DE3126353A1

DE3126353A1 - Verfahren zur quantitativen bestimmung der eleuterozide a, b(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts), b, d, e

Info

Publication number: DE3126353A1
Application number: DE3126353A
Authority: DE
Inventors: Aleksandr Viktorovi&ccaron; Krasnogorsk Baevskij; Grigorij Matveevi&ccaron; Barenboim; Lev Aramovi&ccaron; Moskva Piruzian
Original assignee: NII BIOLOG ISPYTANIJAM CHIMI S
Current assignee: NII BIOLOG ISPYTANIJAM CHIMI S
Priority date: 1981-01-18
Filing date: 1981-07-03
Publication date: 1982-08-12
Also published as: DE3126353C2; SU976354A1

Description

BESCHREIBIMG

Die -Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der analytischen Chemie, und insbesondere auf physikalisch-chemische

Methoden der quantitativen Analyse der Eleuterozide A, B^, B, D, E. Die genannten Bleuterozide sind im Extrakt pflanzlicher Objekte enthalten, z.B. im Eleuterokokkextrakt, der als Arznei, Nahrungsmittel- bzw.Futterzusatz verwendet wird.

Stacheliger Eleuterokock (Eleuterococcus Senticocus Maxim.) ist ein Gesträuch aus den Araliengewächsen und mit der bekannten orientalischen Heilpflanze, dem Ginseng, nah verwandt. Zusammen mit dem Ginseng, der rosigen Rodiola, dem Pantocrin und anderen Heilmitteln aus der Gruppe natürlicher Adaptogene steigert der Eleuterokokk die nicht spezifische .Resistenz, die Adaption der Organismen gegenüber verschiedenartigen ungünstigen Außeneinwirkungen. Dank einem breiten Wirkungsbereich wird dieses Arzneipräparat bei sehr vielen Erkrankungen sowie vor der Erkrankung verordnet, wenn diese mit erhöhter physischer Belastung, geschwächter Widerstandsfähigkeit des Körpers verbunden ist, sowie inder postoperativen Periode, bei allgemeiner Schwäche des Körpers und in vielen anderen Fällen. Der Eleuterokokk hat eine sehr breite Anwendung in der Medizin sowie in der Nahrungsmittelindustrie und in der Landwirtschaft und gilt als Massenheilmittel. Deshalb hat die Bestimmung der Qualität des herzustellenden Eleuterokokkextrakts eine sehr wichtige Bedeutung, da seine eventuelle Uberdosierung bzw. /ein Ausbleiben von Komponenten im Produkt keinen Nutzen bringt und sogar krankheitserregend wirken kann.

Unter den Stoffen, die einen Wirkstoff des Eleuterokokks

bilden, unterscheidet man fünf einheitliche chemische Stoffe, welche in der Chemie der Naturverbindungen Eleuterozide A, B-, ,B, D,B genannt werden, die mengenmäßig in der Summe bis zu 90% sämtlicher Eleuterozide bilden. Der Sleuterozid A ist Daukosterin, B₁ - 7 - oC ist ein Isofraxidinglukosid, B-4—y³ ist ein Synaptalkoholglukosid, D und E sind Syringaresinoldiglukoside, die sich durch Konformation unterscheiden. In den Eleuterokokkexfcrakten unterscheidet sich das Verhältnis zwischen den Eleuteroziden unbedeutend, hängt von der Vegetationsperiode, von den Organen der Pflanze fast nicht ab und beträgt Α:Β_χ:Β:ϋ:Ε ₌ 4:5:15:12:1 (I.V.Dardymov. "S-inseng, Sleuterokokk", Moskau, "Nauka", 1976).

Bekannt ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Eleuterozide A,B^,B,D,E, das auf der Ausscheidung aus dem Eleuterokokkextrakt jedes Eleuterozids einzeln im Kriotallzustand durch eine mehrfache hintereinanderfolgende chromatographische 'trennung des Extrakts an der Säule mit darauffolgender gravimetrischer. Bestimmung der Eleuterozidmenge beruht. Ovodov Ju.S., OvodovaR.G., Soloveva T.i¹., Elyakov G.B., Kochetkov N.K. "Glukoside des stacheligen Eleuterokokks (Eleuterococcus Sent ic oc us)." I. Ausscheidung und einige Eigenschaften der Eleuterozide B und E. - Chemie der " Naturverbindungen, 1965, Nr. 1,S. 3-7). Vorteil des bekannten Verfahrens ist die Möglichkeit einer getrennten Bestimmung sämtlicher Eleuterozide, das macht die Anwendung dieses Verfahrens zur quantitativen Analyse der Gemische mit beliebigem Verhältais der Eleuterozide möglich. Zu den Nachteilen des Verfahrens gehören der Kraft- und Zeitaufwand (eine Analyse braucht 7 bis 10 Tage), keine hohe Genauigkeit (die Stoff- ·

Verluste während des Trennungsprozesses sind schwer einzu-

Bmpfindliobkeit schätzen), eine niedrige*(für die Analyse braucht man einige Gramm der Trockensubstanz des Extrakts), zur Durchführung der Analyse aber braucht man qualifizierte Chemiker.rAnalytiker.

Bekannt ist auch ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Eleuterozide A, B^,, B,D,S, bei dem das zu analysierende Geraisch auf/frforderliche optische Dichte gebracht wird mit darauffolgender Bestimmung der BIeuterozidkonzentrat ionen an Hand der Größe optischer Parameter für das zu analysierende Gemisch und die Eichmaße . (V.I?. Lanchik, G.M. Frolova, Ju.S. Ovodov. "Quantitative Bestimmung der Glukoside des stacheligen Bleuterokokks". - Methodik der Untersuchungen. Band V.Pflanzliche Reserven. Ausgabe 2, 1969)·

Das zu analysierende Gemisch wird an Hand dieses Verfahrens der Chromatographie an der Säule unterzogen. Als Ergebnis der Chromatographie erhält man eine EIeuteroζidfrakt ion. Die optische Dichte dieser Fraktion wird auf Werte im Bereich von 0,1 bis 1,4 durch ihre Verdünnung mit Methanol oder Eindampfung bei einer Wellenlänge von 270 nm gebracht. Nach der Größe der optische Dichte der Lösung bestimmt man mittels der Eiohgeraden die Konzentration der Summe der Eleuterozide B,D,E, deren individuelle Mengen und Gehalt am Gemisch restlicher Eleuterozide berechnet werden kann, indem man das bekannte Verhältnis zwischen ihnen verwendet.

Vorteile dieses Verfahrens im Vergleich zu dem obengeschilderten sind eine größere Genauigkeit der Bestimmung, Einfachheit und Verkürzung der Analysezeit. Jedoch kann man durch dieses Verfahren nur die Summe der Eleuterozide B,D,S bestim-

men, über individuelle Mengen jedes Eleuterozids im einzelnen kann man nur indirekt urteilen, indem das bekannte Verhältnis zwischen diesen Komponenten im ITaturgemisch benutzt wird.

