JP2005524835A - 宿主細胞によって生産された医薬品の精製プロセスの間に汚染物質除去の監視をするための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1.0 はじめに
本研究では、我々が、SELDI-TOF-MS(Ciphergen社)によって、ヒト組み換えIgG1(2)の部分的精製の間に汚染物質の除去を進めた。このIgG1は、網膜由来の初期ヒト細胞から生成されたPER.C6細胞株内で発現される。PER.C6細胞株は、ヒトモノクロナール抗体(グリカンを含む)を完全に生成できる(文献1、2)。
2.1 発酵及び精製
ヒトIgG1(2)を発現するPER.C6細胞が、2つの摺拌翼を使用して75rpmの回転速度で37℃、13日間、バッチ培養で2リットルのEX-CELL VPRO培地(JRH Biosciences社、米国)で培養された。細胞及び上清は、室温 (R. T. )で、300gで5分間の遠心分離によって分離され、該上清は引き続き 22 μmフィルタ(Millipak 20、ミリポア社)で濾過された。この精製された物質から、サンプルが、SELDI-TOF-MS(サンプル1、表1)による分析のために取られた。100mlの容量の明澄にされた及び濾過された収穫物は、Akta Explorerクロマトグラフィー・システム(Pharmacia Biotech社)に接続された組み換えプロテインAカラム(13.8cmベッド高さ及び13.1 mLの容積、Pharmacia Biotech社)に与えられた。該明澄にされた収穫物の適用前に、該カラムは、1.67 mL/minで、20 mM Tris(pH 7.5)、150 mM 塩化ナトリウムの3倍カラム容量で平衡にされた。該明澄にされた収穫物が1.67mL/minで与えられている間に、サンプルが、フロースルーから取られた(サンプル2、表1)。1.67mL/分で、20 mMトリス(pH 7.5)、150 mM 塩化ナトリウムの10倍カラム容量でカラムを洗浄後、該カラムは1.67mL/分で、10倍カラム容量の0.1Mのクエン酸塩(pH 5.0)にもたらされた。IgG1は、5カラム容量の0.1M クエン酸塩(pH 3.3)によってカラムから溶出され、そして引き続き1M トリス-HCl(pH 9)で中和された(サンプル3、表1)。蛋白質の溶出が、280nmでの吸収を測定することによって追跡された。
この実験において、2つの異なるエネルギー吸収マトリックス(EAM)(50 %アセトニトリル(ACN)、0.5% トリフルオロ酢酸(TFA)中にいずれにもある、飽和されたシナピン酸(SPA)及びアルファ−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸(CHCA)の20%飽和溶液)が使用された。サンプルは、下記(2.2.1)の実験手順に記載されるように分析された。0.15g/Lの生成物濃度を得るために、サンプル2及びサンプル4が、リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)(pH 7.4)で、3.3倍及び6.6倍に夫々希釈された。その後、各サンプル(希釈されサンプル2及び4、並びに希釈されていないサンプル1及び3)から、3μlがスポットに添加された。サンプル1、2、3及び4は、スポットA、B、C及びD上に、そして再びE、F、G及びH上に施与された。スポットA〜DはCHCAで、及びスポットE〜HはSPAで分析された。
− 製造会社によって提供されたプロトコルに従い、分子量基準C100-0003(Ciphergen社)を使用して、低分子量分析のためにSELDI-TOF-MSを較正する。
− 製造会社によって提供されたプロトコルに従い、分子量基準C100-0004(Ciphergen社)を使用して、高分子量分析のためにSELDI-TOF-MSを較正する。
− EAM(SPA及びCHCAの両方、5mg、Ciphergen社)で1カップをとり、そして125μL ACN及び125μL 1% TFA(5μL TFAを495μL HPLC等級水に添加することによって新たに調製された)を添加する。5分間ボルテックスし、そして5分間室温で放置する。
− 最高速度で5分間、マイクロフュージ(microfuge)する。
− 飽和されたSPA溶液としてSPAの上清を使用する。
− 100μL の飽和されたCHCA溶液を取ることによって20% CHCA溶液を作成し、そして200μL ACN、200μL 1% TFAに添加する。
