DE10311384A1

DE10311384A1 - Nachweisverfahren für pflanzliche Moleküle

Info

Publication number: DE10311384A1
Application number: DE2003111384
Authority: DE
Inventors: Florian J. Prof.Dr. Schweigert
Original assignee: Universitaet Postdam
Current assignee: Universitaet Postdam
Priority date: 2003-03-11
Filing date: 2003-03-11
Publication date: 2004-09-30
Also published as: WO2004081562A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von pflanzlichen Molekülen, wobei die Proben, die die entsprechenden pflanzlichen Moleküle aufweisen, auf eine aktive Oberfläche gegeben werden, so daß spezifische Wechselwirkungen zwischen der Oberfläche und den pflanzlichen Molekülen ausgebildet werden. Nicht gebundene Moleküle werden von der Oberfläche durch Waschen entfernt. In einem abschließenden Verfahrensschritt wird das Molekülgewicht der auf der Oberfläche gebundenen Moleküle mit Hilfe von massenspektrometrischen Methoden bestimmt. Dieses Verfahren ist insbesondere für den Nachweis bestimmter Proteine aus Getreide, insbesondere von Gluten, Gliadin, Secalin und/oder Hordein geeignet.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von pflanzlichen Molekülen. Bei diesen Molekülen handelt es sich insbesondere um Proteine aus Getreide.
Um eine ausreichende Qualität von Nahrungsmitteln zu gewährleisten, ist es erforderlich, die Inhaltsstoffe von für die Nahrungsmittelproduktion vorgesehenen Getreiden sehr sorgfältig zu analysieren und zu kontrollieren. Dies gilt zum einen für die gewöhnliche Nahrungsmittelproduktion und in ganz besonderer Weise für Nahrungsmittel aus Getreiden, für bestimmte Diäten vorgesehen sind, beispielsweise für eine Zöliaker-Diät.
Bei der Zöliakie handelt es sich um eine Krankheit, die im wesentlichen auf einer Unverträglichkeit von Gluten als Protein aus Weizen beruht. Die Krankheit kann sich durch eine profuse Diarrhöe mit schwerer intestinaler Malabsorption als Folge äußern. Andere, häufigere Symptome sind oligosymptomatische oder atypische Verlaufsformen, wie beispielsweise Anämien, Osteoporose, Störungen des muskulären Sy stems oder Endokrinopathien. Für das Endstadium der Erkrankung ist eine totale Zottenatropie und eine schwere Malabsorption von Nährstoffen, Vitaminen und Mineralstoffen charakteristisch. Dementsprechend wird die Erkrankung auch als Gluten-induzierte Enteropathie bezeichnet. Die Zöliakie bei Kindern und die einheimische Sprue bei Erwachsenen beruht wahrscheinlich auf ein und derselben Erkrankung mit der gleichen Pathogenese.

Erfreulicherweise läßt sich diese Erkrankung durch das absolute Vermeiden von Gluten in der Diät sehr erfolgreich behandelt. Eine Eliminationsdiät führt schon innerhalb weniger Wochen zu einer vollständigen klinischen und physiologischen Rückbildung. Eine unbehandelte Sprue ist jedoch bei langer Laufzeit mit einem deutlich erhöhten Risiko für die Ausbildung von sekundären Autoimmunerkrankungen verbunden. Hierzu zählen beispielsweise Typ I Diabetes, Kollagenosen, Hepatitis und Thyoriditis (Schuppan, D. (2000). Current concepts of celiac disease pathogenesis. Gastroenterology 119, 234–242).

Gluten und die unter diesen Oberbegriff zu fassenden Gliadine sind Proteine, die insbesondere in Weizen gefunden werden. Diese mit Alkohol extrahierbaren Proteine sind glutaminreiche Gliadin-Polypeptide, die entsprechend ihres elektrophoretischen Wanderverhaltens in Subgruppen eingeteilt werden können (Shewry, P. R. and Halford, N. G. (2002). Cereal seed storage proteins: Structures, properties and rote in grain utilization. J. Exp. Bot. 53, 947–958). Peptide aller Subtypen können bei entsprechenden Patienten toxisch wirken und die für die Zöliakie bzw. Sprue charakteristischen intestinalen Läsionen induzieren. Neben Gluten können jedoch auch die verwandten Proteine aus Roggen und Gerste (Secalin und/oder Hordein) diese pathogenen Effekte auslösen.

Im allgemeinen läßt sich bei Zöliakie-Patienten eine genetische Prädisposition beobachten. Insbesondere zeigen die Patienten oftmals eine erhöhte Häufigkeit von Serum-Histokompatibilitätsgenen, insbesondere der HLA-DQ2- und HLA-DQ8-Typen. Es wird davon ausgegangen, daß diese genetischen Faktoren prädisponierend für die immunologische Tolerierung von Nahrungsproteinen (Gluten, Gliadin, Secalin und/oder Hordein) sind. Andererseits sind diese genetischen Faktoren für die Produktion von pathogenen Antigluten-Antikörpern zumindest mitverantwortlich, die zu einer Bindung von Gluten bzw. der anderen Proteine an epithelialen Zellen mit nachfolgender Zellzerstörung führen können (Schuppan, D. (2000). Current concepts of celiac disease pathogenesis. Gastroenterology 119, 234–242; Tighe, M. R. and Ciclitira, P. J. (1995). The gluten-host interaction. Baellieres Clin. Gastroenterol. 9, 211–230). Die familiäre Inzidenz der Sprue bzw. Zöliakie bei einem Erkrankten liegt unter ersten Blutsverwandten zwischen 10 und 20 %.

