KR20230062855A

KR20230062855A - 트립신 소화, 구배 크로마토그래피 및 박스카 질량 분광분석법을 조합하여 치료용 항체에서 숙주 세포 단백질을 검출하는 방법

Info

Publication number: KR20230062855A
Application number: KR1020237011424A
Authority: KR
Inventors: 쑹 녜; 타일러 그리어; 존슨 리드 오브라이언; 샤오징 정; 닝 리
Original assignee: 리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
Priority date: 2020-09-08
Filing date: 2021-09-08
Publication date: 2023-05-09
Also published as: BR112023004206A2; CN116324420A; JP2023543398A; EP4211475A1; MX2023002765A; CA3194211A1; EP4211475A4; US20220074950A1; AU2021340626A9; AU2021340626A1; WO2022055954A1; IL301134A

Abstract

본 발명은 개선된 검정법을 사용하여 치료용 항체 제제에서 바람직하지 않은 숙주 세포 단백질 (HCP)의 특성을 프로파일링하는 개선된 방법을 제공한다. 검정법은 극도로 낮은 트립신 소화, 장구배 액체 크로마토그래피, 및 구체적으로 박스카 (BoxCar) 질량 분광분석법을 사용한 질량 분광분석법 (MS)을 포함하는 3가지 예시적인 단계를 포함한다. 본 발명은 치료용 항체의 순도를 결정하도록 허용하여 환자의 사용에 적합하다.

Description

트립신 소화, 구배 크로마토그래피 및 박스카 질량 분광분석법을 조합하여 치료용 항체에서 숙주 세포 단백질을 검출하는 방법

관련 출원에 대한 교차-참조

본 출원은 2020년 9월 8일에 제출된 미국 가특허출원 제 63/075,617호의 우선권을 주장하고 있으며, 이는 본원에서 이의 전문이 참고문헌으로 통합된다.

본 발명은 일반적으로 개선된 검정법을 사용하여 치료용 항체 제제에서 숙주 세포 단백질 (HCP)의 특성을 프로파일링하는 방법에 관한 것이다. 본 검정법은 극도로 낮은 트립신 소화, 장구배 액체 크로마토그래피 및 질량 분광분석법 (MS), 구체적으로 박스카 (BoxCar) 질량 분광분석법을 포함하는 3가지 예시적인 단계를 포함한다.

치료용 항체는 의학을 혁신하여 왔으며, 최근에 개발된 약물의 상당한 부분을 차지한다. 이들의 개발에 대한 실질적인 투자를 통해 미국 식품의약기구는 79가지의 치료용 단일클론 항체 (mAb)를 승인하였으며, 전세계적 mAb 시장에 의해 창출된 수익은 2025년까지 3,000억 달러에 이를 것으로 추산된다.

장애가 있는 숙주에 대한 mAb 요법의 채택은 우선적으로 이들의 높은 특이도, 다양한 약물 표적에 대한 친화도 및 최소의 부작용로 인해 증가하고 있다. 그러나, 이러한 혜택은 mAb의 거대한 크기 및 화학적 이질성, 뿐만 아니라 세포 발현 동안 치료용 단백질과 조합하여 생성된 숙주 세포 단백질 (HCP) 오염물의 존재에 의해 감축된다.

치료제의 HCP 집단은 환자 안전성을 위협하거나 약물 효능을 감소시키는 단백질을 포함할 수 있기 때문에 가장 염려가 된다. 예를 들면, 면역원성 HCP는 환자에서 의도치 않은 유해 면역 반응을 유도할 수 있는 한편, 효소적 활성이 있는 HCP가 치료용 항체 자체를 분해하거나 제형물 완충액의 성분과 반응하여 항체 안정성을 저하시키고, 가시적인 입자 형성을 증가시킬 수 있다.

실제로, 면역원성 및 효소 잠재력 둘 다가 있는 HCP의 보고 사례가 존재한다. 이러한 위험성은 모니터링되고 허용가능한 수준으로 관리되어야 하는 임계 품질 속성 (CQA)으로서 HCP 수준의 분류를 필요로 하였다. 규제 가이드라인이 특정한 HCP 과잉 (abundance) 한계를 제공하지 않지만, 보편적인 관행은 정제된 약물 산물에서 총 100 ppm 이하의 최대 값으로 한 위험성 기반의 접근법을 채택하고 있다.

이와 같이 HCP 과잉을 낮은 수준으로 감소시키는 것은 상당한 범위의 크기, 순 전하, 소수성 및 기타 많은 물리화학적 성질이 있는 수천 가지 단백질을 사실상 제거할 수 있는 다단계 크로마토그래피 공정의 실행을 요구한다. 이러한 공정은 전형적으로 프로테인 A 친화 크로마토그래피로 시작하여 대다수의 HCP를 제거하며, 이어서 음이온 교환 크기 배제 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피와 같은 정규의 정제 단계를 진행하여 남아있는 오염물 집단 및 과잉분을 추가로 감소시킨다 (Gilgunn, S. et al., Bones, J. J. Chromatogr. A 2019, 1595: 28-38; Liu, H. F. et al., MAbs 2010, 2: 480-499; Zhu, M. M. et. al., In Handbook of Industrial Chemistry and Biotechnology 2017, pp 1639-1669).

성공적인 치료용 항체의 정제 전략이 총 HCP 수준을 100 ppm 미만으로 감소시키기 때문에, 이러한 빈약한 (low abundance) 분석물을 모니터링하는 것은 중요하고, 종종 다수의 검정법을 요구한다. HCP 검출 및 정량화 전략은 공통적으로 효소 결합 면역흡착 검정법 (ELISA)으로 시작한다. 이러한 공통점은 이 방법의 높은 특이도, 정확도 및 정밀도, 뿐만 아니라 이의 사용 편의성 및 자동화로부터 나온다 (Zhu-Shimoni, J. et al., Biotechnol. Bioeng. 2014, 111: 2367-2379; Rey, G. et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 2012, 70: 580-586).

그러나, ELISA의 장점에는 이의 유용성을 감소시키는 여러 단점도 수반된다. 매우 중요하게도, ELISA는 무-표지 세포주를 동물에 면역 접종하여 생산되는 다중클론 항체를 필요로 하고, 이는 생산 세포주로부터의 HCP 세포 모두가 완전히 포괄되지 않고, 면역원성이 더 큰 HCP이 치우쳐 검출되도록 한다 (Zhu-Shimoni, J. et al., Biotechnol. Bioeng. 2014, 111: 2367-2379; Henry, S. M. et al., MAbs 2017, 9: 1065-1075). 또한, HCP 수준의 과소평가도 단백질이 치료용 항체와 비공유 결합되거나 이의 농도가 다중클론 항체의 용량보다 높은 경우에 보편적이다 (Anicetti, V. R. et al., J. Immunol. Methods 1986, 91: 213-224).

마지막으로, 중요한 단일 HCP (포스포리파제 B 유사 2)를 검출하는 ELISA 키트가 존재하고 다른 공지된 의문의 단백질에 대해 개발될 수 있는 반면, 통상적인 ELISA 플랫폼은 총 단백질 농도를 측정하지만 특이적 단백질을 식별하거나 이의 개별 농도는 정량화할 수는 없다 (Henry, S. M. et al., MAbs 2017, 9: 1065-1075). 이러한 제한이 현재 규제 기관은 액체 크로마토그래피 병합된 질량 분광분석법 (LC-MS2)와 같은 정규의 방법을 통하여 달성하도록 기대하는 HCP 특성화에서 허용불가능한 간격을 만든다.

이러한 이유로, 단백질 시료 예를 들면 치료용 항체의 신속하고 정확한 HCP 품질 관리 (심화 프로파일링)에 분석 물리화학을 사용하는 튼튼하고 매우 정확한 검정법을 갖는 것이 유익하다. 이러한 검정법은 임상 개발 및 상업적 용도에서 항체의 제조, 공개되고 확립된 방법과 비교하여 더 높은 전반적인 HCP 품질 관리, 더 높은 동질성 적용범위 및 약 0.1 ppm 정도의 민감한 정밀도, 그리고 다른 방법과 비교하여 더 높은 속도, 사용 편의성 (최소의 단계) 및 더 낮은 비용을 보장하는 광범위하게 적용되는데 바람직하다.