Da die Wirkung jedes Eleuterozids individuell und die Wirkungsweise jedes von ihnen offensichtlich unterschiedlich ist, muß man zur Bestimmung der Extraktquälität unbedingt den Gehalt jedes Bleuterozids im einzelnen kennen. Da es nichtmöglich ist, das Ausgangsgemisch der Eleuterozide genügend vollständig von den Beimengungen durch einmaliges Chromato— graphieren an der Säule zu trennen (Nebenbestandteile haben nahe R„-Werte) , wird die Genauigkeit der Methode herabgesetzt. Dieses Verfahren ist auch langwierig (ca. 4-8 Stunden).

Wegen der genannten Nachteile werden die bekannten Verfahren in der Industrie nicht verwendet. Zur Zeit bestimmt man in den chemisch-pharmazeutischen Betrieben die Mengen der herzustellenden Eleuterokokkextrakte nach dem Gewicht der Trockensubstanz und nach organoleptischen Eigenschaften (Farbe, Geruch, Geschmack), was entsprechend den heutigen Forderungen an Arzneipräparate äußerst unzulänglich ist.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Ausarbeitung eines neuen Verfahrens zur quantitativen Bestimmung der Eleuterozide A₁B₁,B,D,E, welches die Verkürzung der Analysezeit, Erhöhung der Genauigkeit der Bestimmung, die Bestimmung im Gemisch nicht nur der Eleuterozide B,D,E, sondern auch der Eleuterozide A und B-, ermöglicht.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung einer neuen optischen Methode, mit deren Hilfe die Konzentration der Haupteleuterozide innerhalb einer kurzen

Zeit bestimmt werden kann.

Die- gestellte Aufgabe wird ausgehend von einem Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Eleuterozide Δ,Β^,Β,Β,Ε im Ausgangsgemisch, ' ' , das die Messung der optischen Dichte einschließt, erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das Ausgangsgemisch auf eine optische Dichte von 0,08-0,1 bei Wellenlängen, die in einem Bereich von 270 biü 3üO nm liegen, gebracht wird, die Größe der Luminiszonzintensität bei Anregung mit UV-Licht bei einer Wellenlänge im genannten Bereich gemessen wird, wonach die Konzentration der Eleuterozide B₁, B,D,E im Ausgangsgemisch durch zwei Varianten bestimmt wird: entweder durch den Vergleich der gemessenen Größe der Luminiszenzintensität mit der Luminiszenzintensität der Lösungen der genannten reinen Eleuterozide und deren Gemische unter der Benutzung des bekannten quantitativen Verhältnises zwischen den Eleuteroziden in deren Naturgemischen AiB-, :B:D:E» = 4:5ϊ15!12:1, oder nach der Formel:

C ₌ F . η , wobei gilt

K . tge* -Eichmaß

C *- Konzentration der Eleuterozide oder des Gemisches der Eleuterozide,

F — Größe der Luminiszenzintensität,

η - Grad der Verdünnung oder Eindampfung des zu analysierenden Gemisches, wenn seine optische Dichte auf einen Wert von 0,08 bis 0,1 gebracht wird,

^K ~ " Konstante, bei welcher tg ca und tg oC - Eichmaß entsprechend die Tangense der Neigungswinkel der linearen Abschnitte der Kurven der Abhängigkeit

der Größen der Luminiszenzintensität des entsprechenden reinen Eleuterozids oder des Gemisches der reinen Eleuterozide B,D,B und der Eichsubstanz von deren Konzentration sind, wobei Tryptophan die Eichsubstanz , zur Bestimmung der Eleuterozide B,D,Ξ ist und I-Anilinonaphthalin-8-Sulfonat die Eichsubstanz zur Bestimmung des Eleuterozids B₁ ist, die unter ähnlichen Bedingungen abgenommen sind. Nachdem die Konzentration des Bleuterozids B-, gefunden ist, bestimmt man die Konzentration des Eleuterozids A durch arithmetische Berechnung, indem der erhaltene Wert der Konzentration des Eleuterozids B₁ sowie das bekannte Verhältnis zwischen diesen Eleuteroziden AiB₁ in deren Naturgemischen verwendet wird.

Zur Durchführung der Analyse wird empfohlen, dem zu analysierenden Gemisch zwei Proben zu entnehmen. Die eine Probe ist zur Bestimmung der Eleuterozide B,D,E in dieser, die andere Probe zur Bestimmung des Eleuterozids B₁ gedacht. Zur Bestimmung der Eleuterozide B,J,E wird die optische Dichte der zu analysierenden Probe auf einen Wert in den Bereichen von 0,08-0,1 bei einer Wellenlänge im Bereich von 270 bis 300 nm gebracht. Üie Lumineszenz wird bei einer Wellenlänge in einem Bereich, von 270-300 nm angeregt . ..Die Luininiszenzintensität . ■-. wird bei einer Wellenlänge im Bereich von 310 bis 380 nm gemessen.

Zur Bestimmung des Eleuterozids B₁ wird die optische Dichte der zu analysierenden Probe auf einen Wert in den Bereichen von 0,08 - 0,1 bei einer Wellenlänge in einem Bereich von 360-380 nm gebracht, die Luminiszenz wird bei pH=12-13 bei einer Wellenlänge in einem Bereich von 360-380 nm angeregt - Die." Lu-

miniszenzintensität wird bei einer Wellenlänge in einem Bereich von 460-540 nm gemessen.

Um die Genauigkeit der Bestimmung von Eleuteroziden zu erhöhen sowie getrennt die Eleuterozide AjB₁ ,B und. d,ie Summe der Eleuterozide D,E zu bestimmen, wird vorgeschlagen, das zu analysierende Gemisch einer Vorreinigung und der Fraktionierung mittels der Dünnschicht-Chromatographie zu unterziehen. Die gewonnenen Fraktionen bringt man auf einen Wert der optischen Dichte von 0,08-0,1 bei Wellenlänge, die in einem Bereich von 27O-J58O nm liegen, und mißt die Werte der Luminiszenzintensität der Fraktionen bei Wellenlängen in einem Bereich'.von 310-540 EM · ^ Hand dieser Größen bestimmt man die Konzentrationen der Eleuterozide wie oben geschildert.

Da es schwer ist, den Eleuterozid A an einem Chromatograram visuell festzustellen, wird vorgeschlagen, eine Nachweis reaktion auf diesen Stoff durchzuführen. Dazu wird die Fraktion, in der das Vorhandensein des Eleuterozids A vermutet wird, in Chloroform aufgelöst und mit schwefelsauerer Lösung in Essigsäureanhydrid behandelt. Nach der Rötung der Losung urteilt man über das Vorhandensein des Eleuterozids A in dem zu analysierenden Gemisch. Ist der Eleuterozid A in dem zu analysierenden Gemisch vorhanden, berechnet man seine Konzentration aus seinem bekannten proportionalen Gehalt mit dem Eleuterozid B₁ in den Natur gemischen.

