DE3126353C2 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Eleuterozide A,B,B↓1↓, D, E - Google Patents

Abstract

Das Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Eleuterozide A, B ↓1, B, D, E besteht darin, daß in dem zu analysierenden Gemisch die optische Dichte auf einen Wert von 0,08-0,1 bei Wellenlängen gebracht wird, die im Bereich von 270 bis 380 nm liegen. Danach werden Spektren registriert und die Größen der Lumineszenzintensität im Maximum der Lumineszenz unter der Anregung bei Wellenlängen in demselben Bereich gemessen. Anhand der erhaltenen Größen der Lumineszenzintensität berechnet man die Konzentrationen der Eleuterozide in zwei Varianten. Die eine davon besteht im Vergleich der Größe der Lumineszenzintensität des zu analysierenden Gemisches mit der Größe der Lumineszenzintensität der Lösungen reiner Eleuterozide unter der Ausnutzung des bekannten Verhältnisses zwischen den Eleuteroziden im Eleuterokokk, welches A : B ↓1 : B : D : E = 4 : 5 : 15 : 12 : 1 beträgt. Die zweite Variante zur Bestimmung der Konzentrationen besteht in der Berechnung nach der Formel (Formel 1) wobei gilt C - Konzentration des Eleuterozids oder des Gemisches der Eleuterozide, F - Größe der Lumineszenzintensität, n - Grad der Verdünnung oder Eindampfung des zu analysierenden Gemisches, wenn seine optische Dichte auf einen Wert von 0,08 bis 0,1 gebracht wird; (Formel 2) - Konstante, wobei tg α und tg α- Eichmaß entsprechend die Tangens der Neigungswinkel der linearen Abschnitte der Kurven der Abhängigkeit der Größen der Lumineszenzintensität des entsprechenden reinen Eleuterozids oder des Gemisches

Description

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangsgemisch einer Vorreinigung und Fraktionierung mittels der Dünnschicht- to Chromatographie unterzogen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Feststellung des Vorhandenseins und zur Bestimmung der Konzentration des Eleuterozids A die Fraktion, die der Stellung des Eleutero- zlds A am Chromatograrnm entspricht, in Chloroform gelöst und mit schwefelsaurer Lösung In Essigsäureanhydrid behandelt wird und beim Erscheinen einer Rötung, die das Vorhandensein des Eleuterozids A bestätigt, der Gehalt des Eleuterozlds A entsprechend seinem Verhältnis zum Eleuterozid Bi ermittelt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung des Eleuterozids Bi seine Lumineszenzintensität bei einem pH-Wert von 12 bis 13 gemessen wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion, die der Stellung des Eleuterozids Bi entspricht, mit Co²⁺-SaIz behandelt wird und beim Erscheinen eines neuen Bandes im Absorptionsspektrum der Fraktion mit einem Maximum bei ca. 400 nm unter allmählicher Rötung das Vorhandensein des Eleuterozids Bi festgestellt wird, wonach sein quantitativer Gehalt bestimmt wird.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Eleuterozlde A, Bi, B, D, E in einem zu analysierenden Gemisch.

Die genennten Eleuterozlde sind im Extrakt pflanzlicher Objekte enthalten, z.B. im Eleuterokockextrakt, der als Arznei, Nahrungsmittel- bzw. Futterzusatz verwendet wird. Stachliger Eleuterokock (Eleuterococcus Senticocus Maxim.) ist ein Gesträuch aus den Arallengewächsen und mit der bekannten orientalischen Hellpflanze dem Ginseng, nah verwandt. Zusammen mit dem Ginseng, der rosigen Rodlola, dem Pantocrin und anderen Heilmitteln aus der Gruppe natürlicher Adaptogene steigert Eleuterokock die allgemeine Widerstandskraft und die Adaption des Organismus gegenüber verschiedenartigen ungünstigen Außeneinwirkungen. Dank eines breiten Wirkungsbereichs wird dieses Arzneimittelpräparat bei sehr vielen Erkrankungen verordnet, wenn diese mit erhöhter physischer Belastung und geschwächter Widerstandsfähigkeit des Körpers verbunden sind, in der postoperativen Periode, bei allgemeiner Schwäche des Körpers und In vielen anderen Fällen. Die Eleuterokock-Pflanze hat eine sehr breite Anwendung In der Medizin, in der Nahrungsmittelindustrie und in der Landwirtschaft und gilt als Massenheilmittel. Deshalb hat die Bestimmung der Qualität des herzustellenden Eleuterokockextrakts eine sehr hohe Bedeutung, da eine eventuelle Überdosis bzw. ein Fehlen von Komponenten Im Produkt keinen Nutzen bringt und sogar krankheitserregend wirken kann.

Unter den Stoffen, die Wirkstoffe des Eleuterokocks bilden, unterscheidet man fünf einheitliche chemische Stoffe, welche Eleuterozlde A, Bi, B, D, E genannt werden und mengenmäßig in der Summe bis zu 90% sämtlicher Eleuterozlde bilden. Das Eleuterozid A ist Daukosterln, Β,-7-ct Ist ein Isofraxldlnglukosld, B-4-/J ist ein Synaptalkoholglukosld, D und E sind Syringareslnoldlglukoside, die sich durch Konformation unterscheiden. In den Eleuterokockextrakten unterscheidet sich das Verhältnis zwischen den Eleuterozlden unbedeutend, hängt von der Vegetationsperiode, von den Organen der Pflanze fast nicht ab und beträgt A: B, :B:D:E = 4:5:15:12:1 (I.V. Dardymov »Ginseng, Eleuterokock«, Moskau, »Nauka«, 1976).