일 양태에서, 본 발명은 HCP 특성화에서 허용불가능한 간격을 속도 및 정확도의 개선으로 해결하는 것에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 치료용 단백질 시료에서 오염 단백질의 동질성 또는 양을 결정하는 고속 검정법으로서, 치료용 단백질 시료에 대해 (1) 극도로 낮은 트립신 소화, (2) 장구배 액체 크로마토그래피, 및 (3) 질량 분광분석법 (MS), 구체적으로 박스카 질량 분광분석법을 시행하는 것을 포함하는 3가지 단계를 전형적으로 포함하는, 고속 검정법을 제공한다. 상기 3가지 단계, 즉 극도로 낮은 트립신 농도 소화, 장구배 액체 크로마토그래피 및 박스카 질량 분광분석법은 본원에서 머릿글자 ULTLB로 약칭된다.

일 구현예에서, 검정법은 오염 단백질, 구체적으로 숙주 세포 단백질 (HCP)의 동질성 및 과잉을 일렬로 결정하는데 적합하다.

일 구현예에서, 검정법은 단백질을 확인하기에 충분하도록 아미노산 서열 또는 부분적 서열에 의해 오염 단백질의 동질성을 결정할 수 있다.

일부 구현예에서, 검정법은 오염 단백질의 과잉을 백만 당 부분 (ppm)의 측정 수준으로 결정할 수 있으며, 여기서 오염 단백질의 양은 백만 당 부분 (ppm) 수준의 약 10 ppm, 5 ppm, 2 ppm, 1 ppm 또는 0.1 ppm 미만 및 이들의 범위 내로 낮고, 즉 10 ppm 미만, 5 ppm 미만, 2 ppm 미만, 1 ppm 미만 또는 0.1 ppm 미만의 민감도로 결정된다.

구현예에서, 검정법은 기본적으로 임의의 치료용 단백질 시료를 HCP 불순물의 존재에 대해, 구체적으로 항체, 항체 변이체 또는 항체 융합과 같은 치료용 단백질에 대해 조사하는데 사용될 수 있다.

따라서, 검정법은 본원에 열거된 다양한 치료용 항체, 변이체 또는 융합의 정제 공정에 적용하는데 사용될 수 있다 ("광범위한 검정법의 응용"이라는 제목의 서브섹션 참조).

본 명세서에 통합되어 이의 일부를 구성하는 첨부된 도면은 본 발명의 여러 구현예를 도시하고, 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하도록 제시된다.
도 1은 표시된 바와 같은 3가지 핵심 단계를 갖는 구체적인 검정법의 모식도를 나타낸다. 단계 1은 극도로 낮은 트립신 농도 소화 공정이 시행되는 숙주 세포 단백질 (HCP)을 갖는 치료용 항체 시료를 나타내고; 단계 2는 장구배 액체 크로마토그래피 공정이 시행되는 결과로 생성된 소화된 폴리펩티드를 나타내며; 단계 3은 이전의 방법과 비교하여 유의하게 개선시킨 (적층 벤 다이어그램으로 나타낸 바와 같음) 박스카 질량 분광분석 획득 공정이 시행된 이전 단계 2의 폴리펩티드를 나타낸다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 3가지 단계, 즉 극도로 낮은 트립신 농도 소화, 장구배 액체 크로마토그래피, 및 박스카 질량 분광분석법은 본원에서 머릿글자 ULTLB로 약칭된다. 용어 "박스카 (BoxCar)"는 예로 더 큰 정밀도를 달성하도록 12개의 분리 윈도우, 즉 "박스"를 포함하는 선택적인 MS 스캔을 말한다 (도 3 역시 참조).
도 2a는 왼쪽부터 오른쪽으로 정상적, 고유의 및 극도로 낮은 강도로 감소하는 다양한 트립신 소화 조건이 시행될 때 항체 표준 (NIST mAb)을 포함하는 항체 시료를 나타낸다. 각 시료는 두 벌씩 전개하였다.
왼쪽 패널은 정상적 및 고유의 소화 조건과 비교하여, 극도로 낮은 조건을 사용하여 가장 많은 양의 HCP가 식별되는 것을 나타낸다.
오른쪽 패널은 정상적 및 고유의 소화 조건과 비교하여, 극도로 낮은 조건을 사용하여 가장 많은 양의 독특한 펩티드가 식별되는 것을 나타낸다.
도 2b는 왼쪽부터 오른쪽으로 진행하는 다양한 액체 크로마토그래피 (LC) 컬럼 길이 (25 cm 또는 50 cm) 및 구배 시간 (2시간 또는 4시간)이 시행될 때 상기 언급된 소화 조건의 항체 표준 (NIST mAb)을 포함하는 항체 시료를 나타낸다. 각 시료는 두 벌씩 전개하였다.
왼쪽 패널은 짧은 컬럼 길이 (25 cm) 및 짧은 구배 (2시간)와 비교하여 긴 컬럼 길이 (50 cm) 및 긴 구배 (4시간)을 사용하여 가장 많은 양의 HCP가 식별되는 것을 나타낸다.
오른쪽 패널은 짧은 컬럼 길이 (25 cm) 및 짧은 구배 (2시간)와 비교하여 긴 컬럼 길이 (50 cm) 및 긴 구배 (4시간)을 사용하여 가장 많은 양의 독특한 펩티드가 식별되는 것을 나타낸다.
도 3a 내지 도 3c는 빈약한 펩티드의 MS 신호를 부스팅하여 HCP 확인을 개선시킨 박스카 획득 프로파일을 나타낸다. 도 3a는 표준 전체 스캔의 대표적인 예를 나타낸다. 도 3b는 12개의 좁은 분리 윈도우 ("박스")로 구성되는 인접한 박스카 스캔을 나타낸다. 도 3a 및 도 3b에서, 삽입된 음영 강조 및 관찰가능한 펩티드 신호는 전체 스캔과 비교하여 박스카 스캔에서 증가한다. 신호 대 잡음 비 (S/N)는 비교를 위해 제공된다. 도 3c는 통상적인 데이터 의존적 획득 (DDA)과 비교하여 박스카 획득 시료에 의해 획득된 HCP 확인에서 유의한 개선 (약 51%)을 나타낸다.
도 4는 패널 A에서 시료 준비, LC 분리 및 MS 획득의 최적화로부터의 ULTLB 방법을 사용한 전반적인 HCP 확인의 개선을 나타낸다. 도면 설명은 다음과 같다: 고유: 고유의 소화; 25 cm 및 50 cm는 컬럼 길이를 표시하고, 2시간 및 4시간은 구배 시간을 나타낸다. 패널 B에서는 고유의 소화와 비교하여 ULTLB에 의해 확인된 총 HCP의 적층 벤 다이어그램 및 MWCO 강화 방법을 나타낸다. 총 453가지의 HCP가 ULTLB를 포함한 방법에 의해 식별되었다.
도 5는 패널 A에서 이중 전개 (표시된 바와 같은 반복 1 및 반복 2)를 통해 확인된 HCP의 매우 일관된 중첩 (92%)을 가리키는 적층 벤 다이어그램을 나타낸다. 패널 B에서는 이중 전개 (표시된 바와 같은 반복 1 및 반복 2)를 통해 확인된 단백질 과잉의 높은 일치를 가리키도록 피어슨 상관관계를 나타낸다.
도 6은 패널 A에서 본원에 기술된 구체적인 구현예에 따른 구체적인 방법과 비교하여 (ULTLB를 사용한 방법), 예시적인 치료용 항체 REGN mAb1 (프로테인 A 및 고유의 소화)에 대한 이전의 2가지 HCP 검출 방법을 비교하는 적층 벤 다이어그램을 나타낸다. 또한, 이러한 정보는 도표 형식으로도 제시된다. 패널 B에서는 본원에 기술된 구체적인 구현예에 따른 구체적인 방법과 비교하여 (ULTLB를 사용한 방법), 제 2의 예시적인 치료용 항체 REGN mAb2 (프로테인 A 및 고유의 소화)에 대한 이전의 2가지 HCP 검출 방법을 비교하는 적층 벤 다이어그램을 나타낸다.

I. 정의

용어 "분석 기법 또는 분석 화학"은 예를 들면 액체 크로마토그래피 (LC), 질량 분광분석법 (MS) 또는 이들의 조합을 사용하는 예시적인 방법을 수행할 목적으로 한 폴리펩티드 분자의 정량적인 분석을 말한다.