Um die Zöliakie bzw. Sprue wirksam therapieren zu können, ist es erforderlich, eine Diät bereitzustellen, die vollständig frei von Gluten bzw. auch frei von Gliadin, Secalin und/oder Hordein ist. Die entsprechenden Analysen der Nahrungsmittel müssen sehr zuverlässig und genau erfolgen, da ansonsten ein Erfolg der Therapie dieser Krankheit nicht möglich ist.

Die bisher üblichen Nachweismethoden für entsprechende pflanzliche Proteine beruhen zum einen auf immunologische Nachweisverfahren wie beispielsweise ELISA oder Western Blotting. Eine andere Möglichkeit ist die Analyse mit eindimensionaler oder zweidimensionaler Elektrophorese, die unter Umständen mit immunologischen Nachweisverfahren kombiniert werden kann.

Ein großer Nachteil der immunologischen Nachweismethoden ist, daß die hierbei eingesetzten Antikörper in der Regel auf einzelne Komponenten, beispielsweise bestimmte Subgruppen der Gliadine beschränkt sind. Entsprechende Nachweisverfahren sind daher nicht universell ein setzbar. Nachteilig bei Nachweismethoden, die auf Elektrophorese beruhen, ist, daß die Durchführung entsprechender Analysen sehr zeit- und personalintensiv ist und die Ergebnisse oftmals nur schwer reproduzierbar sind. Daher sind die Ergebnisse allgemein wenig aussagekräftig. Darüber hinaus eignen sich diese Methoden in der Regel nicht für Analysen mit hohen Probendurchsätzen, wie es für die in diesem Bereich notwendigen Reihenuntersuchungen zu fordern ist. Ein weiterer Nachteil liegt darin, daß die Methoden im allgemeinen nicht in der Lage sind, kleine Proteine, insbesondere Peptide (< 9–10 kDa) nachzuweisen.

Die Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, ein Verfahren zum Nachweis von pflanzlichen Molekülen bereitzustellen, welches zum einen sehr zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse erbringt sowie zum anderen auch für Analysen mit hohen Probendurchsätzen geeignet ist. Darüber hinaus soll das Verfahren mit relativ geringem personellen Aufwand durchführbar sein, so daß derartige Untersuchungen standardmäßig für Routineanalysen eingesetzt werden können.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis von pflanzlichen Molekülen, wie es im Anspruch 1 formuliert ist. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Verfahrens sind in den Ansprüchen 2 bis 19 aufgeführt. Anspruch 20 betrifft einen Kit zum Nachweis von pflanzlichen Molekülen. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dazu vorgesehen, daß pflanzliche Moleküle, insbesondere Peptide und/oder Proteine, in insbesondere biologischen Proben nachgewiesen werden. Unter biologischen Proben sind solche Proben zu verstehen, die Peptide und/oder Proteine biologischen Ursprungs enthalten. Bei diesen Proben kann es sich beispielsweise um Mehle, Extrakte aus Getreiden oder anderen pflanzlichen Rohstoffen handeln. Andererseits können entsprechende Moleküle auch in bereits zubereiteten Nahrungsmitteln, wie beispielsweise in Backwaren oder ähnlichem, nach entsprechender Aufbereitung nachgewiesen werden. Darüber hinaus können die pflanzlichen Moleküle auch in beispielsweise Patientenmaterial oder ähnlichem nachgewiesen werden. Hierfür eignen sich unter anderem Blut oder andere Körperflüssigkeiten, Gewebeproben, beispielsweise Gewebeproben aus dem Darm, Magen- oder Darminhalt oder Fäzes.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben, die gegebenenfalls entsprechend aufbereitet sind, auf eine aktive Oberfläche gegeben werden. Diese Oberfläche ist so ausgestaltet, daß sie mit den nachzuweisenden pflanzlichen Molekülen Wechselwirken, insbesondere selektiv wechselwirken kann. Nach Ausbildung der entsprechenden Wechselwirkungen werden an der Oberfläche nicht gebundene Moleküle durch Waschen entfernt. Anschließend wird das Molekulargewicht der auf der Oberfläche gebundenen Moleküle mit Hilfe von massenspektrometrischen Methoden bestimmt. Diese massenspektrometrische Bestimmung kann anhand der noch an der Oberfläche gebundenen Moleküle durchgeführt werden. Andererseits ist es auch möglich, die entsprechenden Moleküle erst von der Oberfläche abzutrennen und danach massenspektrometrisch zu bestimmen. Mit dieser massenspektrometrischen Analyse können einerseits die intakten pflanzlichen Moleküle nachgewiesen werden. Andererseits können die Moleküle im Verlauf des Verfahrens oder vorher auch gespalten werden, so daß dann die Fragmente massenspektrometrisch nachgewiesen werden. Dieser massenspektrometrische Nachweis erlaubt die Identifizierung der in der Probe enthaltenen pflanzlichen Moleküle, die von Interesse sind.

