DE60028005T2

DE60028005T2 - Verfahren für die qualitätskontrolle und standardisierung von medizinischen pflanzenprodukten

Info

Publication number: DE60028005T2
Application number: DE60028005T
Authority: DE
Inventors: John Peter HYLANDS; Jeremy Kirk Exhibition Road NICHOLSON; Elaine Claire Exhibition Road HOLMES; Michael John Cobham DUNN
Original assignee: Oxford Natural Products PLC
Current assignee: Oxford Natural Products PLC
Priority date: 1999-02-10
Filing date: 2000-02-10
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2020-02-11
Also published as: CN1201148C; US6806090B1; NO20013889L; HK1046730A1; NO20013889D0; JP2002536664A; GB2362953A; ATE326695T1; AU779104B2; ID30478A; MXPA01008030A; CN1357106A; AU2450800A; KR20010108196A; BR0008122A; EP1151292B1; GB0121376D0; EP1151292A1; CA2362058A1; DE60028005D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Anwendung der NMR-Spektroskopie und der biologischen Profilerstellung in Kombination mit rechnergestützten statistischen Verfahren bei der Standardisierung und Qualitätskontrolle von medizinischen Pflanzenmaterialien.
Weltweit haben im Laufe der Jahrhunderte zahlreiche Gesellschaften ein System der traditionellen Medizin entwickelt, das sich weitgehend auf die Verwendung von Pflanzen und Kräutern als therapeutischen Substanzen stützt. Der hier verwendete Ausdruck "Pflanze" umfasst Pflanzen, einschließlich Kräuter und Pilze.
In den letzten Jahren hat das Interesse der Allgemeinheit an der direkten Verwendung von Pflanzen und Pflanzenextrakten als gesundheitsfördernden Mitteln erheblich zugenommen; z.B. Panax ginseng, Allium sativum (Knoblauch), Ginkgo biloba, Hypericum perforatum (echtes Johanniskraut), Echinacea angustifolia und Aloe vera. Diese Pflanzen sind derzeit auf dem Markt als Kräuterprodukte und diätetische Ergänzungsmittel erhältlich. Der jährliche Verkaufswert dieser Produkte beläuft sich weltweit derzeit auf einige zehn Milliarden Dollar. Trotz dieses Vermarktungspotentials hat der Großteil der pharmazeutischen Industrie bisher der Entwicklung von medizinischen Produkten, die aus Pflanzen stammen, keine Beachtung geschenkt. Dies ist teilweise auf Probleme, die mit der komplizierten Natur und der von Natur aus gegebenen Ungleichmäßigkeit von Pflanzenmaterialien verbunden sind, zurückzuführen, wozu auch gehört, dass es kein anerkanntes System gibt, mit dem für derartige Produkte die Zulassungsbestimmungen für Arzneistoffe sichergestellt werden können.
Bei den Materialien, die in der Kräutermedizin und in der Medizin auf Pflanzengrundlage verwendet werden, handelt es sich üblicherweise um vollständige Pflanzen, Teile von Pflanzen oder Extrakte von Pflanzen oder Pilzen. Da Pflanzen- und Pilzmaterialien zahlreiche verschiedene chemische Komponenten enthalten, handelt es sich bei den Materialien definitionsgemäß um komplexe Gemische. Dadurch wird die Standardisierung und Qualitätskontrolle der Materialien stark erschwert. Bei zahlreichen Heilmitteln, die in der Traditionellen Chinesischen Medizin und in der Ayurveda-Medizin verwendet werden und die vorstehend erwähnt wurden, handelt es sich um Gemische aus zwei oder mehr Komponenten auf Pflanzenbasis. In der Tat handelt es sich daher um "Gemische von Gemischen", deren Analyse noch schwieriger ist als bei Kräuterheilmitteln, die auf dem Material einer einzigen Pflanze beruhen. Ferner sind die für derartige Heilmittel eingesetzten Rezepte und Herstellungsverfahren häufig unveröffentlicht. Diese Faktoren erschweren es erheblich, den Nachweis zu führen, dass zwei Proben eines gegebenen Heilmittels, die aus verschiedenen Quellen erhalten worden sind und vorgeblich identisch sind, tatsächlich das gleiche Gemisch von Bestandteilen enthalten. Dieses Problem, das zu Schwierigkeiten bei der Qualitätskontrolle von derartigen Materialien führt, hat bisher die Akzeptanz von aus dem Osten stammenden Kräuterheilmitteln bei Anwendern der Kräutermedizin im Westen eingeschränkt.
Die Pflanzen, die bei der praktischen Ausübung der Kräutermedizin verwendet werden, sind häufig lokal nicht verfügbar und müssen daher von Quellen bezogen werden, die vom Endverbraucher weit entfernt sind. Jedoch kann die Versorgung mit derartigen Pflanzen aus fernen Orten fehlerhaft und ungenau sein, da insbesondere keine ausführlichen Monografien über die Identität und Qualitätsstandards für zahlreiche dieser Pflanzen existieren. Das in medizinischen Pflanzen aufgefundene komplexe Gemisch von Bestandteilen variiert jedenfalls in starkem Umfang in Bezug auf den Typ und die Konzentration, und zwar in Abhängigkeit von zahlreichen Faktoren, zu denen der botanische Ursprung, der Ort, wo die Pflanze gewachsen ist, der Erntezeitpunkt der Pflanze, die Bedingungen, unter denen das Material gelagert und verarbeitet worden ist, und das eingesetzte Extraktionsverfahren gehören. Wenn diese Pflanzen wiederum mit anderen Pflanzen vermischt werden, z.B. gemäß traditionellen chinesischen Kräuterrezepten, besteht erheblicher Raum für Schwankungen der erhaltenen Produkte.
Es ist derzeit praktisch unmöglich, mit Gewissheit zu sagen, dass Proben eines vorgegebenen Pflanzenmaterials, das aus verschiedenen Quellen erhalten worden ist, eine einheitliche Identität und biologische Aktivität aufweisen. Die vorliegende Erfindung befasst sich mit diesem Problem, indem sie Maßnahmen zur Standardisierung von medizinischem Pflanzenmaterial bereitstellt. Der Lösungsweg berücksichtigt die Gesamtheit der Komponenten des Pflanzenmaterials, ohne dass irgendwelche Nachforschungen über die eigene Natur von einer der Komponenten selbst oder über die biochemische Beschaffenheit der Pflanzen erforderlich sind. Der Lösungsweg beinhaltet Ermittlungen über die Konsistenz eines Pflanzenmaterials sowohl auf chemischem als auch auf biologischem Niveau.
Somit stellt das erfindungsgemäße Verfahren eine Maßnahme zur Definition eines Standards für ein vorgegebenes medizinisches Pflanzenmaterial auf der Basis einer bekannten Probe des Materials bereit, das die speziellen Eigenschaften besitzt, die für den Standard angestrebt werden. Eine Spezifikation für den Standard wird aufgestellt, indem man die bekannte Probe (a) einer Kombination aus NMR-Spektroskopie und einer rechnergestützten Mustererkennungstechnik und (b) einer oder mehreren biologischen Profilierungstechniken unterwirft und die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse als Standardspezifikation definiert. Anschließend können als "Kandidaten" dienende Proben des Pflanzenmaterials dahingehend getestet werden, ob sie den Standard erfüllen, je nachdem, ob die Proben zu analytischen Ergebnissen führen, die teilweise oder ganz unter die aufgestellte Spezifikation fallen oder herausfallen, akzeptiert oder zurückgewiesen werden.
Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erstellen einer Standardspezifikation für ein medizinisches Pflanzenmaterial gemäß Anspruch 1 bereit.
Die sich aus (iv) von Anspruch 1 ergebende Standardspezifikation beruht somit auf den Ergebnissen von NMR-Spektroskopie und rechnergestützter Mustererkennung sowie auf den Ergebnissen von einer oder mehreren biologischen Profilierungstechniken. Wenn jedoch die als Kandidaten in Frage kommenden Proben des medizinischen Pflanzenmaterials dahingehend getestet werden, ob sie den Standard erfüllen, müssen sie nicht alle sowohl der NMR-spektroskopischen Analyse als auch der biologischen Profilierung unterzogen werden. Vielmehr werden sämtliche als Kandidaten in Frage kommenden Proben der NMR-Spektroskopie und der Mustererkennung unterzogen, während nur ausgewählte, als Kandidaten in Frage kommende Proben, die beispielsweise periodisch aus Chargen des medizinischen Pflanzenmaterials entnommen worden sind, dahingehend getestet werden, ob sie den biologischen Profilierungsaspekt der Standardspezifikation erfüllen. Der Zweck dieser Maßnahme besteht darin, dass man sich vorwiegend auf das analytische Verfahren stützt, das am besten geeignet ist, um bei hohem Durchsatz einen zweckmäßigen und raschen Betrieb zu ermöglichen. Dies wird durch NMR-Spektroskopie und Mustererkennungsanalyse erreicht. Die biologischen Techniken werden typischerweise auf willkürlicher Basis für die Validierung und zur Bestätigung der zu treffenden Entscheidungen herangezogen, um als Kandidaten in Frage kommende Proben auf der Basis der NMR-spektroskopischen Ergebnisse und der Mustererkennungsergebnisse zu akzeptieren oder zurückzuweisen.
Demzufolge kann die Erfindung ferner das Bereitstellen einer Probe eines medizinischen Pflanzenmaterials umfassen, wobei die Probe eine Standardspezifikation für das Material, das durch das vorstehend definierte erfindungsgemäße Verfahren definiert worden ist, erfüllt, wobei das Verfahren gemäß Anspruch 2 durchgeführt wird.