용어 "항체"는 질환 또는 장애, 예를 들면 면역 또는 종양학적 장애를 조절하기 위해 대상체 내로 도입하는데 적합한 치료적 면역결합제, 예로 단일클론 항체, 이중 또는 다중 특이적 항체를 말한다. 용어 "항체"는 광범위하게 단일클론 항체, 이중특이적 항체, 다중특이성을 갖는 항체 조성물, 뿐만 아니라 항체 단편 또는 소단위체 (예로, Fab, F(ab')₂, scFv, Fv, Fd, Fc/2 및 LC), 항체 유도체, 융합, 변이체 및 유사체를 기술하는 것으로서 참작되어야 한다.

용어 "박스카"는 선택적으로 분석되는 하나 이상의 윈도우 또는 "박스"가 있는 MS 기법으로서 공지되어 있는, 폴리펩티드를 특성화하기 위한 분석 기법을 말한다.

용어 "DDA"는 질량 분광분석법 단계를 수행하는 것과 연결한 데이터 의존적 획득으로서 공지되어 있는, 폴리펩티드를 특성화하기 위한 분석 기법을 말한다.

용어 "심화 프로파일링"은 분석 기법 (예로, MS)를 사용하여 시료로부터 고성능 단백질 정량화를 달성하는 능력을 말한다.

용어 "HCP" 및 "HCP들"은 숙주 세포, 전형적으로 CHO 세포와 같은 진핵 세포에서 제조될 때 (즉 유전적으로 발현됨) 단백질 제제에서 발견되는 바람직하지 않은 불순물인 단일 및 다수의 숙주 세포 단백질(들)을 말한다.

용어 "HRAM"은 고-해상도 정확한 질량 분광분석법으로서 공지되어 있는, 폴리펩티드를 특성화하기 위한 분석 기법을 말한다.

용어 "LC"는 액체 크로마토그래피로서 공지되어 있는, 폴리펩티드를 특성화하기 위한 분석 기법을 말한다.

용어 "LC-MS"는 액체 크로마토그래피 및 질량 분광분석법으로서 공지되어 있는, 폴리펩티드를 특성화하기 위한 분석 기법을 말한다.

용어 "LCMS2"는 액체 크로마토그래피 및 일렬 질량 분광분석법로서 공지되어 있는, 폴리펩티드를 특성화하기 위한 분석 기법을 말한다.

용어 "장구배 LC"는 액체 크로마토그래피로서 공지되어 있는, 폴리펩티드를 특성화하기 위한 분석 기법으로서, 장구배가 컬럼 크기 및 체류 시간, 예로 각각 50 cm 및 4시간인, 분석 기법을 말한다.

용어 "mAb"는 단일클론 항체를 말한다.

용어 "MS"는 질량 분광분석법으로서 공지되어 있는, 폴리펩티드를 특성화하기 위한 분석 기법을 말한다.

용어 "m/z"는 예로 MS를 사용하여 폴리펩티드의 양태를 특성화하기 위한 분석 매개변수로서, "m"은 질량을 의미하고, "z"는 관찰된 이온의 전하수를 의미한다.

용어 "NIST mAb"는 "국립 표준공학연구소 인간화 IgG1κ 단일클론 항체 표준 (NIST mAb)"으로서 공지되어 있는 단일클론 항체 표준을 말한다.

용어 "오비트랩 (Orbitrap)" 및 "익스플로리스 (Exploris)"는 폴리펩티드를 특성화하기 위한 분석 화학 분야에서 널리 공지되어 있는 시판되는 질량 분광분석기를 말한다.

용어 "트립신 소화물 또는 소화"는 트립신 효소 매개된 절단 단계에 노출되었던 단백질을 말한다. 소화물은 원하는 결과를 달성하도록 트립신 농도 및 배양 시간에 의해 높게 변형될 수 있다. 구현예에서, 트립신 소화물은 예를 들면 10,000 : 1 비율의 "극도로 낮은 소화물"일 수 있다.

용어 "폴리펩티드 소화물 또는 펩티드 소화물"은 적절한 크기의 폴리펩티드 또는 펩티드가 ULTLB를 포함하는 구체적인 방법을 사용하여 조사될 수 있도록 더 큰 단백질 또는 폴리펩티드 서열을 소화시킬 수 있는 하나 이상의 효소 (예로, 트립신)와 배양될 때, 본원에 기술된 바와 같이 폴리펩티드, 예로 항체를 노출시키는 것으로부터 생성된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 믹스를 말한다.

용어 "ULTLB"는 극도로 낮은 트립신 농도 소화, 장구배 액체 크로마토그래피 및 박스카 질량 분광분석법으로서 지칭되는 3가지 단계 검정법의 머릿글자이다.

용어 "극도로 낮은 트립신 농도 소화"는 바람직한 펩티드 프로파일을 달성하기 위한 낮은 트립신 비율을 말한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 용어 및 문구는 달리 반박이 명백하게 지시되지 않거나, 용어 또는 문구가 사용된 맥락으로부터 명백하게 자명하지 않는 한 용어 및 문구가 당해 기술분야에서 이해되는 의미를 포함한다.

2. 치료용 항체 제제에서 HCP의 특성 및 과잉을 특성화하기 위한 개선된 검정법

본 발명은 전형적으로 3가지 단계를 포함하는 검정법을 제공한다.

단계 1은 숙주 세포 단백질 (HCP)를 갖는 치료용 항체 시료에 극도로 낮은 트립신 농도 소화 공정이 시행되는 것을 포함한다.

단계 2는 생성된 소화된 폴리펩티드에 장구배 액체 크로마토그래피 공정이 시행되는 것을 포함한다.

단계 3은 이전 단계 2의 폴리펩티드에 종류 및 과잉 둘 다가 확인된 폴리펩티드 갯수를 유의하게 개선시킨 박스카 질량 분광분석 획득 공정이 시행되는 것을 포함한다.

구체적인 방법 및 각 단계는 하기 다수의 실시예에서 설명된다. 중요하게도, 구체적인 검정법은 공지된 기법과 비교하여 월등한 결과와 함께 여러 치료용 항체에 응용될 수 있다.

상기 3가지 단계, 즉 극도로 낮은 트립신 농도 소화, 장구배 액체 크로마토그래피 및 박스카 질량 분광분석법은 본원에서 머릿글자 ULTLB로 약칭되며, 도 1에 모식도 형식으로 제시된다.

본원에 기술된 구체적인 검정법은 속도 및 사용 편의성과 함께 높은 정밀도를 달성하는 매개변수를 사용한다. 구체적인 검정법은 환자를 보호하기 위하여 항체 치료제가 임의의 HCP 불순물을 스크리닝하도록 추가로 허용한다.

3. 광범위한 응용

본 발명은 치료용 항체 제제에 있는 숙주 세포 단백질 (HCP)의 동질성 및 과잉의 신속하고 정확한 측정을 높은 정밀도 (약 0.1 ppm 이내)로 제공하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 구체적인 검정법은 월등한 결과와 함께 2가지 예시적인 치료용 항체 (REGN mAb1 및 REGN mAb2)에 적용되었다 (도 6의 상부 패널 및 하부 패널 각각 참조). 이에 따라, 개시된 방법은 임의의 상업적으로 생산되는 치료용 항체의 CMC (화학, 제조 및 품질 관리)를 옹호하면서 개선한다.

예를 들면, 일 양태에서 구체적인 검정법은 제조에 완벽을 기하고, 수많은 항체 요법의 균질도 및 순도를 보장하도록 허용한다.

이러한 항체 요법은 앱식시맙, 아달리무맙, 아달리무맙-adbm, 아달리무맙-atto, 아도-트라스투주맙 엠탄신, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 벤랄리주맙, 베박시주맙, 베박시주맙-awwb, 베즐로톡수맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브로달루맙, 브로수맙-twza, 카나키누맙, 카프로맙 펜데티드, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙, 다클리주맙 (제나팍스®), 다클리주맙 (진브리타®), 다라투무맙, 데노수맙, 디누툭시맙, 듀필루맙, 듀르발루맙, 에쿨리주맙, 엘로투주맙, 에미시주맙-kxwh, 에레누맙-aooe, 에볼로쿠맙, 젬투주맙 오조가미신, 골리무맙, 구셀쿠맙, 이발리주맙-uiyk, 이브리투모맙 티욱세탄, 이다루시주맙, 인플릭시맙, 인플릭시맙-abda, 인플릭시맙-dyyb, 인플릭시맙-qbtx, 이노투주맙 오조가미신, 이필리무맙, 익세키주맙, 메폴리주맙, 나탈리주맙, 네시투무맙, 니볼루맙, 오빌톡삭시맙, 오비누투주맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 엠브롤리주맙, 퍼투주맙, 라무시루맙, 라니비주맙, 락시바쿠맙, 레슬리주맙, 리툭시맙, 사릴루맙, 세쿠키누맙, 실툭시맙, 틸드라키주맙-asmn, 토실리주맙, 트라스투주맙, 트라스투주맙-dkst, 우스테키누맙, 베돌리주맙, 및 리툭시맙 및 히알루로니다제를 포함한다.