Unter Berücksichtigung der Tatsache, daß der Eleuterozid

B₁ am Chromatogramm visuell ebenfalls schwer festzustellen ist, wird vorgeschlagen, auch .dafür eine Nschweisreaktion durchzuführen. Dazu wird die Fraktion, die im Ergebnis einer Dünn-

schicht-Chromatographie gewonnen wurde und vermutlich den Eleuterozid Β_χ enthält, mit Co²⁺-SaIz behandelt und das-Absorptionsspektrum der Losung registriert. Das Erscheinen eines neuen Bandes im Spektrum mit einem Maximum von ca. 400 nm

weist auf das Vorhandensein des Eleuterozids B-, hin. Die Erfindung ermöglicht die Bestimmung der

Eleuterozide A₁B₁₅BjDjBmIt erhöhter Genauigkeit im Vergleich zu bekannten Verfahren innerhalb einer kürzeren Zeit. Die Analysedauer ohne Vorreinigung des zu analysierenden Gemisches mittels ohromatographis eher Methode beträgt ca. 0,5 Stunden

Bei Verwendung des VorChromatographierens beträgt die Analysedauer 2,5-3 Stunden, während beim bekannten optischen Verfahren die Analysedauer 8-10 Stunden beträgt. Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist die hohe Empfindlichkeit. Zur Analyse braucht man um das 100-1000-fache weniger Stoff, als in den bekannten Verfahren verwendet wird. Berücksichtigt man die Tatsache, daß mittels des bekannten optischen Verfahrens die Konzentrationen der Bleuterozide A und B-, sich überhaupt nicht bestimmen lassen, werden die Vorteile des vorliegenden Verfahrens verständlich. Die qualitative Bestimmung der Sleuterozide A und B₁ ist sehr wichtig, da sie eine einmalige optische

• . ■ ο ·

Struktur und Mechanismen der biologischen Wirksamkeit besitzen. Außerdem läßt das erfindungsgemäße Verfahren im Falle der Vortrennung des Gemisches mittels der Dünnschicht-Chromatographie den Eleuterozid B einzeln und die Summe der Eleuterozide D und E bestimmen, während das bekannte Verfahren nur die Bestimmung der Summe der Eleuterozide B+D+IS vorsieht, aus der man annähernd deren individuellen Gehalt berechnen kann.

Nachstehend wird die Erfindung im

einzelnen erläutert. Dem zu analysierenden Gemisch, in dem das Vorhandensein der Eleuterozide Α,Β-, ,Β,ΰ,Ε vermuterfe wird, werden zur Analyse zwei gleiche Proben entnommen: ,d.ie Probe 1 - zur Bestimmung der Eleuterozide B,D,B und die Probe 2 zur Bestimmung des Bleuterozids B^. Beide Proben werden mit einem wäßrig-alkoholischen Gemisch bzw. mit Wasser verdünnt oder solange eingedampft, bis die optische Dichte eine Größe in den Bereichen von 0,08-0,1 erreicht. Die optische Dichte der Probe 1 bestimmt man bei einer Weilenlänge in einem Bereich von 2*/0-300 nm, die optische Dichte der Probe 2 bestimmt man bei einer Wellenlänge in einem Bereich von 360-380 nm.

Danach registriert man die Luminiszenzspektren bei Anregung mit UV-Licht: der Probe 1 bei 27Ο-3ΟΟ nra und der Probe 2 bei 360-380 nm, und mißt die Größe F der Luminiszenzintensität in den Maxima der Bänder .für die Probe 1 bei einer Wellenlänge in einem Bereich von 310-380 nm und für die Probe 2 bei einer Wellenlänge in einem Bereich von 460-540 nm· Unter der Verwendung der erhaltenen Größen F für die Luminiszenzintensität für die Probe 1 und die Probe 2 bestimmt man die Konzentration der Summe der Eleuterozide B,D,B und des Bleuterozids B-, mittels zwei Varianten; nämlich durch Vergleich oder nach der. Formel.

Die Bestimmung der Konzentrationen der Eleuterozide mittels der Variante ■ Vergleich verwendet man in dem Fall, wenn dem Experimentator reine individuelle Eleuterozide zur Verfügung stehen. Die Variante des "Vergleichs" besteht darin, daß die Größen F der Luminiszenzintensität der Probe 1 und der

Probe 2 mit der Größe F der Luminiszenzintensität

der wäßrigalkoholischen bzw. der wäßrigen Lösungen des Gemisches der reinen Eleuterozide B,D,B in einem Verhältnis von 15:12:1 und des reinen Eleuterozids B₁ verglichen werden. Um die Größe der Luminiszenz intensität der reinen Eleuterozide zu erhalten, ist es notwendig, wäßrig-alkoholische oder wäßrige Lösungen des Gemisches der reinen Eleuterozide B,D,B in einem Gewichtsverhältnis von 15:12:1 und eine wäßrig-alkoholische bzw. eine wäßrige Lösung des Eleuterozids B-, zu bereiten, die optische Dichte genannter Lösungen auf eine Größe in den Bereichen von 0,01-0,1 für das Gemisch der Eleuterozide B,D,E bei einer Wellenlänge im Bereich von 2'/0 bis 300 nm und für den Eleuterozid B-, bei einer Wellenlänge in einem Bereich von 360- -380 nm zu bringen. Danach werden die Luminiszenzspektren der genannten Lösungen reiner Eleuterozide bei Anregung mit UV— -Licht registriert : für die Lösung des Gemisches der Eleuterozide B,D,E bei einer Wellenlänge im Bereich von 270 bis 300 nm, für die Lösung des EIeafcerozids B₁ bei einer Wellenlänge im Bereich von 360 bis 380 nm. An Hand der erhaltenen Spektren werden die Größen der Luminiszenzintensität für die Lösung des Gemisches der Bleuterozide B,D,E bei einer Wellenlänge in einem Bereich von 310-380 nm und für die Lösung des Eleuterozids B-, bei einer Wellenlänge in einem Bereich von 460-540 nm gemessen.

Die ermittelte Größe F_B+D+E(Probe 1) wird mit der Größe ^B+D+E ^(reinJ' ^die Gteöße F_B1 (Probe 2) aber wird mit der

Größe Sg₁ (rein) verglichen. Danach berechnet man die Konzentration des Eleuterozids B₁ und des Gemisches der Eleuterozide B,D,Ξ in den zu analysierenden Proben, wenn die Konzentra-

t *

tionen der Lösungen des reinen Eleuterozids B₁ und des Gemisches der Eleuterozide B,D,E in einem Verhältnis von 15:12:1 bekannt sind, wobei von einer direkten proportionalen Abhängigkeit zwischen den Konzentrationen . und den Größen der Lumineszenz der Eleuterozide in den· Lösungen und den zu analysierenden Proben unter den obengenannten Meßbedingungen für die Größen der Luminiszenzintensität ausgegangen wird.