Bekannt ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Eleuterozide A, Bi, B, D, E, das auf der Ausscheidung aus dem Eleuterokockextrakt jedes Eleuterozids einzeln Im Kristallzustand durch eine mehrfache hlnterelnanderfolgende chromatographische Trennung des Extrakts an der Säule mit darauffolgender gravimetrlscher Bestimmung der Eleuterozidmenge beruht [Ovodov Ju.S., Ovodova R.G., Soloveva T.F., Elyakov G.B., Kochetkov N.K. »Glukoside des stacheligen Eleuterokocks (Eleuterococcus Senticocus). I. Ausscheidung und einige Eigenschaften der Eleuterozlde B und E«. - Chemie der Naturverbindungen, 1965, Nr. 1, S. 3 bis 7]. Ein Vorteil dieses Verfahrens 1st die Möglichkeit einer getrennten Bestimmung sämtlicher Eleuterozlde, was dessen Anwendung zur quantitativen Analyse von Gemischen mit beliebigem Verhältnis der Eleuterozlde ermöglicht. Zu den Nachtellen des Verfahrens gehören der Energie- und Zeltaufwand (eine Analyse dauert 7 bis 10 Tage), geringe Genauigkeit (die Stoffveriuste während des Trennungsprozesses sind schwer einzuschätzen), eine niedrige Empfindlichkeit (für die Analyse braucht man einige Gramm der Trokkensubstanz des Extrakts), zur Durchführung der Analyse benötigt man qualifizierte Analyse-Chemiker.

Bekannt ist ein weiteres Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Eleuterozlde A, B₁, B, D, E, bei dem das zu analysierende Gemisch auf die erforderliche optische Dichte gebracht wird mit darauffolgender Bestimmung der Eleuterozldkonzentrationen an Hand der Größe optischer Parameter für das zu analysierende Gemisch und für Elchmaße (V. F. Lanchik, G. M. Frolova, Ju. S. Ovodov »Quantitative Bestimmung der Glukoside des stacheligen Eleuterokocks«. - Methodik der Untersuchungen, Band V: Pflanzliche Reserven, Ausgabe 3, 1969).

Das zu analysierende Gemisch wird bei diesem Verfahren der Chromatographie an der Säule unterzogen. Als Ergebnis der Chromatographie erhält man eine Eleuterozidfraktion. Die optische Dichte dieser Fraktion bei einer Wellenlänge von 270 nm wird auf Werte im Bereich von 0,1 bis 1,4 durch Verdünnung mit Methanol oder Eindampfung gebracht. Nach der Größe der optischen Dichte der Lösung bestimmt man mittels einer Eichgeraden die Konzentration der Summe der Eleuterozlde B, D, E, deren Individuelle Mengen und Gehalt am Gemisch restlicher Eleuterozlde berechnet werden kann, Indem man das bekannte natürliche Verhältnis zwischen Ihnen verwendet.

Die Vorteile dieses Verfahrens Im Vergleich zu dem obengeschilderten sind eine größere Genauigkeit der Bestimmung, Einfachheit und Verkürzung der Analysezeit. Jedoch kann man durch dieses Verfahren nur die Summe der Eleuterozlde B, D, E bestimmen; über die individuellen Mengen jedes Eleuterozlds Im einzelnen kann man nur Indirekt urteilen, Indem das bekannte Verhältnis zwischen diesen Komponenten Im Naturgemisch benutzt wird.

Da die Wirkung jedes Eleuterozlds Individuell und die Wirkungswelse jedes von Ihnen offensichtlich unterschiedlich ist, muß man zur Bestimmung der Extraktqualltät unbedingt den Gehalt jedes Eleuterozlds Im einzelnen kennen. Da es nicht möglich 1st, das Ausgangsgemisch der Eleuterozlde genügend vollständig von den Beimengungen durch einmaliges Chromatographieren an der Säule zu trennen (Nebenbestandteile haben nahe fy-Werte), wird die Genauigkeit der Methode herabgesetzt. Dieses Verfahren 1st auch langwierig (ca. 48 Stunden).

Wegen der genannten Nachteile werden die bekannten Verfahren In der Industrie nicht verwendet. Zur Zelt bestimmt man In den chemisch-pharmazeutischen Betrieben die Mengen der herzustellenden Eleuterokockextrakte nach dem Gewicht der Trockensubstanz und nach organoleptischen Eigenschaften (Farbe, Geruch, Geschmack), was entsprechend den heutigen Forderungen an Arzneimittelpräparate äußerst unzulänglich ist.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht In der Schaffung einer neuen optischen Methode, mit deren Hilfe die Konzentration der einzelnen Eleuterozlde schnell und genau bestimmt werden kann.

Die gestellte Aufgabe wird durch die Im Kennzeichen des Anspruchs 1 genannten Maßnahmen gelöst.

Die Unteransprüche 2 bis 5 beschreiben vorteilhafte Maßnahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Die Erfindung ermöglicht Im Vergleich zu den bekannten Verfahren die Bestimmung der Eleuterozlde A, B₁, B, D, E, mit erhöhter Genauigkeit Innerhalb einer kürzeren Zelt. Die Analysedauer ohne Vorrelnl- ^(iS gung des zu analysierenden Gemisches mittels chromatographischer Methode beträgt ca. 0,5 Stunden.