Durch die aktive Oberfläche wird ein Verfahrensschritt bereitgestellt, der eine auf Affinität beruhende Anreicherung der nachzuweisenden pflanzlichen Moleküle erlaubt. Durch Kopplung dieser Anreicherung mit einer massenspektrometrischen Analyse bzw. Identifizierung kann auf sehr direktem und schnellem Weg ein „Protein- bzw. Peptidfingerabdruck" der Probe geliefert werden, der eine schnelle und zuverlässige Identifizierung von potentiell pathogenen pflanzlichen Molekülen, insbesondere pflanzlichen Peptiden und/oder Proteinen ermöglicht.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann also beispielsweise der Gehalt an Gluten, Gliadin, Secalin und/oder Hordein untersucht werden. Diese Proteine aus Getreide sind für die eingangs erwähnten Unverträglichkeiten (Zöliakie, Sprue) zumindest mitverantwortlich und daher bei der Analyse von Nahrungsmitteln bzw. Nahrungsrohstoffen von sehr großem Interesse. Ferner können auch Peptide nachgewiesen werden, die entweder bereits nativ im Getreide oder dessen Produkten vorhanden sind, oder die infolge eines Abbaus von Proteinen entweder bei der Verarbeitung des Getreides oder bei den Verdauungsvorgängen im Magen-Darm-Trakt entstehen können. Dieser Aspekt ist von besonderer Bedeutung, da vor allem auch Peptide, die im Verlauf der Verdauung entstehen, in der Pathogenese der Zöliakie von eminenter Bedeutung sind.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zeichnet sich die aktive Oberfläche gemäß Verfahrensschritt (a) durch immobilisierte Antikörper aus. Diese Antikörper können direkt oder indirekt über einen Spacer auf der Oberfläche fixiert sein. Durch die Verwendung eines Spacers kann vorteilhafterweise die Orientierung des Fängermoleküls, insbesondere des Antikörpers, kontrolliert werden. Bei der entsprechenden Oberfläche handelt es sich beispielsweise um die Oberfläche eines Protein-Chips, wie er dem Fachmann geläufig ist. Es kann sich jedoch auch um andere Oberflächen handeln, wie beispielsweise übliche Chromatographiematerialien (Agarose, Cellulose o. ä.), wie sich dem Fachmann erschließen wird.

Die Wahl der geeigneten Antikörper richtet sich selbstverständlich nach dem nachzuweisenden pflanzlichen Molekül. Soll mit dem erfindungsgemäßen Verfahren beispielsweise der Gehalt an potentiell pathogenen pflanzlichen Proteinen wie Gluten, Gliadin, Secalin und/oder Hordein nachgewiesen werden, werden Antikörper gewählt, die spezifisch gegen diese Proteine gerichtet sind. Hierbei kann es sich zum einen um monoklonale Antikörper handeln, die eine sehr hohe Spezifität aufweisen. Andererseits kann es auch bevorzugt sein, polyklonale Antikörper zu wählen, die im allgemeinen verschiedene Epitope der entsprechenden pflanzlichen Proteine erkennen und so eine universellere Einsatzmöglichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglichen. Ob eine mehr oder weniger spezifische Wahl der Antikörper vorgenommen wird, hängt vom jeweiligen Anwendungsfall ab. Soll z. B. allgemein der Gehalt an Gluten, Gliadin, Secalin und/oder Hordein analysiert werden, bietet es sich an, Antikörper gegen diese Proteine zu wählen, die bezüglich der Bindung an bestimmte Epitope nicht sehr spezifisch sind, wie z. B. polyklonale Antikörper. Soll andererseits beispielsweise eine bestimmte Sorte nachgewiesen werden, die einen bestimmten Subtyp von Gluten oder ähnlichem enthält, kann es vorteilhaft sein, einen sehr spezifischen monoklonalen Antikörper zu verwenden.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die aktive Oberfläche durch immobilisierte Rezeptoren gebildet. Hierbei werden natürliche oder künstliche Rezeptoren eingesetzt, die mit den nachzuweisenden pflanzlichen Molekülen Wechselwirken können. Die Rezeptoren können mit oder ohne Spacer immobilisiert sein. Die Wahl entsprechender spezifischer Rezeptoren hängt von dem nachzuweisenden pflanzlichen Molekül ab. Die Verwendung von Rezeptoren anstatt von Antikörpern kann bevorzugt sein, da Rezeptoren im Vergleich zu den sehr komplex aufgebauten Antikörpern unter Umständen eine größere Stabilität gegenüber verschiedenen Versuchsbedingungen aufweisen können. Daher kann die Verwendung von Rezepto ren insbesondere bei einem Versuchsaufbau, der für eine Vielzahl von Reihenuntersuchungen vorgesehen ist, vorteilhaft sein. Voraussetzung hierfür ist, daß entsprechende Rezeptoren mit geeigneter Spezifität für die nachzuweisenden pflanzlichen Moleküle zur Verfügung stehen. Durch eine geeignete Wahl der Rezeptoren können z. B. bestimmte Glycoprotein-Varianten der pflanzlichen Moleküle angereichert werden, deren Nachweis von Interesse sein kann.

Neben den genannten Antikörpern oder Rezeptoren können aber auch andere Moleküle oder Strukturen verwendet werden, die eine spezifische Selektivität erlauben. Dies können beispielsweise Aptamere sein oder Oberflächen, die eine Anreicherung beispielsweise über einen negativen Molekülabdruck ermöglichen.