Somit bestimmt man durch die geschilderte Variante des "Vergleichs" die Konzentration des Eleuterozids B-, und des Gemisches der Eleuterozide B₁D,E in den zu analysierenden Proben. In den zu analysierenden Gemischen unbekannter Herkunft wird der Gehalt des Eleuterozids A und jedes der Eleuterozide B,D,E im einzelnen durch diese Variante nicht bestimmt. Wenn es jedoch im voraus bekannt ist, daß das zu analysierende Gemisch ein Naturgemisch der Eleuterozide ist, z.B. wäßrig-alkoholischer Eleuterokokkextrakt, so lassen sich diese Eleuterozide bestimmen. Dazu ermittelt man zuerst die Konzentration des Eleuterozids B-, und der Summe der Eleuterozide B,D,E . . An Hand der ermittelten Werte berechnet man das bekannte Verhältnis zwischen den Eleuteroziden Α,Β^,Β^ϋ,Ε in deren Naturgemischen von 4;5;1"5":12;T benutzend, die Konzentration des Eleu·*-

terozids A und die Konzentrationen der Eleuterozide B,D,E einzeln. Die geschilderte Variante zur Bestimmung der Konzentrationen der Eleuterozide ist dann geeignet, wenn dem Experimentator individuelle reine Eleuterozide zur Verfügung stehen.

Fehlen individuelle reine Eleuterozide, kann man die Konzentrationen der Eleuterozide in dem zu analysierenden Gemisch durch die zweite Variante bestimmen^ die der Kürze wegen die

- 16 Variante "nach der Formel¹¹ genannt wird.

Diese Variante besteht in der Bestimmung der Konzentrationen der Eleuterozide nach der Formel: η F . η

. . ... , wobei gilt

K. tg <=^ -Eichmaß
C - Konzentration des Eleuterozids oder des Gemisches der

Eleuterozide, ■ - -

F - Größe der Luminiszenzintensitat der Proben 1 und 2, η - Grad der Verdünnung bzw. Eindampfung der Proben des Ausgangsgemisches, wenn seine optische Dichte auf einen Wert in einem Bereich von 0,08 - 0,1 gebracht wird,

K — te; °^·

~ — ^m Konstante (hängt nicht vom Gerät ab) ,

tg <=£ -Eichmaß
wobei tg oC und tg <=£ - Eichmaß die Tan₆enseder Neigungswinkel der linearen Abschnitte der Kurven der Abhängigkeit der Größen der Luminiszenzintensitäten des reinen Slenterozids B-. oder des Gemisches der reinen Eleuterozide B,D,E in einem Verhältnis von 15:12:1 und der Eichsubstanz von deren Konzentrationen sind,' die unter gleichen Bedingungen abgenommen worden. Zur Bestimmung" der Größe der Konstante K werden die Größen tg oL und tg oC - Sichmaß aus Schaubildern für die Abhängigkeit der Luminiszenzintensitat des reinen Eleuterozids B, oder des Gemisches der reinen Eleuterozide B,D,E in einem Verhältnis von 15:12:1 und der Eichsub'-stanz von deren Konzentrationen in den Lösungen ermittelt. Die Größe tgo/- Eichmaß wird vor öeder Analyse berechnet. Als Standard subs tanzen verwendet man im vorliegenden Verfahren das Tryptophan - zur Bestimmung der Eleuterozide B,D,E und I-Anilinonaphthalin-8-Sulfonat (1,8 ANS) - zur Bestimmung des

Eleuterozids B,. Zur Herateilung der genannten Sohaubilder bereitet man wäßrige Lösungen der Eichsubstanzen mit eir ner optischen Dichte unter 0,1 bei einer Wellenlänge im Bereich von 270 bis 300 nm vor - für Tryptophan-Lösungen und bei einer Wellenlänge im Bereich von 300 bis 380 nm für Lösungen des I-Anilinonaphthalin-8-Sulfonat. Die Luminiszenz der Tryptophan-LÖsungen wird mit Licht mit derselben Wellenlänge angeregt, bei der die Luminiszenz der Probe 1 im Bereich von 270 bis 300 nm angeregt wird, die Luminiszenz der 1,8 ANS-LÖaungen aber regt man mit Licht mit derselben Wellenlänge an, wit der die Luminiszenz der Probe 2 im Bereich von 360 bis 380 nm angeregt wird. Danach wird die Luminiszenz intensität der LÖsun-". gen bei einer Wellenlänge im Bereich von 310 bis 380 nm für Tryptophan-Lösungen und im Bereich von 460 bis 5^0 nm für 1,8 ANB-Lösungen gemessen.

Das Schaubild der Abhängigkeit der ermittelten Größen der Luminiszenzintensität von den Konzentrationen der Stoffe wird so erstellt, daß , dabei der Tangens des Neigungswinkels des linearen Abschnitts des Schaubilds dieser Abhängigkeit, d.h. tg⁰^- Eichmaß, gemessen wird. Der Wert tg ·=<! für reine Eleuterozide und deren Gemische wird ähnlich wie für

die Eichsubstanzen ermittelt. Die berechneten Werte der Konstante K betragen 0,17 für das Gemisch der Eleuterozide B₉D.E und 3,5 für den Eleuterozid B₁. Der Wert K für den Eleuterozid B₁ wurde bei einem pH-Wert der Lösung von 12-13 ermittelt.

An Hand der obengenannten Formel kann man die Konzentration der Summe der Eleuterozide B,D₉E und die Konzentration des

- ie -

Eleuterozids B₁ in dem zu analysierenden Gemisch bestimmen. Wenn es jedoch im voraus bekannt ist, daß das zu analysierende Gemisch ein Naturgemisch der Eleuterozide ist, z.B. ein wäßrig-alkoholischer Eleuterokokkextrakt, so kann man an Hand der ermittelten Konzentrationen der Summe der Eleuterozide .B,D,E und des Eleuterozids B-, die Konzentrationen, jedes dieser Eleuterozide einzeln sowie die Konzentration des Eleuterozids A, unter Nutzung des bekannten Verhältnisses zwischen den' Eleuterozideh - im Eleuterokokk von A: B-, : B: D: E = = 4:^:15:12:1 berechnen.

Bs wurde festgestellt, daß die Luiainiszenzspektren der wäßrig-alkoholischen oder wäßrigen Lösungen der Eleuterozide Β,Ώ,Έ bzw. deren Gemische vom pH-Wert des Mediums nicht abhängen. Gleichzeitig ändern sich die Luminiszenzspektren der Lösungen des Eleuterozids B-, wesentlich beim Variieren des pH-Wertes des Mediums. Die Luminiszenzintensität der Lösungen des Eleuterozids B₁ erhöht sich beim Übergang des pH-Wertes des Mediums von 2-2 auf 12-1J ungeiä'hr um das 4fache. Die Gesamtkonfiguration des Luminiszenzspektrums des Eleuterzids B₁ ändert sich dabei praktisch nicht. Deshalb wird empfohlen, zur Erhöhung der Empfindlichkeit der Bestimmung des Eleuterozids B₁ die Registrierung der Luminiszenzspektren der Probe 2 und der Lösung des reinen Eleuterozids B₁ bei einem pH-Wert des Mediums von 12-12 durchzuführen.

Um die Genauigkeit der Bestimmung von Eleuteroziden zu erhöhen und Eleuterozide in willkürlichen Gemischen zu bestimmen, ist es notwendig, die zu analysierenden Gemische vor der Messung optischer Parameter zu Chromatographieren.