Bei Verwendung des Vorchromatographlerens beträgt die Analysedauer 2,5 bis 3 Stunden, während beim bekannten optischen Verfahren die Analysedauer 8 bis 10 Stunden beträgt. Ein weiterer Vorteil der Erfindung 1st die hohe Empfindlichkeit. Zur Analyse braucht man um das 100- bis lOOOfache weniger Stoff, als in den bekannten Verfahren verwendet wird. Berücksichtigt man die Tatsache, daß sich mittels des bekannten optischen Verfahrens die Konzentrationen der Eleuterozlde A und B₁ überhaupt nicht bestimmen lassen, werden weitere Vorteile des vorliegenden Verfahrens verständlich. Die qualitative Bestimmung der Eleuterozlde A und B₁ 1st sehr wichtig, da sie eine besondere optische Struktur und besondere Mechanismen der biologischen Wirksamkeit besitzen. Außerdem läßt sich durch das erfindungsgemäße Verfahren Im Falle der Vortrennung des Gemisches mittels der Dünnschlcht-Chromatographle das Eleuterozld B einzeln und die Summe der Eleuterozide D und E bestimmen, während das bekannte Verfahren nur die Bestimmung der Summe der Eleuterozlde B + D + E gestattet.

Nachstehend wird die Erfindung In Form von Beispielen erläutert. Dem zu analysierenden Gemisch werden zur Analyse zwei gleiche Proben entnommen: die Probe 1 zur Bestimmung der Eleuterozide B, D, E und die Probe 2 zur Bestimmung des Eleuterozlds B₁. Beide Proben werden mit einem wäßrlg-alkchollschen Gemisch bzw. mit Wasser verdünnt oder solange eingedampft, bis die optische Dichte im Bereich von 0,08 bis 0,1 liegt. Die optische Dichte der Probe 1 bestimmt man bei einer Wellenlänge im Bereich von 270 bis 300 nm, die optische Dichte der Probe 2 bei einer Wellenlänge Im Bereich von 360 bis 380 nm.

Danach registriert man die Lumineszenzspektren bei Anregung mit UV-Licht einer Wellenlänge Im Bereich von 270 bis 300 nm für die Probe 1 und bei 360 bis 380 nm für .die Probe 2 und mißt die Größe F der Lumineszenzintensität In den Maxima der Bänder bei einer Wellenlänge Im Bereich von 310 bis 380 nm für die Probe 1 und bei einer Wellenlänge Im Bereich von 460 bis 540 nm für die Probe 2. Unter der Verwendung der erhaltenen Größen F für die Lumlneszenzlntensität kann man die konzentration der Summe der Eleuterozide B, D, E und des Eleuteroztds B, mittels zwei Varianten bestimmen, nämlich durch Vergleich oder nach der Formel.

Die Bestimmung der Konzentrationen der Eleuterozlde mittels der Variante »Vergleich« verwendet man, wenn dem Experimentator reine Individuelle Eleuterozlde zur Verfugung stehen. Die Variante des »Vergleichs« besteht darin, daß die Größen F der Lumineszenzintensität der Probe 1 und der Probe 2 mit den Größen F der Lumineszenzintensität von Lösungen des Gemisches der reinen Eleuterozlde B, D, E und des reinen Eleuterozlds Bi verglichen werden. Um die Größe der Lumineszenzintensität der reinen Eleuterozlde zu erhalten, Ist es notwendig, wäßrig-alkoholische oder wäßrige Lösungen des Gemisches der reinen Eleuterozlde B, D, E In einem Gewichtsverhältnis von 15:12:1 und eine wäßrig-alkoholische bzw. eine wäßrige Lösung des Eleuterozlds Bi zu bereiten, die optische Dichte der genannten Lösungen auf eine Größe In Bereichen von 0,01 bis 0,1 für das Gemisch der Eleuterozlde B, D, E bei einer Wellenlänge Im Bereich von 270 bis 300 nm und für den Eleuterozid B, bei einer Wellenlänge Im Bereich von 360 bis 380 nm zu bringen. Danach werden die Lumineszenzspektren der genannten Lösungen reiner Eleuterozlde bei Anregung mit UV-Licht einer Wellenlange Im Bereich von

270 bis 300 um für die Lösung des Gemisches der Eleuterozide B, D, E und einer Wellenlänge im Bereich von 360 bis 380 nm für die Lösung des Eleuterozlds B, registriert. An Hand der erhaltenen Spektren wird die Lumineszenzintensität für die Lösung des Gemisches der Eleuterozide B, D, E bei einer Wellenlänge im Bereich von 310 bis 380 nm und für die Lösung des Eleuterozids B₁ bei einer Wellenlange im Bereich von 460 bis 540 nm gemessen.

Die ermittelte Größe F_a

: (Probe 1) wird mit der i»

Größe f_s+o+£(rein), die Größe F_m (Probe 2) mit der Größe F₈₁ (rein) verglichen. Danach berechnet man die Konzentration des Eleuterozids Bi und des Gemisches der Eleuterozide B, D, E in den zu analysierenden Proben, wenn die Konzentrationen der Lösungen des i> reinen Eleuterozids B, und des Gemisches der Eleuterozide B, D, E in einem Verhältnis von 15:12:1 bekannt sind, wobei von einer direkten proportionalen Abhängigkeit zwischen den Konzentrationen u:.d den Größen der Lumineszenz der Eleuterozide in den Lösungen und den zu analysierenden Proben unter den obengenannten Meßbedingungen ausgegangen wird.