Dieses Verfahren wird zweckmäßigerweise unter hohem Durchsatz durchgeführt. Als Kandidaten in Frage kommende Proben werden Chargen des gleichen Pflanzenmaterials entnommen und den Stufen (i') bis (iv') von Anspruch 2 unterworfen.
Die biologischen Profilierungstechniken werden nachstehend ausführlich erörtert.
Bei der "Eigenschaft, die für den Standard angestrebt wird", kann es sich im erfindungsgemäßen Zusammenhang um beliebige Eigenschaften oder Qualitäten handeln, die ein medizinisches Pflanzenmaterial besitzt oder die diesem zugeschrieben werden. Zu Beispielen hierfür gehören eine klinisch nachgewiesene therapeutische Wirksamkeit, eine für pharmazeutische Zwecke geeignete Beschaffenheit, eine bestimmte Varietät einer vorgegebenen Pflanzengattung, eine authentische Herkunft (in Bezug auf Wachstumsort oder gewerbliche Charge) und ein bestimmter pathologischer Zustand. Beim in Frage stehenden pathologischen Zustand kann es sich um einen gegebenen Reifegrad, der durch den Erntezeitpunkt festgelegt wird, oder eine festgestellte Resistenz gegen Parasiten, Herbizide, Insektizide oder andere Mittel mit einem Potential zur Schädigung der in Frage stehenden Pflanze handeln.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung handelt es sich bei der Probe eines medizinischen Pflanzenmaterials, von der bekannt ist, "dass sie die eine oder sämtliche Eigenschaften, die bei dem Material angestrebt werden, besitzt", um eine Probe eines für echt erklärten und geprüften Pflanzenmaterials, dessen Herkunft bekannt ist. Eine Standardspezifikation wird aufgestellt, indem man die Probe der NMR-Spektroskopie/Mustererkennung und einer biologischen Profilierung gemäß den vorstehenden Angaben unterwirft. Anschließende Proben des gleichen Pflanzenmaterials, deren Herkunft oder Qualität unbekannt oder zweifelhaft ist, können sodann dahingehend getestet werden, ob sie die Standardspezifikation, die für das für echt erklärte und geprüfte Material erstellt worden ist, erfüllen.
Von der kernmagnetischen Resonanzspektroskopie (NMR) ist bekannt, dass sie ein analytisches Werkzeug bei der Untersuchung von Pflanzenmaterialien darstellt. Ein Beispiel für ihre Anwendung ist die Bestätigung der authentischen Beschaffenheit von Getränken, die sich von Obst ableiten. Bei einer Herangehensweise bedient man sich der Wasserstoff-1-NMR-Spektroskopie mit der Technik der ortsspezifischen, natürlichen Isotopenfraktionierung (SNIF-NMR) als Maßnahme zur Feststellung der Authentizität von Fruchtsäften. Beispielsweise beschreiben Martin et al. in JAOAC Int., Bd. 79 (4) (Juli-August 1996), S. 917–928, die Verwendung der Wasserstoff-2-NMR-Spektroskopie (SNIF-NMR-Verfahren) zum Erfassen von Fruchtsäften, die durch Zusatz von Rübenzucker verfälscht worden sind. Die Techniken stützen sich auf die Tatsache, dass dann, wenn ein Fruchtsaft oder Fruchtkonzentrat fermentiert wird, der Anteil der entstandenen Ethanolmoleküle, die am Methylrest monodeuteriert sind, durch Zugabe von Rübenzucker abnimmt. Somit weisen beliebige Fruchtsaftproben, denen Rübenzucker zugesetzt worden ist, ein signifikant geringeres (D/H)-Isotopenverhältnis als eine entsprechende authentische Probe auf. Diese Technik wurde auch auf den Nachweis einer Chaptalisation von Wein angewandt, wobei man sich der Wasserstoff-2-NMR-Spektroskopie bedient; ein Beispiel hierfür beschreiben Martin et al., J. Chim. Phys.-Chim. Biol., Bd. 80 (1983), S. 293–297.
Die Wasserstoff-1-NMR-Spektroskopie selbst kann nicht in zweckmäßiger Weise auf Pflanzenmaterialien angewandt werden, da sie Spektren erzeugt, deren Analyse visuell zu kompliziert ist. Eine Lösung für dieses Problem, über das beispielsweise Kowalski und Bender in J. Am. Chem. Soc., Bd. 94 (1972), S. 5632–5639, berichten, besteht darin, die Daten durch eine geeignete multivariate statistische Analyse (mit mehreren Merkmalsvariablen) zu analysieren, beispielsweise durch Analyse der Hauptkomponenten ("principal component analysis"; PCA). Hierbei handelt es sich um eine Technik der Mustererkennung, bei der man die Anzahl der Dimensionen der Daten durch Kombination von korrelierten Variablen (Peaks im Spektrum) unter Bildung eines neuen, kleineren Satzes von unabhängigen orthogonalen Variablen, die als Hauptkomponenten (PCs) bezeichnet werden, verringert. Diese PCs werden entsprechend ihrer Fähigkeit zur Erklärung der in den ursprünglichen Daten enthaltenden Varianz geordnet. Eine Projektion der Proben auf einen Zwischenraum, der durch die ersten PCs überspannt wird, liefert Erkenntnisse über die Ähnlichkeit oder Unähnlichkeit der Proben in Bezug auf ihre biochemische Zusammensetzung. Unbekannte Proben oder Testproben können ebenfalls auf diesen Zwischenraum projiziert werden und können somit häufig visuell mit Referenzproben verglichen werden (Vogels et al., J. Agric. Food Chem., Bd. 44 (1996), S. 175–180).
Die Kombination der Wasserstoff-1-NMR-Spektroskopie mit Mustererkennungstechniken wurde als ein Screening-Werkzeug bei der Bestimmung der Authentizität von Orangensaft eingesetzt (Vogels et al., (1996), a.a.O.). Die Verfälschung von verdächtigen Proben konnte durch diese Maßnahme nachgewiesen werden. Die Identität der verantwortlichen Verunreinigungen wurde sodann bestimmt, indem man die PCA-Ergebnisse mit bestimmten Resonanzen, die im ursprünglichen NMR-Spektrum vorlagen, korrelierte.
Eine Kombination der Wasserstoff-1-NMR-Spektroskopie und der Kohlenstoff-13-NMR-Spektroskopie mit PCA wurde ebenfalls dazu herangezogen, um Weine auf der Grundlage ihrer Herkunft zu differenzieren (Vogels et al., Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems: Laboratory Information Management, Bd. 21 (1993), S. 249–258). Diskriminierende Diagramme von Proben, die aus unterschiedlichen Weinanbaugebieten in Deutschland stammten, zeigten im diskriminierenden Bereich eine Clusterbildung der Proben aufgrund ihrer Herkunft, nachdem ein kontrolliertes Verfahren der statistischen Analyse durchgeführt worden war. Anschließend wurden rekonstruierte Spektren aus den PCA-Daten erstellt, um die NMR-spektroskopischen Peaks der speziellen Weinbestandteile (z.B. Monosaccharide, wie Glucose, Mannose, Rhamnose und Galactose), die für die Differenzierung verantwortlich sind, festzustellen. Über ähnliche Studien wurde auch anderweitig berichtet, z.B. von Vogels et al., in Trends in Flavour Research, Maarse & Van de Heij (Hrsg.), Elsevier, Amsterdam (1994), S. 99–106. Gleichermaßen beschreibt WO-96/18911 die Anwendung einer ähnlichen Technik zum Identifizieren von Pflanzenspezies, um ihre Herkunft zu bestimmen. Diese Technik eignet sich insbesondere zur Identifikation von Wein, da sie Polyphenole, die natürlicherweise in Traubenextrakten vorhanden sind, als Markerverbindungen heranzieht.
Eine weitere Anwendung der Wasserstoff-1-NMR-Spektroskopie und der Hauptkomponentenanalyse beschreiben Trevisan et al. in Kapitel 8 von "Characterisation of cell suspension cultures of hop, Humulus lupulus L."; an der Universität Leiden, Niederlande, vorgelegte Dissertation (veröffentlicht 1997), S. 95–122. Die Autoren führten eine Wasserstoff-1-NMR-Spektroskopie und eine PCA an behandelten Zellextrakten mit dem Ziel durch, spezifische Metaboliten zu identifizieren, die von den Zellen nach der Behandlung angereichert worden waren. Die Autoren waren daher an den sich ergebenden spezifischen Peaks im NMR-Spektrum interessiert, von denen bekannt ist, dass sie auf die individuellen Zellkomponenten zurückzuführen sind.
Im Gegensatz zu diesen in der Literatur beschriebenen Verfahren erfordert das NMR-spektroskopische und Mustererkennungsverfahren, das erfindungsgemäß herangezogen wird, weder eine Untersuchung über die biochemische Beschaffenheit der der Analyse unterzogenen Pflanze noch eine anschließende Korrelation der Mustererkennungsergebnisse mit speziellen NMR-spektroskopischen Resonanzen, die einer oder mehreren spezifischen Komponenten des Pflanzenmaterials zugeordnet werden. Statt dessen stützt sich das erfindungsgemäße Verfahren auf die Informationen, die durch das naturgegebene Muster von Clustern, die sich von NMR-Daten ableiten, präsentiert werden, wobei diese Daten wiederum die Gesamtheit der Verbindungen im Pflanzenmaterial, die auf die eingesetzte NMR-spektroskopische Technik reagieren, widerspiegelt.
Die NMR-Spektroskopie in Kombination mit einer rechnergestützten Mustererkennung (nachstehend als NMR-Spektroskopie/Mustererkennung bezeichnet), die beim erfindungsgemäßen Verfahren herangezogen wird, umfasst typischerweise Folgendes:

(a) man unterwirft die Testlösung oder den Testextrakt der NMR-Spektroskopie und zeichnet ein oder mehr NMR-Spektren auf; und
(b) man unterwirft die aus einem oder allen NMR-Spektren erhaltenen Daten einer multivariaten Analyse zur Erzeugung von einem oder mehreren Punkten auf einem Bewertungsdiagramm.