Ea wird vorgeschlagen, die DünnHchicht-Chromatographie zu verwenden. Das zu. analysierende Gemisch wird in einer Dünnschicht im System, der Lösungsmittel: Chloroform, Methanol, Wasser in einem Verhältnis von 40:10:1 Chromatograph! er ^b, indem das Ausgangsgemisch längs der gesamten Front der Platte aufgetragen wird. Der Standort der Bleuterozide auf der Platte wird wie folgt bestimmt.

Von der Platte werden Streifen mit einer Breite von 0,5- -0,8 cm von den Seiten und aus der Mitte längs der Richtung der Front ent wi ckl ung des ChI or mat ogr amins abgeschnitten. Die Streifen werden bei einer Temperatur von 200-25O⁰C durchwärmt und an Hand der Werte *L_lc für Eleuterozide AjB₁,B,D,E und der charakteristischen Färbung der Flecke der Eleuterozide nach dem Durchwärmen (Eleuterozid B - blau-violetter Fleck, Eleuterozide D,E orangefarbener Fleck unter dem Eleuterozid B) bestimmt man die Stellung der Eleuterozide B,D,E. Die Bestimmung der Stellung der Eleuterozide A und B-, am Chromatogramm ist in der Regel sehr schwierig wegen eines

niedrigen Gehaltes dieser Bleuterozide in den Naturgemischen und einer nicht intensiven Färbung dieser Flecke infolge des Durchwärmens der Platte. Es wurde festgestellt, daß der Fleck des Eleuterozids B₁ am Chromatogram über der Stellung des Eleuterozids B liegt, an diesen angrenzt und dieselbe Breite hat, der Fleck des Eleuterozids A in ähnlicher Art über der Stellung des Eleuterozid B₁ liegt. Die Werte R _1(J für Eleuteroziöe AjB₁JBjDjE sind in der 'Tabelle 1 angeführt.

ρ ·· ·ν · ·» »·■ J I Z O O J J

Tabelle 1

Bezeichnung des

A B₁ B D S

Eleuterozids

Rg₁₀ 6,52 5,43 5,03 3,01 2,61

Die durch das Erwärmen entwickelten Streifen benutzt man als Zeugen und legt die Stellung der Eleuterozide auf dem restlichen nicht entwickelten Veil der Platte fest. Danach schneidet man aus dem nicht entwickelten Teil der Platte Abschnitte aus, welche der Stellung jedes Eleuterozids entsprechen. Aus jedem Abschnitt werden diese Stoffe mit einem wäßrig-alkoholischen Gemisch oder Wasser eluiert. Im Ergebnis gewinnt man Fraktionen individueller Eleuterozide A,B-, ,B,D,S. Jede der Fraktionen der Eleuterozide B-, ,B,D,E bringt man durch Eindampfung oder Verdünnung mit einem wäßrig-alkoholischen Gemisch oder mit Wasser auf eine optische Dichte von 0,08-0,1 bei Wellenlängen, die im Bereich von 270 bis 3&0 nm liegen. Dabei wird die iWessung der optischen Dichte der Fraktion der Eleuterozide B und D+B bei einer Wellenlänge im Bereich von 270 bis 3OO nm, der Fraktion des Eleuterozids B-, aber bei einer Wellenlänge in einem Bereich von 36Q-3SO nm durchgeführt. Danach registriert man die Luminiszenzspektren der Fraktionen bei Anregung mit UV-Licht: für den Eleuterozid B und das Gemisch D+E bei einer Wellenlänge im Bereich von 270 bis 300 nm und für den Eleuterozid B-, bei einer Wellenlänge im Bereich von 360 bis 380 nm bei einem pH-Wert der Lösung von 12-13· -üie Größe der Luminiszenzintensitat der Fraktionen des Eleuterozids B und des Geraisches D+E wird bei einer Wellenlänge

in einem Bereich von 310-28Q mn und für den Eleuterozid B₁ bei einer Wellenlänge in einem Bereich von 460-540 nm gemessen. Die Berechnung der Konzentrationen der Kleuterozide B₁)B und der Summe D+E wird ähnlich dem obengeschilderten durchgeführt, d.h. durch zwei Varianten: durch die Variante des "Vergleichs" oder "nach der Formel".

Die Werte der Konstante K für die Bestimmung der Eleuterozide, die mittels der. Werte von tg ^- und tg oC - Eichmaß berechnet werden, betragen 0,5 für den Eleuterozid B und 0,09 für die BIe utero ζ ide D,E und für deren Summe.

Da man über das Vorhandensein des Bleuterozids A in dem zu analysierenden Gemisch an Hand der Luminiszenz nicht urteilen kann, da dieser *->toff nicht luminisziert und seine Darstellung an einer chromatographischen Platte sehtr schwierig ist, muß man das Vorhandensein dieses Stoffes in der Fraktion feststellen, die nach der Chromatographie gewonnen wird. Dazu wird eine Hachweisreaktion- für den Aglykonteil des Moleküls des

Form der
Eleuterozids A inVLiebermannsche-Burghard-Eeaktion durchgeführt.

Dazu, wird die den Eleuterozid A vermutlich enthaltende Fraktion eingedampft, in Chloroform aufgelöst und mit l ml frisch bereitete Lösung versetzt, die aus einigen Tropfen Schwefelsäure in 5 ml gekühlten Essigsäureanhydrid zusammengesetzt ist., ist der Eleuterozid A in der zu untersuchenden Fraktion vorhanden, so erscheint in einigen Sekunden eine rötliche Färbung, ist'das Vorhandenseijn v> des Sie utero ζ ids A festgestellt / berechnet man seine Konzentration nach den ermittelten Konzentrationen der Eleuterozide B-, oder B bzw. der Summe der Bleuteroside D und E, ausgehend vom bekannten Ver-

hältnis zwischen den EIe utero ζ id en im Bleut er okokk, welches ArB₁XBrDrB = 4:5:15:12:1 beträgt.

Wie oben angegeben, entnimmt man dem Ausgangsgemisch für die Analyse zwei Proben: die eine zur Bestimmung der Summe der Bleuterozide B,D,E, die andere zur Best immung des Eleuterozids B-, . Für die Analyse kann man auch nur eine Probe benutzen. In diesem Fall bestimmt man zuerst die Summe der Sleuterozide B,D,B, Dazu bringt man' die optische Dichte der Probe auf einen Wert in den Bereichen von 0,OiJ-0,1 bei einer Wellenlänge im Bereich von 270 bis 300 nm . Bei derselben ^ellenlange regt man Luminiszenz an und mißt die Große der Luminiszenzintensität bei einer Wellenlänge im Bereich von J510 bis 380 nm. Zur Bestimmung des Eleuterozids B₁ bringt man danach die optische Dichte der Probe auf einen Wert in den Bereichen von 0,08-0,1 bei einer Wellenlänge im bereich von 360 bis 380 nm. Bei derselben Wellenlänge regt man die Luminiszenz an- Die Größe der Luminiszenzintensität aber wird bei einer Wellenlänge im Bereich von 460 .bis 540 nm gemessen. Die Durchführung der Analyse mit einer Probe gibt weniger genaue Brgenisse als mit zwei Proben. Dies hängt damit zusammen, daß während der Luminiszenzmessungen bei der Bestimmung der Eleuterozide B,D,B die Probestoffe einem Teilabbau unter der Einwirkung des UV-Lichts ausge- ' setzt werden, was zu. einer Verfälschung der Ergebnisse üex darauffolgenden Analyse der Konzentration des Eleuterozids Berühren kann. Es wird deshalb enpfohlen, zwei Proben zu benutzen: die eine

zur Bestimmung der Summe der Eleuterozide B,D,S und die zweite zur Bestimmung des Eleuterozids B₁.