Somit bestimmt man durch die geschilderte Variante des »Vergleichs« die Konzentration des Eleuterozids B, und des Gemisches der Eleuterozide B, D, E in den zu analysierenden Proben. In den zu analysierenden Gemischen unbekannter Herkunft wird der Gehalt des Eleuterozids A und jedes der Eleuterozide B, D, E im einzelnen durch diese Variante nicht bestimmt. Wenn es jedoch Im voraus bekannt ist, daß das zu analyslerende Gemisch ein Naturgemisch der Eleuterozide 1st, z. B. ein wäßrig-alkoholischer Eleuterokockextrakt, so lassen sich diese Eleuterozide bestimmen. Dazu ermittelt man zuerst die Konzentration des Eleuterozids B₁ und der Summe der Eleuterozide B, D, E. An Hand der -« ermittelten Werte berechnet man, das bekannte Verhältnis zwischen den Eleuteroziden A, B₁, B, D, E In deren Naturgemischen benutzend, die Konzentration des Eleuterozlos A und die Konzentrationen der Eleuterozide B, D, E einzeln.

Fehlen individuelle reine Eleuterozide, kann man die Konzentrationen der Eleuterozide in dem zu analysierenden Gemisch durch die zweite Variante bestimmen, die der Kürze wegen die Variante »nach der Formel« genannt wird.

Diese Variante besteht In der Bestimmung der Konzentrationen der Eleuterozide nach der Formel:

C =

F-

tg CCEidimqfl

, wobei gilt

C - Konzentration des Eleuterozlds oder des Gemisches der Eleuterozide,

F - Größe der Lumineszenzintensität der Proben 1 und 2,

η ■- Grad der Verdünnung bzw. Eindampfung der Proben des Ausgangsgemisches, wenn seine optische Dichte auf einen Wert in einem Bereich von 0,08 bis 0,1 gebracht wird,
tg ix

L - Konstante (hängt nicht vom Gerät ab),

¹S ^Eichmaß

wobei tg α und tg oc_EichmqJ die Tangens der Neigungswinkel der linearen Abschnitte der Kurven der Abhängigkeit der Größen der Lumineszenzintensitäten des reinen Eleuterozlds B₁ oder des Gemisches der reinen Eleuterozide B, D, E In einem Verhältnis von 15 : 12 : 1 und der Elchsubstanz von deren Konzentrationen sind, die unter gleichen Bedingungen abgenommen wurden.

60

65 Zur Bestimmung der Größe der Konstante K werden die Größen tg α und tg tx_Elchmqß aus Schaubildern für die Abhängigkeit der Lumineszenzintensität des reinen Eleuterozlds Bi oder des Gemisches der reinen Eleuterozide B, D, E in einem Verhältnis von 15: 12:1 und dei· Elchsubstanz von deren Konzentrationen In den Lösungen ermittelt. Die Größe tg <x_Eichmgß wird vor jeder Analyse berechnet. Als Eichsubstanzen verwendet man im vorliegenden Verfahren das Tryptophan zur Bestimmung der Eleuterozide B, D, E und 1-Anillnonaphthalln-8-Sulfonat (1,8 ANS) zur Bestimmung des Eleuterozids B₁. Zur Herstellung der genannten Schaubilder bereitet man wäßrige Lösungen der Elchsubstanzen mit einer optischen Dichte unter 0,1 bei einer Wellenlänge Im Bereich von 270 bis 300 nm für Tryptophan-Lösungen und bei einer Wellenlänge im Bereich von 300 bis 380 nm für Lösungen des l-Anillnonaphthalin-8-Sulfonat vor. Die Lumineszenz der Tryptophan-Lösungen wird mit Licht derselben Wellenlänge Im Bereich von 270 bis 300 nm angeregt, bei der die Lumineszenz der Probe 1 angeregt wird, die Lumineszenz der 1,8-ANS-Lösungen regt man mit Licht der Wellenlänge im Bereich von 360 bis 380 nm an, mit der die Lumineszenz der Probe 2 angeregt wird. Danach wird die Lumineszenzlntensllät bei einer Wellenlänge im Bereich von 310 bis 380 nm für Tryptophan-Lösungen und Im Bereich von 460 bis 540 nm für 1,8-ANS-Lösungen, gemessen.

Das Schaubild der Abhängigkeit der ermittelten Größen der Lumineszenzintensität von den Konzentrationen der Stoffe wird so erstellt, daß dabei der Tangens des Neigungswinkels des linearen Abschnitts des Schaubilds dieser Abhängigkeit, d. h. tg a_Behmfi, gemessen wird. Der Wert tga für reine Eieuterozide und deren Gemische wird ähnlich wie für die Elchsubstanzen ermittelt. Die berechneten Werte der Konstante K betragen 0,17 für das Gemisch der Eleuterozide B, D, E und 3,5 für den Eleuterozld B|. Der Wert K für den Eleuterozld B₁ wurde bei einem pH-Wert der Lösung von 12 bis 13 ermittelt.

An Hand der obengenannten Formel kann man die Konzentration der Summe der Eleuterozide B, D, E und die Konzentration des Eleuterozids Bi in dem zu analysierenden Gemisch bestimmen. Wenn es Im voraus bekannt ist, daß das zu analysierende Gemisch ein Naturgemisch der Eleuterozide 1st, z. B. ein wäßrlgalkohollscher Eleuterokockextrakt, so kann man an Hand der ermittelten Konzentrationen der Summe der Eleuterozide B, D, E und des Eleuterozlds B₁ die Konzentrationen jedes dieser Eleuterozide einzeln sowie die Konzentration des Eleuterozlds A, unter Nutzung des bekannten natürlichen Verhältnisses zwischen den Eleuteroziden Im Eleuterokock berechnen.