구체적인 검정법이 시행되는 다양한 적응증에 대한 기타 관심있는 치료용 항체는 눈병을 치료하기 위한 아플리버셉트; 실명 및 전이성 결장직장암을 치료하기 위한 릴로나셉트; 가족성 고콜레스테롤혈증 또는 임상 죽상경화성 심혈관 질환 (ASCVD)을 치료하기 위한 알리로쿠맙; 아토피성 피부염을 치료하기 위한 듀필루맙; 류마티스성 관절염 및 COVID-19를 치료하기 위한 사릴루맙; PD-1 관련 질환을 치료하기 위한 세미플리맙; 및 에볼라를 치료하기 위한 항체를 포함한다.

실시예

하기 실시예는 설명할 목적으로 제공되고, 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 발명을 한정하는 것으로 고려되어서는 안된다. 본 출원서 내에 인용된 모든 참고문헌 및 특허는 본원에서 참고문헌으로 포함된다.

재료 및 방법

참고문헌

본 발명의 방법은 당업자에 의해 실행될 때, 본 발명 내에서 제공될 뿐만 아니라 하기 참고문헌 및 최신 전자 버전, 예컨대 2015년, Pradip Kumar Ghosh의 "Introduction to Protein Mass Spectrometry"; 2017년, Jennie R. Lill 및 Wendy Sandoval의 "Analytical Characterization of Biotherapeutics"; 2008년, Mary S. Lipton 및 LjilJang Pasa-Tolic의 "Mass Spectrometry of Proteins and Peptides: Methods and Protocols 제 2판 (Method in Molecular Biology)"; 2019년, Alisa G. Woods 및 Costel C. Darie의 "Advancement of Mass Spectrometry in Biomedical Research"; 및 2017년, Mike S. Lee 및 Qin C. Ji의 "Protein Analysis using Mass Spectrometry: Accelerating Protein Biotherapeutics from Lab to Protein"에 기술된 펩티드 및 단백질의 분석에 대한 물리화학 분야에서 통상적인 기법을 사용할 수 있다.

재료

트리플루오로아세트산 (TFA), 포름산 (FA) 및 아세트릴은 써모 피셔 사이언티픽사 (락포드 IL)로부터 구입하였다. 우레아, 이오도아세트아미드 (IAM), 트리스(2-카르복시에틸) 포스핀 염산화물 (TCEP-HCl) 및 인간화 IgG1κ 단일클론 항체 표준 RM 8671은 시그마-알드리치사 (세인트루이스, MO)로부터 구입하였다.

재현탁 완충액이 있는 시퀸싱 등급 변형된 트립신은 프로메가사 (매디슨, WI)로부터 구입하였고, 트리스-HCl 완충액 (pH 7.5)은 인비트로겐사 (칼스베드, CA)로부터 구입하였다. C18 SPE는 워터스사 (밀포드, MA)로부터 구입하였다. 정제된 단일클론 항체 및 스파이크 형성되는 CHO 단백질은 리제네론사 (태리타운, NY)에 의해 내부적으로 생산되었다.

정상적인 소화

200 μg의 약물 원료 시료는 9 M 우레아 / 100 mM 트리스-HCl을 사용하여 5 mg/mL로 희석하였다. 이황화 결합은 10 mM DTT로 환원시키고, 50℃에서 30분 동안 배양하였다. 시료는 실온으로 냉각시키고, 암소에서 30분 동안 15 mM IAM으로 알킬화하였다.

환원되고 알킬화된 시료는 100 mM 트리스-HCl을 사용하여 대략 8배 희석하였다. 단백질 분해 소화는 트립신을 사용하여 (1 : 20 트립신 : 물질 비율) 37℃에서 밤새 수행하였다. 소화는 0.2% FA까지 산성화하여 켄칭하였다. 시료는 나노 LC-MS/MS 분석 이전에 C18 SPE 컬럼으로 탈염하였다.

고유의 소화

고유의 소화의 자세한 설명은 2017년, 황 등 (Huang et al., Anal. Chem. 2017, 89: 5435-5444)이 제공하였다. 간략하게, 시료는 50 mM 트리스-HCl, pH 8을 사용하여 약 5 mg/mL로 희석하였다. 다음으로 단백질은 트립신 (1 : 400 w/w 효소 : 물질 비율)으로 37℃에서 약 7.4의 최종 pH로 밤새 소화시켰다.

후속으로, 이황화 결합은 5 mM TCEP를 사용하여 환원시키고, 90℃에서 10분 동안 배양하였다. 생성된 펩티드 혼합물은 약 0.2% FA까지 산성화하고, 15,000 g에서 2분 동안 원심분리하였다. 상청액은 10 kDa 아미콘 분자량 컷오프 (MWCO) 원심분리 필터로 이전하여 나노 LC-MS/MS 분석 이전에 입자를 제거하였다.

낮은 트립신 농도 소화

시료는 10 kDa 아미콘 MWCO 원심분리 필터를 사용하여 탈염하고, 50 mM 트리스-HCl, pH 7.5 내에 완충액 교환하였다. 단백질 농도는 써모 피셔 사이언티픽사로부터의 나노드롭 2000 분광광도계를 사용하여 측정하고, 약 5 mg/mL로 희석하였다. 다음으로, 재현탁 완충액으로 희석된 트립신 (50 μg/μL)은 37℃에서 밤새 소화하도록 시료에 10,000 : 1 w/w 단백질 : 트립신 비율로 첨가하였다. 후속으로, 이황화 결합은 5 mM TCEP를 사용하여 환원시키고, 90℃에서 10분 동안 배양하였다. 시료는 약 0.2% FA까지 산성화하고, 15,000 g에서 2분 동안 원심분리하였다. 상청액은 10 kDa MWCO 원심분리 필터로 이전하여 나노 LC-MS/MS 분석 이전에 입자를 제거하였다.

나노 LC-MS/MS

모든 HCP 시료는 오비트랩 익스플로리스 480 질량 분광분석기 (써모 사이언티픽사)가 연결된 울티메이트 3000 RSLC 나노 시스템 (써모 사이언티픽사)을 사용하여 분석하였다. RSLC 나노 시스템은 25 cm 또는 50 cm C18 컬럼이 장착되어 있었다 (코안 테크놀로지사, 360 μm OD, 75 μm ID, 10 μm 팁 ID).

이동상 A는 물 중 0.1% FA를 포함하였고, 이동상 B는 80% 아세토니트릴 / 20% 물 중 0.1% FA를 포함하였다. 시료는 액크레임 펩맵 100, 75 μm ×2 cm 프리-컬럼 (써모 사이언티픽사) 위에 5 μL/분의 유속으로 5분 동안 로딩하였다. 2시간 구배를 위해 선형 LC 구배를 다음과 같이 설정하였다: 0분에서 5% B, 8분에서 8% B, 95분에서 36% B, 및 115분 내지 120분에서 95% B.

4시간 구배를 위해 선형 LC 구배를 다음과 같이 설정하였다: 0분에서 5% B, 10분에서 8% B, 220분에서 36% B, 및 235분 내지 240분에서 95% B. 유속은 25 cm 컬럼의 경우 0.25 μL/분이고, 50 cm 컬럼의 경우 0.2 μL/분이었다.

질량 스펙트럼 데이터 획득은 엑스칼리버 버전 4.3 (써모 피셔 사이언티픽사, CA)을 사용하여 수행하였다. 나노 ESI 스프레이 전압은 2200 V로 설정하였다. 통상적인 데이터 의존적 획득 모드 (DDA)에서, 조사 스캔은 3분의 주기 시간으로 오비트랩에서 수행하였다. 전체 MS 스캔은 300% 표준 자동화 결과 품질 관리 (AGC) 및 20 ms의 최대 주입 시간으로 60 K 해상도 (m/z 200)에서 m/z 380 내지 1500으로부터 획득하였다.