Zum besseren Verständnis der Erfindung werden Beispiele angefahrt, die das "Verfahren zur Bestimmung der Konzentrationen der Bleuterozide A,B₁ ,B,D, E erläutern.

Beispiel 1.

Zur Analyse wird kommerzieller wäßrig-alkoholischer Eleuterokokkertrakt genommen. Dem Exfcrakt werden zwei Proben mit ge 0,1 ml entnommen. Jede Probe wird mit Wasser auf einen,vorgegebenen wert der optischen Dichte verdünnt. Die eine wird um das ^OOfache auf eine optische Dichte von 0,097 bei 290 nm verdünnt (Probe 1), die zweite Probe verdünnt man um das 20Ofache auf eine optische Dichte von 0,093 bei 370 nm (Probe 2). An einem Spektralfluorometer werden Luminiszenzspektren der Proben bei Anregung mit UV-Licht registriert, von der Probe 1 bei einer Wellenlänge der Anregung von 290 nm und von der Probe 2 bei einer Wellenlänge der Anregung von 370 nm bei einem pH-V/ert =12. Danach.wird die Luminiszenzintensität der Probe 1 bei 345 nm gemessen, die 45 beträgt, und der Probe 2, die 34 bei 500 nm beträgt. Die Konzentrationen des Bleuterozids B₁ und der Summe der Eleuterozide B,D,E werden mittels zwei Methoden ermittelt:

a) Methode des "Vergleichs" oder

b) Methode der "Berechnung nach der Formel¹¹.

Die Bestimmung der Konzentrationen der Eleuterozide mittels der Vergleichsmethode besteht in folgendem. Ea werden wäßrige Lösungen des reinen Sleuterozids B-, und eine Lösung des Gemisches reiner Eleuterozide B,D,E in einem Verhältnis von 15sl2:l bereitet. Durch Verdünnung mit Wasser bringt man die optische Dichte der Lösungen auf eine Größe von 0,085 bei 370 nm

für die Lösung des Eleuterozids B-, und von 0,094 bei 290 nm für die Lösung des Gemisches der Eleuterozide B,D,S.

Man registriert die Luminiszenzspektren der gewonnenen Lösungen: für die Lösung des Eleuterozids B-, bei einer Wellenlänge des anregenden U7-Lichts von 370 mn. bei einem pH-Wert ₌12 und für die Lösung des Gemisches der Eleuterozide B,D,E bei einer Wellenlänge des anregenden UV-Lichts von 290 nm. Danach wird die Luminiszenzintensität der wässrigen Lösungen der Eleuterozide gemessen. Die Luminiszenzintensität der Lösung des Eleuterozids B-, wird bei 500 nm gemessen. Sie beträgt 41. Die Luminiazenzintensität der Lösung des Gemisches der Eleuterozide B,D,E wird bei 34-5 ™ gemessen., sie beträgt 33· Die ermittelten Größen der Luminiszenzintensität der Lösungen der Eleuterozide vergleicht man mit den Größen der Lumineszenz der zu analysierenden Proben 1 und 2, wonach die Konzentration des Eleuterozids B-, und der Summe der Eleuterozide B,D,E in dem zu analysierenden Extrakt berechnet wird, ausgehend von der bekannten Konzentration des reinen Eleuterozids B-, und der Summe reiner Eleuterozide Β,ΰ,Ε in deren wäßrigen Lösungen. Somit findet man die Konzentration des Eleuterozids B-, im Ausgangsgemisch, die 0,75 mg/ml beträgt, und der Summe der Bleuterozide B,D,E, die 4,6 mg/ml beträgt. Da der Eleuterokokkextrakt analysiert wird, d.h.' ein Naturgemisch der Eleuterozide, berechnet man individuelle Konzentrationen der Eleuterozide und des Gehalts des Eleuterozids A an diesem, welche

Eleuterozid A - 0,6 mg/ml,

Eleuterozid B - 2,4 mg/ml,

Eleuterozid D - 2,0 mg/ml,

Eleuterozid E - 0,2 mg/ml

betragen.

Die Konzentration der Eleuterozide A₁B^,B,D,E kann man auch nach der Formel errechnen.

Die Methode der Bestimmung von Konzentrationen der ELeuterozide A,B₁, B, D, E nach, der Formel besteht in'folgendem. Dazu benutzt man die oben angeführte Formel _r F . η

^ = _f wobei gilt

K . tgo£ -Eichmaß

C - Konzentration dos Eleuterozids B·, oder der Summe der

Eleuterozide B,D,E,
F - Größe der Luminiszenzintensität der Probe 1 - 45 bzw.

der Probe 2 - J54,
η - Verdünnung der Proben: 500 für die Probe 1 und 200 für die Probe 2,

K - Konstante, die 0,17 für die Probe 1 und 5,5 für die Probe 2 beträgt,

tgoo- Eichmaß =" Tangens des Neigungswinkels des linearen Abschnitts der Kurve der Abhängigkeit der Größe der Lumineszenzintensität der Bichsubsbanz von deren Konzentration. Zur Bestimmung des tgc£ - Eichmaßes für die Probe 1 verwendet man als Eichsubstanz eine Amino-Sttbstanz , nämlich die Aminosäure Tryptophan, für die Probe 2 aber I-Anilinonaphthalin-8-Sulfonat (1,8 ANS). Es werden wäßrige Lösungen der genannten Eichsubstanzen bereitet, deren optische Dichte 0,1 nicht überschreiten darf bei 290 ¹¹¹¹I für Sie Tryptophan-Lösung und bei 370 nm für die 178-ANS-Lösung.

Die Tryptophan-Lösungen haben eine optische Dichte von 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,07, 0,1 bei 290 nm, die 1,8-ANS-

-Lösungen haben eine optische Dichte von 0,01, 0,02, O₁OJ, 0,05, 0»07f O»^{1 De}i 37° a²¹· ^Es werden Spektren registriert und die Luminiszenzintensität der tryptophanhaltigen Losungen bei 345 nm und der 1,8-ANS-haltigen Lösungen bei 500 nm gemessen.

