ．１本鎖抗体を示すM13ファージの特異的な捕獲 HIV-1 Tatタンパク質（McKesson BioScrvices）を、予め活性化した基質に結 合させた。エタノールアミンでのブロッキング後、アレイを、リン酸緩衝化生理 食塩水、pH７中の0.005% Tween20、次いでリン酸緩衝化生理食塩水、pH７中の0. 1% BSAで洗浄した。Tatタンパク質に対して１本鎖抗体を示すM13ファージの連続 希釈を、４℃で一晩、Tatタンパク質吸着体アレイとともにインキュベートした 。Tatタンパク質に対して１本鎖抗体を示さないM13ファージの連続希釈のネガテ ィブコントロールもまた、同じ方法で、Tatタンパク質吸着体アレイとともにイ ンキュベートした。アレイを、リン酸緩衝化生理食塩水中の0.05% Tween20で洗 浄し、次いで、リン酸緩衝化生理食塩水、pH7.0中の1M尿素で洗浄し、そして最 後に水で洗浄して緩衝液および尿素を除去した。50%アセトニトリル0.5%トリフ ルオロ酢酸中のCHCAの0.3μｌのアリコートを、添加した。保持されたファージ を、レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析器で分析する。 Tatタンパク質に対して１本鎖抗体を示すM13ファージの特異的な結合を、濃度 依存性の様式において観察した（実線）。図26Ａ〜26Ｄ。非特異的なM13ファー ジによる非特異的な結合は、吸着体アレイにおいて最小であった（破線）。これ らの結果は、標的被分析物を特異的に認識する１本鎖抗体をコードする遺伝子を 含むファージを検出する、非常に感度が高い方法を説明する。 XI．化合物がレセプターとリガンドとの間の結合を阻害するか否かを決定するた めのスクリーニング 本発明の方法は、試験因子が、レセプターに対するリガンドの結合を調節する か否かを決定するために使用され得る。この例において、本発明者らは、被保持 物クロマトグラフィーが、TGF-βと、遊離TGF-βレセプターによる吸着体として 使用される結合したTGF-βレセプターとの間の結合の阻害を検出し得ることを示 す。 TGF-β組換えレセプター−Fcの融合タンパク質（R&D、Minnesota）を、プロテ インＧ吸着体アレイ上に特異的に結合した。TGF-β（R&D、Minnesota）を、細胞 馴化培地（2.5×濃縮化）に連続希釈し、そして４℃で一晩、レセプター−Fcプ ロテインＧ吸着体アレイとともにインキュベートした。細胞馴化培地中の連続希 釈したTGF-βの別のセットを、調節化剤の存在下、レセプター−FcプロテインＧ 吸着体アレイとともにインキュベートした。この説明において、調節化剤は、遊 離のTGF-βレセプターであった。同じ条件下でのインキュベーション後、チップ を、PBS中の0.05％ Triton X100、次いでPBS中の３M尿素で洗浄した。シナピン 酸の0.3μｌのアリコートを、各スポットに添加し、そしてレーザー脱着／イオ ン化飛行時間型質量分析法によって分析した。 図27Ａは、レセプター−FcプロテインＧ吸着体アレイへの、１μｇ/ml TGF-β の特異的な結合を示す（実線）。細胞馴化培地中のタンパク質は、結合されるこ とが、ほとんどまたは全く見出されなかった。図27Ｂは、レセプター−Fcプロテ インＧ吸着体アレイへの、100ng/mlのTGF-βの特異的な結合を示す（実線）。TG F-βおよびレセプター−FcプロテインＧ吸着体アレイのインキュベーションが、 調節化剤（遊離のTGF-βレセプター）の存在下で行われた場合、100ng/mlのTGF- βが存在する場合、結合は完全に排除され（図27Ａ、破線）、そして１μｇ/ml のTGF-βが存在した場合、僅かな結合のみであった（図27Ｂ、破線）。この説明 において、調節化剤（同じレセプター）は、リガンドに対して高い特異的な結合 親和性を有し、従って標的被分析物結合事象の非常に効果的な拮抗を提供する。 他の場合において、調節化剤の存在下および不在下で吸着体に結合される標的被 分析物の比率は、調節化剤の抗力の指標を与える。 XII．被保持物クロマトグラフィーの分離力 この実施例は、被保持物クロマトグラフィーが、異なる選択条件下での試料の その平行な（Parallel）工程で、試料中のタンパク質を分離する能力を実証する 。 