Zur Herstellung von entsprechenden aktiven Oberflächen werden auf in geeigneter Weise voraktivierten Oberflächen entsprechend üblichen Standardmethoden die Fängermoleküle, also insbesondere Antikörper (monoklonal, polyklonal), Rezeptoren, Aptamere oder negative Molekülabdrücke, immobilisiert. Diese Fängermoleküle sind in der Lage, bestimmte Moleküle, insbesondere Peptide oder Proteine zu binden und so das entsprechende Peptid oder Protein bzw. Fragmente dieser Peptide oder Proteine in seinen heterogenen Varianten aus komplexen Matrizes (Probe) zu fischen. Die Kopplung von Antikörpern und Rezeptoren erfolgt in üblicher Weise während einer Inkubationsperiode, deren Parameter (Dauer, Temperatur etc.) von der Matrix und der Konzentration des jeweils zu untersuchenden Peptids oder Proteins abhängig sind.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die aktive Oberfläche chromatographische Materialien auf oder besteht aus solchen Materialien. Voraussetzung hierfür ist, daß das entsprechende chromatographische Material eine ausreichende Spezifität bezüglich der nachzuweisenden pflanzlichen Moleküle aufweist, so daß eine entsprechende Anreicherung durch das Material erfolgen kann. Beispiele für geeignete Materialien sind insbesondere Ionenaustauschermaterialien wie Anionenaustauscher oder Kationenaustauscher. Es können z. B. auch hydrophob wechselwirkende Materialien eingesetzt werden. Die Spezifität des chromatographischen Materials hinsichtlich des nachzuweisenden pflanzlichen Moleküls oder der nachzuweisenden pflanzlichen Moleküle hängt zum einen natürlich von der Struktur des nachzuweisenden Moleküls ab. Zum anderen hängt die Spezifität von den gewählten Bedingungen in diesem Verfahrensschritt, beispielsweise pH-Wert und/oder Salzgehalt des Puffers, ab. Durch wenige Versuche wird der Fachmann in der Lage sein, entsprechende Materialien und Bedingungen zu finden, die für die Anreicherung bzw. den Nachweis des jeweiligen nachzuweisenden pflanzlichen Moleküls geeignet sind.

Weitere mögliche Ansatzpunkte zur Anreicherung der gesuchten pflanzlichen Moleküle sind Oberflächen bzw. Oberflächenmodifikationen mit bekannten oder bisher noch unbekannten physiko-chemischen Eigenschaften wie beispielsweise Farben, Kunststoffe oder Metalle. Beispielsweise kann Teflon als aktive Oberfläche eingesetzt werden. Ein weiteres Beispiel für eine aktive Oberfläche sind mit Silikonoxid beschichtete Oberflächen, die insbesondere zur Anreicherung hydrophiler Moleküle geeignet sind. Weitere geeignete aktive Oberflächen erschließen sich dem Fachmann.

Nach Ausbildung von Wechselwirkungen zwischen nachzuweisendem pflanzlichen Molekül und aktiver Oberfläche werden in einem nachfolgenden Schritt (b) die nicht gebundenen bzw. nicht wechselwirkenden Moleküle durch Waschen entfernt. Bei diesem Schritt sollte gewährleistet werden, daß durch das Waschen nicht die Wechselwirkung zwischen den nachzuweisenden pflanzlichen Molekülen und der aktiven Oberfläche unterbunden wird, so daß hierbei nicht die spezifisch gebundenen Moleküle unbeabsichtigt von der Oberfläche entfernt werden.

Entsprechende. Bedingungen für diesen Waschschritt erschließen sich dem Fachmann.

Im nächsten Verfahrensschritt (c) wird das Molekulargewicht der auf der Oberfläche gebundenen Moleküle mit Hilfe von massenspektrometrischen Methoden bestimmt, so daß eine Identifizierung der pflanzlichen Moleküle, insbesondere Peptide und/oder Proteine, möglich ist. Durch die Kombination der hohen Selektivität des Anreicherungsschrittes (a) mit der hohen Genauigkeit der massenspektrometrischen Bestimmung des Molekulargewichts der angereicherten Moleküle gemäß Verfahrensschritt (c) stellt das erfindungsgemäße Verfahren eine analytische Methode bereit, die bisher ungelöste Probleme im Bereich der Lebensmittelanalyse und insbesondere bei der Getreideanalyse löst. Die Massenspektrometrie erlaubt eine epitopfreie Charakterisierung der verschiedenen pflanzlichen Moleküle über einen weiten Massenbereich. Da die Massenspektrometrie allein jedoch nur eine relativ geringe Auftrennungskapazität gewährleistet, wird es erst durch die erfindungsgemäße Kombination mit dem Anreicherungsschritt auf einer aktiven Oberfläche möglich, mit ausreichender Zuverlässigkeit, Genauigkeit und Schnelligkeit entsprechende pflanzliche Moleküle nachzuweisen.