Bs werden zwei SchauMlder der Abhängigkeit der Größe der Luminiszenzintensität der genannten Eichsubstanzen von deren Konzentrationen hergestellt . Man findet-den .Tangens der Neigungswinkel der linearen Abschnitte dieser Schaubilder zur Abszisse, an der die Konzentrationen- aufgetragen sind zu:5xlO ; 10 ^;

2x10-2; 3χ1Ο~⁵; 4xlO"2; 5x10"2 (-^f-) für Tryptophan und

-2; 3xlO~2_; 5x10-2; _8χ10"2; ΙΟ"²; l^xlO"² (-5-^) für

1,8-ANS. Die Größen dieser Tangensa betragen in diesem. Fall 2,88 . 10⁴ für Tryptophan und 2,59 · 10⁵ für 1,8 ANS.

So ermittelt man an Hand der obengenannten Formel die Größe der Konzentration des Bleuterozids B-,, die 0,75 mg/ml beträgt, und die Konzentration der Summe der Eleuterozide B,D,E, die 4,6 mg/ml beträgt. Da, wie oben angegeben, das zu analysierende Gemisch der Eleuterokokkextrakt ist, d.h. ein Naturgemisch von Eleuteroziden, berechnet man den Gehalt Jedes Eleuterozids sowie des Eleuterozids A an diesem. Die Konzentrationen der Eleuterozide betragen:

Eleuterozid A - 0,6 mg/ml

Eleuterozid B - 2,4 rag/ml

Eleuterozid D - 2,0 mg/ml

Eleuterozid E - 0,2 mg/ml.

Somit werden die Konzentrationen der Eleuterozide mittels der Vergleichsmethode in dem Fall bestimmt, wenn dem Experimentator individuelle Eleuterozide zur Verfügung stehen. Im ent-

gegengesetzten Fall verwendet man zur Bestimmung der Konzentrationen von EIeuteroziden die als Eichsubstanzen verfügbare Stoffe Tryptophan und 1,8-MS und rechnet nach der Formel.

Die Dauer der von einem Experimentator durchgeführten Analyse beträgt 0,5 Stunden.

Beispiel 2.

Zur Erhöhung der Genauigkeit bei der Bestimmung von Konzentrationen der Eleuterozide in dem zu analysierenden Gemisch bzw. in dem F_all, wenn das zu analysierende Gemisch unbekannter Herkunft ist, ist das Ausgangsgemisch einer Vorreinigung mittels der Dünnschicht-Chromatographie zu unterziehen.

Dazu werden dem Ausgangsgemisch zur Analyse 0,5 ml entnommen und in einer Dünnschicht des Kieselgels im Sysbeiu der Lösungsmittel:Chloroform, Methanol, Wasser in einem Verhältnis von 40:10:1 chromatographiert, indem das Ausgangsgemisch längs der gesamten Front der Platte aufgetragen wird.

Zur Bestimmung der Stellung der Eleuterozide auf der Platte werden von der letzteren drei Streifen mit einer Breite von 0,5 cm von den Seiten und aus der Mitte längs der Richtung der Entwicklungsfront des Chromat ο gramms abgeschnitten.

Die Streifen werden bei einer Temperatur von 250⁰C durchwärmt, die Stellung der Sleuterozide bestimmt man an Hand der Werte R^_1c für die Eleuterozide A₁B₁,B,D₁ S und (oder) der charakteristischen Färbung der Flecke der Eleuterozide B,D₁E nach dem Durchwärmen (Eleuterozid B - blau-violetter Fleck, Eleuterozide D und E - orangefarbener Fleck unter dem Eleuterozid B). Den Wert H _lo bestimmt man aus der Tabelle 1. Die Flecke, die der Stellung der Eleuterozide A und B-, auf den entwickelten Streifen der Platte entsprechen, lassen sich visuell

nicht feststellen. Es wurde experimentell festgestellt, daß der Fleck des Eleuterozids B-, am Chromatogramm über dem Eleuterozid B liegt, an diesen angrenzt und dieselbe Breite hat.

Der Fleck des Eleuterozids A liegt-ähnlich über dem Fleck des Eleuterozids, B^.

Die durch daa Erwärmen entwickelten Streifen benutzt man als Zeugen zur Festlegung der Stellung der Eleüterozide auf dem restlichen nicht entwickelten Teil der Platte. Danach schneidet man aus dem nicht entwickelten Teil der Platte Abschnitte aus, welche der Stellung jedes Eleuterozids entsprechen. Aus jedem Abschnitt werden diese Stoffe unter Benutzung von 3 Wl Wasser eluiert. Die gewonnenen Fraktionen werden, ähnlich wie im Beispiel- I₇ behandelt, d.h. sie werden auf die erforderliche optische Dichte gebracht, man registriert da3 Luminiszenzspektrum und mißt die Größe ihrer Intensität. Danach bestimmt man die Konzentrationen der Eleuterozide B^ , B und die Summe D und E mittels zwei Methoden: der Methode des "Vergleichs¹¹ oder "nach der Formel", ähnlich

wie es im Beispiel 1 geschildert ist. Die Ergebnisse der Analyse sind :

Eleufcerozid B-, - 0,7 mg/ml

Eleuterozid B - 2,1 mg/ml

Summe der Bleuterozide

D und E - 1,9 mg/ml.

Wie oben angegeben, läßt sich die Stellung der Eleüterozide A und B₁ am Chromatogramm visuell nicht feststellen. Zur Feststellung des Vorhandenseins des Eleuterozids A in dem zu analysierenden Gemisch wird eine Nachweisreaktion durchge—

führt. Diese Reaktion besteht darin, daß die Bluatprobe aus dem Bereich der Stellung des Eleuterozids A am Chromatogramm eingedampft und in Chloroform gelöst wird. Der Probe werden 0,5 ml schwefelsaueren Lösung in Essigsäureanhydrid zugegeben. Wenn sich die Lösung in einigen Sekunden rosig -färbt, zeugt dies

vom Vorhandensein des Sleuterozids A in dieser. Die Konzentration des Eleuterozids A, die analog dem Beispiel 1 festgestellt wurde, beträgt in dem zu analysierenden Gemisch 0,56 mg/ml. Das Vorhandensein des Eleuterozids B₁ in dem zu ■analysierenden Gemisch beweist man an Hand einer Nachweisreaktion die darin besteht, daß der Bluatprobe aus dem Bereich der Stellung des Eleuterozids B₁ 0,1 ml 0,01 M C0.Cl₂-Losung im Wasser zugegeben werden. Innerhalb von wenigen Minuten erfolgt dabei eine Rötung der Lösung und in ihrem Absorptionsspektrum erscheint ein neues Band ". mit einem Maximum von ca. 400 nm.

Aus der Beschreibung des Verfahrens und . . . der angeführten Beispiele * ist ersichtlich., daß die

Erfindung nicht nur eine quantitative Analyse der Eleuterozide A₉B₁,B,D,E, sondern auch deren qualitative Analyse ermöglicht. Als solche dienen im Falle der Eleuterozide A und B₁ die Uaehweisreaktionen, das Vorhandensein der Eleuterozide B,D,E aber stellt man an Hand der vorhandenen gefärbten Flecke auf der chromatographischen Platte fest (Eleuterozid B - blau-violetter FIeckj Eleuterozide D und E - orangefarbener Fleck).