MS/MS 단편화는 15 K (m/z 200)의 해상도, 75% 표준 AGC 및 50 ms의 최대 주입 시간에서 30%의 정규화된 충돌 에너지로의 HCD를 사용하여 수행하였다. 동적 배제 지속기간은 단일 반복 계수와 함께 45초로 설정하였고, +2 내지 +6의 전하 상태에 있는 전구체만을 선별하였다.

익스플로리스 480 상의 박스카 스캔

박스카 스캔 설정은 일부 변형시킨 메이어 등 (Meier et al., Nat.Methods 2018, 15: 440-448)에 의해 발표된 방법을 따랐다. 전반적인 획득 주기는 전체 표준 스캔 및 이어진 1.5초의 주기 시간으로의 m/z 400 내지 1200 범위를 포괄하는 2회 박스카 스캔을 포함하였다. 적합한 전구체 이온은 통상적인 DDA 실험과 동일한 판정기준 및 설정을 적용하는 이전의 전체 스캔으로부터 선택하였다.

각 박스카는 상이한 m/z 윈도우를 갖는 12개의 상이한 박스를 갖는다. 각 박스카 스캔을 위해, 총 AGC 표적 값은 300% 표준 AGC로 조정되고, 모든 박스에 걸쳐 고르게 분포하였다. 각 박스를 위해, 최대 총 이온 주입 시간은 20 ms이었다. 다른 모든 매개변수는 이전에 기술된 표준 DDA와 일치하였다.

데이터 분석

HCP 단백질 확인을 위한 테이터베이스 검색은 스위스프로트 마우스 표적-디코이 단백질 데이터베이스에 대응하는 프로테옴 디스커버러 2.2 (써모 피셔 사이언티픽사) 내에 내장된 SEQUEST 및 마스코트를 사용하여 수행하였다. 전구체 이온 질량 한계 (tolerance)는 20 ppm으로 설정하였고, 단편 이온 질량 한계는 0.02 Da으로 설정하였다

트립신은 허용된 하나의 소실된 절단으로의 데이터베이스 검색 동안 소화 효소로서 특정하였다. 메티오닌 산화 (+16 Da)는 가변 변형으로서 선택하고, 시스테인 카바미도메틸화는 정상 (알킬화된) 소화물의 고정된 변형으로서 선택하였다.

거짓 발견율 (FDR)은 단백질 당 검출된 최소 2가지 독특한 펩티드를 기준으로, 펩티드 확인의 경우 1% 및 단백질 확인의 경우 5%로 설정하였다.

실시예 1

치료용 항체 제제를 순도에 대해 조사하기 위한 HCP 검정법의 설계 양태 및 개선

본 실시예는 치료용 항체 제제에 있는 HCP를 검출하는 구체적인 검정법을 구축하는데 고려되는 많은 문제점 및 설계 양태 해법을 설명하고 있다.

매우 정밀한 LC 분리 및 민감한 고-해상도 정확한 질량 (HRAM) 질량 분광분석기의 결합은 HCP의 면역원성과 독립적으로 개별 HCP의 확인 및 정량화를 가능하게 한다. 이러한 분석의 주요 장애물은 과잉 치료용 항체 및 빈약한 개별 HCP (치료제 mg 당 1 ng 내지 100 ng 미만의 HCP) 상이의 막대한 농도 차이로부터 발생한다.

치료용 항체의 정제 전략이 진보되면서, 치료제 및 오염 단백질 사이의 동적 범위만 증가되었으며, 대부분의 빈약한 HCP가 면역원성 또는 효소 활성을 여전히 갖을 수 있어 직접적 LC-MS2 방법 단독으로는 검출할 수 없다.

이러한 문제점에 대응하여, (1) HCP 및 치료용 단백질 사이의 농도 차이를 면역친화, 프로테인 A 또는 분자량 컷오프를 통해 축소시키고, (2) HCP 및 치료 펩티드 피크 사이의 중첩을 다차원 크로마토그래피를 사용하여 감소시키며, (3) 하한 외부에 속하는 종의 데이터 의존적 분석을 방해하는 스캔-내 동적 범위 제한을 회피하는 다수의 시료 준비 및 기기 기법이 개발되어 왔다 (Henry, S. M. et al., MAbs 2017, 9: 1065-1075; Thompson, J. H. et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2014, 28: 855-860; Madsen, J. A. et al., MAbs 2015, 7: 1128-1137; Chen, I. H. et al., Anal. Chem. 2020, 92: 3751-3757; Doneanu, C. E. et al., MAbs 2012, 4: 24-44; Farrell, A. et al., Anal. Chem. 2015, 87: 9186-9193; Kufer, R.; Haindl, M. et al., Anal. Chem. 2019, 91: 9176-9723; Walker, D. E. et al., MAbs 2017, 9: 654-663; Doneanu, C. E. et al., Anal. Chem. 2015, 87: 10283-10291; Kreimer, S. et al., Anal. Chem. 2017, 89: 5294-5302; Johnson, R. O. et al., Anal. Chem. 2020; Wang, Q. et al., Anal. Chem. 2020).

이들 방법 중 일부가 ppm 하위 수준까지 단백질 오염물을 검출할 수 있는 한편, 많은 방법은 우선적으로 특정 HCP에 대해 선택적이거나, 처리량을 유의하게 감소시키거나, 신규한 단백질을 확인하는데 어려움을 증가시킨다. 이와 같이, 유의한 편향 또는 다른 조건을 도입하지 않으면서 HCP 적용 범위를 실질적으로 넓히는 비교적 간단한 LC-MS2 방법은 바이오의약품 산업 및 규제 기관 전체에 걸쳐 수요가 높다.

질량 분광분석법과 결합된 액체 크로마토그래피 (LC-MS)는 이의 민감도, 선별도 및 적응성으로 인해 항체 약물 공정 개발 동안 숙주 단백질 (HCP)의 분석을 위한 강력한 도구이다. 그러나, 치료용 항체 및 수반되는 HCP 사이의 막대한 동적 범위는 이러한 빈약한 불순물의 LC-MS 기반의 검출에는 상당한 도전이 된다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여, 면역친화, 프로테인 A, 2D-LC 또는 다른 전량을 통한 HCP의 농축 강화를 전형적으로 수행한다. 그러나, 이러한 농축 강화는 시간을 소모하고, 때로 많은 시료량을 요구한다.

본원에서는 비-변성화 조건 하에 소화 동안 극도로 낮은 트립신 농도, 긴 크로마토그래피 구배, 및 사중극자 오비트랩 질량 분광분석기를 사용한 박스카 획득 (ULTLB)을 조합함으로써, 번거로운 농축 강화 없이 치료용 항체 시료에서 HCP를 분석하는 간단하고 민감한 전략을 개시하고 있다.

NIST 단일클론 항체 표준 (NIST mAb)에 이러한 전략의 응용은 453가지 마우스 HCP를 확인시켜 주었으며, 이는 이전의 보고와 비교하여 농축 강화 없이 확인된 HCP 갯수의 유의한 증가이다. 공지된 HCP 양은 정제된 항체 약물 원료 내에 스파이크가 형성되고, 방법의 민감도가 0.1 ppm 정도로 낮음이 입증되었다. 따라서, ULTLB 방법은 항체에서 HCP의 심화 프로파일링을 위한 민감하고 간단한 플랫폼이다.

시료 준비, LC 분리 및 MS 데이타 수집의 진보적인 조합은 보통 번거롭지 않고 심화 HCP 프로파일링이 가능한 방법으로 개발하는 핵심이 될 것 같다. 이러한 개발은 비-변성화 조건을 사용함으로써 항체와 비교하여 우선적으로 HCP를 소화시킨다 (Huang, L. et al., Anal. Chem. 2017, 89: 5436-5444). 또 다른 단백질체학 연구는 HCP에 적용되지 않지만, 소화 동안 극도로 낮은 트립신 농도 (1 : 25,000 w/w 효소 : 기질 비율)를 적용함으로써 빈약한 단백질의 검출 증진을 관찰하였다 (Fonslow, B. R. et al., Nat. Methods 2013, 10: 54-56).

LC 컬럼 및 구배 시간에 관한 단백질체학 연구는 컬럼 및 구배가 길수록 추가적인 시료 준비, 및 다차원 LC의 힘든 시간 요건이 없이도 민감하고 심층 프로테옴 적용 범위를 생성하는 점을 보여주었다 (Thakur, S. S. et al., Mol. Cell Proteomics 2011, 10: M110 003699; Hinzke, T. et al., Front Microbiol. 2019, 10: 238).

