DE60308354T2

DE60308354T2 - Prozess für die kontrolle der kontaminationsbeseitigung während des reinigungsprozesses eines durch eine wirtszelle produzierten arzneimittels

Info

Publication number: DE60308354T2
Application number: DE60308354T
Authority: DE
Inventors: Gerarda Maria GUNNEWIJK; Manuel Jose COCO MARTIN
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2002-05-03
Filing date: 2003-05-01
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2023-05-02
Also published as: EP1502103B1; CA2484529A1; AU2003224515A1; ES2271565T3; ATE339685T1; JP2005524835A; DK1502103T3; US20050170328A1; US7371581B2; DE60308354D1; WO2003093814A1; EP1502103A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Überwachung der Kontaminationsbeseitigung während des Reinigungsprozesses eines durch eine Wirtszelle produzierten Arzneimittels.
Die Überwachung der Entfernung von Kontaminationen während des Reinigungsprozesses eines von einer Wirtszelle produzierten Arzneimittels ist notwendig, damit eine Marktzulassung des Arzneimittels erhalten wird. Für die Marktzulassung des Arzneimittels muss gezeigt werden, dass das Reinigungsverfahren reproduzierbar ist und das Arzneimittel mit konstanter Qualität (d.h. Reinheit) hergestellt wird. Daher besteht ein Bedarf an zuverlässigen Verfahren zur Überwachung der Kontaminationsbeseitigung während des Reinigungsprozesses eines Arzneimittels.
Nachweisverfahren, die zur Überwachung der Kontaminationsbeseitigung während des Reinigungsverfahrens eines durch eine Wirtszelle produzierten Arzneimittels verwendet werden, sind im Stand der Technik bekannt. Die bekannten Verfahren nutzen immunologische Verfahren, zum Beispiel ELISA oder Western-Blot, größtenteils in Kombination mit anderen bekannten Verfahren, die nicht auf Immunologie basieren, zum Beispiel 1- und 2D-Gelelektrophorese oder (Umkehrphasen-)HPLC (siehe beispielsweise Bioresponse, Bd. 8, 1988, S. 137).
Ein Nachteil der bekannten immunologischen Verfahren ist, dass die verwendeten Antikörper nur gegen bestimmte Proteine erzeugt werden. Gewöhnlich werden Antikörper nur gegen immunogene Wirtszellenproteine erzeugt. Daher können andere Kontaminationen als diese immunogenen Wirtszellenproteine nicht mit immunologischen Verfahren nachgewiesen werden.
Bei immunologischen Verfahren werden gewöhnlich polyklonale Antikörper verwendet, die gegen (Wirtszellen-)Proteine in einem Wirtstier (z.B. Kaninchen, Ziege, Maus) erzeugt werden. Daher können immunologische Verfahren nur die (Wirtszellen-) Proteine nachweisen, die in der Lage sind, eine immunologische Antwort in dem Wirtstier hervorzurufen. In der Regel macht dies den Nachweis von nur 20-30% der Gesamt-(Wirtszellen-)Proteine aus. Weil polyklonale Antikörper gewöhnlich nicht in Menschen erzeugt werden, können die verbleibenden, nicht nachgewiesenen Wirtszellenproteine gut eine immunologische Reaktion bei Menschen auslösen. Außerdem werden andere Kontaminationen neben (Wirtszellen-)Proteinen ebenfalls nicht entdeckt.
Der Nachteil sowohl der immunologischen als auch der anderen bekannten Nachweisverfahren, die nicht auf immunologischem Nachweis basieren, ist, dass sie keine hohe Empfindlichkeit in Kombination mit der Fähigkeit zum Nachweis einzelner Proteine besitzen; die bekannten Verfahren weisen entweder einzelne Proteine mit relativ niedriger Empfindlichkeit (Western-Blot, HPLC, 1- und 2D-Gelelektrophorese) oder ein Gesamtproteinsignal mit höherer Empfindlichkeit nach (z.B. ELISA).
Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Überwachung der Kontaminationsbeseitigung während des Reinigungsprozesses eines durch eine Wirtszelle produzierten Arzneimittels bereitzustellen, wobei das Verfahren in der Lage ist, einzelne Proteine mit relativ hoher Empfindlichkeit nachzuweisen.
Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst, indem wenigstens zwei verschiedene Proben, die während des Reinigungsprozesses des Arzneimittels genommen werden, mit einem Protein-Biochiparray inkubiert werden, und durch anschließenden Nachweis der an den Protein-Biochiparray gebundenen Kontaminationen.