− 使用まで、4℃、暗所でEAM溶液を保存する。
− 3μL HPLC等級水で各スポットを予め湿らせる。
− HPLC等級水を除去し、そしてスポット当たり3μLの1つのサンプルを直ちに施与する。
− 該スポットを風乾させる。
− 各スポットを5μL HPLC等級水で洗浄する。
− 放置乾燥し、そして洗浄を1回繰り返す。
− 0.8 μL SPA/CHCAを施与する。
− 該チップを風乾(フード内で5分間)させる。
− 他の0.8 μL SPA/CHCA を施与し、そして乾燥する
− 該チップを下記に与えられた機器設定で分析する。
低分子量0-10 kDa(EAMとしてSPA)用
− ハイマス(high mass)を10000ダルトンに設定し、1000ダルトンから7500ダルトンに最適化されている。
− 開始レーザー強度(LI)を180に設定する。
− 開始検出器感度を6に設定する。
− ラグタイムを600 nsで焦点をあわせる。
− データ捕捉方法をセルディ(Seldi)評価法に設定する。
− セルディ(Seldi)獲得パラメーターを21、デルタを2に、トランジエントを5ずつ(transient per to 5)、終点を81にセットする。
− 2ショットを有するウォーミング位置を強度185で設定し、そしてウォーミングショットを含めない。
− サンプルを処理する。
− ハイマスを200000ダルトンに設定し、10000ダルトンから150000ダルトンに最適化されている。
− 開始LIを230に設定する。
− 開始検出器感度を9に設定する。
− 最適中心によって焦点をあわせる。
− データ捕捉方法をセルディ評価法に設定する。
− セルディ獲得パラメーターを20、デルタを4に、トランジエントを10ずつ(transient per to 10)、終点を80にセットする。
− 2ショットを有するウォーミング位置を強度240で設定し、そしてウォーミングショットを含めない。
− サンプルを処理する。
− ハイマスを15000ダルトンに設定し、1000ダルトンから10000ダルトンに最適化されている。
− 開始LIを180に設定する。
− 開始検出器感度を9に設定する。
− 最適中心によって焦点をあわせる。
− データ捕捉方法をセルディ評価法に設定する。
− セルディ獲得パラメーターを21、デルタを5に、トランジエントを10ずつ(transient per to 10)、終点を79にセットする。
− 2ショットを有するウォーミング位置を強度185で設定し、そしてウォーミングショットを含めない。
− サンプルを処理する。
サンプル1〜4が、SAX2、WCX2、NP20及びH4 プロテインチップ上に施与された。サンプル1及び4は、第1のNP20のために示されたのと同じ稀釈率で使用された。該サンプルは、2.3.2の機器設定で2.3.1に記載された実験手順に従い解析された。
− 種々のチップを有するバイオプロセッサーを作る。
− 各スポットへ50μL平衡バッファー(表2)を添加することによって、H4及びNP20チップを平衡化し、そして300rpmで5分間振とうする。
− その後、表2で示されるような適切なバインディングバッファーの50μLを加えることによって、すべてのプロテインチップのスポットを平衡化する。
− ウェル内にバインディングバッファーの90μLを分配する。
− 分けられたサンプルの10μLを溶液中に加える。
− ウェルの底で泡を形成しないように極度に注意をする。
− 4回、ピペットを上下することによって混合する。
− このようにしてサンプルをすべて添加する。
− シール箔でバイオプロセッサーを覆う。
− ボルテックス振とう機で60分間アレイアセンブリを振とうする(室温、350回転/秒)。
− 流しに溶液をはじき飛ばし、そしてクリーンルームワイプ上でバイオプロセッサーを覆う。
− 室温で5分間振とうすることによって、150μl バインディングバッフで3回アレイを洗浄する。
− 各アレイを150μl脱イオン化(DI)水で1分間素早く洗浄する。
− バイオプロセッサーからチップを除く。
− ペーパーティッシュでスポットの外側の過剰な液体を乾燥する。
− 空気で乾燥することを許す。
− 0.8μl の飽和されたSPA溶液(調製について2.2.1を参照)を施与する。
− 乾燥することを許す。
− 2回目の0.8μl の飽和されたSPA溶液を施与する。
− 乾燥することを許す。
− チップを読む。
− 解析まで室温、暗所中でチップを保存する。