Es wurde festgestellt, daß die Lumineszenzspektren der wäßrig-alkoholischen oder wäßrigen Lösungen der Eleuterozide B, D, E bzw. deren Gemische vom pH-Wert des Mediums nicht abhängen. Dagsgen ändern sich die Lumineszenzspektren der Lösungen des Eleuterozids Bi wesentlich beim Variieren des pH-Wertes des Mediums. Die Lumineszenzintensität der Lösungen des Eleuterozlds Bi erhöht sich beim Übergang des pH-Wertes des Mediums von 2 bis 3 auf 12 bis 13 ungefähr um das 4fache. Die Gesamtkonfiguration des Lumineszenzspektrums des Eleuterozlds B₁ ändert sich dabei praktisch nicht. Deshalb wird empfohlen, zur Erhöhung der Empfindlichkeit der Bestimmung des Eleuterozlds B₁ die Registrierung der Lumlneszenzspcktren der Probe 2 und der LösunR des reinen Eleuterozlds Bi bei

einem pH-Wert des Mediums von 12 bis 13 durchzuführen.

Um die Genauigkeit der Bestimmung von Eleuterozlden zu erhöhen und Eleuterozlde In willkürlichen Gemischen zu bestimmen, 1st es notwendig, die zu analysierenden Gemische vor der Messung optischer Parameter zu chromatographleren.

Es wird vorgeschlagen, die Dünnschicht-Chromatographie zu verwenden. Das zu analysierende Gemisch wird in einer Dünnschicht im System der LOsungsmlttel: Chloroform, Methanol, Wasser in einem Verhältnis von 40 :10 : 1 chromatographlert, Indem das Ausgangsgemisch längs der gesamten Front der Platte aufgetragen wird. Der Standort der Eleuterozide auf der Platte wird wie folgt bestimmt. '>-■

Von der Platte werden Streifen mit einer Breite von 0,5 bis 0,8 cm von den Selten und aus der Mitte längs der Richtung der Frontentwicklung des Chromatogramms abgeschnitten. Die Streifen werden bei einer Temperatur von 200 bis 25O⁰C durchwärmt und an Hand der Werte R_g/C für die Eleuterozide A, Bi, B, D, E und der charakteristischen Färbung der Flecke der Eleuterozide nach dem Durchwärmen (Eleuterozld B blau-violetter Fleck, Eleuterozide D, E - orangefarbener Fleck unter dem Eleuterozld B) bestimmt man die Stellung der Eleuterozide B, D, E. Die Bestimmung der Stellung der Eleuterozide A und Bi am Chromatogramm Ist in der Regel sehr schwierig wegen des niedrigen Gehaltes dieser Eleuterozide in den Naturgemischen und der schwachen Färbung dieser Flecke nach M dem Durchwärmen der Platte. Es wurde festgestellt, daß der Fleck des Eleuterozlds Bi am Chromatogramm über der Stellung des Eleuterozids B liegt, an diesen angrenzt und dieselbe Breite hat und der Fleck des Eleuterozlds A in ähnlicher Art über der Stellung des Eleuterozids B, Hegt. Die Werte R_gk für die Eleuterozide A, B₁, B, D, E sind In der Tabelle 1 angeführt.

Tabelle 1

Bezeichnung des Eleuterozlds A

B,

6,52 5,43 5,03 3,01 2,61

40

45

Die durch das Erwärmen entwickelten Streifen benutzt man als Anzeige und legt damit die Stellung der Eleuterozide auf dem restlichen nicht entwickelten Teil der Platte fest. Danach schneidet man aus dem nicht entwickelten Teii der Flaue Abschnitte aus, welche der Stellung jedes Eleuterozids entsprechen. Aus jedem Abschnitt werden diese Stoffe mit einem wäßrigalkoholischen Gemisch oder Wasser eluiert. Im Ergebnis gewinnt man Fraktionen Individueller Eleuterozide A, B₁, B, D, E. Jede der Fraktionen der Eleuterozide B₁, B, D, E bringt man durch Eindampfung oder Verdünnung mit einem wäßrig-alkoholischen Gemisch oder mit Wasser auf eine optische Dichte von 0,08 bis 0,1. Dabei wird die Messung der optischen Dichte der &o Fraktion der Eleuterozide B und D + E bei einer Wellenlänge Im Bereich von 270 bis 300 nm, der Fraktion des Eleuterozlds Bi bei einer Wellenlänge in einem Bereich von 360 bis 380 nm durchgeführt.

Danach registriert man die Lumineszenzspektren der Fraktionen bei Anregung mit UV-Licht einer Wellenlänge im Bereich von 270 bis 300 nm für das Eleuterozld B und das Gemisch D + E und einer Wellenlänge Im Bereich von 360 bis 380 nm für das Eleuterozld B, bei einem pH-Wert der Lösung von 12 bis 13. Die Größe der Lumineszenzintensität der Fraktionen des Eleuterozlds B und des Gemisches D + E wird bei einer Wellenlänge In einem Bereich von 310 bis 380 nm und für den Eleuterozld B, bei einer Wellenlänge In einem Bereich von 460 bis 540 nm gemessen. Die Berechnung der Konzentrationen der Eleuterozide Bi, B und der Summe D + E wird ähnlich dem obengeschilderten durchgeführt, d. h. durch zwei Varianten: durch »Vergleich« oder »nach der Formel«.

Die Werte der Konstante K für die Bestimmung der Eleuterozlde, die mittels der Werte von tg α und tg a_Elchnaß berechnet werden, betragen 0,3 für das Eleuterozid B und 0,09 für die Eleuterozide D, E und für deren Summe.