Protein-Biochiparrays sind im Stand der Technik bekannt (US 2001/0053535) und zum Beispiel von Biacore (Upsala, Schweden) sowie Ciphergen Biosystems (Fremont, Kalifornien, USA) kommerziell erhältlich. Bisher hat man Protein-Biochiparrays zur Isolation eines Produkts und zur Analyse von Zellbestandteilen (z.B. für Studien der differentielle Genexpression) verwendet ( US 6,225,047 ).
Es wurde überraschenderweise gefunden, dass Protein-Biochiparrays äußerst fähig zur Überwachung der Kontaminationsbeseitigung während des Reinigungsprozesses eines durch eine Wirtszelle produzierten Arzneimittels sind und dass der Nachweis einzelner Proteine mit relativ hoher Empfindlichkeit erfolgt. Außerdem sind Protein-Biochiparrays in der Lage, sowohl Proteine als auch andere Kontaminationen zu binden, wohingegen die bekannten immunologischen Verfahren nur Proteine nachweisen können und wohingegen die anderen bekannten, nicht auf Immunologie basierenden Verfahren entweder nur Proteine oder nur Kontaminationen nachweisen können.
Der Begriff "Arzneimittel" bedeutet Proteine (z.B. Antikörper, Rezeptoren, Enzyme, Fusionsproteine usw.), die als ein Wirkstoff in pharmazeutischen Zubereitungen verwendet werden können, (Plasmid-)DNAs mit medizinischer Anwendung, zum Beispiel für die Verwendung in der Gentherapie, oder Impfstoffe.
Der Begriff "Kontamination" bedeutet alle anderen in dem Arzneimittel vorliegenden Verbindungen als das gewünschte Arzneimittel selbst. Kontaminationen sind zum Beispiel (Wirtszellen-)Proteine, Kontaminationen aus dem Zellkulturmedium, in dem das Arzneimittel von der Wirtszelle produziert wird, Additive, die während des Reinigungsprozesses zugegeben werden, zum Beispiel aus Säulen auswaschbare Substanzen, Stabilisierungsmittel, Virusinaktivierungs-mittel, kleine organische Moleküle usw.
Reinigungsverfahren für ein Arzneimittel, das von einer Wirtszelle produziert wird, umfassen gewöhnlich mehrere Reinigungsschritte in unterschiedlichen Kombinationen und unterschiedlicher Reihenfolge. Beispiele für Reinigungsschritte sind Trennschritte (z.B. durch Affinitätschromatographie und/oder Ionenaustauschchromatographie), wohingegen andere Schritte zum Beispiel zum Auf konzentrieren des Arzneimittels (z.B. durch Ultrafiltration oder Diafiltration) benötigt werden, Schritte zum Pufferaustausch oder Schritte zur Entfernung oder Inaktivierung von Viren (z.B. durch Virusfiltration, pH-Verschiebung oder Lösungsmittel-Detergenz-Behandlung).
Eine erfindungsgemäße Überwachung der Reinigung eines Arzneimittels erfolgt durch Inkubieren von wenigstens zwei verschiedenen Proben, die während des Reinigungsverfahrens des Arzneimittels genommen werden, mit wenigstens einem Protein-Biochiparray und anschließenden Nachweis der an den Protein-Biochiparray gebundenen Kontaminationen. Ein Vergleich der erhaltenen Nachweisergebnisse zeigt die Wirkung der Reinigung. Wann die Proben genommen werden, ist nicht wirklich entscheidend, solange die Wirkung der Reinigung aus dem Vergleich der Nachweisergebnisse der verschiedenen Proben ersehen werden kann. In der Praxis werden vorzugsweise Proben zwischen zwei Reinigungsschritten entnommen. Stärker bevorzugt werden Proben wenigstens vor dem ersten Reinigungsschritt und nach dem letzten Reinigungsschritt genommen. Am stärksten bevorzugt werden Proben vor dem ersten Reinigungsschritt und nach jedem anschließenden Reinigungsschritt genommen.
Protein-Biochiparrays haben eine interaktive Oberfläche, an die Proteine binden können. Die interaktive Oberfläche kann zum Beispiel chemischer Natur sein, zum Beispiel ein Ligand eines bestimmten Rezeptors, oder eine chromatographische Oberfläche oder eine biologische Oberfläche. Zu chromatographischen Oberflächen gehören aliphatische hydrophobe Oberflächen, aromatische hydrophobe Oberflächen, negativ geladene Kationenaustauschoberflächen, positiv geladene Anionenaustauschoberflächen, immobilisierte Metallaffinitätschromatographieoberflächen und gemischte Oberflächen, die zum Beispiel eine negativ geladene Kationenaustauschoberfläche und eine positiv geladene Anionenaustauschoberfläche umfassen, sie sind aber nicht darauf beschränkt. Chromatographische Oberflächen sind beispielsweise auch im US 6,225,047 beschrieben.