Die im Verfahren für die Nachweisreaktion zu verwendenden Reagenzien sowie die Eichsubstanzen sind bekannt,

billig und verfügbar. Zur Registrierung der Absorptionsspektren

der Luminiszenz und zur Messung der optischen Dichte verwendet man bekannte Geräte, die in der Laborpraxis eine breite Anwendung finden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist zur Analyse der EIeuterozide in Gemischen unbekannter Herkunft geeignet und kann somit zum Erkennen eventueller Verfälschungen eines Arzneipräparat-Eleuterokokks verwendet werden.

Claims

PATENTANWÄLTE« . "..' Z v^ii-w^^/^

SCHIFF ν. FÜNER STREHL °si:RtfBEitv-HÖPF ^: J=TB SLN G HAU S FlNCK

MARIAHILFPLATZ 2 & 3, MÖNCHEN 9O POSTADRESSE! POSTFACH 95 O16O, D-8OOO MÜNCHEN 95

ALSO PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEPOBE THE EUROPEAN PATENT OFFICE

KARL LUDWIO SCHIFP (1ΘΒ4-1Β7Β)

Naucno-issledovatel' ski j institut ««-^CHEM·^DR·^{ALEX4NDBR v}·^F0NER

_ .ν ϊ · S J- ·· 1-«· DIPL. ING. PETER STREHL

po biologiceskim ispytanijam cnimi- 0,PL_-CHEM₁DR₁

ceskich soedinenin ^dipl·^IN<3· Biete

DR. INQ. DIETER FINCK

TELEFON (OBO) 485054

TELEX B-33 0eS AURO D

TELEGRAMME AUBOMABCPAT MÜNCHEN

3. Juli 1981 DEA-22102

VERFAHREN ZUR QUANTITATIVEN BESTIMMUNG DER ELEUTEROZIDE A, B₁, B, D, E

PATENTANSPRÜCHE:

Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Eie uterozide A ,B, ,B,D,E in'einem zu analysier enden. Gemisch, unter , · Messung der optischen Dichte,. d a d u rjc h .^g e - _}

gekennze ichnet, daß das Ausgangsgemisch auf eine optische Dichte von 0,08 - 0,1 bei Wellenlängen, die im Bereich von 270 bis 380 nm liegen, gebracht wird, wonach die Größe der Luminiszenzintensität bei Anregung mit UV-Licht bei genannten Wellenlängen gemessen wird, die Konzentrationen der Eleuterozide B^,B,D,E. im Ausgangsgemisch nach· zwei. · . ."; Varianten bestimmt werden, entweder'durch den Vergleich der gemessenen Größe der Luminiszenzintensität mit der Luminiszenzintensität der Lösungen der genannten reinen Eleuterozide und deren Gemische unter der Benutzung des bekannten quantitativen Verhältnises zwischen den Eleuteroziden

A:B, :B:D:E ₌ 4:5:15:12:1 in deren ITaturgemischen, oder nach ^x F . η

der Formel C - , wobei gilt

K . tg ^- -Eichmaß

C - Konzentration des Eleuterozids oder des Gemisches der Eleuterozide,

F - Größe der Luminiszenzintensitat,
η - Grad der Verdünnung oder Eindampfung des zu. analysierenden Gemisches, wenn seine optische Dichte auf einen Wert von 0,08 bis 0,1 gebracht wird;

Konstante, wobei tgoi. und tgoC - Eich-

tg dL -Eichmaß

maß entsprechend die Tangensed er Neigungswinkel der linearen Abschnitte der

Kurven der Abhängigkeit der Größen der Luminiszenzintensitat des entsprechenden reinen Eleuterozids oder des Gemisches der reinen Eleuterozide und der Eichsubstanz von deren. Konzentration sind, wobei Tryptophan eine Eichsubstanz zur Bestimmung der Eleuterozide B,D,S und I-Anilinonaphthalin-8-SuIfonat eine Eichsubstanz zur Bestimmung des Eleuterozids B₁ ist, die unter ähnlichen Bedingungen abgenommen sind, und die Konzentration des Eleuterozids A berechnet wird, indem der erhaltene Wert der Konzentration des Eleuterozids B, verwendet wird, ausgehend vom bekannten Verhältnis zwischen diesen Eleuteroziden in deren iTaturgemischen.

2. Verfahren nach Anspruch !,dadurch gekennze ichnet, daß zur Bestimmung der Konzentration der Eleuterozide B₁D₁E die optische Dichte auf einen Wert von 0,08- 0,1 gebracht wird, die Lumineszenz bei einer Wellenlänge im Bereich von 270 bis 300 nm angeregt und die Lumineszenz-

intensität bei einer Wellenlänge im Bereich, von 310 bis 580 nm gemessen wird.

3. "Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung der Konzentration des Eleuterozids B₁ die optische Dichte auf einen Wert von 0,08 - 0,1 gebracht , die Luminiszenz bei einer Wellenlänge im. Bereich von 360 bis 380 nm angeregt und die Luminiszenzintensität bei einer ^ellenlange im Bereich von 460 bis 540 nm gemessen wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erhöhung der Genauigkeit bei der Bestimmung der Konzentrationen von Eleuteroziden das Ausgangsgemisch einer Vorreinigung und Fraktionierung mittels der Dünnschicht-Chroaiatograph.ie unterzogen wird unter'Gewinnung von Fraktionen, welche individuelle Eleuterozide enthalten, die optische Dichte der Fraktionen der Bleuterozide B-, ,B,D,E auf einen Wert von 0,08-0,1 bei Wellenlängen gebracht wird, die im Bereich von 2?0 bis 380 nm liegen, und die Luminiszenzintensität der Fraktionen bei Wellenlängen im Bereioh von 310 bis 540 nm gemessen wird.

5. Verfahren nach. Anspruch 4, dadurch gekennz e i c h η e t, daß zur Feststellung des Vorhandenseins und zur Bestimmung der· Konzentrationen des Eleuterozids A die Fraktion, die der Stellung des Eleuterozids A am Chromatogramm entspricht, in Chloroform gelöst und mit schwefelsauerer Lösung in Essigsäureanhydrid behandelt wird und beim Erscheinen einer Rötung, die das Vorhandensein des Eleuterozids A bestätigt, der Gehalt des Eleuterozids A, ausgehend von seinem proportionalen Gehalt mit dem Eleuterozid B₁ berechnet wird.

_ 4 —

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion, die der Stellung des Eleuterozids B, entspricht, mit Co-SaIz behandelt wird und beim Erscheinen eines neuen Bandes im Absorptionsspektrum der Fraktion mit einem Maximum von ca. 400 nm unter allmählicher Rötung der Losung das Vorhandensein des Eleuterozids B₁ festgestellt wird, wonach sein quantitativer Gehalt bestimmt wird.

7 ·- Verfahren nach Anspruch-1_f 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erhöhung der Genauigkeit bei der Bestimmung des Eleuterozids B^ seine Luminiszenzintensitat bei einem pH-Wert von 12-15 gemessen wird.