Bei der allgemeinen multivariaten Analysentheorie handelt es sich bei den Gesamtdaten um das Produkt aus Bewertungen und Beladungen. Das Beladungsdiagramm kann zur Definition des Beitrags der einzelnen Variablen (spektrale Deskriptoren) verwendet werden. Ein "Bewertungsdiagramm" ist eine grafische Darstellung, bei der Proben auf den Zwischenraum, der von zwei oder mehr Hauptkomponentenachsen überspannt wird, projiziert werden. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) ist ein bestimmtes Verfahren, das zur Analyse von Daten, die in einer multivariaten Analyse enthalten sind, verwendet wird. Bei der PCA kann die Position der Proben in einem Bewertungsdiagramm in zwei Dimensionen aufgetragen werden, wobei ähnliche Proben zur Clusterbildung neigen, während unähnliche Proben tendenziell sich über weite Strecken verteilen (Kowalski & Bender, a.a.O. (1972); und Trevisan, a.a.O. (1997).
Der Zusammenhang, in dem die Punkte auf dem Bewertungsdiagramm in dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugt werden, muss der gleiche sein, wenn die Standardspezifikation erstellt wird und wenn die als Kandidaten in Frage kommenden Proben in Bezug auf die Erfüllung des Standards analysiert werden. Die Komponenten der Methodik, die zur Ermittlung der Positionierung des oder der Punkte auf dem Bewertungsdiagramm für die bekannte Probe, die zur Definition des Standards verwendet wird, herangezogen werden, müssen vorliegen, wenn die NMR-spektroskopischen Daten der als Kandidaten in Frage kommenden Testproben bearbeitet werden. In der Praxis werden die Daten, die sich vom NMR-Spektrum der als Standard verwendeten Probe ableiten, einer geeigneten Manipulation durch multivariate statistische Methoden unterzogen, beispielsweise durch Hauptkomponentenanalyse oder kanonische Variation, zusammen mit den Daten des Standards. Der Akzeptanzbereich wird durch die Grenzen im Bewertungsdiagramm festgelegt, die auf der Grundlage der Position im Bewertungsdiagramm von Punkten, die sich von einem oder mehreren Extrakten der bekannten Probe ableiten, erstellt worden ist. Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung wird die multivariate Analyse unter Anwendung einer unüberwachten Methodik durchgeführt.
Die erfindungsgemäß verwendete NMR-spektroskopische Technik kann die Durchführung einer Wasserstoff-1-NMR-Spektroskopie bei hohem Feld in Kombination mit einer multivariaten Analyse umfassen. Gemäß diesem speziellen Aspekt werden die NMR-Spektren typischerweise bei 400 bis 700 MHz gemessen. Die daraus sich ergebenden Daten werden anschließend durch multivariate Analysensoftware analysiert, beispielsweise mit dem handelsüblichen "Pirouette"-Paket.
Beispiele für die hochauflösende Wasserstoff-1-NMR-Spektroskopie und Mustererkennungsanalyse werden von M. L. Anthony et al., Biomarkers, Bd. 1 (1996), S. 35–43, und Molecular Pharmacology, Bd. 46 (1994), S. 199–211, sowie von J. O. T. Gibb et al., Comp. Biochem. Physiol., Bd. 118B, Nr. 3 (1997), S. 587–598, erörtert.
Als eine Alternative zur eindimensionalen Wasserstoff-1-NMR-Spektroskopie bei hoher Feldstärke kann erfindungsgemäß die eindimensionale NMR-Spektroskopie unter Verwendung von anderen NMR- aktiven Kernen, wie Kohlenstoff-13 oder Wasserstoff-2, herangezogen werden. Ferner ist es möglich, einen Bereich von zweidimensionalen spektroskopischen Pulssequenz-Untersuchungen mit Wasserstoff-1 oder anderen NMR-aktiven Kernen, wie sie vorstehend erörtert wurden, einzusetzen. Dabei gelten jedoch in jedem Fall die gleichen Prinzipien und die Ergebnisse werden durch entsprechende multivariate Analyse analysiert.
Die NMR-Spektren können vor Durchführung der rechnergestützten Mustererkennung normiert werden oder unnormiert bleiben. Eine Normierung hat die Wirkung, dass die Peakintensität, die einen rein quantitativen Parameter der Spektren darstellt, als diskriminierender Faktor beseitigt wird. Eine Normierung wird daher typischerweise vorgenommen, wenn das Hauptziel des Verfahrens darin besteht, qualitative Unterschiede zwischen Spektren, die von verschiedenen Proben erhalten wurden, herauszustellen. Jedoch kann in einigen Fällen die Peakintensität als diskriminierender Faktor erforderlich sein, wenn absolute quantitative Werte, z.B. die Wirkungsstärke, benötigt werden. In derartigen Situationen bleiben die Spektren unnormiert.
Ein wichtiger Vorteil der NMR-Spektroskopie/Mustererkennung besteht darin, dass sie nicht durch ein selektives Abgabe- oder Nachweissystem beschränkt wird. Die Spektren können ohne vorherige Reinigung der Testlösung oder des Testextrakts aufgezeichnet werden, was es ermöglicht, dass sämtliche Komponenten der Probe, die ein Proton aufweisen, zum Gesamt-NMR-Spektrum beitragen können. Eine Analyse des Spektrums durch multivariate analytische Techniken, die vorstehend erörtert wurden, ergibt potentielle wertvolle Diskriminierungsmerkmale der Spektren, die unter Gewährleistung eines hohen Präzisionsgrads für die Beschreibung der komplexen Gemische der in den Pflanzenmaterialien enthaltenen Komponenten verwendet werden können.
Trotzdem ist es in bestimmten Fällen möglich, dass die Differenzierung der Proben des Pflanzenmaterials auf dem Bewertungsdiagramm schlecht ist, wobei Punkte, die sich von identischen Proben eines vorgegebenen Pflanzenmaterials ableiten, breit gestreut sind, statt einen Cluster zu bilden. Dieser Verlust an Ähnlichkeit entsteht, wenn eine Variation der Werte der NMR-spektroskopischen Verschiebung von einzelnen Komponenten des Pflanzenmaterials vorliegt. Eine derartige Variation kann beispielsweise durch das Vorliegen einer überwältigend hohen Konzentration von einer bestimmten Verbindung im Pflanzenmaterial oder durch die modifizierende Wirkung des pH-Werts oder von Metallionen, die eine Veränderung der Verschiebungswerte hervorrufen, verursacht werden. Wenn dieses Problem auftritt, können die Testlösungen oder Testextrakte des Pflanzenmaterials, die der NMR-Spektroskopie unterzogen werden, vorbehandelt werden, um die Fehlerquelle zu beseitigen und um eine bessere Clusterbildung im Bewertungsdiagramm zu erreichen. Ein Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst daher die zusätzliche anfängliche Stufe der Reinigung der Testlösung oder des Testextrakts der als Kandidat in Frage kommenden Probe eines Pflanzenmaterials, bevor die Probe der NMR-Spektroskopie unterworfen wird.
Anhand von Tee lässt sich dieses Prinzip in zweckmäßiger Weise erläutern. Signale, die auf Coffein zurückzuführen sind, dominieren das Wasserstoff-1-NMR-Spektrum von Tee. Wenn somit NMR-spektroskopische Ergebnisse von Tee durch multivariate Analyse bearbeitet werden, bilden die Punkte auf dem Bewertungsdiagramm für Proben des gleichen Tees keine Cluster. Wenn vor Durchführung der NMR-Spektroskopie das Coffein aus dem Tee entfernt wird, z.B. durch Umkehrphasen-Chromatografie, tritt eine einwandfreie Clusterbildung der Proben auf und die Ähnlichkeiten zwischen gleichen Proben auf dem Bewertungsdiagramm treten in klarer Weise auf. Dies wird in Beispiel 2 und in den beigefügten 4A und 4B erläutert. 4A ist ein Bewertungsdiagramm für unbehandelte Teeproben, wobei die Clusterbildung undeutlich ist. 4B ist ein Bewertungsdiagramm für vorbehandelten Tee, wobei im Gegensatz zur vorherigen Situation eine klare Clusterbildung auftritt, die eine positive Unterscheidung ermöglicht.
Die NMR-Spektroskopie/Musterkennungsanalyse ist hochgradig empfindlich und ermöglicht die Unterscheidung von Proben von Pflanzenmaterial, die bei Analyse durch andere Methoden den Eindruck einer identischen Beschaffenheit vermitteln. Dies wird wiederum anhand von Tee erläutert. Das Vergleichsbeispiel 1 beschreibt die Analyse von Extrakten zweier unterschiedlicher Teetypen durch Hochleistungs-Flüssigchromatografie (HPLC). Die erhaltenen Chromatogramme sind in den beigefügten 2 und 3 dargestellt. Bei einem Experiment wurden unbehandelte Proben (Chromatogramm A jeweils in den 2 und 3) verwendet. Bei einem anderen Experiment wurde eine behandelte Probe (Chromatogramm B in jeder Figur) verwendet.
Die Figuren zeigen vor allem, dass HPLC keine klare Unterscheidung zwischen behandelten und unbehandelten Proben von Tee ermöglicht, da die Chromatogramme 2A und 2B praktisch identisch sind, was auch für die Chromatogramme 3A und 3B gilt. Zweitens zeigen die Figuren, dass HPLC keine Unterscheidungsmöglichkeit zwischen verschiedenen Teetypen gibt, da die Chromatogramme von 2 praktisch identisch mit denen von 3 sind. Bezüglich beider Gesichtspunkte steht HPLC im Gegensatz zu der erfindungsgemäß eingesetzten NMR-Spektroskopie/Mustererkennungstechnik, wie Beispiel 2 und die beigefügten 4A und 4B erläutern.