Zu biologischen Oberflächen gehören kovalent gebundene Antikörper, DNA, Enzyme, Rezeptoren, Liganden und einkettige variable Antikörper oder antikörperähnliche Liganden (wobei die beiden Letzteren aus einer Phagen-Display-Bank erhalten werden können), sie sind aber nicht darauf beschränkt.
Die Art der interaktiven Oberfläche bestimmt, welche Kontaminationen gebunden werden. Wenn beispielsweise der Protein-Biochiparray eine interaktive Oberfläche besitzt, die einkettige variable Antikörper oder antikörperähnliche Liganden, die aus einer Phagen-Display-Bank erhalten werden, gegen Wirtszellenproteine umfasst, werden die meisten Wirtszellenproteine (und nicht nur diejenigen Wirtszellenproteine, die eine immunologische Antwort in einem Wirtstier induzieren können) nachgewiesen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Probe, die nach einem gegebenen Reinigungsschritt erhalten wird, mit wenigstens zwei, stärker bevorzugt wenigstens drei, am stärksten bevorzugt wenigstens vier verschiedenen Protein-Biochiparrays mit unterschiedlichen interaktiven Oberflächen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren inkubiert. Die Verwendung mehrerer verschiedener Protein-Biochiparrays nebeneinander hat den Vorteil, dass mehr verschiedene Kontaminationen nachgewiesen werden können.
Kontaminationen, die an die Protein-Biochiparray-Oberfläche gebunden sind, können direkt nachgewiesen werden. Beispiele für Techniken, die sich zum direkten Nachweis eignen, sind u.a. photometrische Ansätze zur Überwachung einer Brechungsindexänderung, beispielsweise Ansätze unter Verwendung von Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR), Fluoreszenz- oder Polarisationsänderung;, und massenspektrometrische Ansätze, zum Beispiel SELDI (surface enhanced laser desorption ionization).
Alternativ können Kontaminationen auch indirekt nachgewiesen werden; in diesem Fall werden an den Protein-Biochiparray gebundene Kontaminationen von dem Array eluiert und in einem Elutionsmittelstrom zu einem Detektor geführt. Beispiele für Techniken, die sich zum indirekten Nachweis eignen, sind u.a. Elektrospray-Ionisation (ESI) oder matrixunterstützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI). Vorzugsweise werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Kontaminationen direkt nachgewiesen, vorzugsweise unter Verwendung eines Massenspektrometrie-Ansatzes.
Vorzugsweise wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ein direktes Nachweisverfahren, stärker bevorzugt Massenspektrometrie, zum Nachweis der Kontaminationen verwendet, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren an den Protein-Biochiparray gebunden werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise zur Überwachung von Proteinentfernung, stärker bevorzugt von Wirtszellenproteinentfernung, aus dem Arzneimittel verwendet.
Wirtszellen, die zur Herstellung von Arzneimitteln verwendet werden können, sind prinzipiell alle Zellen, die dem Fachmann bekannt sind, die die Fähigkeit haben, ein pharmazeutisches Protein, (Plasmid-)DNA oder Impfstoff zu produzieren. Beispiele für Wirtszellen sind eukaryotische Zellen, zum Beispiel filamentöse Pilze, beispielsweise Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Penicillium chrysogenum, Hefen, zum Beispiel Saccharomyces cerevisiae, Phaffia rhodozyma, Pichia pastoris, Säugerzellen, zum Beispiel CHO-(Chinesischer-Hamster-Ovar-)Zellen, Hybridome, BHK-(Baby-Hamster-Kidney-)Zellen, Myelomzellen, Humanzellen, zum Beispiel HEK-293-Zellen, humane lymphoblastische Zellen, und prokaryotische Zellen, zum Beispiel Escherichia coli, Bacillus sp., beispielsweise B. licheniformis, B. subtilis, B. amyloliquifaciens, B. alkalophilus, Streptomyces sp., Corynebacterium glutamicum, Pseudomonas sp. Beispiele für eukaryotische Zellen sind zum Beispiel auch in Chu, L., Robinson, D.K., (2001) Curr. Opinion Biotechn., Bd. 12, S. 180-187, beschrieben.