마지막으로, "박스카" 방법으로도 명명되는, 오비트랩 질량 분광분석기의 신규한 획득 방법은 좁은 m/z 윈도우로부터 이온이 있는 C-트랩을 파일링하고, 후속으로 이들 패킷을 오비트랩으로 전달함으로써 DDA 동안 전체 스캔 MS1을 방해하는 스캔-내 동적 범위 문제를 감소시켜 단일 스캔으로 분석된다 (Meier, F. et al., Nat. Methods 2018, 15: 440-448). 박스카 기법은 더 빈약한 이온에 더 많은 획득 시간을 허용하고, 과잉 이온이 많은 트랩에서 소모되는 공간을 제한하여 전체 규모 순위로 잡음 대비 신호를 증가시킬 수 있다.

본 연구에서는, 다수의 컬럼 및 구배 시간의 조사는 HCP 확인 및 박스카 획득을 둘 다 최대화하기 위한 길이가 길수록 통상적인 DDA보다 더 많은 HCP를 확인하는 점을 밝혔다. 또한, 비-변성화 조건 하에 소화 동안 극도로 낮은 트립신 농도를 긴 크로마토그래피 구배 및 사중극자 오비트랩 질량 분광분석기 상의 박스카 질량 분광분석 획득과 조합함으로써, HCP의 심화 프로파일링을 위한 간단하고 신규한 플랫폼을 확립하였다. 본원에서 언급된 바 "ULTLB" 방법으로 명명되는, 이러한 간단하고 튼튼하며 신속한 프로토콜은 ULTLB 방법이 추가적으로 시간을 소모하는 불필요한 시료 농축 강화 단계를 제거하기 때문에 다른 방법과 비교하여 HCP의 더 심화 프로파일링을 가능하게 한다.

본원에 개시된 바와 같이, 다수의 컬럼 및 구배 시간의 조사는 HCP 확인 및 박스카 획득을 둘 다 최대화하기 위한 길이가 길수록 통상적인 DDA보다 더 많은 HCP를 확인하는 점을 밝혔다. 또한, 비-변성화 조건 하에 소화 동안 극도로 낮은 트립신 농도를 긴 크로마토그래피 구배 및 사중극자 오비트랩 질량 분광분석기 상의 박스카 질량 분광분석 획득과 조합함으로써, HCP의 심화 프로파일링을 위한 간단하고 신규한 플랫폼이 필요한 점을 확립하였다.

"ULTLB" 방법으로 명명되는 바, 이러한 단순하고 튼튼하며 신속한 프로토콜은 다른 방법과 비교하여 HCP의 더 심화 프로파일링을 가능하게 하고, 추가적으로 시간을 소모하는 불필요한 시료 농축 강화 단계를 제거시킨다 (도 1, 실시예 6 및 표 2 참조). 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 검정법은 296가지 폴리펩티드를 확인하였다. 첸 등은 단지 104가지 폴리펩티드를 확인하였다. 황 등은 단지 43가지 폴리펩티드만을 확인하였다.

따라서, 본 실시예는 하기에 자세하게 추가로 기술되는 바와 같이, HCP 검출의 문제점을 설명하고, HCP 검출을 유의하게 개선하는 본원에 기술된 구체적인 검정법 (ULTLB를 사용한 방법)의 다양한 매개변수를 설명한다.

실시예 2

3가지 단계 검정법 중 단계 1에 속하는 검정 설계 및 결과: 트립신 소화 단계

본 실시예는 검정법의 3가지 단계 중 첫 번째 단계: 트립신 소화 단계로 시작하는, 치료용 항체 제제에 있는 HCP를 검출하기 위한 구체적인 검정법의 설계 양태를 기술한다.

농축 강화 단계가 없는 간단하고 민감한 시료 제조 방법은 신규한 소화 전략을 사용하여 개발하였다. 이러한 소화 단계는 비-변성화 조건에서 트립신의 극도로 낮은 농도를 사용하여 mAb 자체와 비교하여 우선적인 HCP 소화를 유도하는 것이 관여하였다.

mAb는 전형적으로 대부분의 HCP보다 훨씬 더 많고 총 16개의 이황화 결합에 의해 안정화되어 트립신에 대해 HCP보다 덜 접근가능하고, 환원 조건 하에 또는 비교적 높은 프로테아제 수준에 의해 쉽게 소화된다. 최적의 소화 조건을 획득하기 위하여, 25,000 : 1 내지 1,000 : 1의 상이한 단백질 : 트립신 비율은 비-변성화 조건에서 NIST mAb를 소화시켜 테스트하였다.

모든 시료는 25 cm 컬럼 상에서 2시간 구배로 분석하였다. 도 2는 25,000 : 1 내지 1,000 : 1의 단백질 : 트립신 비율로의 소화물과 비교하여 10,000 : 1 내지 2,500 : 1의 단백질 : 트립신 비율로의 소화물로부터 더 많은 HCP 및 독특한 펩티드가 확인된 것을 나타낸다. 추가의 분석은 확인된 mAb 펩티드 스펙트럼의 갯수가 트립신 농도가 증가하면서 수배 증가하는 것을 보여주었다 (약 1,000 대 약 4,200).

비교적 적은 mAb 스펙트럼이 극도로 낮은 트립신 농도 소화 시료에서 확인되었으며 (25,000 : 1 내지 1,000 : 1), 이는 최소량의 mAb가 이들 시료에서 소화되는 점을 가리킨다. mAb 펩티드 스펙트럼이 발견되는 갯수에 대응하여 확인된 HCP의 갯수를 고려하여, 10,000 : 1의 단백질 : 트립신 비율이 대부분의 HCP가 검출되고, 최소량의 mAB가 소화되는 최적의 단백질 : 트립신 비율로서 선택되었다.

이러한 방법을 정상적인 고유의 소화와 비교하기 위하여, 각 조건 하에 제조된 시료는 동일한 LC-MS 조건을 사용하여 분석하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 극도로 낮은 농도 트립신 소화 방법은 고유의 소화 방법과 비교하여 HCP 확인을 유의하게 개선시킨다 (단백질 수준에서 68% 및 펩티드 수준에서 60%). 둘 다의 방법은 단지 적은 HCP 및 펩티드만을 검출하였던 정상적인 소화 조건보다 실질적으로 더 양호하게 수행하였다.

HCP 검출이 감소되는 주요한 이유는 정상적인 소화물 시료에서 LC 크로마토그램을 우세하고 고유의 소화 시료에서 여전히 풍부한 소화된 항체 펩티드의 높은 과잉이다. 그러나, 극도로 낮은 트립신 농도 소화 시료는 mAb 소화된 펩티드의 적은 갯수를 갖으며, 따라서 HCP 펩티드의 간섭도 더 적다.

결과는 개시된 극도로 낮은 농도 트립신 소화가 추가적인 지루한 농축 강화 절차 없이도 시료 제조 동안 미가공된 mAb를 유지함으로써 빈약한 HCP 펩티드를 선택적으로 소화시키는 간단한 방법임을 입증하고 있다. 도 2a 및 도 2b 참조.

따라서, 본 실시예는 HCP 검출의 문제점을 설명하고, 검정법의 3가지 단계 중 첫 번째 단계: 트립신 소화 단계를 유의하게 개선하는 본원에 기술된 구체적인 검정법 (ULTLB를 사용한 검정법)의 다양한 매개변수를 설명한다.

실시예 3

3가지 단계 검정법 중 단계 2에 속하는 검정 설계 및 결과: 장구배 액체 크로마토그래피 단계

본 실시예는 검정법의 3가지 단계 중 두 번째 단계: 장구배 액체 크로마토그래피 단계로 시작하는, 치료용 항체 제제에 있는 HCP를 검출하기 위한 구체적인 검정법의 설계 양태를 기술한다.

LC 분리를 최적화하고, HCP 확인을 개선하기 위하여, 다수의 회사로부터 다양한 길이 및 차원을 갖는 일련의 컬럼을 NIST mAb HCP 시료를 사용한 최상의 분리를 획득하도록 테스트하였다 (데이터 미도시). 최상의 성능을 갖는 컬럼 (코안 테크놀로지사, LLC, 1.7 μm, C18 컬럼)은 후속으로 NIST mAb 고유의 소화 시료를 사용한 추가의 컬럼 길이 및 구배 최적화에 사용하였다. 컬럼 길이 최적화 실험으로부터의 테이터는 2시간 구배를 사용할 때 50 cm 컬럼을 사용하는 것이 25 cm 컬럼과 비교하여 44.2%의 더 많은 HCP 및 36.0%의 더 많은 독특한 펩티드를 확인시켜 주는 점을 나타낸다 (도 2).

