EP0991948A1 - Nachweis und bestimmung von phenolartigen inhaltsstoffen mittels direkter nasschemischer methoden - Google Patents

Nachweis und bestimmung von phenolartigen inhaltsstoffen mittels direkter nasschemischer methoden

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EP0991948A1
EP0991948A1 EP99920719A EP99920719A EP0991948A1 EP 0991948 A1 EP0991948 A1 EP 0991948A1 EP 99920719 A EP99920719 A EP 99920719A EP 99920719 A EP99920719 A EP 99920719A EP 0991948 A1 EP0991948 A1 EP 0991948A1
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EP
European Patent Office
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reagent
color
solution
hemp
detection
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Withdrawn
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EP99920719A
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Peter Rausch
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/948—Sedatives, e.g. cannabinoids, barbiturates

Definitions

  • Phenolic compounds are important, pharmacologically active ingredients of various plants and preparations made from them.
  • cannabinoids the main active ingredients of the hemp plant (Cannabis sativa)
  • hemp plant the main active ingredients of the hemp plant (Cannabis sativa)
  • cannabinoids the main active ingredients of the hemp plant (Cannabis sativa)
  • US 3,656,906 describes the detection of cannabinoids in biological materials such as blood plasma and urine by condensation of the previously extracted cannabinoids with polycarboxylic acid and subsequent photometric determination.
  • cannabinoids in body fluids is also described in US 4,816,415.
  • the cannabinoids are bound to aryl-carboxyacids using a special filter funnel and then the color of the cannabinoids is determined by color reaction with known reagents, namely real blue salt BB, real Bordeaux salt Gp, real green salt, Duquenois-Negm reagent or Beam reagent.
  • known reagents namely real blue salt BB, real Bordeaux salt Gp, real green salt, Duquenois-Negm reagent or Beam reagent.
  • - 2 - EP 132313 A2 describes cannabinoid detection methods for drug test packs based on diazonium reagents. The reaction is carried out on filter paper and the reagents are applied in liquid form or as a spray.
  • sample material has to be prepared by measures such as drying, extraction, filtration and evaporation in order to be able to carry out the corresponding determinations.
  • the task was therefore to provide a method which enables a quick and simple detection of cannabinoids which can also be carried out easily by the layperson on site.
  • This object is achieved by a method for the wet chemical detection of phenol-like substances, in particular cannabinoids and materials containing such substances, characterized in that the sample material is mixed directly with a color-forming reagent A, an additional reagent B for developing the specific color reaction is added and, by measuring the dye formed, the phenol-like substance to be determined is determined and, if necessary, also quantitatively recorded.
  • a color-forming reagent A is added directly to the sample, that is to say, for example, in pretreated or untreated form, even without prior drying.
  • Reagent A can be used as a solution of a color-forming substance with or without the addition of organic solvents.
  • Preferred examples of the color-forming substance are real black K, real blue salt B, 2,6-dibromoquinone chlorimide, 2,6-dichloroquinone chlorimide, formaldehyde, acetaldehyde, salicylaldehyde, vanillin, p-dimethylamino-benzaldehyde, p-diethylamino-benzaldehyde, iron III-chloride, 4-amino-antipyrine, 4-aminophenol or potassium hexacyanoferrate.
  • the reagents are preferably in the form of 0.001 to 10% solutions of the color-forming substance (weight / volume) in water and / or primary, secondary and tertiary alcohols with 1 to 10 carbon atoms with or without the addition of organic solvents such as saturated and unsaturated hydrocarbons , halogenated hydrocarbons, ethers, ketones, carboxylic acid esters and / or aromatic hydrocarbons.
  • Reagent B is preferably a solution of a color-developing substance, for example a base such as an alkali metal hydroxide and / or an alkali metal carbonate, an ammonium or alkali metal salt of an organic acid or mixtures thereof which may be substituted by one or more organic radicals, for example alkyl groups, and is in the form of a solution of 1 to 50% of the color-developing substance (w / v) in water and / or primary, secondary and tertiary CC 10 alcohols or mixtures thereof.