Eine wichtige Anwendungsmöglichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Standardisierung von Gemischen von Pflanzenmaterialien. Zu Beispielen für derartige Gemische gehören Arzneimittel der Traditionellen Chinesischen Medizin, wie sie vorstehend erörtert wurden. Bei diesen handelt es sich typischerweise um Gemische von mehreren verschiedenen Pflanzen und Pilzen, die gemäß Rezepten hergestellt worden sind, die möglicherweise hunderte von Jahren alt sind. Bisher gibt es keine analytische Technik, mit der Hersteller von derartigen Materialien in zuverlässiger und übereinstimmender Weise eine Unterscheidung ihrer Produkte von vorgeblich identischen Produkten, die von Wettbewerbern unter der gleichen Bezeichnung vertrieben werden, ermöglichen können. Es wurde nunmehr überraschenderweise festgestellt, dass die NMR-Spektroskopie/Mustererkennungstechnik, die erfindungsgemäß eingesetzt wird, eine klare Unterscheidung zwischen Proben eines vorgegebenen Gemisches von Pflanzenmaterialien, von denen angenommen wird, dass sie identisch sind, die aber aus unterschiedlichen Quellen stammen, ermöglichen kann. Dies wird in Beispiel 5 und in der beigefügten 7 erläutert. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht somit die Unterscheidung und Standardisierung von Gemischen von Pflanzenmaterialien.
Die Kombination aus NMR-Spektroskopie/Mustererkennung und biologischer Profilierung ist häufig erstrebenswert, da das komplexe Gemisch von Verbindungen in einem medizinischen Pflanzenmaterial eine klinische Gesamtwirkung entfalten kann, die sich vorwiegend von einer speziellen Komponente ableitet, die aber durch die Anwesenheit von anderen Komponenten in erheblichem Maße modifiziert oder verstärkt wird. Eine biologische Profilerstellung kann somit für ein quantitatives Maß der biologischen Wirkungen von Pflanzen und Pflanzenextrakten sorgen, wodurch die durch die NMR-spektroskopischen und Mustererkennungsanalysen erhaltenen Informationen ergänzt und/oder bestätigt werden.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten biologischen Profilierungstechniken stellen eine Maßnahme der Kontrolle und der Standardisierung einer erwünschten Probe eines Pflanzenmaterials in Bezug auf ihre biologische Aktivität dar. Es gilt derzeit als gesichert, dass die Gesamtwirkung von Arzneimitteln auf Pflanzenbasis sich nicht nur von einer einzelnen aktiven Komponente ableitet, sondern auch auf Hilfsverbindungen, die in dem komplexen Gemisch von Substanzen in der Pflanze vorhanden sind, zurückzuführen ist. Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten biologischen Profilierungstechniken ermöglichen die Untersuchung von synergistischen Wirkungen, die durch diese Hilfsverbindung ausgeübt werden, ohne dass es erforderlich ist, die Verbindungen selbst zu identifizieren. Zu synergistischen Wirkungen, die beobachtet werden können, gehören beispielsweise die Verstärkung der Aktivität der Hauptkomponente, die Verstärkung der Selektivität oder biologischen Verfügbarkeit der therapeutischen Substanz und die Unterdrückung von unerwünschten Nebenwirkungen. Dieser Aspekt der biologischen Profilierung ist besonders wertvoll, um die Aussage zu stützen, dass die Verwendung einer vollständigen Pflanze oder eines Pflanzenextrakts bei der Therapie günstiger ist als die Verwendung von einzelnen Komponenten, die aus der Pflanze isoliert worden sind.
Erfindungsgemäß umfasst die biologische Profilierungstechnik die Proteomik. Der Grund hierfür ist, dass Veränderungen in der Proteinexpression die letztendliche biologische Wirkung darstellen, unabhängig vom speziellen Wirkungsmechanismus, z.B. von Enzymhemmung, Rezeptor-Bindungshemmung oder Modulation der Signalübertragung. Der Ausdruck Proteom beschreibt den vollständigen Satz von Proteinen, die vom gesamten Genom während der Lebenszeit einer Zelle exprimiert und im Anschluss an die Expression modifiziert werden. Die Proteomik ist die Untersuchung des Proteoms unter Anwendung von Techniken einer Trennung und Identifizierung von Proteinen im Großmaßstab (Nature, Bd. 402 (1999), S. 715). Eine Proteomik-Analyse ist im nachstehenden Beispiel 6 dargelegt.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Stufen (i) und (ii) gemäß Anspruch 1 an einer Probe des Pflanzenmaterials durchgeführt, das eine oder sämtliche Eigenschaften, die für den Standard angestrebt werden, besitzt. Das Gesamtmuster der Veränderung der Proteinexpression, das in Stufe (ii) beobachtet wird, wird als ein Bestandteil der Standardspezifikation für das Pflanzenmaterial definiert. Als Kandidaten in Frage kommende Proben des gleichen Pflanzenmaterials können sodann in Abhängigkeit davon, ob sie bei Durchlaufen der vorstehenden Stufen (i) und (ii) das gleiche Muster ergeben, akzeptiert oder abgelehnt werden.
Eine geeignete Zielzelle wird in der ersten Stufe entsprechend der klinischen Indikation oder der Krankheit, die als Modell dienen soll, ausgewählt. Im Anschluss an die Inkubation der Zellen der Testprobe werden die Proteine in der Zielzelle durch zweidimensionale Elektrophorese in einzelne Proteine aufgetrennt. Der Nachweis und die Analyse der erhaltenen Proteinmuster wird typischerweise unter Anwendung von rechnergestützten Bildanalysetechniken vorgenommen und Proteine werden unter Anwendung von Mikrosequenzierung und Massenspektroskopie identifiziert. Die Ergebnisse können gegebenenfalls rechnergestützten Mustererkennungsverfahren unterzogen werden, beispielsweise der vorstehend beschriebenen Hauptkomponentenanalyse. Veränderungen der Proteinexpression, die im Anschluss an die Inkubation der Zielzelle mit der Testprobe nachgewiesen werden, werden sodann mit den entsprechenden Veränderungen verglichen, die im Anschluss an eine Inkubation der Zielzelle mit einer bekannten Probe, von der die Aktivität gegen die in Frage stehende klinische Indikation bereits gesichert ist, festgestellt worden sind.
Die Wirkungsstärke der Testprobe kann mit der Wirkungsstärke eines Standards von pharmazeutischer Qualität in Korrelation gebracht werden, indem man die Konzentration der Testprobe, die zur Erzielung der Reaktion des Standards erforderlich ist, vergleicht.
Bei einer weiteren biologischen Profilierungstechnik handelt es sich um einen Rezeptor-Bindungstest oder Enzym-Hemmtest. Dadurch kann sich ein quantifizierbares Maß der biologischen Aktivität eines Pflanzenmaterials ergeben. Ein derartiger Test kann gemäß einem herkömmlichen Testverfahren durchgeführt werden. Ein Beispiel für einen geeigneten Test ist ein Verfahren zum Screening eines Pflanzenmaterials als Kandidat für die Behandlung oder Prophylaxe von Krebs oder Entzündungen, wobei das Verfahren die Bestimmung beinhaltet, ob die Substanz die Stimulation eines Genpromotors, von dem eine Beteiligung bei der Karzinogenese oder bei Entzündungen angenommen wird, unterdrückt.
Im erfindungsgemäßen Verfahren besteht das Pflanzenmaterial typischerweise aus einer vollständigen Pflanze, einem Pflanzenteil, einem Pflanzenextrakt oder einer Pflanzenfraktion oder leitet sich von diesen ab. Vorzugsweise besteht das Material aus einem oder mehreren der Bestandteile Wurzeln, Blätter, Knospen, Blüten, Früchte, Säfte und Samen einer Pflanze oder leitet sich von diesen Bestandteilen ab.
Die naturgegebene Variabilität von Pflanzenmaterialien stellt ein besonderes Problem bei den für die Zulassung von Arzneistoffen zuständigen Behörden dar, da diese überzeugt werden müssen, dass ein für die pharmazeutische Zulassung vorgesehenes Produkt von gleichmäßiger und verifizierbarer Qualität ist. Der Grund hierfür ist, dass die Dosierungsniveaus und die Behandlungsverfahren garantiert werden müssen. Derzeit ist jedoch kein zuverlässiges System verfügbar, das es ermöglicht, die Identität und Aktivität eines Produkts auf Pflanzenbasis im Vergleich zu einem anerkannten Standard zu messen, und das universell auf sämtliche Arten von Pflanzenmaterialien anwendbar ist. Gemäß einem Aspekt bietet die vorstehend definierte Erfindung eine Lösung für dieses Problem und stellt Maßnahmen zum Erstellen eines Standards von pharmazeutischer Qualität für eine therapeutische Substanz, die sich von einem Pflanzenmaterial ableitet oder aus einem solchen besteht, bereit.
Nachstehend wird die Erfindung anhand der folgenden Beispiele unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren beschrieben.
1 ist ein Hauptkomponentenanalysen(PCA)-Bewertungsdiagramm, in dem ein Faktor 3 (y-Achse) gegen einen Faktor 2 (x-Achse) für sechs Proben von Panax ginseng, die von verschiedenen Lieferanten gemäß den Angaben in Beispiel 1 erhalten worden sind, aufgetragen sind. Folgende Symbole werden für diese Figur verwendet: * = Lieferant 1; • = Lieferant 2; + = Lieferant 3; ∇ = Lieferant 4; ☐ = Lieferant 5; und ⊗ = Lieferant 6.