50 cm 컬럼 길이의 입증된 우월성은 더 양호한 분리 및 더 좁은 피크 너비 때문이다. 구배 시간은 50 cm 컬럼 상에서 추가로 최적화하였다. 본 발명자들은 HCP 확인이 2시간 구배와 비교하여 4시간 구배를 사용하여 단백질 수준에서 14.7% 및 펩티드 수준에서 13.5%로 추가로 개선될 수 있음을 관찰하였다. 그러나, 훨씬 더 긴 구배 (6시간 및 8시간)가 동일한 컬럼 상에서 테스트되었지만, 추가의 개선은 관찰되지 않았다. 단백질체학 연구가 복잡한 조직 또는 세포 시료에서 4시간 또는 6시간 구배와 비교할 때 8시간 구배가 최상의 성능을 갖음을 보여주는 한편, 유사한 시간의 구배를 사용하는 것의 장점은 HCP 시료를 분석할 때 이들이 덜 복잡하고 빈약한 HCP 펩티드 분석을 간섭하는 단일 단백질 (mAb)의 유난히 높은 농도를 갖기 때문에 감소되는 것으로 보인다.

또한, 빈약한 HCP 펩티드의 MS 신호는 6시간 또는 8시간과 같은 더 긴 구배에서 피크 너비를 확장시킴으로 인해 유의하게 감소될 수 있다. 이러한 관찰은 본 발명자들이 최적의 LC 분리 조건으로서 50 cm 컬럼 상의 4시간 구배를 선택하도록 안내한다. 25 cm 컬럼 상의 더 짧은 2시간 분리를 대신하여 4시간 구배 및 50 cm 컬럼을 사용할 때, 약 65.5%의 더 많은 HCP (187 대 113) 및 54.4%의 더 많은 독특한 펩티드 (772 대 500)를 NIST mAb 고유의 소화 시료에서 확인하였다 (도 2). 최적의 LC 분리를 본 발명자들의 극도로 낮은 트립신 농도 소화와 조합하는 것이 표준 LC 조건을 사용한 고유의 소화와 비교하여 3배 이상의 확인된 HCP 갯수를 생성하였다 (366 대 113). 도 2a 및 도 2b 참조.

따라서, 본 실시예는 HCP 검출의 문제점을 설명하고, 검정법의 3가지 단계 중 두 번째 단계: 장구배 액체 크로마토그래피 단계를 유의하게 개선하는 본원에 기술된 구체적인 검정법 (ULTLB를 사용한 검정법)의 다양한 매개변수를 설명한다.

실시예 4

3가지 단계 검정법 중 단계 3에 속하는 검정 설계 및 결과: 액체 크로마토그래피 질량 분광분석법 (LC-MS) 박스카 단계

본 실시예는 검정법의 3가지 단계 중 세 번째 단계: 액체 크로마토그래피 질량 분광분석법 (LC-MS) 박스카 단계로 시작하는, 치료용 항체 제제에 있는 HCP를 검출하기 위한 구체적인 검정법의 설계 양태를 기술한다.

LC-MS 기반의 방법에 대한 주요 문제점은 시료 소화물에 있는 HCP 및 치료용 항체 사이의 농도 차이에서 6 이상의 규모 순위가 있을 수 있는 것이다. 또한, 포집화 기반의 질량 분광분석기의 핵심 한계는 많은 빈약한 이온을 MS1 수준 분석으로 배제하는 제한된 이온 트랩의 전하 성능이다. HCP 분석을 방해하는 넓은 동적 범위 논의를 완화시키기 위하여, 박스카 획득 방법은 동적 검출 범위를 증가시키도록 HCP 시료 분석에 적용하였다.

도 3a 및 도 3b에 나타낸 바와 같이, 박스카 스캔의 합친 이온 주입 시간 (164.6 ms)는 표준 전체 스캔의 이온 주입 시간 (1.3 ms)보다 훨씬 더 길었으며, 개별 박스의 평균 이온 주입 시간은 표준 전체 스캔의 경우보다 10배 더 높았다. 최종 결과는 빈약한 신호 대 잡음 비 (S/N)을 갖는 빈약한 종의 전체 스캔 신호에서 40배 이상의 증가이었다.

하나의 LC-MS 실험 내에서, 박스카 스캔의 갯수 및 박스카 당 박스의 갯수를 고정하였다. 전반적인 획득 주기는 표준 전체 스캔 및 m/z 400 내지 1,200 범위를 포괄하는 2회 이상의 박스카 스캔을 포함하였다. 더 많은 박스카 스캔 및 하나의 박스에서 더 많은 스캔은 동적 검출 범위를 증가시킬 수 있지만, 더 긴 주기 시간이 필요하다.

전반적인 주기 시간 및 박스카 스캔의 갯수를 계산하기 위하여, 다수의 박스카 설정을 조사하였다. 가장 많은 HCP 확인은 2회의 박스카 스캔을 더한 1회의 전체 스캔을 사용할 때 획득하였다. 2회의 박스카 스캔 중 각 스캔에 대한 자세한 m/z 윈도우는 표 1에 제공된다.

박스카 설정을 최적화한 이후에, 박스카 획득은 일치하는 LC 조건 (25 cm 컬럼 상의 2시간 구배)으로 분리된 NIST mAb 고유의 소화 시료를 사용한 DDA와 비교하였다. 171가지 HCP는 박스카 획득을 사용하여 확인하였으며, 이는 독특한 펩티드 확인이 약 55% 증가되면서 통상적인 DDA와 비교하여 약 51% 개선을 나타낸다.

따라서, 본 실시예는 HCP 검출의 문제점을 설명하고, 검정법의 3가지 단계 중 세 번째 단계: 액체 크로마토그래피 질량 분광분석법 (LC-MS) 박스카 단계를 유의하게 개선하는 구체적인 검정법의 다양한 매개변수를 설명한다.

실시예 5

3가지 단계 검정법 조합의 검정 설계 및 결과: ULTLB 방법

본 실시예는 검정법의 3가지 단계 모두를 조합함으로써 치료용 항체 제제에 있는 HCP를 검출하기 위한 구체적인 검정법의 설계 양태를 기술한다.

따라서, 상기 구체적인 검정법의 모든 단계, 즉 비-변성화 조건 하에 극도로 낮은 트립신 농도 소화, 최적의 긴 LC 구배, 및 "ULTLB 방법"으로 명명되는 새로운 방법 내의 박스카 획득을 조합하고, 이는 표준 항체 (NIST mAb)에 적용되어 다른 보고와의 직접적인 비교를 허용한다. ULTLB 방법은 총 453개의 마우스 단백질을 확인하였다 (확인된 HCP의 완전한 목록의 경우, 표 1 참조).

도 4a에 나타낸 바와 같이, ULTLB 방법은 25 cm 컴럼 상의 2시간 구배를 사용하여 분석된 표준 고유의 소화와 비교하여 4배 이상으로 HCP 확인을 증가시켰다. 또한, 결과는 시료 준비, LC 분리 및 MS 획득을 포함하는 각 최적화가 HCP 확인을 개선하는데 많이 기여하는 정도를 나타내고, 여기서 더 긴 컬럼 (50 cm), 더 긴 구배 (4시간) 및 박스카 획득은 HCP 확인을 각각 44%, 14% 및 38% 개선하였다. 극도로 낮은 트립신 농도 소화를 최적화된 LC-MS 조건과 조합함으로써, HCP 확인은 추가로 75% 이상 증가되었다.

이것은 극도로 낮은 트립신 농도 소화가 ULTLB 방법에서 HCP 확인의 갯수를 개선시켰던 점을 가리킨다. 최근에, 첸 등 (Chen et al., Anal. Chem. 2020, 92: 3751-3757) 및 황 등 (Huang et al., Anal. Cem. 2017, 89: 5436-5444)은 둘 다 HCP 확인 전략을 개발하였으며, NIST mAb를 사용하여 이들의 효능을 테스트하여 각각 164개의 HCP 및 60개의 HCP를 확인하였다. 고유의 소화 방법 (Huang et al.)에 의해 검출된 60개의 HCP 중 57개는 ULTLB 방법으로도 확인되었으며, MWCO 방법에 의해 확인된 164개의 HCP 중 147개는 ULTLB 방법에 의해 유사하게 적용되었다. NIST mAb에서 총 296개의 마우스 HCP가 이전의 2가지 연구에서 보고되지 않는 ULTLB 방법에 의해 확인되었다 (도 4b). 하기 표 1은 항체 시료에서 스파이크 형성되는 단백질의 다양한 농도로 테스트된 검출 한계를 나타낸다.