Beispiele für Proteine, die als Wirkstoff in pharmazeutischen Zubereitungen verwendet werden können, (wobei der Markenname des entsprechenden Pharmazeutikums in Klammern genannt ist) sind beispielsweise Tenecteplase (TN Kase^TM), (rekombinanter) antihämophiler Faktor (ReFacto^TM), lymphoblastisches Interferon α-n1 (Wellferon^TM), (rekombinanter) Gerinnungsfaktor (NovoSeven^TM), Etanercept (Enbrel^TM), Trastuzumab (Herceptin^TM), Infliximab (Remicade^TM), Palivizumab (Synagis^TM), Basiliximab (Simulect^TM), Daclizumab (Zenepaz^TM), Rituximab (Rituxan^TM), (rekombinanter) Gerinnungsfaktor IX (Benefix^TM) und Interferon β-1a (Avonex^TM).
Beispiele für DNAs mit möglicher medizinischer Anwendung sind gentherapeutische Plasmid-DNAs. Einige gentherapeutische Plasmid-DNAs werden zurzeit in klinischen Versuchen hinsichtlich ihrer medizinischen Anwendung getestet.
Beispiele für Impfstoffe sind lebender, oraler tetravalenter Rotavirus-Impfstoff (RotaShield^TM), Tollwut-Impfstoff (RanAvert^TM) und inaktivierter Hepatits-A-Impfstoff (VAQTA^TM).
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines oder mehrerer Protein-Biochiparrays zur Überwachung der Kontaminationsbeseitigung während des Reinigungsverfahrens eines durch eine Wirtszelle produzierten Arzneimittels. Vorzugsweise die Verwendung von wenigstens zwei, stärker bevorzugt wenigstens drei, am stärksten bevorzugt wenigstens vier verschiedenen Protein-Biochiparrays mit unterschiedlichen interaktiven Oberflächen. Vorzugsweise sind die Kontaminationen Proteine, stärker bevorzugt Wirtszellenproteine.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand des folgenden Beispiels veranschaulicht, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein.
BEISPIELE
1.0 Einleitung
In dieser Studie verfolgten wir die Entfernung von Kontaminationen während der partiellen Reinigung eines humanen rekombinanten IgG1 (2) durch SELDI-TOF-MS (Ciphergen). Das IgG1 wird in der PER.C6-Zelllinie exprimiert, die aus von Retina stammenden primären humanen Zellen erzeugt wurde. Die PER.C6-Zelllinie ist in der Lage, vollständig humane monoklonale Antikörper (einschließlich der Glycane) zu bilden (1, 2).
Die Kontaminationen, die in den Proben vorlagen, die während des Reinigungsprozesses genommen wurden, wurden unter Verwendung von ProteinChips analysiert. Die ProteinChips (Ciphergen) haben einen interaktive Oberfläche, an die Proteine binden können. Wir verwendeten den ProteinChip mit normaler Phase (NP20), den starken Anionenaustauscher-ProteinChip (SAX2), den schwachen Kationenaustauscher-ProteinChip (WCX2) und den hydrophoben Wechselwirkungs-ProteinChip (H4) unter verschiedenen Bindungsbedingungen.
2.0 Materialien und Verfahren
2.1 Fermentation und Reinigung
Die PER.C6-Zellen, die humanes IgG1 exprimieren (2), wurden in 2 l EX-CELL-VRPO-Medium (JRH Biosciences, Inc., USA) in einem geschlossenen System für 13 Tage bei 37°C mit einer Schüttelgeschwindigkeit von 75 U/min unter Verwendung von zwei Impellern gezüchtet. Die Zellen und der Überstand wurden durch Zentrifugation für 5 min bei 300 g und Raumtemperatur (R.T.) getrennt, der Überstand wurde anschließend über ein 22-μm-Filter (Millipak 20, Millipore) filtriert. Von diesem geklärten Material wurde eine Probe für die Analyse mittels SELDI-TOF-MS genommen (Probe 1, Tabelle 1). Ein Volumen von 100 ml geklärter und filtrierter Ernte wurde auf eine Säule mit rekombinantem Protein A (13,8 cm Betthöhe und ein Volumen von 13,1 ml, Pharmacia Biotech) aufgetragen, die mit einem Akta-Explorer-Chromatographiesystem (Pharmacia Biotech) verbunden war. Vor dem Auftragen der geklärten Ernte wurde die Säule mit 3 Säulenvolumina 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl bei 1,67 ml/min äquilibriert. Während die geklärte Ernte bei 1,67 ml/min aufgetragen wurde, wurde eine Probe aus dem Durchfluss entnommen (Probe 2, Tabelle 1). Nach Waschen der Säule mit 10 Säulenvolumina 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl bei 1,67 ml/min wurde die Säule auf 0,1 M Citrat pH 5,0 in 10 Säulenvolumina bei 1,67 ml/min gebracht. Das IgG1 wurde von der Säule durch 5 Säulenvolumina 0,1 M Citrat pH 3,3 eluiert und anschließend mit 1 M Tris-HCl (pH 9) neutralisiert (Probe 3, Tabelle 1). Die Elution von Proteinen wurde durch Messen der Absorption bei 280 nm verfolgt. Tabelle 1. Gesammelte Zwischenprodukte für die Analyse mittels SELDI-TOF-MS während der Reinigung von IgG1.