  • a color-developing substance for example a base such as an alkali metal hydroxide and / or an alkali metal carbonate, an ammonium or alkali metal salt of an organic acid or mixtures thereof which may be substituted by one or more organic radicals, for example alkyl groups, and is in the form of a solution of 1 to 50% of the color-developing substance (w / v) in water and / or primary, secondary and tertiary CC
  • ammonium or alkali salts of organic acids such as acetic acid, propionic acid, butyric acid, oxalic acid, fumaric acid, malic acid, sorbic acid, benzoic acid, salicylic acid, phthalic acid, phenylacetic acid, naphthylacetic acid and / or indole-3-acetic acid, for example in amounts of 0.1 to 20 % (W / v) are added to reagent B.
  • organic acids such as acetic acid, propionic acid, butyric acid, oxalic acid, fumaric acid, malic acid, sorbic acid, benzoic acid, salicylic acid, phthalic acid, phenylacetic acid, naphthylacetic acid and / or indole-3-acetic acid, for example in amounts of 0.1 to 20 % (W / v) are added to reagent B. - 4 -
  • the method according to the invention has proven particularly useful in the detection of cannabinoids, the pharmacologically interesting main active ingredients of hemp. This makes it possible for the first time to differentiate between drug and industrial hemp in young or adult, male or female plants from the age of two weeks. Furthermore - 5 - The degree of ripeness of hemp plants can be determined quickly and easily even directly on fresh plants.
  • the areas of application of the method according to the invention include agricultural hemp cultivation (industry), hemp cultivation, hobby gardening (“home grow” area), cannabis research and medicine, cannabis consumption (quality control) and official applications (drugs -Control).
  • the method for the detection of cannabis preparations in biological sample materials in particular human samples, e.g. Body fluids such as blood, saliva or urine, or tissue samples such as hair or nails are used.
  • the methods can also be used for the identification and quality assessment of essential oils and plant materials by determining existing phenolic bodies. Due to the simple implementation and the use of reagents and solvents that are as non-toxic as possible, even inexperienced laymen can carry out the described tests without difficulty.
  • these processes are particularly suitable for analysis packs (test kits) that can be used directly on site.
  • test kits test kits
  • the methods can also be used for the quantitative determination of the detected phenolic bodies.
  • the reagent solution A preferably monohydric or polyhydric alcohols alone or mixtures thereof are used as solvents, which on the one hand provide optimal extraction of the active ingredients and on the other hand - 6 - but also guarantee good loose properties for the reagent used and a trouble-free color reaction.
  • the reagent solutions B necessary for color development were designed in such a way that they can only be added to the reagent mixture in drops in order to be as simple and effective as possible.
  • the addition of salts of organic acids to the reagent solution B also made it easier to read the developed color shades and to improve their durability.
  • Reagent A Solution of 0.01% p-aminophenol in isopropanol
  • Reagent B 10% solution of sodium hydroxide in H 2 O-isopropanol (2: 1)
  • CBD Cannabidiol
  • THC Tetrahydrocannabiol
  • CBN green-blue Cannabinol
  • Reagent A 0.15% iron (III) chloride in absolute ethanol
  • Reagent B 1% ammonium acetate in absolute ethanol
  • Reagent A 0.01% solution of real black K in ethanol
  • Reagent B 5% sodium hydroxide solution in ethanol 50%
  • sample material 50 ml to 100 mg of sample material are mixed with 5 ml of reagent A in a clear, unstained sample tube and shaken several times. A drop of reagent B is added, shaken again and the resulting color is read off within 1 minute.
  • Reagent A 0.01% solution of 2,6-dichloroquinone chlorimide in
  • Isopropanol reagent B aqueous, saturated potassium carbonate solution
  • Fresh, undried plant material is used to determine the degree of ripeness, as the cannabinoid content can be changed during drying (e.g. conversion of cannabidiol to THC).
  • test should be repeated with a reduced amount of samples. Too small amounts of sample can in turn result in pale, indistinct shades that are shifted to yellow. In this case the test should be repeated with a larger amount of sample. - 1 1 - c) Execution of the tests
  • a small amount of the samples (see under Sample amounts) is placed in a glass tube.
  • the tube is filled up to half with reagent A, closed with a plastic cap and shaken several times within about 1 min.
  • the color obtained can be protected from light and kept stable longer under lock and key.