2 zeigt zwei HPLC-Chromatogramme für Kemmun-Tee, wobei ein für die Trennung von Catechinen gemäß den Angaben in Vergleichsbeispiel 1 optimiertes System verwendet wird. A bedeutet eine unbehandelte Teeprobe und B eine Teeprobe, die vorher durch Passage durch eine Festphasen-Extraktionskolonne behandelt worden ist.
3 zeigt zwei HPLC-Chromatogramme für Lapsang Souchong-Tee, wobei ein für die Trennung von Catechinen optimiertes System gemäß den Angaben in Vergleichsbeispiel 1 verwendet wird. A bedeutet eine unbehandelte Teeprobe und B bedeutet eine Teeprobe, die vorher durch Passage durch eine Festphasen-Extraktionskolonne behandelt worden ist.
Die 4A und 4B zeigen PCA-Bewertungsdiagramme, in denen ein Faktor 2 (y-Achse) gegen einen Faktor 1 (x-Achse) für sechs verschiedene Teetypen gemäß Beispiel 2 aufgetragen sind. Die Symbole in den Figuren für die einzelnen Teetypen haben folgende Bedeutung: ☐ = Oolong; + = Kemmun; ∇ = Lapsang Souchong; • = Darjeeling; * = Gunpowder; ♦ = Assam.
5 ist ein PCA-Bewertungsdiagramm, in dem ein Faktor 3 (y-Achse) gegen einen Faktor 1 (x-Achse) für fünf verschiedene handelsübliche Proben von Tanacetum parthenium (Mutterkraut)-Kapseln gemäß Beispiel 3 aufgetragen sind. Für die einzelnen Proben werden folgende Symbole verwendet: ⊗ = Probe 1; * = Probe 2; ☐ = Probe 3; • = Probe 4; und ∇ = Probe 5.
6 ist ein PCA-Bewertungsdiagramm, in dem ein Faktor 2 (y-Achse) gegen einen Faktor 1 (x-Achse) für sieben Proben von Tanacetum parthenium, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Pflanzen geerntet worden sind, gemäß den Angaben in Beispiel 4 aufgetragen sind. Folgende Symbole werden verwendet: • = Probe T0; ∇ = Probe T1; ⊗ = Probe T2; * = Probe T3; + = Probe T4; ☐ = Probe T5; und ♣ = Probe T6.
7 ist ein PCA-Bewertungsdiagramm, in dem ein Faktor 2 (y-Achse) gegen einen Faktor 1 (x-Achse) für das in Beispiel 5 analysierte Heilmittel der Traditionellen Chinesischen Medizin aufgetragen ist. Für die Proben werden folgende Symbole verwendet: • = Lieferant 1; * = Lieferant 2; und + = Lieferant 3.
8 ist ein zweidimensionales Gelproteinprofil (Silberfärbung) von humanen dermalen IBR3-Fibroblasten, die gemäß dem Test des nachstehenden Beispiels 6 erhalten worden sind. A bedeutet eine unbehandelte Kontrollprobe und B bedeutet eine Probe 72 Stunden nach Behandlung mit 10 μg/ml-Extrakt von Buddleja globosa.
9 ist ein zweidimensionales Gelproteinprofil (Silberfärbung) von humanen dermalen IBR3-Fibroblasten, die gemäß dem Test des nachstehenden Beispiels 6 erhalten worden sind. A bedeutet eine unbehandelte Kontrollprobe und B bedeutet eine Probe 72 Stunden nach Behandlung mit einem 10 μg/ml-Extrakt von Buddleja globosa.
Beispiel 1: Anwendung der NMR-spektroskopischen und multivariaten Analyse zur Unterscheidung zwischen verschiedenen Quellen von Panax ginseng
Herstellung von Extrakten
Proben von weißem Ginseng wurden von sechs verschiedenen gewerblichen Lieferanten bezogen. Weißes Ginseng leitet sich von der Wurzel von Panax ginseng C. A. Meyer ab. Die Wurzel wird kurz in siedendes Wasser gegeben und sodann in Zuckersaft eingeweicht. Anschließend wird sie der Sonne ausgesetzt und getrocknet. Weißes Ginseng ist auch als Sugar Ginseng bekannt.
Das getrocknete Pflanzenwurzelmaterial wurde fünf Minuten unter Verwendung eines "Illico"-Mischgeräts zur einem feinen Pulver zermahlen. 1 g des Pulvers wurde mit 20 ml kaltem Wasser vermischt und anschließend zwei Stunden auf einer Schüttelvorrichtung mit 150 U/min bei Raumtemperatur (22°C) gerührt. Der Extrakt wurde durch Whatman Nr. 1-Filterpapier filtriert. Das Filtrat wurde gewonnen und über Nacht gefriergetrocknet. 10 mg der Probe wurden für die NMR-spektroskopische Analyse in 1 ml deuteriertem Wasser gelöst. 800 μl wurden für die NMR-spektroskopische Analyse verwendet. Die Proben wurden auf den internen Standard TSP mit 0,00 ppm bezogen.
Verfahren für die NMR-Spektroskopie
Wasserstoff-1-NMR-Spektren wurden an einem Bruker DRX 600-Spektrometer, das mit 600,13 MHz für die Protonenfrequenz betrieben wurde und mit einer BEST-Fließsonde ausgestattet war, aufgezeichnet. Die Spektren waren das Ergebnis von 64 Abtastungen mit einer Abtastrate von 20 ppm und wurden als 49152-Datenpunkte gewonnen. Die Erfassungszeit pro Abtastung betrug 2,0 Sekunden. Vor der Transformation wurde eine Linienerweiterung von 0,3 Hz angewandt und die Spektren wurden einer Fourier-Transformation unterzogen. Die Werte wurden auf TSP als Standard mit 0,00 ppm bezogen. Die NMR-Spektren wurden unter Verwendung der AMIX-Software analysiert, um sie zu "Histogrammen" mit einem Gehalt an Bechern von 0,4 ppm Breite zu reduzieren.
Hauptkomponentenanalyse
Die erhaltene Datei wurde in Excel geöffnet, wo eine Normierung unter Verwendung der Summe des gesamten Spektrums durchgeführt wurde. Die sich daraus ergebenden Daten wurden sodann einer multivariaten Analyse unter Verwendung des Pirouette-Softwarepakets unterzogen. Eine unüberwachte PCA wurde unter Mittelwertbildung (und Autoskalierung) durchgeführt.
Ergebnisse
Die Daten wurden in Punkte auf einem PCA-Bewertungsdiagramm umgewandelt. Dieses Diagramm ist als 1 beigefügt. Die Figur zeigt klar sechs unterschiedliche Cluster von Punkten, die jeder der Panax ginseng-Proben zuzuordnen sind. Dies zeigt, dass die Technik ein Mittel zur Unterscheidung zwischen vorgeblich identischen Proben eines gegebenen Pflanzenmaterials bietet.
Vergleichsbeispiel 1: HPLC-Analyse von Extrakten von Tee
Bei den verwendeten Tees handelt es sich um Kemmun und Lapsang Souchong. Extrakte der einzelnen Tees für die HPLC-Analyse wurden folgendermaßen hergestellt.
Unbehandelte Proben
Eine getrocknete handelsübliche Teeprobe (50 g) wurde unter Verwendung eines Moulinex-"Illico"-Mischgeräts etwa 1 Minute zu einem feinen Pulver gemahlen, um eine homogene Probe herzustellen. 5 g Pulver wurden entnommen und bei Raumtemperatur (22°C) in einem 100 ml-Erlenmeyer-Glaskolben gegeben. 50 ml siedendes, destilliertes Wasser wurden über die Teeprobe gegossen. Sodann wurde die Probe mit einem Kunststoffstab gerührt und 30 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Der Extrakt wurde durch Whatman Nr. 1-Filterpapier filtriert. Das Filtrat wurde gewonnen und über Nacht gefriergetrocknet. 10 mg der Probe wurden sodann in 1 ml destilliertem Wasser gelöst.
HPLC-Ausrüstung: Hewlett Packard-Serie II 1090-Flüssigchromatograph
HPLC-Säule: C18 RP Hypersil 5 μ, 150 × 4,6 mm
mobile HPLC-Phase: Methanol:Wasser:Orthophosphorsäure = 20:79,9:0,1 (Vol./Vol.), Strömungsgeschwindigkeit 0,9 ml/Minute, Absorptionswellenlänge 210 nm.
Die erhaltenen Chromatogramme sind in den beigefügten 2A (Kemmun) und 3A (Lapsang Souchong) dargestellt.
Behandelte Proben
Eine getrocknete Teeprobe (50 g) wurde unter Verwendung eines Moulinex-"Illico"-Mischgeräts etwa 1 Minute zu einem feinen Pulver gemahlen, um eine homogene Probe herzustellen. 50 ml siedendes, destilliertes Wasser wurden über die Teeprobe gegossen. Nach Rühren mit einem Kunststoffstab und 30-minütigem Belassen bei Raumtemperatur wurde der Extrakt durch ein Whatman Nr. 1-Filterpapier filtriert. Das Filtrat wurde gewonnen und über Nacht gefriergetrocknet. 10 mg der Probe wurden sodann in 1 ml destilliertem Wasser gelöst und unter Vakuum über eine Umkehrphasen(RP)-C18-Isolute^®-Säule gegeben. 20 μl wurden für die HPLC-Analyse verwendet, wobei man sich des vorstehend für die unbehandelten Proben beschriebenen Verfahrens bediente.