*Aus der Absorption bei 280 nm bestimmt (ε = 1,71 M^–1·cm^–1)
n.a., nicht anwendbar

2.2 Zwischenprodukte an einem NP20-ProteinChip
Bei diesem Experiment wurden zwei verschiedene Energieabsorptionsmatrices (EAMs) verwendet, gesättigte Sinapinsäure (SPA) und eine 20%ige gesättigte Lösung von alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA), beide in 50% Acetonitril (ACN), 0,5% Trifluoressigsäure (TFA). Die Proben wurden analysiert, wie bei dem nachstehenden experimentellen Verfahren (2.2.1) beschrieben. Um eine Produktkonzentration von 0,15 g/l zu erhalten, wurden Probe 2 und Probe 4 3,3- bzw. 6,6-fach mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, verdünnt. Dann wurden von jeder Probe (Probe 2 und 4 verdünnt und 1 und 3 unverdünnt) 3 μl auf einen Fleck gegeben. Probe 1, 2, 3 und 4 wurden auf Fleck A, B, C und D und dann wieder auf E, F, G und H aufgetragen. Die Flecken A bis D wurden mit CHCA und E bis H mit SPA analysiert.
2.2.1 Experimentelles Verfahren

– SELDI-TOF-MS für die niedermolekulare Analyse unter Verwendung des Molekulargewichtsstandards C100-0003 (Ciphergen) nach dem vom Hersteller zur Verfügung gestellten Protokoll kalibrieren.
– SELDI-TOF-MS für die hochmolekulare Analyse unter Verwendung des Molekulargewichtsstandards C100-0004 (Ciphergen) nach dem vom Hersteller zur Verfügung gestellten Protokoll kalibrieren.
– Ein Gefäß EAM (sowohl SPA als auch CHCA, 5 mg, Ciphergen) nehmen, 125 μl ACN und 125 μl 1% TFA (durch Zugabe von 5 μl TFA zu 495 μl Wasser HPLC-Qualität frisch hergestellt) zugeben. Für 5 min vortexen und für 5 min bei Raumtemperatur stehen lassen.
– Für 5 min bei maximaler Geschwindigkeit in der Mikrofuge zentrifugieren
– Überstand der SPA als gesättigte SPA-Lösung verwenden.
– Die 20%ige CHCA-Lösung durch Entnehmen von 100 μl gesättigter CHCA-Lösung und Zugeben zu 200 μl ACN, 200 μl 1% TFA herstellen
– EAM-Lösungen bis zur Verwendung bei 4°C im Dunkeln aufbewahren.
– Jeden Fleck mit 3 μl Wasser HPLC-Qualität vornetzen.
– Wasser HPLC-Qualität entfernen und sofort 3 μl einer Probe pro Fleck auftragen.
– Flecken lufttrocknen lassen
– Jeden Fleck mit 5 μl Wasser HPLC-Qualität waschen
– Trocknen lassen und die Wäsche einmal wiederholen
– 0,8 μl SPA/CHCA auftragen
– Den Chip lufttrocknen lassen (5 min im Abzug)
– Weitere 0,8 μl SPA/CHCA auftragen und trocknen Den Chip mit den nachstehend angegebenen Instrumenteneinstellungen analysieren