− ハイマスを200000ダルトンに設定し、10000ダルトンから150000ダルトンに最適化されている。
− 開始LIを230又は270に夫々設定する。
− 開始検出器感度を9に設定する。
− 最適中心によって焦点をあわせる。
− データ捕捉方法をセルディ評価法に設定する。
− セルディ獲得パラメーターを夫々20又は21、デルタを5に、トランジエントを10ずつ(transient per to 10)、終点を夫々80又は81にセットする。
− 2ショットを有するウォーミング位置を夫々強度235又は275で設定する。
− ウォーミングショットを含めない。
− サンプルを処理する。
追加のピークは、プロテインチップ NP20上でEAMとしてCHCA又はSPAのいずれかを使用して、低分子範囲で見つからなかった。それ故に、他のプロテインチップが、高及び低分子範囲の両方で不純物の検出を可能にしてEAMとしてのSPAで解析された。
*,LI270で得られた
゜,LI230で得られた
n.a.,IgGが検出されなかった故に適用可能でない
6.0以下で示されたスペクトル及び表から結論されうるように、SELDI-TOF-MS技術を用い高感度で個々の汚染物質を検出することが可能である(図5)。さらに、精製プロセスからの少なくとも2つの中間物を比較することによって、これらの汚染物質の除去が追跡され得る。不純物の適用範囲をさらに改善するために、より多くの異なるバッファー条件が必要でありうる。さらに、より低い質量のより多くの不純物が、より低いレーザー強度を使用して得られうる。
文献1 Jones, D. H.、van Berkel、P. H. C.、Logtenberg, T. 及び Bout, A. 、2002年、「PER.C6 cell line for human antibody production.」、 Gen.編、第22巻、5月15日。
文献2 Jones, D.等、 2003年、「High-level expression of recombinant IgG in the human cell line PER.C6.」、Biotechnol. Prog.、第19巻、163-168頁。
Claims (10)
- 宿主細胞によって生産された医薬品の精製プロセスの間に汚染物質除去の監視をするための方法であって、医薬品の精製プロセスの間に取られた少なくとも2つの異なるサンプルが少なくとも1つのプロテインバイオチップアレイでインキュベーションされること及びプロテインバイオチップアレイに結合された汚染物質が次に検出されることを特徴とする方法。
- 第1の精製ステップの前に及び個々の後の精製ステップの後にサンプルが取られることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 所与の精製ステップの後に得られたサンプルが、本発明における方法において、異なる相互作用表面を有する、少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つ、最も好ましくは少なくとも4つの異なるプロテインバイオチップアレイでインキュベーションされることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- プロテインバイオチップアレイに結合された汚染物質が直接的に検知されることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 質量分析的なアプローチが、汚染物質の直接検知のために使用されることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 検知された汚染物質が蛋白質であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載のプロセス。
- 検知された汚染物質が宿主細胞蛋白質であることを特徴とする、請求項6に記載のプロセス。
- 宿主細胞によって生産された医薬品の精製プロセスの間に汚染物質除去の監視のために1つ又はそれ以上のプロテインバイオチップアレイを使用する方法。
- 異なる相互作用表面を有する少なくとも2つの異なるプロテインバイオチップアレイが使用されることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 宿主細胞蛋白質除去が監視されることを特徴とする、請求項8又は9に記載の方法。
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