Die erhaltenen Chromatogramme sind in den beigefügten 2B (Kemmun) und 3B (Lapsang Souchong) wiedergegeben. Die Figuren zeigen, dass HPLC keine klare Unterscheidung zwischen behandelten und unbehandelten Teeproben ergibt, da die Chromatogramme 2A und 2B praktisch identisch sind, ebenso die Chromatogramme 3A und 3B. Die Figuren zeigen ferner, dass HPLC nicht dazu befähigt ist, zwischen unterschiedlichen Teetypen zu unterscheiden, da die Chromatogramme von 2 praktisch identisch mit denen von 3 sind.
Beispiel 2: Anwendung von NMR-Spektroskopie und multivariater Analyse zur Unterscheidung zwischen Teetypen
Als Tees wurden Gunpowder, Darjeeling, Kemmun, Assam, Lapsang Souchong und Oolong verwendet. Unbehandelte und behandelte Proben dieser Tees wurden gemäß Vergleichsbeispiel 1 vorbereitet.
Verfahren für die NMR-Spektroskopie und Hauptkomponentenanalyse
10 mg Teeproben wurden in 1 ml deuteriertem Wasser (D₂O) gelöst. 800 μl wurden für die NMR-spektroskopische Analyse eingesetzt. Als interner Standard diente TSP mit 0,00 ppm. Das Verfahren von Beispiel 1 wurde für jeden der Teeextrakte durchgeführt.
Ergebnisse
Die Daten wurden auf zwei Bewertungsdiagrammen in Punkte umgewandelt. Die Ergebnisse sind in den 4A und 4B wiedergegeben. 4B zeigt 6 unterschiedliche Cluster von Punkten, die im Anschluss an die Behandlung jedem der Teeextrakte zuzuordnen sind, während 4A zeigt, dass vor der Behandlung die Clusterbildung gering ist.
Somit ist das Unterscheidungsvermögen der NMR-Spektroskopie/PCA-Technik nachgewiesen, was in starkem Gegensatz zum mangelnden Vermögen von HPLC zur Unterscheidung von Teetypen gemäß der Darlegung in Vergleichsbeispiel 1 steht.
Beispiel 3: Anwendung von NMR-Spektroskopie und multivariater Analyse zur Unterscheidung zwischen handelsüblichen Proben von Kräuterheilmitteln
Herstellung von Extrakten
Handelsübliche Kapseln von Mutterkraut (Tanacetum parthenium) wurden von drei verschiedenen Herstellern bezogen. Die Produkte waren vorgeblich identisch, wobei es sich um Hartgelatinekapseln mit einem Gehalt an "standardisiertem" Mutterkrautpulver handelte.
Fünf Proben, die jeweils aus zehn Kapseln bestanden, wurden genommen. Eine Probe stammte vom Hersteller A. Zwei Proben, die jeweils die gleiche Chargennummer trugen, stammten vom Hersteller B. Zwei Proben, die jeweils unterschiedliche Chargennummern trugen, stammten vom Hersteller 3.
Der Kapselinhalt der einzelnen Proben wurde in ein Moulinex-"Illico"-Mischgerät gegeben. Das Material wurde zwei Minuten zu einem feinen Pulver gemahlen, um eine homogene Probe herzustellen. Wasserextrakte für die NMR-spektroskopische Analyse wurden hergestellt, indem man 500 mg Pulver in 50 ml kaltem Wasser löste und den Extrakt vier Stunden bei Raumtemperatur (22°C) mit 150 U/min auf einem Schüttelgerät rührte. Der Extrakt wurde durch Whatman Nr. 1-Filterpapier filtriert. Das Filtrat wurde gewonnen und über Nacht gefriergetrocknet.
Verfahren zur NMR-spektroskopischen und Hauptkomponentenanalyse
Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde für die einzelnen Extrakte durchgeführt.
Ergebnisse
Die Daten wurden in Punkte auf einem Bewertungsdiagramm (unter Mittelwertbildung) umgewandelt. Das Ergebnis ist in 5 abgebildet, wobei die einzelnen Punkte jeweils einer Kapsel entsprechen. Das Diagramm zeigt, dass die Proben 1, 4 und 5 eine gute Clusterbildung aufweisen, was eine Übereinstimmung zwischen einzelnen Kapseln in den Chargen der Produkte widerspiegelt. Die Proben 2 und 3 ergaben eine schlechtere Clusterbildung, was eine größere Schwankung in diesen speziellen Produkten von Kappel zu Kapsel widerspiegelt. Das Diagrammm zeigt auch ausgeprägte Unterschiede zwischen verschiedenen Ansätzen von einem Produkt eines einzigen Herstellers (Proben 4 und 5), die den Anspruch erheben, identisch zu sein.
Beispiel 4: Anwendung von NMR-Spektroskopie und Hauptkomponentenanalyse zur Unterscheidung zwischen Proben von Tanacetum parthenium unterschiedlichen Reifegrads
Züchtung und Ernte von Pflanzenproben
Die medizinische Pflanzenspezies Tanacetum parthenium (Mutterkraut) wurde in Großbritannien aus Saatgut (mit Garantie) der Firma C. N. Seeds, Ely, UK, gezogen. Die Samen wurden am 18. April ausgesäht und unter Glas gehalten. Sämlinge gingen am 25. April auf und wurden am 24. Mai in Parzellen gitterartig ausgepflanzt, um eine randomisierte Probenbehandlung zu gewährleisten.
Fünf Proben von jeweils vier Pflanzen wurden aus den Parzellen geerntet, um eine Analyse in unterschiedlichen Abständen nach dem Auspflanzen vorzunehmen. Zwei weitere Proben wurden bei der abschließenden Ernte genommen, in gefrorenem Zustand aufbewahrt und in Abständen von 1 und 2 Monaten nach der Ernte analysiert. Für die Proben galten folgende Erntedaten:
Herstellung von Extrakten
Getrocknetes Pflanzenmaterial wurde gesammelt und sofort auf –20°C eingefroren. Nach dem Einfrieren wurde das Material 12 Stunden gefriergetrocknet, wonach eine Prüfung der Proben vorgenommen wurde, um zu gewährleisten, dass sie trocken sind. Das Material wurde dann in ein Moulinex-"Illico"-Mischgerät gegeben und zwei Minuten zu einem feinen Pulver gemahlen, um eine homogene Probe zu erzeugen. Wasserextrakte wurden für die NMR-spektroskopische Analyse hergestellt, indem 500 mg Pflanzenmaterial in 50 ml kaltem Wasser gelöst wurden. Der Extrakt wurde vier Stunden bei Raumtemperatur (22°C) auf einem Schüttelgerät mit 150 U/min gerührt. Sodann wurde der Extrakt durch Whatman Nr. 1-Filterpapier filtriert. Das Filtrat wurde gewonnen und über Nacht eingefroren.
Verfahren für die NMR-spektroskopische und Hauptkomponentenanalyse
10 mg der vorstehend erhaltenen Probe wurden in 1 ml deuteriertem Wasser für die NMR-spektroskopische Analyse gelöst. 800 μl wurden für die NMR-spektroskopische Analyse verwendet. Als interner Standard diente TSP mit 0,00 ppm. Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde eingehalten.
Ergebnisse
Die Daten wurden in Punkte an einem PCA-Bewertungsdiagramm (Mittelwertbildung) umgewandelt. Dieses Diagramm ist in 6 dargestellt. Es ist eine klare Clusterbildung von Punkten, die sich auf die verschiedenen Proben beziehen, ersichtlich. Die Ergebnisse zeigen, dass metabolische Veränderungen in einer Pflanze, die sich beispielsweise beim Reifungsprozess ergeben, auf einer PCA-Karte dargestellt werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren liefert somit ein Mittel zur Unterscheidung zwischen Proben eines vorgegebenen Pflanzenmaterials mit unterschiedlichen physiologischen Zuständen, in diesem Fall mit unterschiedlichen Reifegraden.
Beispiel 5: Anwendung von NMR-Spektroskopie und multivariater Analyse zur Unterscheidung von Proben eines Gemisches von Pflanzenmaterialien
Das la Liu Wie Huang Wan bekannte Heilmittel der Traditionellen Chinesichen Medizin, das sechs Pflanzenbestandteile enthält, wurde von drei verschiedenen Lieferanten bezogen (als 1, 2 und 2 bezeichnet).
Herstellung von Extrakten
100 Tabletten von jedem Hersteller wurden in Gruppen zu jeweils 10 Tabletten aufgeteilt und gewogen. Die Tabletten wurden sodann mit Mörser und Pistill zerkleinert. 1 g des erhaltenen Pulvers wurde in einen Glaskolben gebracht. Sodann wurde kaltes Wasser (100 ml) über das Pulver gegossen und das Gemisch wurde 30 Minuten unter Rückfluss erwärmt. Die Lösung wurde abgekühlt, filtriert und gefriergetrocknet.
NMR-Spektroskopie und Hauptkomponentenanalyse
10 mg der auf die vorstehende Weise hergestellten einzelnen Proben wurden entnommen und in 1 ml deuteriertem Wasser gelöst. Sodann wurde das Verfahren von Beispiel 1 durchgeführt.
Ergebnisse
Die Daten wurden in Punkte an einem PCA-Bewertungsdiagramm (Mittelwertbildung) umgewandelt. Das Ergebnis ist in 7 abgebildet. Es besteht eine klare Clusterbildung von Punkten entsprechend den Proben der drei Lieferanten. Diese Ergebnisse zeigen, dass das erfindungsgemäße Verfahren in erfolgreicher Weise zur Unterscheidung zwischen Proben von Mehrkomponenten-Pflanzenmaterialien, die vorgeblich identisch sind, verwendet werden kann.