Bei der massenspektrometrischen Methode handelt es sich in besonders bevorzugter Weise um eine flugzeitmassenspektrometrische Analyse (TOF-MS). Eine solche oder vergleichbare Analyse erlaubt eine Differenzierung der pflanzlichen Moleküle auf der Basis der Molekülmasse, wobei hierbei die angereicherten Moleküle durch Zugabe einer energieabsorbierenden Matrix mit Hilfe eines Laserstrahls ionisiert und anschließend in einem elektrischen Feld beschleunigt werden. Aus der Flugzeit der Stoffe vom Probenträger bis zum Detektor am Ende eines Flugtunnels wird die Molekülmasse der angereicherten Partikel und ihrer eventuell vorhandenen Fragmente bestimmt. Die Differenzierung und Charakterisierung erfolgt in der Regel auf der Basis des Unterschiedes der Moleküle und ihrer eventuell vorhandenen Fragmente.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die massenspektrometrische Methode eine „surface enhanced laser desorption and ionization" (SELDI)-Analyse, die vorteilhafterweise mit TOF-MS kombiniert werden kann. Diese an sich bekannte Methode beruht darauf, daß die auf einer entsprechenden aktiven Oberfläche gebundenen Moleküle mit einem Laserstrahl von der Oberfläche gelöst und anschließend einer Massenspektrumsanalyse zugeführt werden. Hieraus erhält man, ähnlich einer zweidimensionalen Gelanalyse, einen „Proteinfingerabdruck" bzw. einen „Peptidfingerabdruck".

Neben der reinen Identifizierung bestimmter pflanzlicher Moleküle können hierbei die entsprechenden Moleküle auch quantifiziert werden. Eine entsprechende Quantifizierung kann dabei anhand von Standards erfolgen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die pflanzlichen Moleküle vor dem Aufgeben auf die aktive Oberfläche oder nach der Bindung an die Oberfläche modifiziert, insbesondere enzymatisch gespalten. Durch die Analyse von Spaltprodukten bzw. Fragmenten können zum einen weitere Rückschlüsse auf die Natur des jeweils nachzuweisenden pflanzlichen Moleküls geschlossen werden. Durch die Analyse von bestimmten Fragmentmustern können z. B. Fehler ausgeschlossen werden, die bei der Identifizierung bzw. massenspektrometrischen Bestimmung des intakten Moleküls auftreten könnten. Bei der Untersuchung von pathogenen Molekülen kann die Modifizierung bzw. Spaltung der entsprechenden Moleküle auch den weiteren Vorteil haben, daß für das Personal, welches das erfindungs gemäße Verfahren durchführt, ein Kontaminationsrisiko ausgehend von dem Probenmaterial, vermieden oder verringert werden kann.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Verfahren automatisiert durchgeführt. Besonders bevorzugt ist es, wenn die aktive Oberfläche Teil einer miniaturisierten Vorrichtung ist. Besonders geeignet sind hierfür beispielsweise Protein- und/oder Antikörper-Chips sowie chromatographische Chips. Hierdurch können Analysen mit hohem Probendurchsatz verwirklicht werden. Andererseits können hierdurch auch die Probenvolumina minimiert werden, so daß, beispielsweise wenn mit Patientenmaterial gearbeitet werden soll, nur sehr wenig Material für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlich ist. Die Automatisierung ist weiterhin deshalb sehr vorteilhaft, da so mit geringerem personellem Aufwand gearbeitet werden kann. Da das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise mit großem Vorteil in Routineuntersuchungen im Lebensmittelbereich eingesetzt werden kann, sind geeignete Automatisierungsprozesse, die sich dem Fachmann erschließen, sehr vorteilhaft.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Verfahren zum Nachweis von Gliadinen als Untergruppe des Glutens eingesetzt. Dies geschieht vor allem im Hinblick auf den Nachweis von Kontaminationen in Lebensmitteln für Zöliaker, welche für eine wirksame Therapie dieser Krankheit frei von Gluten sein müssen.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhafterweise so durchgeführt werden, daß zunächst Peptide und/oder Proteine aus einer Probe extrahiert werden. Bei dieser Probe kann es sich beispielsweise um Patientenmaterial handeln. Andererseits kann es sich hierbei auch um eine Lebensmittel- bzw. Lebensmittelrohstoffprobe wie z. B. Mehl handeln. Dieser Extrakt wird auf mindestens einen Chip mit chromatographischer Oberfläche gegeben. Nach der Ausbildung von Wechselwirkungen zwischen dem pflanzlichen Protein bzw. Peptid und der Oberfläche werden nicht gebundene Proteine und/oder Peptide bzw. andere Substanzen durch Waschen entfernt. Danach wird eine energieabsorbierende Substanz auf den Chip gegeben. Schließlich werden die Gliadine durch ein massenspektrometrisches Verfahren, insbesondere durch SELDI oder SELDI-TOF-MS, identifiziert und nachgewiesen. Dies geschieht gegebenenfalls nach Abtrennung der Peptide und/oder Proteine von der Oberfläche des Chips.

Vorteilhafterweise kann das Verfahren so durchgeführt werden, daß ein Extrakt auf verschiedene aktive Oberflächen aufgetragen wird, beispielsweise auf verschiedene chromatographische Oberflächen. Bei der Auswertung der Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens können dann die verschiedenen massenspektrometrischen Profile einer Probe, die auf diese Weise erhalten werden, mit anderen Referenz- oder Parallelproben verglichen werden.