2.2.2 Instrumenteneinstellungen
Für niedriges Molekulargewicht 0-10 kDa (SPA als EAM)

– Hohe Masse auf 10000 Dalton einstellen, optimiert von 1000 Dalton bis 7500 Dalton.
– Anfangs-Laserintensität (LI) auf 180 einstellen.
– Anfangs-Detektorempfindlichkeit auf 6 einstellen.
– Focus lag time auf 600 ns einstellen.
– Datenaufnahmeverfahren auf Seldi Quantitation einstellen
– Seldi-Aufnahmeparameter auf 21, delta auf 2, transients per auf 5 ending position auf 81 einstellen.
– Warming positions with 2 shots bei Intensität 185 und Dont't include warming shots einstellen.
– Probe verarbeiten.

Für hohes Molekulargewicht 10-200 kDa (SPA als EAM)

– Hohe Masse auf 200000 Dalton einstellen, optimiert von 10000 Dalton bis 150000 Dalton.
– Anfangs-LI auf 230 einstellen.
– Anfangs-Detektorempfindlichkeit auf 9 einstellen.
– Focus durch optimization center.
– Datenaufnahmeverfahren auf Seldi-Quantitation einstellen
– Seldi-Aufnahmeparameter auf 20, delta auf 4, transients per auf 10 ending position auf 80 einstellen.
– Warming positions with 2 shots bei Intensität 240 und Dont't include warming shots einstellen.
– Probe verarbeiten.

Für niedrige Molekulargewichte (CHCA als EAM)

– Hohe Masse auf 15000 Dalton einstellen, optimiert von 1000 Dalton bis 10000 Dalton.
– Anfangs-LI auf 180 einstellen.
– Anfangs-Detektorempfindlichkeit auf 9 einstellen.
– Focus durch optimization center.
– Datenaufnahmeverfahren auf Seldi-Quantitation einstellen
– Seldi-Aufnahmeparameter auf 21, delta auf 5, transients per auf 10 ending position auf 79 einstellen.
– Warming positions with 2 shots bei Intensität 185 und Dont't include warming shots einstellen.
– Probe verarbeiten.

Die Spektren wurden unter Verwendung der vom Hersteller (Ciphergen, Fremont, CA, USA) im Softwarepaket Ciphergen ProteinChip-Software 3.0.1. gelieferten Peak-Nachweis-Software analysiert. Peaks mit einem Signal/Rauschen-Verhältnis (S/N) von 2 oder mehr wurden in die Vergleichsstudien eingeschlossen. Für Schulter-Peaks ist die Fläche als null angegeben.
2.3 Nachweis an SAX2-, WCX2-, NP20- und H4-ProteinChips unter verschiedenen Bedingungen unter Verwendung von SPA als EAM.
Die Proben 1-4 wurden auf einen SAX2-, WCX2-, NP20- und H4-ProteinChip aufgebracht. Probe 1 und 4 wurden in der gleichen Verdünnung verwendet, wie bei der ersten NP20 angegeben. Die Proben wurden gemäß dem in 2.3.1 beschriebenen experimentellen Verfahren mit den Instrumenteneinstellungen von 2.3.2. analysiert. Tabelle 2. Die erste Äquilibrierung und zwei verschiedene Puffer.