Referenzbeispiel 1: Herstellung eines Testextrakts von Buddleja spp. und Bestimmung der Wirkung von Buddleja globosa auf das Wachstum von humanen dermalen Fibroblasten
Buddleja globosa ist eine Pflanze, von der berichtet wird, dass sie Wundheilungseigenschaften besitzt. Aus diesem Grund wird sie in der Praxis der Kräutermedizin klinisch eingesetzt. Um zu bestätigen, dass die Pflanze eine für diesen Anwendungszweck relevante biologische Aktivität besitzt, und um die Auswahl zu rechtfertigen, dass es sich bei diesem Produkt um einen Kandidaten für die in Beispiel 6 eingesetzte Proteomik-Analyse handelt, wurde ein Test durchgeführt, um festzustellen, ob das Produkt in vitro das Zellwachstum stimulieren kann (Testdurchführung gemäß Hughes und Cherry (1997), Wound Repair and Regeneration, Bd. 5 (1997), S. 159–167). Zu Vergleichszwecken wurde eine unterschiedliche Spezies der gleichen Pflanzengattung (Buddleja davidii), der Wundheilungseigenschaften in geringerem Umfang zugeschrieben werden, ebenfalls getestet. Als Kontrolle wurde Gras eingesetzt.
Herstellung von Extrakten
Frische Blätter (50 g) von Buddleja globosa, Buddleja davidii und Gras wurden getrennt 1 Stunde unter Rückfluss in 1 Liter destilliertem Wasser erwärmt. Der Extrakt wurde abgekühlt und durch Whatman Nr. 1-Filterpapier filtriert. Das Filtrat wurde gewonnen und 12 Stunden gefriergetrocknet. Der getrocknete Extrakt (10 mg) wurde in Wasser (1 ml) gelöst und durch ein 0,2 μm-Filter filtriert. Sodann wurde der Extrakt 1:1000 in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) zur Herstellung einer Lösung mit einer Endkonzentration von 10 μg/ml verdünnt. Diese Lösung wurde mit DMEM 1:1 verdünnt, um eine Lösung mit einem Gehalt an 5 mg/ml herzustellen.
Test mit humanen dermalen Fibroblasten
Humane dermale Fibroblasten (HDFs), die von einer Aurikel-Operation stammten, wurden bei 37°C in 5% CO₂ in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), 0,02% Fungizon und 1% Penicillin und 2% Streptomycin ergänzt war, gezüchtet. HDFs wurden 1–5 Tage bis zu konfluenter Beschaffenheit gezüchtet und aus dem Züchtungskolben unter Verwendung von 0,025% Trypsin/EDTA nach Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) entnommen. HDFs wurden in 50 ml fassende sterile Universalgefäße dekantiert und in 50 ml DMEM resuspendiert, wonach sie fünf Minuten mit 2700 U/min zentrifugiert wurden. Sodann wurden die HDFs in 10 ml DMEM resuspendiert und unter Verwendung eines Hämozytometers gezählt. Sodann wurden die HDFs 24 Stunden vor Verwendung im Test auf Platten mit DMEM mit einem Gehalt an 10% FBS überimpft. Die Beimpfungsdichte beim Test betrug 4 × 10³ Zellen/Mikrotitervertiefung.
24 Stunden später wurde das Medium durch Absaugen entfernt. Der Buddleja globosa-Extrakt wurde zunächst in Wasser in einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst und dann im DMEM mit einem Gehalt an 0,5% FCS (0,5% FCS stellt die Aufrechterhaltungskonzentration für HF-Wachstum dar, 10% wirkt stimulierend) auf Endkonzentrationen von 5, 10 und 100 μg/ml verdünnt (n = 8 für Kontrollen und Behandlungen).
Extrakte wurden der Platte in 200 μl Medium nach Filtration durch ein 0,2 μm Sterilfilter zugesetzt. Die Zellen blieben 24 und 72 Stunden nach Zugabe des Buddleja-Extrakts in Kontakt mit den Extrakten. Dann wurden die Zellen zu diesen beiden Zeitpunkten gewonnen, und zwar für jede der drei verschiedenen Konzentrationen. Die Analyse erfolgte unter Anwendung des nachstehend beschriebenen Neutralrottests.
Neutralrottest
1,2 ml Neutralrot-Farbstoff wurde zu 78,8 ml ausgewogener Hanks'-Salzlösung (HBSS) gegeben. Nach 10-minütiger Inkubation bei 37°C wurde fünf Minuten mit 2600 U/min zentrifugiert. 100 μl wurden in jede Vertiefung gegeben und die Platten wurden 2,5 Stunden inkubiert, wonach das Medium dekantiert wurde und die Zellen zunächst mit 100 μl 1% Ameisensäure und anschließend mit 100 μl 1% Essigsäure gewaschen wurden. Die Mikrotiterplatte wurde sodann auf ein AnthosHill-Plattenlesegerät gelegt und 15 Sekunden geschüttelt. Die Absorption der restlichen Zellen wurde bei 550 nm abgelesen. Das prozentuale Wachstum wurde bestimmt, indem die Absorptionswerte (die in prozentuales Wachstum umgewandelt werden) der Zellen bei Zugabe von Extrakt mit den Werten der Kontrolle (0,5%) verglichen wurden.
Ergebnisse Tabelle: Einflüsse von Pflanzenextrakten auf das IBR3-Wachstum von humanen dermalen Fibroblasten (HDF)
Diese Ergebnisse zeigen, dass Buddleja globosa eine Stimulationswirkung auf das Wachstum von humanen dermalen Fibroblastenzellen bei einer mittleren Konzentration von 5 μg/ml und 10 μg/ml und eine geringere Wirkung bei 100 μg/ml ausübt. Diese Wirkung blieb 72 Stunden lang erhalten. Der Einfluss von geringeren Konzentrationen war reproduzierbar, da zwei verschiedene Extrakte der gleichen Pflanzenspezies vergleichbare Ergebnisse lieferten. Im Gegensatz dazu wurde gezeigt, dass Buddleja davidii eine geringere Wirkung ausübt. Die Aktivität ist somit speziesabhängig, was den Wert der ethnobotanischen überlieferten Informationen bei der Auswahl von in Frage kommenden Kandidaten für die Entwicklung von Pflanzenextrakten bestätigt. Das als Kontrolle verwendete Gras wies eine erheblich geringere Wirkung auf.
Da Buddleja globosa das Wachstum von humanen Fibroblasten fördert, eignet es sich als Kandidat für Pflanzenextrakte, um die Proteinanalysetechnik, die im folgenden Beispiel 6 beschrieben wird, modellartig zu vertreten. Die Ergebnisse in diesem in vitro-Test bestätigen auch die Auswahl von IBR3-HDF als geeignete Zielzelllinie für die Proteinanalyse.
Beispiel 6: Proteomik-Analyse der Wirkung von Buddleja globosa auf die Proteinexpression in humanen dermalen Fibroblastenzellen
Materialien und Methoden
Zellkultur
Humane dermale IBR3-Fibroblasten wurden in DMEM + 10% FCS (Sigma) unter Verwendung von T75-Kolben (TPP-Plastics) gezüchtet. Etwa 50 mg eines getrockneten Extrakts von Buddleja globosa wurde in 5 ml bidestilliertem H₂O gelöst, um eine Vorratslösung mit 10 mg/ml zu erzeugen. Die Vorratslösung wurde durch ein 0,2 μm-Filter filtriert. 5 μl wurden in 5 ml DMEM + 10% FCS (d.h. Verdünnung 1:1000) verdünnt, um eine Lösung mit 10 μg/ml herzustellen. Diese Lösung wurde zur Bildung einer Lösung mit einem Gehalt an 5 μg/ml 1:1 in DMEM + 10% FCS verdünnt.
Ein T75-Kolben wurde für jeden der folgenden Extrakttestkonzentrationen verwendet: 0 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml und Zellen wurden 24 Stunden oder 3 Tage inkubiert (Gesamtanzahl der Kolben = 6).
Eine Platte mit sechs Vertiefungen (Costar) wurde für die radioaktiv markierten Kulturen verwendet und zwei Vertiefungen pro Extraktkonzentration (0 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml) wurden eingesetzt. [³⁵S]-markiertes Methionin wurde in einer Menge von 250 μCi pro Vertiefung zum methioninfreien Medium gegeben. Die Zellen wurden 24 Stunden inkubiert. Sämtliche Inkubationen wurden in einem CO₂-Inkubator bei 37°C durchgeführt.
Zweidimensionale Elektrophorese
Im Anschluss an die Inkubation wurden die Zellen in den T75-Kolben mit 2 × 5 ml PBS und 1 × 5 ml 0,35-Saccharose gewaschen und in 200 μL Lysispuffer (9,5 M Harnstoff, 1% DTT, 2% CHAPS, 0,8% Pharmalyte, pH-Wert 3–10 (Pharmacia)) aufgenommen. Die Zellen in jeder Vertiefung der Platte mit sechs Vertiefungen wurden mit 2 × 2 ml PBS, 1 × 2 ml 0,35 M Saccharose gewaschen und in 35 μl Lysispuffer aufgenommen. Sämtliche Proben wurden bis zur Verwendung bei –20°C aufbewahrt.
Die Proteinkonzentrationen wurden unter Anwendung eines modifizierten Bradford-Tests bestimmt und die Radioaktivität wurde durch Szintillationszählung ermittelt. Es war erforderlich, mit den ummarkierten Zellen eine Acetonfällung durchzuführen, was auf die geringen Proteinmengen zurückzuführen war. Im Anschluss an diese Stufe lagen die Proteinkonzentrationen innerhalb der Testparameter und ermöglichten ein genaues Aufsetzen der Proben.