Da man über das Vorhandensein des Eleuterozlds A In dem zu analysierenden Gemisch an Hand der Lumineszenz nicht urteilen kann, da dieser Stoff nicht lurnineszlert und seine Darstellung an einer chromatographischen Platte sehr schwierig 1st, muß man das Vorhandensein dieses Stoffes In der Fraktion feststellen, die nach der Chromatographie gewonnen wird. Dazu wird eine Nachweisreaktion für den Aglykonteil des Moleküls des Eleuterozids A In Form der Llebermann-Burchard-Reaktlon durchgeführt. Dazu wird die den Eleuterozld A vermutlich enthaltende Fraktion eingedampft, in Chloroform aufgelöst und mit 1 ml frisch bereiteter Lösung versetzt, die aus einigen Tropfen Schwefelsäure in 5 ml gekühlten Essigsäureanhydrid zusammengesetzt 1st. Ist das Eleuterozld A In der zu untersuchenden Fraktion vorhanden, so erscheint In einigen Sekunden eine rötliche Färbung. Ist das Vorhandensein des Eleuterozlds A festgestellt, berechnet man seine Konzentration nach den ermittelten Konzentrationen der Eleuterozide Bi oder B bzw. der Summe der Eleuterozlde D und E, ausgehend vom natürlichen Verhältnis zwischen den Eleuteroziden von A: B, :B:D:E = 4:5:15:12:1.

Wie oben angegeben, entnimmt man dem Ausgangsgemisch für die Analyse zwei Proben: die eine zur Bestimmung der Summe der Eleuterozlde B, D, E, die andere zur Bestimmung des Eleuterozids Bi. Für die Analyse kann man auch nur eine Probe benutzen. In diesem Fall bestimmt man zuerst die Summe der Eleuterozide B, D, E. Dazu bringt man die optische Dichte der Probe auf einen Wert im Bereich von 0,08 bis 0,1 bei einer Wellenlänge im Bereich von 270 bis 300 nm. Bei derselben Wellenlänge regt man Lumineszenz an und mißt die GrOBe der Lumineszenzintensität bei einer Wellenlänge im Bereich von 310 bis 380 nm. Zur Bestimmung des Eleuterozids Bi bringt man danach die optische Dichte der Probe auf einen Wert Im Bereich von 0,08 bis 0,1 bei einer Wellenlänge im Bereich von 360 bis 380 nm. Bei derselben Wellenlänge regt man die Lumineszenz an. Die Große der Lumineszenzintensität wird bei einer Wellenlänge Im Bereich von 460 bis 540 nm gemessen. Die Durchführung der Analyse mit einer Probe ergibt weniger genaue Ergebnisse als mit zwei Proben. Dies hängt damit zusammen, daß während der Lumineszenzmessungen bei der Bestimmung der Eleuterozlde B, D, E die Probestoffe unter der Einwirkung des UV-Lichts teilweise abgebaut werden, was zu einer Verfälschung der Ergebnisse der darauffolgenden Analyse der Konzentration des Eleuterozlds B₁ fahren kann. Es wird deshalb empfohlen, zwei Proben zu benutzen.

Zum besseren Verständnis der Erfindung werden

zwei Beispiele der Bestimmung der Konzentrationen der Eleulerozlde A, B,, B, D, E angeführt.

Beispiel 1

Zur Analyse wird kommerzieller wäßrig-alkoholischer Eleuterokockextrakt genommen. Dem Extrakt werden zwei Proben mit je 0,1 ml entnommen. Jede Probe wird mit Wasser auf einen vorgegebenen Wert der optischen Dichte verdünnt. Die eine wird um das 500fache auf eine optische Dichte von 0,097 bei 290 nm verdünnt (Probe 1), die zweite Probe verdünnt man um das 200fache auf eine optische Dichte von 0,093 bei 370 nm (Probe 2). An einem Spektralfluorometer werden die Lumineszenzspektren der Proben bei Anregung mit UV-Licht registriert, von der Probe 1 bei einer Wellenlänge der Anregung von 290 nm und von der Probe 2 bei einer Wellenlänge der Anregung von 370 nm bei einem pH-Wert von 12. Danach wird die Lumineszenz-Intensität der Probe 1 bei 345 nm gemessen, die 45 beträgt, und der Probe 2, die 34 bei 500 nm beträgt. Die Konzentrationen des Eleuterozlds Bi und der Summe der Eleuterozide B, D, E werden mittels zwei Methoden ermittelt:

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a) Methode des »Vergleichs« oder

b) Methode der »Berechnung nach der Formel«.

Die Bestimmung der Konzentrationen der Eleuterozide mittels der Vergleichsmethode besteht in folgen- J0 dem. Es werden wäßrige Lösungen des reinen Eleuterozlds Bi und eine Lösung des Gemisches reiner Eleuterozide B, D, £ In einem Verhältnis von 15:12:1 bereitet. Durch Verdünnung mit Wasser bringt man die optische Dichte der Lösungen auf eine Größe von 0,085 bei 370 nm für die Lösung des Eleuterozlds Bi und von 0,094 bei 290 nm für die Lösung des Gemisches der Eleuterozlde B, D, E.