n.a. nicht anwendbar

2.3.1 Experimentelles Verfahren

– Den Bioprozessor mit den verschiedenen Chips bestücken
– Den H4- und den NP20-Chip durch Zugabe von 50 μl Äquilibrierungspuffer (Tabelle 2) zu jedem Fleck und Schütteln für 5 min bei 300 U/min äquilibrieren.
– Dann die Flecken aller ProteinChips durch Zugabe von 50 μl des entsprechenden Bindungspuffers, wie in Tabelle 2 angegeben, äquilibrieren.
– 90 μl Bindungspuffer in die Vertiefungen geben.
– 10-μl-Probenaliquot in die Lösung geben
– Sehr gut aufpassen, dass sich keine Blasen am Boden der Vertiefungen bilden
– Durch viermaliges Hoch- und Herunterpipettieren mischen
– Alle Proben auf diese Weise zugeben
– Den Bioprozessor mit Verschlussfolie abdecken
– Den Arrayaufbau für 60 min auf einem Vortex-Schüttler schütteln (R.T., 350 Runden/s)
– Die Lösungen in den Ausguss verwerfen und den Bioprozessor auf einem Reinraumwischtuch ausklopfen.
– Arrays 3-mal mit 150 μl Bindungspuffer durch Schütteln für 5 min bei R.T. waschen
– Jeden Array schnell mit 150 μl deionisiertem (DI) Wasser für 1 min waschen.
– Den (die) Chip(s) aus dem Bioprozessor entfernen
– Überschüssige Flüssigkeit außerhalb des Flecks mit einem Papiertuch trocknen
– Lufttrocknen lassen
– 0,8 μl gesättigte SPA-Lösung (Herstellung siehe unter 2.2.1) auftragen
– Trocknen lassen
– Zweite 0,8 μl der gesättigten SPA-Lösung auftragen
– Trocknen lassen
– Chip ablesen Chips im Dunkeln bei R.T. bis zur Analyse aufbewahren

2.3.2 Instrumenteneinstellungen

– Hohe Masse auf 200000 Dalton einstellen, optimiert von 10000 Dalton bis 150000 Dalton.
– Anfangs-LI auf 230 bzw. 270 einstellen
– Anfangs-Detektorempfindlichkeit auf 9 einstellen.
– Focus durch optimization center.
– Datenaufnahmeverfahren auf Seldi-Quantitation einstellen
– Seldi-Aufnahmeparameter auf 20 bzw. 21, delta auf 5, transients per auf 10 einding position auf 80 bzw. 81 einstellen.
– Warming positions with 2 shots bei Intensität 235 bzw. 275 einstellen.
– Keine Aufwärmschüsse. Probe verarbeiten.

3.0 Ergebnisse
Sowohl unter Verwendung von CHCA als auch SPA als EAM wurden keine zusätzlichen Peaks im niedermolekularen Bereich auf dem ProteinChip NP20 gefunden. Deshalb wurden die anderen ProteinChips mit SPA als EAM analysiert, was einen Nachweis von Verunreinigungen sowohl im hoch- als auch niedermolekularen Bereich gestattete.
Aus dem Unterschied zwischen den Spektren des Mediums und der geklärten Ernte wurden von der Wirtszelle produzierte Proteine/Verunreinigungen (einschließlich Produkt) identifiziert. Im Spektrum des Durchflusses trifft man auf viele dieser Verunreinigungspeaks, was zeigt, dass die Verunreinigungen vom Produkt abgetrennt wurden (siehe die beigefügten Figuren und/oder Tabellen). Das Produkt liegt um 148 kDa in seiner einfach geladenen Form (IgG1 + H) vor, es liegt ebenfalls bei 74 kDa in seiner doppelt geladenen Form (IgG1 + 2H) und manchmal sogar in seiner dreifach geladenen Form um 49 kDa (IgG1 + 3H) vor, diese Peaks sind fett dargestellt.
Für den ersten NP20-ProteinChip (NP20(1)) sind die mit SPA erhaltenen Daten (Fleck E-H), die mit LI 230 analysiert wurden, angegeben. Für die anderen Chromatographieoberflächen sind die entweder mit LI 230 oder LI 270 erhaltenen Daten angegeben. Der prozentuale Anteil an Verunreinigungen kann nur berechnet werden, wenn ein Produktpeak vorhanden ist, also nur für die geklärte Ernte (Probe 2) und das Eluat (Probe 3). Für die Berechnung wurde die folgende Formel (1) verwendet. 100%·(1 – Gesamtfläche IgG-Peaks/Gesamtfläche) (1)
Tabelle 3. Aus der geklärten Ernte (Probe 2) und dem Eluat (Probe 3) berechnete Verunreinigungen, die für die verschiedenen ProteinChips gefunden wurden.
Wenn anwendbar, sind vor dem Schrägstrich die Ergebnisse der Flecken A-D und nach dem Schrägstrich diejenigen der Flecken E-H angegeben. * mit LI 270 erhalten; ° mit LI 230 erhalten; n.a. nicht anwendbar, da kein IgG nachgewiesen wurde.
Durch Vergleichen der Spektren des Mediums vor und nach der Fermentation können von der Wirtszelle produzierte Kontaminationen identifiziert und anschließend während der Reinigung verfolgt werden. Durch Vergleichen der Massen jedes Spektrums können einzigartige Peaks pro Zwischenprodukt pro Proteinchip identifiziert werden, die einen zusätzlichen Einblick in die Menge oder die Entfernung von Verunreinigungen geben können. Verunreinigungen mit Massen innerhalb von 0,5% Unterschied werden als identisch angesehen.
4.0 Schlussfolgerungen
Aus den Spektren und den unter 6.0 gezeigten Tabellen kann geschlossen werden, dass es möglich ist, einzelne Kontaminationen mit hoher Empfindlichkeit mit der SELDI-TOF-MS-Technik nachzuweisen (5). Außerdem kann durch Vergleichen von wenigstens zwei Zwischenprodukten des Reinigungsprozesses die Entfernung dieser Kontaminationen nachverfolgt werden. Um die Abdeckung der Verunreinigungen weiter zu verbessern, können mehr verschiedene Pufferbedingungen benötigt werden. Außerdem können mehr Verunreinigungen einer kleineren Masse durch Verwendung einer niedrigeren Laserintensität erhalten werden.
Die in Tabelle 3 angegebenen Ergebnisse zeigen deutlich die Entfernung von Kontaminationen während der Reinigung des rekombinanten IgG1 über eine ProteinA-Säule. Noch idealer kann die Entfernung gezeigt werden, wenn mehr Reinigungsschritte durchgeführt werden.
5.0 Literatur