Isoelektrische Fokussierung
50 μg unmarkiertes Protein von 1 × 10⁶ CPM-markiertem Protein wurden zu einer Quelllösung (8 M Harnstoff, 0,5% CHAPS, 0,2% Pharmalyte, pH-Wert 3–10 (Pharmacia)) bis zu einem Endvolumen von 450 μL gegeben und zur Quellung von immobilisierten pH-Gradientenstreifen (IPG) verwendet (d.h. Dehydratisierung in Gel). Für jede Extraktbedingung wurden IPG-Streifen, die die pH-Bereiche 3–10 NL (nicht-linear) und 4–7 L (linear) abdeckten, verwendet. Im Anschluss an die Quellung über Nacht wurden die IPGs bei 60 kVh mit 0,05 mA/Streifen bei 20°C fokussiert.
Zweidimensionale Elektrophorese
Bevor man die fokussierten IPGs in der zweiten Dimension laufen ließ, wurden die Streifen für die zweite Dimension vorbereitet, indem sie in Puffer (1,5 M Tris (pH-Wert 8,8), 6 M Harnstoff, 30% Glycerin, 2% SDS, 0,01% Bromphenolblau) mit einem Gehalt an 1% Dithiothreit (DTT) 15 Minuten äquilibriert wurden, wonach eine weitere 15-minütige Behandlung im Puffer mit einem Gehalt an 4,8% Iodacetamid (IAA) folgte.
SDS-PAGE wurde über Nacht durchgeführt (20 mA/Gel, 10°C), wobei 12% T/2,6% C-Trenngele in einem Hoefer-DALT-System verwendet wurden.
Sichtbarmachung
Nach dem Laufen der zweiten Dimension wurden die Gele über Nacht in eine Protein-Fixierlösung (50% Methanol, 10% Essigsäure) gelegt und am nächsten Tag unter Verwendung eines Silber-Färbekits (Daiichi) gefärbt. Radioaktive Gele wurden gleichermaßen fixiert, jedoch nicht der Silberfärbung unterzogen und über Nacht in eine "Geltrockungs"-Lösung (3% Glycerin, 30% Methanol) gelegt. Sodann wurden die Gele auf 3 MM-Papier (Whatman) unter Verwendung eines Savant-Geltrockners getrocknet und 10 Tage auf einen BioMax-Film (Kodak) gelegt. Die Filme wurden in einer AGFA-Bearbeitungsvorrichtung entwickelt.

Nach Silberfärbung oder Filmentwicklung wurden die Gele und Filme mit einer Auflösung von 100 μm unter Verwendung des Molecular Dynamics Personal Densitometer-Geräts SI eingescannt. Die Bilder wurden unter Verwendung von ImageQuant (Molecular Dynamics) betrachtet. Die Computer-Analyse wurde unter Verwendung von PDQuest (Bio-Rad) durchgeführt, was die Ausrichtung, Abgrenzung, Anpassung und anschließende quantitative Analyse der Bilder erleichtert.

Zeitpunkt 24 Stunden:	(1) Mit 250 μCi [³⁵S]-Methionin radioaktiv markierte Zellen (2) Unmarkierte Zellen für die Silberfärbung (2 × 75 cm²-Kolben für jede Probe
Zeitpunkt 72 Stunden:	(1) Unmarkierte Zellen für die Silberfärbung (2 × 75 cm²-Kolben für jede Probe

2-DE: Erste Dimension:
IPG-Streifen, die zwei verschiedene pH-Bereiche abdecken, wurden verwendet.

(1) pH-Bereich 3–10, NL-Streifen
(2) pH-Wert 4–7-Streifen.

12% SDS-PAGE
Probenbeladung:	50 μg Protein für die Silberfärbung 10⁶ cpm für die Autoradiographie

Ergebnisse
Der Einfluss des Buddleja globosa-Extrakts auf die Proteinexpression durch humane dermale Fibroblasten ist in der folgenden Tabelle dargelegt.
Gesamtzahl an entsprechenden Proteinflecken: 850
Die beigefügten 8 und 9 zeigen Beispiele von Proteinflecken, die veränderte Expressionsmuster in Reaktion auf den Buddleja globosa-Extrakt belegen. 8 erläutert eine Region, wo Proteine im Anschluss an die Behandlung mit 10 μg/ml Extrakt nach 72 Stunden verringert sind, während 9 eine Region erläutert, wo Proteine im Anschluss an eine Behandlung mit 10 μg/ml Extrakt nach 72 Stunden zugenommen haben. In jeder der Figuren bedeutet A jeweils eine unbehandelte Kontrolle und B die behandelte Probe.
Die Ergebnisse belegen, dass die Technik der Proteinanalyse zur Bestätigung der Anwesenheit einer relevanten biologischen Aktivität in konzentrationsabhängiger Weise herangezogen werden kann. Von Buddleja globosa wurde in diesem Zusammenhang gezeigt, dass es eine Veränderung der Proteinexpression in humanen dermalen Fibroblastenzellen bewirkt.

Claims

Verfahren zum Erstellen einer Standardspezifikation für ein medizinisches Pflanzenmaterial, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (i) man stellt eine Testlösung oder einen Testextrakt einer Probe des medizinischen Pflanzenmaterials her, von dem bekannt ist, dass es die für den Standard erforderliche(n) Eigenschaft(en) besitzt; (ii) man unterwirft die Lösung oder den Extrakt zwei oder mehr analytischen Methoden unter Einschluss von (a) einer Kombination von NMR-Spektroskopie und einer rechnergestützten Mustererkennungstechnik und (b) einer oder mehreren biologischen Profilierungstechniken, die ein quantifizierbares Maß der biologischen Wirkung der Pflanze liefern und die eine Proteomik-Analyse umfassen, wobei die Proteomik-Analyse folgendes umfasst: (a) eine Zielzelle wird bereitgestellt, die entsprechend der klinischen Indikation, bei der die medizinische Pflanze aktiv ist, ausgewählt wird, und die Zielzellen werden mit der Testlösung oder dem Testextrakt inkubiert; und (b) die inkubierten Zellen werden einer Gelelektrophorese an einem 2-D-Gel unterworfen und die Veränderung der Proteinexpression in den Zellen als Ergebnis der Exposition mit der Lösung oder dem Extrakt wird beobachtet; (iii) man gewinnt die Ergebnisse der in Stufe (ii) eingesetzten analytischen Methoden; und (iv) man definiert eine Standardspezifikation für das Pflanzenmaterial auf der Basis der in Stufe (iii) erhaltenen Ergebnisse; wobei das Verfahren so durchgeführt wird, dass die NMR-Daten die Gesamtheit der Verbindungen im Pflanzenmaterial, die auf die angewandte NMR-Technik reagieren, wiederspiegeln.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren ferner das Bereitstellen einer Probe eines medizinischen Pflanzenmaterials umfasst, wobei die Probe eine Standardspezifikation für das Material, das durch das Verfahren von Anspruch 1 definiert worden ist, erfüllt, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (i') man stellt eine Testlösung oder einen Testextrakt einer Kandidatenprobe des medizinischen Pflanzenmaterials her; (ii') man unterwirft die Lösung oder den Extrakt zwei oder mehr analytischen Methoden unter Einschluss von (a) einer Kombination von NMR-Spektroskopie und einer rechnergestützten Mustererkennungstechnik und (b) einer oder mehreren biologischen Profilierungstechniken, die ein quantifizierbares Maß der biologischen Wirkung der Pflanze liefern und die eine Proteomik-Analyse umfassen, wobei die Proteomik-Analyse folgendes umfasst: (a) eine Zielzelle wird bereitgestellt, die entsprechend der klinischen Indikation, bei der die medizinische Pflanze aktiv ist, ausgewählt wird, und die Zielzellen werden mit der Testlösung oder dem Testextrakt inkubiert; und (b) die inkubierten Zellen werden einer Gelelektrophorese an einem 2-D-Gel unterworfen und die Veränderung der Proteinexpression in den Zellen als Ergebnis der Exposition mit der Lösung oder dem Extrakt wird beobachtet; (iii') man gewinnt die Analysenergebnisse von Stufe (ii'); und (iv') man wählt die Kandidatenprobe aus, wenn die Ergebnisse in Stufe (iii') die Standardspezifikation für dieses Material, die in Stufe (iv) des in Anspruch 1 definierten Verfahrens erstellt worden ist, erfüllen; wobei das Verfahren so durchgeführt wird, dass die NMR-Daten die Gesamtheit der Verbindungen im Pflanzenmaterial, die auf die angewandte NMR-Technik reagieren, wiederspiegelt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Kombination aus NMR-Spektroskopie und einer rechnergestützten Mustererkennungstechnik folgendes umfasst: (a) man unterwirft die Testlösung oder den Testextrakt der NMR-Spektroskopie und zeichnet ein oder mehr NMR-Spektren auf; und (b) man unterwirft die aus einem oder allen NMR-Spektren erhaltenen Daten einer multivariaten Analyse zur Erzeugung von einem oder mehreren Punkten auf einem Bewertungsdiagramm.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei es sich bei der multivariaten Analyse um eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) handelt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das medizinische Pflanzenmaterial besteht oder abgeleitet ist aus einer vollständigen Pflanze, einem Teil einer Pflanze, einem Pflanzenextrakt oder einer Pflanzenfraktion.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die multivariate Analyse von Stufe (b) unter Anwendung einer unüberwachten Methodik durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Pflanzenmaterial aus einem Gemisch aus zwei oder mehr verschiedenen Pflanzen abgeleitet ist oder daraus besteht.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem Gemisch um ein Heilmittel aus einem System der traditionellen Medizin handelt, wobei Gemische von Pflanzen oder Pflanzenextrakten verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei es sich beim System der traditionellen Medizin um die traditionelle chinesische Medizin oder um die Ayurveda-Medizin handelt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei es sich bei der Probe des medizinischen Pflanzenmaterials, das die für den Standard erwünschte(n) Eigenschaft(en) besitzt, um eine Probe von authentischem oder geprüftem Pflanzenmaterial, dessen Herkunft bekannt ist, handelt.