Neben der oben beschriebenen Möglichkeit, bestimmte pathogene Proteine und/oder Peptide nachzuweisen, eignet sich dieses Verfahren auch in hervorragender Weise, die Qualität von Nahrungsmitteln oder beispielsweise die Getreidequalität zu untersuchen. Auf diese Weise können beispielsweise Aussagen über Backeigenschaften getroffen werden. Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Verfahren in vorteilhafter Weise für den Nachweis von Sorten genutzt werden, wenn entsprechende pflanzliche Moleküle, insbesondere Peptide und/oder Proteine, bekannt sind, die für die jeweilige nachzuweisende Sorte charakteristisch sind. Das Gleiche gilt für den Nachweis des Herkunftsortes der pflanzlichen Probe, vorausgesetzt, es stehen bestimmte charakteristische Moleküle hierfür zur Verfügung. Weiterhin kann das Verfahren bei der Züchtung von Pflanzen eingesetzt werden. Beispielsweise können mit diesem Verfahren Zuchterfolge nachgewiesen werden bzw.

Screenings von Getreide oder anderen Pflanzen vor der Aussaat im Hinblick auf Neuzüchtungen durchgeführt werden.

Schließlich umfaßt die Erfindung einen Kit zum Nachweis von pflanzlichen Molekülen, insbesondere von Peptiden und/oder Proteinen, in insbesondere biologischen Proben. Dieser Kit ist dadurch gekennzeichnet, daß er zumindest eine aktive Oberfläche gemäß der obigen Beschreibung umfaßt. Bezüglich weiterer Einzelheiten des erfindungsgemäßen Kits wird auf das bereits Gesagte verwiesen.

Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen und den Beispielen in Verbindung mit der Figur. Hierbei können die verschiedenen Merkmale jeweils für sich oder in Kombination miteinander verwirklicht sein.

In der Figur ist gezeigt:

1 Massenspektrometrische Darstellung des Proteinprofiles von Gliadinen aus verschiedenen Weizenmehlen nach selektiver Anreicherung auf verschiedenen aktiven Oberflächen (SAX = Anionenaustauscher, NP = Normalphase, WCX = Kationenaustauscher).