1 Jones, D.H., van Berkel, P.H.C., Logtenberg, T, und Bout, A., 2002, "PER.C6 cell line for human antibody production.", Gen. 22, Ausg. 15. Mai.
2 Jones, D., et al., 2003, "High-level expression of recombinant IgG in the human cell line PER.C6.", Biotechnol. Prog. 19, 163-168.

6.0 Tabellen Tabelle 4. Eigenschaften der auf dem ProteinChip NP20(1) erhaltenen Peaks.
Tabelle 5. ProteinChip NP20(2)
Tabelle 6. ProteinChip SAX2
Tabelle 7. ProteinChip WCX2
Tabelle 8. ProteinChip H4

Claims

Verfahren zur Kontrolle der Kontaminationsbeseitigung während des Reinigungsprozesses eines durch eine Wirtszelle produzierten Arzneimittels, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens zwei verschiedene, während des Reinigungsprozesses des produzierten Arzneimittels entnommene Proben mit wenigstens einem Protein-Biochiparray inkubiert werden und daß die an den Protein-Biochiparray gebundenen Kontaminationen anschließend nachgewiesen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Proben vor dem ersten Reinigungsschritt sowie nach jedem nachfolgenden Reinigungsschritt entnommen werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine nach einem gegebenen Reinigungsschritt erhaltene Probe mit wenigstens zwei, stärker bevorzugt wenigstens drei, am stärksten bevorzugt wenigstens vier, verschiedenen Protein-Biochiparrays mit unterschiedlichen interaktiven Oberflächen inkubiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die an den Protein-Biochiparray gebundenen Kontaminationen direkt nachgewiesen werden.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß zum direkten Nachweis der Kontaminationen ein massenspektrometrischer Ansatz verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den nachgewiesenen Kontaminationen um Proteine handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den nachgewiesenen Kontaminationen um Wirtszellenproteine handelt.
Verwendung eines oder mehrerer Protein-Biochiparrays zur Kontrolle der Kontaminationsbeseitigung während des Reinigungsprozesses eines durch eine Wirtszelle produzierten Arzneimittels.
Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens zwei verschiedene Protein-Biochiparrays mit unterschiedlichen interaktiven Oberflächen verwendet werden.
Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Beseitigung von Wirtszellenproteinen kontrolliert wird.