방법의 검출 한계를 평가하기 위하여, 0.1 ppm 내지 200 ppm 범위의 농도에서 13가지 정제된 CHO 단백질이 매우 낮은 수준의 내인성 HCP를 포함하는 정제된 시판 등급의 단일클론 항체 mAb1 내에 스파이크 형성되었다 (표 1). PLBD2, 카텝신 D 및 금속 프로테아제 저해제 1 등과 같은 중요한 빈약한 HCP 표적이 목록에 포함되었다. 2가지 단일클론 항체에 대해 획득된 비교 결과를 위해 도 6 참조.

스파이크-내 시료는 처리하여 ULTLB 방법을 사용하여 세 벌씩 분석하였다. 표 1은 모두 13가지 스파이크-내 단백질이 높은 신뢰도로 확인되고, 심지어 가장 낮은 농도 단백질 (0.1 ppm)도 8가지 스펙트럼으로 확인되는 점을 나타낸다. 결과는 ULTLB 방법이 민감하고 0.1 ppm까지 HCP를 검출할 수 있음을 입증하고 있다.

또한, ULTLB 방법의 재연성은 NIST mAb를 사용한 2회의 개별 전개를 통해 평가하였으며, 모든 단백질 중 92%와 동등한 총 583가지 단백질이 전개 사이에 공유되었다 (도 5a). 이러한 재연가능한 결과는 HCP 분석을 위해 중요한 단백질 확인에서의 높은 신뢰도를 나타낸다. 단백질 과잉도 무-표지 정량화 방법에 의해 정량화하고, 둘 다의 전개에서 비교하였다. 이러한 방법에 대한 피어슨 상관관계는 0.95보다 높아서, ULTLB 방법이 매우 재연가능한 점을 가리킨다.

따라서, 본 실시예는 HCP 검출의 문제점을 설명하고, 3가지 단계 ULTLB 방법의 다양한 매개변수 및 데이터 결과를 설명한다.

실시예 6

5가지 상이한 HCP 분석 기법의 비교 분석

본 실시예는 표 2에 정리된 5가지 상이한 HCP 분석 기법의 비교 분석을 제시한다.

본 발명은 비-변성화 조건 하에 소화 동안 극도로 낮은 트립신 농도, 긴 크로마토그래피 구배 및 사중극자 오비트랩 질량 분광분석기 상의 박스카 질량 분광분석 획득을 조합함으로써, ULTLB 방법으로 명명되는 HCP의 심화 프로파일링을 위한 간단하고 신규한 플랫폼을 확립한다.

이러한 전략을 사용하여, mAb 시료에서 빈약한 HCP는 우선적으로 비-변성화 조건에서 극도로 낮은 트립신 농도를 사용하여 소화시키고, 비교적 미가공된 mAb를 남기고, 변성 또는 MWCO 필터에 의해 이것을 제거하도록 허용한다. 긴 구배 분리 및 박스카 획득을 최적화하는 것은 1 내지 2의 규모 순위로 HCP 검출 동적 범위를 추가로 개선하였다.

스파이크-내 실험은 ULTLB 방법의 0.1 ppm까지 검출 한계를 달성하는 높은 민감도를 입증한다. 또한, ULTLB 방법은 이전에 다른 방법으로 보고된 거의 모든 확인된 HCP를 포함하는, 높은 재연성으로 NIST mAb에서 450가지 이상의 HCP를 검출하였다.

따라서, ULTLB 방법은 간단하고 튼튼하며, 다른 방법과 비교하여 훨씬 더 심화된 HCP 프로파일링을 가능하게 하고, 시간을 소모하는 추가적인 시료 농축 강화 단계를 생략시킨다. 하기 표 2는 치료용 항체의 순도를 특성화하기 위한 HCP 검정법의 비교를 나타낸다.

따라서, 본 실시예는 HCP 검출에 대해 ULTLB가 우월함을 보여주는 구체적인 검정법 (ULTLB를 사용함)과 비교하여 4가지 기존의 방법의 분석을 설명한다.

다른 구현예

전술한 명세서에서 특정 구현예 및 실시예가 기재되고, 많은 세부사항이 예시의 목적으로 설명되었던 한편, 당업자에게 현재까지 기술된 구체적인 검정법이 추가적인 구현예에 취약하고, 본원에 기술된 특정 세부사항이 본원에 기술된 기본 원칙으로부터 벗어나지 않고도 변형될 수 있음은 자명할 것이다.

Claims

치료용 단백질 시료에서 오염 단백질의 동질성 또는 양을 결정하는 방법으로서,
상기 단백질 시료를 소화시켜 더 작은 폴리펩티드 서열을 획득하는 단계;
상기 소화물을 크로마토그래피 단계에 노출시키는 단계; 및
상기 크로마토그래피 단계의 소화물을 질량 분광분석법 (MS)에 노출시켜 상기 오염 단백질의 동질성 또는 과잉을 결정하는 단계
를 포함하는, 방법.
제 1항에 있어서,
상기 오염 단백질의 동질성은 크기 또는 서열에 의해 결정되는, 방법.
제 1항에 있어서,
상기 오염 단백질의 양은 백만 당 부분 (ppm) 수준의 10 ppm 미만, 5 ppm 미만, 2 ppm 미만, 1 ppm 미만 또는 0.1 ppm 미만으로 결정되는, 방법.
제 1항에 있어서,
상기 오염 단백질은 숙주 세포 단백질 (HCP)인, 방법.
제 1항에 있어서,
상기 치료용 단백질은 항체, 항체 변이체 또는 항체 융합인, 방법.
제 1항에 있어서,
상기 소화물은 낮은 트립신 농도 소화인, 방법.
제 1항에 있어서,
상기 크로마토그래피는 장구배 액체 크로마토그래피인, 방법.
제 1항에 있어서,
상기 질량 분광분석법 (MS)는 박스카 (BoxCar)인, 방법.
치료용 항체 시료에서 오염 숙주 세포 단백질 (HCP)의 동질성 또는 양을 결정하는 방법으로서,
상기 단백질 시료를 극도로 낮은 트립신 농도에 노출시켜 단백질 소화물을 생성하는 단계;
상기 소화물을 장구배 액체 크로마토그래피 단계에 노출시키는 단계; 및
상기 크로마토그래피 단계의 소화물을 질량 분광분석법 (MS) 박스카에 노출시켜 상기 오염 HCP 단백질의 동질성 또는 과잉을 결정하는 단계
를 포함하는, 방법.
제 9항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 항체, 항체 변이체 또는 항체 융합인, 방법.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 오염 단백질은 베타-헥소스아미니다제, 보체 C1r-A 소구성성분, hPLBD2, 카텝신 Z, 카텝신 D, 시알레이트 O-아세틸에스테라제, 금속 프로테아제 저해제 1, 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소머라제, 리소좀 산 리파제, c-x-c 모티브 케모카인, 트랜스테이레틴, 산 세라미다제, 및 프로콜라겐 C 엔도펩티다제 인핸서 1로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제 9항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 트립신 매개된 소화물은 10,000 : 1의 비율인, 방법.
제 9항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 장구배 액체 크로마토그래피 단계는 50 cm 컬럼 및 4시간의 구배를 포함하는, 방법.
제 10항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체, 항체 변이체 또는 항체 융합은 아플리버셉트, 릴로나셉트, 알리로쿠맙, 듀필루맙, 사릴루맙, 세미플리맙 및 항-에볼라 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제 9항의 방법에 따라 오염 숙주 단백질 (HCP)을 백만 당 부분 (ppm) 수준의 10 ppm 미만, 5 ppm 미만, 2 ppm 미만, 1 ppm 미만 또는 0.1 ppm 미만으로 갖도록 결정되는 폴리펩티드.
제 15항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 항체, 항체 변이체 또는 항체 융합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
제 15항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 아플리버셉트, 릴로나셉트, 알리로쿠맙, 듀필루맙, 사릴루맙, 세미플리맙 및 항-에볼라 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
제 15항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 아플리버셉트인, 폴리펩티드.