1. Extraktion der Pflanzenproteine
Als Ausgangsmaterial dienen beispielsweise Getreide, Mehle oder Backwaren. Weiterhin können auch Gewebe oder Körperflüssigkeiten erfindungsgemäß analysiert werden. Die Extraktion erfolgt zunächst nach üblichen Methoden. Beispielsweise können die interessierenden pflanzlichen Moleküle, insbesondere pflanzlichen Peptide und/oder Proteine, in 70%igem Ethanol für 4 h unter kontinuierlichem Schütteln bei Raumtemperatur extrahiert werden. Die Überstände werden entweder direkt weiterverarbeitet oder durch Lyophilisierung getrocknet und bei etwa 4°C oder tiefgefroren bis zur weiteren Verwertung gelagert.
2. Vorbereitung der Antikörper-Chips
Spezifische monoklonale bzw. polyklonale Antikörper gegen das zu untersuchende Peptid und/oder Protein sowie eine IgG-Kontrolle in einer Konzentration zwischen üblicherweise 0,01 und 0,09 mg/ml werden in einem Volumen von 5–20 μl auf die voraktivierten Oberflächen des Protein-Chips aufgetragen. Anschließend erfolgt die Inkubation in einer wasserdampfgesättigten Kammer (Inkubationskammer) für 1–2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht (14–16 h) bei etwa 4°C. Während dieser Inkubationsperiode werden die Antikörper kovalent an die voraktivierte Protein-Chip-Oberfläche gebunden. Die verbleibenden freien Stellen des Protein-Chips werden durch die nun anschließende Zugabe von 20 μl Glycerinlösung (0,1 M, pH 7,8) blockiert. Es erfolgt eine weitere Inkubation für 20 min. bei Raumtemperatur in der Inkubationskammer. Anschließend wird die überschüssige Antikörperlösung durch mehrmaliges Waschen entfernt. Hierfür werden die Flächen mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,8) mit 50 bis 100 μl gewaschen. Anschließend erfolgt eine zweimalige Waschung mit jeweils 300 μl PBS-Lösung, die 0,5 % (v/v) Triton X-100 enthält. Die Inkubationsdauer bei Raumtemperatur beträgt dabei jeweils 20 min. in der Inkubationskammer. Anschließend erfolgen zwei weitere Waschschritte mit jeweils 300 μl PBS (ohne Triton X-100) für 10 min. bei Raumtemperatur in der Inkubationskammer. Gegebenenfalls kann als Spacer beispielsweise Protein A oder Protein G zwischen Oberfläche und Antikörper eingefügt werden.
3. Vorbereitung chromatographischer Oberflächen
Bis auf eine entsprechende Waschung bzw. Aktivierung mit geeignetem Puffer sind bei Chips mit chromatographischen Oberflächen, insbesondere bei Chips mit Ionenaustauschermaterialien, oder anderen üblichen chromatographischen Oberflächen keine weiteren Vorbereitungen notwendig.
4. Aufgabe der Probe
Die Probe, die die nachzuweisenden pflanzlichen Moleküle enthält, wird direkt auf den Antikörper-Chip oder den chromatographischen Chip mit Ionenaustauscher-Oberfläche aufgegeben und nachfolgend für einen Zeitraum von üblicherweise bis zu 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Inkubation kann auch über Nacht bei etwa 4°C erfolgen. Anschließend wird mit Puffern selektiver Stringens gewaschen. Die Inkubationsparameter (Dauer, Temperatur etc.) und die Waschbedingungen sind von der Chipoberfläche sowie der Matrix (Probe) und der Konzentration des jeweils zu untersuchenden Peptids oder Proteins abhängig. Im folgenden Waschschritt erfolgt die Entfernung aller auf der aktiven Oberfläche vorhandenen Proteine, die nicht spezifisch an die aktive Oberfläche gebunden haben. Nachfolgend wird der Chip mit einer energieabsorbierenden Substanz behandelt. Gegebenenfalls kann ein Trocknen des Chips erforderlich sein. Als energieabsorbierende Substanz wird beispielsweise α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure (2 mg/ml) in 50% (v/v) Acetonitril und 0,2% (v/v) Trifluoressigsäure zugegeben.
5. Molekulargewichtsbestimmung der pflanzlichen Moleküle
Im abschließenden Verfahrensschritt werden die pflanzlichen Moleküle über ihre unterschiedlichen Molekulargewichte nachgewiesen und/oder identifiziert. Als besonders geeignetes Verfahren wird hier SELDI-TOF-MS eingesetzt. Die Analyse kann hierbei über beispielsweise Flugzeitmassenspektrometer oder vergleichbare Apparaturen erfolgen, die eine Differenzierung auf der Basis der Molekülmasse oder auch anderen Selektions- und Detektionsmethoden erlauben. Hierfür werden die Moleküle nach der erfolgten Zugabe einer energieabsorbierenden Matrix (α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure) mit Hilfe eines Laserstrahls ionisiert und anschließend in einem elektrischen Feld beschleunigt. Die Schußfrequenz des Laserstrahls beträgt hierbei im Durchschnitt 50 bis 100 Schüsse. Aus der Flugzeit der Stoffe wird die Molekülmasse der Partikel bzw. der pflanzlichen Moleküle und ihrer eventuell vorhandenen Fragmente bestimmt. Hierdurch können die nachzuweisenden pflanzlichen Moleküle differenziert und identifiziert werden. Weiterhin ist auch eine Quantifizierung der pflanzlichen Moleküle möglich.
6. „Peptidfingerabdrücke" der Gliadine aus verschiedenen Weizenmehlen
Zunächst werden die Gliadine nach Patey and Evans (Patey A.L. und Evans D.J., 1973: Large-scale preparation of gliadin proteins. J. Sci. Food. Agric., 24, 1229–1233.) in 70% Ethanol bei Raumtemperatur (RT) unter Schütteln für 20 min. extrahiert. Die Probe wird anschließend bei 13.000 × g für 10 min. bei RT zentrifugiert und der Überstand anschließend abgenommen. Zur Analytik werden jeweils 10 μl des Überstandes verwendet.
Für die einzelnen Oberflächen stellt sich die weitere Vorgehensweise folgendermaßen dar: Alle Schritte werden zunächst in einem Bioprozessor (vergleichbar einer 96-well-Miktotiterplatte) durchgeführt, der es erlaubt, größere Mengen auf die Chip-Oberfläche aufzutragen.
Bei der Verwendung eines Chips mit einer Anionenaustauscher-Oberfläche wird die Oberfläche zunächst mit 300 μl Natriumphosphat-Puffer (0,1 M Natriumphosphat, pH 6,5) für 5 min. bei RT aktiviert. Anschließend wird der Puffer entfernt und die Probe (10 μl) verdünnt in 190 μl Probenpuffer (0,1 M Natriumphosphat, pH 6,5) aufgegeben. Die Inkubation erfolgt für 60 min. bei RT auf einem Schüttler. Zur Entfernung von nichtgebundenem Material und zur Verminderung des Hintergrundsignals erfolgt eine zweimalige Waschung der Chipoberfläche für jeweils 15 min. bei RT unter Schütteln mit obigem Puffer. Anschließend wird der Chip aus dem Bioprozessor entnommen und der Puffer durch zweimaliges Waschen in destilliertem Wasser (HPLC grade) entfernt. Auf die noch feuchte Oberfläche werden jeweils 1 μl energieabsorbierende Matrix (angesetzt in 198 μl Wasser und 2 μl Trifluoressigsäure) gegeben. Nach der Trocknung erfolgt die Messung. Als energieabsorbierende Substanz wird zur Detektion von Proteinen (> 15 kDa) α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure (2 mg/ml) verwendet. Bei Peptiden wird Zimtsäure zugesetzt, die in vergleichbarer Weise angesetzt wird.
Bei der Verwendung einer Kationenaustauscheroberfläche erfolgt die Aktivierung zunächst mittels 10 mM HCl (300 μl für 5 min. bei RT). Anschließend wird diese Lösung entfernt und 300 μl Natriumphosphat-Puffer (0,1 M Natriumphosphat, pH 6,5) für 5 min. bei RT aufgegeben. Bei der Verwendung eines Normalphasen-Chips werden direkt 5 μl Probe als Tropfen aufgegeben und nach Inkubation für 5 min. mit destilliertem Wasser (HPLC grade) die nicht gebundenen Komponenten abgewaschen. Bei dem Normalphasen-Chip handelt es sich um einen mit Silikonoxid beschichteten Chip, der zur Anreicherung hydrophiler Moleküle geeignet ist. Bei der Verwendung von Oberflächen mit hydrophoben Wechselwirkungen wird die Oberfläche mit 5 μl Acetonitril aktiviert (5 min., RT). Nach Entfernung des Acetonitrils durch Absaugen wird die Probe (1–5 μl) entweder direkt oder in Acetonitril verdünnt aufgegeben. Durch den Anteil Acetonitril in der Probe kann die Hydrophobizität kontrolliert werden. Die Probe wird für 20 min. bei RT inkubiert und anschließend im stehenden Tropfen zweimal mit destilliertem Wasser (HPLC grade) gewaschen. Alle weiteren Schritte entsprechen der Beschreibung der Vorgänge bei einem Anionenaustauscher.
Zur massenspektrometrischen Bestimmung (SELDI-TOF-MS) wird eine Laserintensität zwischen 150 und 220 gewählt, die Sensitivität des Detektors liegt bei 9. Die Datensammlung je Spot erfolgt an 10 Punkten mit jeweils 10 Schüssen. Die Kalibrierung des Systems erfolgt über ein Protein- und Peptidgemisch bekannter Zusammensetzung und bekannter Molekularmassen.
Aus 1 gehen die massenspektrometrischen Profile von Gliadinen aus unterschiedlichen Weizenmehlen (1 bis 5) hervor. Es ist jeweils in einer Reihe das massenspektrometrische Profil des Extraktes eines Weizenmehls nach Anreicherung auf verschiedenen aktiven Oberflächen (SAX = Anionenaustauscher, NP = Normalphase, WCX = Kationenaustauscher) im Massenbereich von 15 bis 45 kDa gezeigt. Die Unterschiede zwischen den verschiedenen Mehlen werden insbesondere bei den Normalphase- und Kationenaustauscher-Oberflächen deutlich.