Hemophilusインフルエンザ溶解物を、10%のグリセロール中に調製した。遠心 分離後、上清を、25mM HEPES、pH7.4中の0.01%Triton X100中で、１：３に希釈 した。希釈した試料の２μｌのアリコートを、吸着体アレイのカチオン性部位の スポットに添加した。室温で30分間のインキュベーション後、スポットを25mM H EPES、pH7.4で洗浄した。希釈物試料の２μｌの第２のアリコートを、吸着体ア レイ脂肪族疎水性部位のスポットに添加した。室温で30分間のインキュベーショ ン後、スポットを水で洗浄した。希釈した試料の２μｌの第３のアリコートを、 吸着体アレイCu(II)部位のスポットに添加した。室温で30分間のインキュベーシ ョン後、リン酸緩衝化生理食塩水、pH7.4中の0.05% Triton X100で、スポットを 洗浄した。50%アセトニトリル0.5%トリフルオロ酢酸中のシナピン酸溶液の0.3μ ｌのアリコートを、各スポットに添加した。各部位に保持された被分析物を、レ ーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析器で分析した。 結果を、図28〜31に示す。全ての保持された被分析物の計数は、約550であっ た。結果は、平行する複数の被分析物の分別および検出を包含する、組合せ的な 分別についての方法を説明する。 XIII．多量体構造の連続的なアセンブリ この実施例は、一次吸着体に対する二次吸着体を構築する方法を例示する。次 いで、二次吸着体は、標的被分析物についての特異的な吸着体として作用する。 20mM Tris、10mM塩化ナトリウム、0.4% NP40、pH7.2中で希釈されたGST融合レ セプターの0.5μｌのアリコートを、吸着体アレイの通常の部位のスポットに添 加した。溶液を、ほとんど乾燥するまでスポット上で濃縮させた。スポットを、 ２μｌの10mM Tris、50mM塩化ナトリウム、pH7.2で、３回、洗浄した。各洗浄は 、吸着体のスポットに、洗浄溶液を５回、ピペットで出し入れすることによって 達成された。このスポットを、最終的に２μｌの水で２回洗浄して、残余の緩衝 液を除去した。50%アセトニトリル、0.5%トリフルオロ酢酸中のシナピン酸溶液 の0.3μｌのアリコートをスポットに添加した。保持されたGST融合レセプターを 、レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析器で分析した。（図32。） 20mM Tris、100mM塩化ナトリウム、0.4% NP40、pH7.2中のGST融合レセプター の0.5μｌのアリコートを、吸着体アレイの通常の部位のスポットに添加した。G STタンパク質のみを含有する試料（レセプターを含有しない）を、ネガティブコ ントロールとして、別のスポットに適用した。溶液を、ほとんど乾燥するまでス ポット上で濃縮させた。10mM Tris、50mM塩化ナトリウム、pH7.2の0.5μｌを、 各スポットに添加した。溶液を、室温にて10秒間の放置後、ピペットを使用して 取り出した。 96個の他のリガンドのライブラリーにおける１つの特異的なリガンドを含有す る溶液の１μｌのアリコートを、各スポットに即座に添加した。吸着体アレイを 、室温で１時間、加湿チャンバーにおいてインキュベートした。各スポットを２ μｌの、水中の30%イソプロパノール：アセトニトリル（１：２）で、２回洗浄 した。各洗浄は、10回、スポットに洗浄溶液をピペットで出し入れすることによ って達成した。50%アセトニトリル、0.5%トリフルオロ酢酸中のα-シアノ-４-ヒ ドロキシ桂皮酸溶液の0.3μｌのアリコートを、スポットに添加した。レセプタ ー上に捕獲されたリガンドを、レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析器で 分析した。 図33Ａは、このリガンドを吸着体アレイの通常部位に捕獲するGST融合レセプ ターへの、96個の他のリガンドのライブラリー以外の特異的なリガンドの結合を 示す。図33Ｂは、実験のネガティブコントロールとして作用する同じアレイに捕 獲されたGSTタンパク質単独（レセプターを含有しない）へのリガンドの結合は 存在しないことを示す。 