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Abstract

Die Erfindung betrifft modifizierte nasschemische Analysenmethoden zum Nachweis und zur Bestimmung von phenolartigen Verbindungen und Cannabinoiden mittels Farbreaktionen auf bisher nicht bekannte, einfach Weise, direkt in Frischpflanzen, Pflanzenmaterialien und deren Zubereitungen. Mit diesen Verfahren kann der spezifische, nasschemische Nachweis einzelner Cannabinoide mittels spezieller Farbreaktionen selektiv durchgeführt werden. Die Verfahren sind für die Anwendung in Analysen-Schnelltest-Packungen einsetzbar und die vorgesehenen Bestimmungen können auch für Laien schnell und problemlos durchgeführt werden.

Description

Nachweis und Bestimmung von phenoiartigen Inhaltsstoffen mittels direkter nasschemischer Methoden
Beschreibung
Phenolartige Verbindungen sind wichtige, pharmakologisch wirksame Inhaltsstoffe verschiedener Pflanzen und daraus hergestellter Zubereitungen.
Insbesonders Cannabinoide, die Hauptwirkstoffe der Hanfpflanze (Cannabis sativa) stehen durch ihre vielfältigen und wertvollen pharmakologischen Eigenschaften in letzter Zeit im Mittelpunkt des wissenschaftlichen Interesses.
Für ihren Nachweis sind verschiedene physikalische, chemische und auch diverse nasschemische Methoden bekannt. Letztere werden hauptsächlich in Form von "Spot Tests" unter Verwendung von Sprühreagenzien angewendet.
US 3,656,906 beschreibt den Nachweis von Cannabinoiden in biologischen Materialien wie Blutplasme und Urin durch Kondensation der vorher extrahierten Cannabinoide mit Polycarboxylsäure und anschließender photometrischer Bestimmung.
In US 4,816,415 wird ebenfalls der nachweis von Cannabinoiden in Körperflüssigkeiten beschrieben. Bei diesem Verfahren werden die Cannabinoide mit Hilfe eines Spezialfiltertrichters an Aryl-carboxyisäuren gebunden und anschließend durch Farbreaktion mit bekannten Reagenzien, nämlich Echtblausalz BB, Echtbordeaux-Salz-Gp, Echtgrünsalz, Duquenois- Negm-Reagenz oder Beam-Reagenz der Cannabinoidgehalt ermittelt. - 2 - ln EP 132313 A2 werden Cannabinoid-Nachweis-Methoden für Drogentest- Packungen auf Basisvon Diazonium-Reagenzien beschrieben. Die Reaktion wird auf Filterpapier durchgeführt und die Reagenzien in flüssiger Form oder als Spray aufgetragen.
Diese und ähnliche Verfahren sind relativ umständlich durchzuführen und meist ist eine Aufbereitung des Probematerials durch maßnahmen wie Trocknung, Extraktion, Filtration und Eindampfen, notwendig, um die entsprechenden Bestimmungen durchführen zu können.
Dies erfordert einen erheblichen Arbeits- und Zeitaufwand und kann mitunter auch zu einer Veränderung der stofflichen Zusammensetzung des Probematerials führen. Außerdem sich bei diesen Methoden häufig die Verwendung von giftigen oder stark ätzenden Chemikalien erforderlich, was für eine breite Anwendung durch den Laine problematisch ist.
Im Bereich der Drogenfahndung wird zur Cannabis-Schnellerkennung hauptsächelich die nasschemische Duquenois-Reaktion in Form eines Reagenzienkits eingesetzt. Diese Methode ist jedoch wenig spezifisch, kann keinerlei Auskunft über das tatsächliche Cannabinoid-Verhältnis geben, arbeitet mit konzentrierter Säure und ist außerdem nicht ganz einfach durchzuführen.