Claims

Verfahren zum Nachweis von pflanzlichen Molekülen, insbesondere Peptiden und/oder Proteinen, in insbesondere biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet, daß a) die Proben mit den Molekülen auf eine aktive Oberfläche gegeben werden, b) die an der Oberfläche nicht gebundenen Moleküle durch Waschen entfernt werden und c) das Molekulargewicht der auf der Oberfläche gebundenen Moleküle, gegebenenfalls nach Abtrennung von der Oberfläche, mit Hilfe von massenspektrometrischen Methoden bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Moleküle Proteine aus Getreide sind, insbesondere Gluten, Gliadin, Secalin und/oder Hordein.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Oberfläche Antikörper direkt oder über einen Spacer immobilisiert sind.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper spezifisch gegen Gluten, Gliadin, Secalin und/oder Hordein gerichtet sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Oberfläche Rezeptoren immobilisiert sind.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Rezeptoren spezifisch für Gluten, Gliadin, Secalin und/oder Hordein sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche chromatographische Materialien aufweist oder daß die Oberfläche aus chromatographischen Materialien besteht.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die chromatographischen Materialien Ionenaustauschermaterialien sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die massenspektrometrische Methode eine flugzeitmassenspektrometrische (TOF-MS) Analyse ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die massenspektrometrische Methode eine „surface enhanced laser desorption and ionization" (SELDI)-Analyse, insbesondere eine SELDI-TOF-MS Analyse ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Moleküle vor dem Aufgeben auf die aktive Oberfläche oder nach der Bindung an die Oberfläche modifiziert, insbesondere enzymatisch gespalten werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren automatisiert durchgeführt wird, insbesondere mit hohem Probendurchsatz.
Verfahren nach einem der vorhergehendem Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die aktive Oberfläche Teil einer miniaturisierten Vorrichtung, insbesondere eines Protein-Chips, Antikörper-Chips und/oder chromatographischen Chips, ist.
Verfahren zum Nachweis von Gliadinen in Proben, dadurch gekennzeichnet, daß a) Proteine und/oder Peptide aus einer Probe, insbesondere einer Lebensmittelprobe, extrahiert werden, b) der Extrakt auf mindestens einen Chip mit chromatographischer Oberfläche gegeben wird, c) nach der Ausbildung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen und/oder Peptiden und Oberfläche nicht gebundene Proteine und/oder Peptide durch Waschen entfernt werden, d) eine energieabsorbierende Substanz auf den Chip gegeben wird und e) die Gliadine durch ein massenspektrometrisches Verfahren, insbesondere durch „surface enhanced laser desorption/ionization" (SELDI), gegebenenfalls nach Abtrennung von der Oberfläche des Chips, nachgewiesen werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur Untersuchung der Qualität von Nahrungsmitteln eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur Untersuchung von Getreidequalität eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zum Nachweis von Pflanzensorten eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zum Nachweis des Herkunftsortes einer Probe eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren bei der Züchtung von Pflanzen, insbesondere beim Screening von Pflanzen und/oder Saatgut vor der Aussaat, und/oder bei der Auswertung von Zuchtergebnissen eingesetzt wird.
Kit zum Nachweis von pflanzlichen Molekülen, insbesondere Peptiden und/oder Proteinen, in insbesondere biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet, daß er zumindest eine aktive Oberfläche gemäß mindestens einem Merkmal der Ansprüche 1 bis 19 umfaßt.