本発明は、被保持物クロマトグラフィーについての新規な物質および方法を提 供する。特定の例が提供されたが、上述の記載は、例示的なものであって、限定 的なものではない。本発明の多くの変形が、本明細書を検討する際に、当業者に 明らかになる。それゆえ、本発明の範囲は、上述の記載を参照して決定されるべ きでないが、その代わりに添付の請求の範囲に沿って、それらの十分な範囲の等 価物とともに参照することによって決定されるべきである。 本出願において引用される全ての刊行物および特許書類は、各個々の刊行物ま たは特許書類が、個々に記載されるのと同じ程度に、全ての目的のためにそれら の全体が参考として援用される。この書類における種々の参考文献のこれらの引 用により、出願人らは、任意の特定の参考文献が出願人らの発明に対する「先行 技術」であることを認めない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．試料中の少なくとも１つの被分析物を検出するための基材を調製する方法で あって、 a)少なくとも２つの異なる選択条件に該試料を曝露する工程であって、各選択 条件は、該吸着体による該被分析物の保持を可能にするために、該吸着体と溶離 物との組み合わせによって規定される、工程； b)該被分析物を保持される少なくとも１つの選択条件下で、脱離スペクトロメ トリーによって同定する工程；および c)同定された選択条件の少なくとも１つの吸着体を含む基材を調製する工程を 包含する、方法。 ２．前記同定する工程が、複数の被分析物を保持される少なくとも１つの選択条 件下で同定する工程を包含する、請求項１に記載の方法。 ３．前記調製する工程が、複合吸着体として溶離条件下で前記被分析物を保持す る複数の吸着体を含む基材を調製する工程を包含する、請求項１に記載の方法。 ４．試料中の被分析物についての改良された分離を有する選択条件を進行的に同 定する方法であって、 (a)以下の工程によって、試料中の被分析物を保持する選択条件を同定する工 程： (i)選択条件のセットに試料を曝露する工程であって、各選択条件が、少な くとも１つの結合特性および少なくとも１つの溶離特性によって定義される、工 程； (ii)脱離スペクトロメトリーによって各選択条件下で保持される被分析物を 検出する工程；および (iii)山該被分析物を保持する選択条件を同定する工程；ならびに (b)以下の工程によって、該被分析物についての改良された分離を有する選択 条件を同定する工程： (i)該同定された選択条件から少なくとも１つの結合特性または溶離特性を 選択する工程、および選択特性定常セットにそれを添加する工程； (ii)選択条件の改変されたセットに該試料を曝露する工程であって、該異変 されたセットにおける各選択条件が、(1)該定常セットにおける該選択特性、お よび(2)該定常セットにはない結合特性または溶離特性を含む、工程；および (iii)先の同定された選択条件と比較して改良された分離で該被分析物を保 持する脱離スペクトロメトリーによって、改変されたセットから選択条件を同定 する工程、 を包含する、方法。 ５．工程(b)を少なくとも１回反復する工程をさらに包含する、請求項４に記載 の方法。 ６．選択条件が、前記試料から前記標的被分析物のみを保持することが同定され るまで、工程(b)を反復する工程を包含する、請求項５に記載の方法。 ７．請求項４に記載の方法によって被分析物を分離するために同定された選択条 件からの吸着体を含む、脱離スペクトロメトリーのための基材。 ８．前記吸着体と組み合わせて前記溶離物を使用することにおいて、前記選択条 件からの溶離物または指示をさらに含むキットの形態での、請求項７に記載の基 材。 ９．被分析物が、第１および第２の生物学的試料に示差的に存在するかどうかを 決定する方法であって、 a)少なくとも１つの選択条件についての該第１の試料中の該被分析物について 、第１の保持マップを決定する工程； b)同じ選択条件についての該第２の試料中の該被分析物について、第２の保持 マップを決定する工程；および c)該第１と該第２の保持マップとの間の差を検出する工程； を包含し、 これによって、該保持マップにおける差は、該被分析物が第１および第２の試 料に示差的に存在する決定を提供する、方法。 １０．請求項９に記載の方法であって、前記第１の生物学的試料が、健常被験体 に由来し、そして前記第２の生物学的試料が、病理学的状熊に罹患している被験 体に由来する、方法。 １１．前記生物学的試料は、第１および第２の細胞抽出物を含む、請求項９に記 載の方法。 １２．前記保持マップが、複数の選択条件を含む、請求項９に記載の方法。 １３．検出工程の前に、前記被分析物を、前記被分析物の分子量よりも小さい分 子量の少なくとも１つのフラグメントに変換する工程を包含する、請求項９に記 載の方法。 １４．差を検出する工程が、プログラム可能なデジタルコンピュータで行われる 、請求項９に記載の方法。 １５．物質が生物学的試料中でタンパク質の発現を変更するかどうかを決定する ための、請求項９に記載の方法であって、第２の生物学的試料にではなく第１の 生物学的試料に物質を投与する工程をさらに包含する、方法。 １６．前記試料が、血液、尿、血清、および組織からなる群より選択される、請 求項１０に記載の方法。 １７．請求項１０に記載の方法であって、前記第１の生物学的試料よりも第２の 生物学的試料において多くの量が存在する被分析物を同定する工程をさらに包含 し、これによって、該被分析物が、前記病理学的状態についての候補診断マーカ ーとして同定される、方法。 １８．前記第１の細胞抽出物が、健常細胞に由来し、そして前記第２の細胞抽出 物が、ガン細胞に由来する、請求項１１に記載の方法。 １９．被験体において少なくとも１つの診断マーカーによって特徴づけられる病 気を診断する方法であって、 a)少なくとも１つのアドレス可能位置を含む脱離スペクトロメトリーでの使用 のための基材を提供する工程であって、各アドレス可能位置は、溶離条件下で少 なくとも１つの該診断マーカーを分離する吸着体を含む、工程； b)該診断マーカーの保持を可能にするための溶離条件下で、該被験体からの生 物学的試料に該基材を曝露する工程；および c)脱離スペクトロメトリーによって、保持された診断マーカーを検出する工程 ； を包含し、 これによって、保持された診断マーカーを検出する工程が、該病気の診断を提 供する、方法。 ２０．請求項１９に記載の方法であって、診断が、複数の診断マーカーの検出を 含み、そして前記アドレス可能位置が、該複数の診断マーカーを分離する吸着体 を含む、方法。 ２１．試料中の被分析物を検出するためのキットであって、(1)少なくとも１つ のアドレス可能位置を含む脱離スペクトロメトリーでの使用のための基材であっ て、各アドレス可能位置が、該吸着体および溶離物を含む選択条件下で被分析物 を分離する吸着体を含む、基材、および(2)該選択条件に該試料を曝露するため の該溶離物または指示、を含む、キット。 ２２．病気の診断のための請求項２１に記載のキットであって、前記少なくとも １つの該被分析物が、該病気についての少なくとも１つの診断マーカーである、 キット。 ２３．請求項２２に記載のキットであって、前記病気が、複数の診断マーカーに よって特徴づけられ、そして前記基材が、複数のアドレス可能位置を含み、各ア ドレス可能位置が、少なくとも１つの該診断マーカーを分離する吸着体を含む、 キット。 ２４．少なくとも１つの吸着体が、少なくとも１つの診断マーカーをそれぞれ保 持する吸着体種を含む複合吸着体である、請求項２３に記載のキット。 ２５．少なくとも１つの吸着体が、バイオポリマーを含まない、請求項２３に記 載のキット。 ２６．少なくとも１つのアドレス可能位置が、診断マーカーに特異的なリガンド を含む、請求項２３に記載のキット。 ２７．前記リガンドが抗体である、請求項２６に記載のキット。 ２８．少なくとも１つのアドレス可能位置に少なくとも１つの吸着体を含む、脱 離スペクトロメトリーのための基材であって、該少なくとも１つの吸着体が、患 者試料からの病理学的状態についての複数の診断マーカーを分離する、基材。 ２９．少なくとも１つの吸着体が、バイオポリマーを含まない、請求項２８に記 載の基材。 ３０．１つの吸着体が、複数の診断マーカーを分離する、請求項２８に記載の基 材。
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