Man registriert die Lumineszenzspektren der gewonnenen Lösungen: für die Lösung des Eieuterozlds B, bei einer Wellenlänge des anregenden UV-Lichts von 370 nm bei einem pH-Wert von 12 und für die Lösung des Gemisches der Eleuterozlde B, D, E bei einer Wellenlänge des anregenden UV-Lichts von 290 nm. Danach wird die Lumineszenzintensität der wäßrigen Lösungen der Eleuterozlde gemessen. Die Lumineszenzintensität der Lösung des Eleuterozlds Bi wird bei 500 nm gemessen. Sie beträgt 41. Die Lumineszenzintensität der Lösung des Gemisches der Eleuterozlde B, D, E wird bei 345 nm gemessen. Sie beträgt 33. Die ermittelten Größen der Lumineszenzintensität der Lösungen der Eleuterozide vergleicht man mit den Größen der Lumineszenz der zu analysierenden Proben 1 und 2, wonach die Konzentration des Eieuterozlds Bi und der Summe der Eleuterozide B, D, E In dem zu analysierenden Extrakt berechnet wird, ausgehend von der bekannten Konzentration des reinen Eleuterozids Bi und der Summe reiner Eleuterozide B, D, E in deren wäßrigen Lösungen. Somit findet man die Konzentration des Eleuterozlds Bi im Ausgangsgemisch, die 0,75 mg/ml beträgt, und der Summe der Eleuterozide B, D, E, die 4,6 mg/ml beträgt. Da ein Eleuterokockextrakt analysiert wird, d. h. ein Naturgemisch der Eleuterozlde, berechnet man Individuelle Konzentrationen der Eleuterozide und des Gehalts des Eleuterozids A an diesem, welche

Eleuterozld B - 2,4 mg/ml,
Eleuterozld D - 2,0 mg/ml,
Eleuterozid E - 0,2 mg/ml

betragen.

Die Konzentration der Eleuterozide A, Bi, B, D, E kann man auch nach der Formel errechnen.

Die Methode der Bestimmung von Konzentrationen der Eleuterozide A, Bi, B, D, E nach der Formel besteht In folgendem. Dazu benutzt man die oben angeführte Formel

C =

F- η

^-t8 «Eichmaß

, wobei gilt

C - Konzentration des Eleuterozlds Bi oder der

Summe der Eleuterozide B, D, E,
F - Größe der Lumineszenzintensität der Probe 1 = 45

bzw. der Probe 2 = 34,
η - Verdünnung der Proben: 500 für die Probe 1 und

200 für die Probe 2,
K - Konstante, die 0,17 für die Probe 1 und 3,5 für die Probe 2 beträgt,

tß<* Eichmaß - Tangens des Neigungswinkels des lineraren Abschnitts der Kurve der Abhängigkeit der Größe der Lumineszenzintensität der Elchsubstanz von deren Konzentration. Zur Bestimmung lies f&ZEichmaß f^{ür dle} Probe 1 verwendet man als Elchsubstanz eine Amlnosubstanz, nämlich die Aminosäure Tryptophan, für die Probe 2 aber 1-Anilinonapthalln-8-Sulfonat (1,8 ANS).

Es werden wäßrige Lösungen der genannten Eichsubstanzen bereitet, deren optische Dichte 0,1 nicht überschreiten darf bei 290 nm für die Tryptophan-Lösung und bei 370 nm für die 1,8-ANS-Lösung.

Die Tryptophan-Lösungen haben eine optische Dichte von 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,07, 0,1 bei 290 nm, die 1,8-ANS-Lösungen haben eine optische Dichte von 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,07, 0,1 bei 370 nm. Es werden Spektren registriert und die Lumineszenzintensität der tryptophanhaltlgen Lösungen bei 345 nm und der 1,8-ANS-haltigen Lösungen bei 500 nm gemessen.

Es werden zwei Schaubilder der Abhängigkeit der Größe der Lumineszenzintensität der genannten Eichsubstanzen von deren Konzentration hergestellt. Man findet den Tangens des Neigungswinkels der linearen Abschnitte dieser Schaubilder zur Abszisse, an der die Konzentrationen aufgetragen sind zu: 5x10-*; ΙΟ"³; 2 χ IO-³; 3 χ IO-³; 4 χ IO-³; 5 χ IO-³ Q) für Tryptophan und 1,5 χ IO-³; 3 χ 10"³; 5 χ 10"³; 8 χ 10"³; 10"²; 1,5 χ 10"^J (2i) für 1,8-ANS. Der Tangens beträgt In diesem Fall 2,88 χ IO⁴ für Tryptophan und 2,59 χ IO³ für 1,8 ANS.

So ermittelt man an Hand der obengenannten Formel die Größe der Konzentration des Eleuterozlds Bi, die 0,75 mg/ml beträgt, und die Konzentration der Summe der Eleuterozide B, D, E, die 4,6 mg/ml beträgt. Da, wie oben angegeben, das zu analysierende Gemisch der Eleuterokockextrakt 1st, d. h. ein Naturgemisch von Eleuteroziden, berechnet man den Gehalt jedes Eleuterozids sowie des Eleuterozlds A an diesem. Die Konzentrationen der Eleuterozide betragen:

Eleuterozld A - 0,6 mg/ml

Eleuterozid B - 2,4 mg/ml

Eleuterozld D - 2,0 mg/ml

Eleuterozld E - 0,2 mg/ml.

Eleuterozld A - 0,6 mg/ml,

Die Dauer der von einem Experimentator durchge-

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führten Analyse beträgt 0,5 Stunden.

Beispiel 2

Zur Erhöhung der Genauigkeit bei der Bestimmung der Konzentrationen der Eleuterozide In dem zu analysierenden Gemisch bzw. In dem Fall, wenn das zu analysierende Gemisch unbekannter Herkunft Ist, Ist das Ausgangsgemisch einer Vorreinigung mittels der Dünnschlcht-Chromatographle zu unterziehen.

Dazu werden dem Ausgangsgemisch zur Analyse 0,5 ml entnommen und In einer Dünnschicht des Kleselgels Im System der Lösungsmittel: Chloroform, Methanol, Wasser in einem Verhältnis von 40:10:1 Chromatographien, indem das Ausgangsgemisch längs is der gesamten Front der Platte aufgetragen wird.

Zur Bestimmung der Stellung der Eleuterozide auf der Platte werden von der letzteren drei Streifen mit einer Breite von 0,5 cm von den Seiten und aus der Mitte längs der Richtung der Entwicklungsfront des Chromatogramms abgeschnitten.

Die Streifen werden bei einer Temperatur von 250° C durchwärmt, die Stellung der Eleuterozide bestimmt man an Hand der Werte /?_gfc für die Eleuterozide A, Bi, B, D, E und (oder) der charakteristischen Färbung der Flecke der Eleuterozide B, D, E nach dem Durchwärmen (Eleuterozld B - blau-violetter Fleck, Eleuterozide D und E - orangefarbener Fleck unter dem Eleuterozld B). Den Wert R_gh entnimmt man der Tabelle 1. Die Flecke, die der Stellung der Eleuterozide A und Bi auf den entwickelten Streifen der Platte entsprechen, lassen sich visuell nicht feststellen. Es wurde experimentell festgestellt, daß der Fleck des Eleuterozids B₁ am Chromatogramm über dem Eleuterozid B liegt, an diesen angrenzt und dieselbe Breite hat. Der Fleck des Eleuterozids A liegt ähnlich über dem Fleck des Eleuterozids B₁.

Die durch das Erwärmen entwickelten Streifen benutzt man als Anzeige zur Festlegung der Stellung der Eleuterozide auf dem restlichen nicht entwickelten Teil der Platte. Danach schneidet man aus dem nicht entwickelten Teil der Platte Abschnitte aus, welche der Stellung jedes Eleuterozids entsprechen. Aus jedem Abschnitt werden diese Stoffe unter Benutzung von 3 ml Wasser eluiert. Die gewonnenen Fraktionen werden, ähnlich wie im Beispiel 1, behandelt, d. h. sie werden auf die erforderliche optische Dichte gebracht, man registriert das Lumineszenzspektrum und mißt die Größe ihrer Intensität. Danach bestimmt man die Konzentrationen der Eleuterozide Bi, B und die Summe so D und E mittels der Methode des »Vergleichs« oder »nach der Formel«, ähnlich wie es im Beispiel i geschildert ist. Die Ergebnisse der Analyse sind:

Eleuterozid B₁ - 0,7 mg/ml

Eleuterozid B - 2,1 mg/ml

Summe der Eleuterozide
D und E - 1,9 mg/ml.

Wie oben angegeben, läßt sich die Stellung der Eleuterozlde A und Bi am Chromatogramm visuell nicht feststellen. Zur Feststellung des Vorhandenseins des Eleuterozids A in dem zu analysierenden Gemisch wird eine Nachweisreaktion durchgeführt. Diese Reaktion besteht darin, daß die Eluatprobe aus dem Bereich der ^6S Stellung des Eleuterozids A am Chromatogramm eingedampft und in Chloroform gelöst wird. Der Probe werden 0,5 ml schwefelsaueren Losung in Esslgsäurean-

hydrid zugegeben. Wenn sich die Lösung in einigen Sekunden rosig färbt, zeugt dies vom Vorhandensein des Eleuterozids A. Die Konzentration des Eleuterozids A, die analog dem Beispiel 1 festgestellt wurde, beträgt In dem zu analysierenden Gemisch 0,56 mg/ml. Das Vorhandensein des Eleuterozids Bi In dem zu analysierenden Gemisch beweist man durch eine Nachweisreaktion, wobei der Eluatprobe aus dem Bereich der Stellung des Eleuterozids Bi 0,1 ml 0,01 M CoCl₂-Lösung Im Wasser zugegeben werden. Innerhalb von wenigen Minuten erfolgt dabei eine Rötung der Lösung und In Ihrem Absorptionsspektrum erscheint ein neues Band mit einem Maximum von ca. 400 nm.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Eleuterozlde A, B, Bi, D, E In einem zu analyslerenden Gemisch, dadurcu gekennzeichnet, daß

a) dem zu analysierenden Gemisch mindestens zwei Proben entnommen werden;

b) die Proben verdünnt werden und dabei die optlsehen Dichten auf einen Wert von 0,08 bis 0,1 bei Wellenlängen Im Bereich von 270 bis 300 nm für mindestens eine Probe und im Bereich von 360 bis 380 nm für mindestens eine andere Probe gebracht werden;

c) die Proben zur Anregung der Lumineszenz mit UV-Licht im Bereich der bei der Einstellung der optischen Dichten verwendeten Wellenlängen bestrahlt und die Größen der Lumineszenzintensitäten im Bereich von 310 bis 380 nm bei der η einen Probe und Im Bereich von 460 bis 540 nm bei der anderen Probe gemessen werden;

d) die Zusammensetzung des zu analysierenden Gemisches ermittelt wird durch Vergleich der Meßwerte mit den Werten von eingestellten Standardlosungen, die einzelne Eleuterozlde oder Gemische derselben enthalten, oder durch Vergleich mit Eichlösungen, wobei einerseits Tryptophan und andererseits 1-Anlllnonaphthalin-8-sulfonat eine Elchsubstanz ist, und wobei die Standard- bzw. Elchlösungen in bezug auf die Einstellung der optischen Dichten, die Anregung mit UV-Licht und die Messung der Größen der Lumineszenzintensitäten in gleicher Weise wie die Probenlösungen behandelt werden.