Es bestand also die Aufgabe, ein Verfahren bereitzustellen, das einen schnellen und einfachen, auch für den Laien vor Ort leicht durchführbaren Nachweis von Cannabinoiden ermöglicht.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum nasschemischen Nachweis von phenolartigen Substanzen, insbesondere von Cannabinoiden und solche Stoffe enthaltenden Materialien, dadurch gekennzeichnet, daß das Probenmaterial direkt mit einem farbbildenden Reagenz A versetzt, zur Entwicklung der spezifischen Farbreaktion ein zusätzliches Reagenz B zugegeben wird und durch Messung des gebildeten Farbstoffes die zu bestimmende phenolartige Substanz bestimmt und ggf. auch quantitativ erfaßt wird.
Die Probe wird direkt, d.h. beispielsweise in vorbehandelter oder unbehandelter Form, auch ohne vorherige Trocknung direkt mit einem farbbildenden Reagenz A versetzt. Das Reagenz A kann als Lösung einer farbbildenden Substanz mit oder ohne Zusatz organischer Lösungsmittel eingesetzt werden. Bevorzugte Beispiele für die farbbildende Substanz sind Echtschwarz K, Echtblausalz B, 2,6-Dibromchinon-chlorimid, 2,6- Dichlorchinon-chlorimid, Formaldehyd, Acetaldehyd, Salicylaldehyd, Vanillin, p-Dimethylamino-benzaldehyd, p-Diethylamino-benzaldehyd, Eisen-lll-chlorid, 4-Amino-antipyrin, 4-Aminophenol oder Kaliumhexacyanoferrat. Die Reagenzien werden vorzugsweise in Form von 0,001 bis 10%igen Lösungen der farbbildenden Substanz (Gewicht/Volumen) in Wasser und/oder primären, sekundären und tertiären Alkoholen mit 1 bis 10 Kohlenstoff atomen mit oder ohne Zusatz von organischen Lösungsmittel wie gesättigten und ungesättigten Kohlenwasserstoffen, halogenierten Kohlenwasserstoffen, Ethern, Ketonen, Carbonsäureestern und/oder aromatischen Kohlenwasserstoffen vorgelegt. Reagenz B ist vorzugsweise eine Lösung einer farbentwickelnden Substanz, z.B. einer Base wie etwa einem Alkalihydroxid und/oder einem Alkalicarbonat, einem ggf. durch einen oder mehrere organische Reste, z.B. Alkyl-Gruppen substituierten Ammonium- oder Alkalisalz einer organischen Säure oder Gemischen davon und liegt in Form einer Lösung von 1 bis 50% der farbentwickelnden Substanz (Gew. /Vol.) in Wasser und/oder primären, sekundären und tertiären C C10 Alkoholen oder deren Gemischen vor. Gegebenenfalls können Ammonium- oder Alkalisalze organischer Säuren wie Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Oxalsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Sorbinsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Phthalsäure, Phenylessigsäure, Naphthylessigsäure und/oder lndol-3-essigsäure, z.B. in Mengen von 0, 1 bis 20% (Gew. /Vol.) dem Reagenz B zugesetzt werden. - 4 -
Überraschenderweise ist es gelungen, ein Verfahren zu entwickeln, in dem speziell ausgewählte Farbreaktionen so modifiziert werden, daß die Reagenzien unmittelbar dem als Extraktionsmittel fungierenden Lösungsmittel zugefügt und in der nasschemischen Nachweisreaktion direkt eingesetzt werden. Dadurch sind die sonst notwendigen Vorbehandlungen des Probenmaterials, wie Trocknen, Extraktion und abschließendes Eindampfen nicht mehr erforderlich.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird durch geeignete Auswahl und Konzeption der Reagenzien, sowie durch spezielle Modifikation bei der Durchführung des Verfahrens erreicht, daß der jeweils vorherrschende Phenolkörper durch Entwicklung eine spezifischen, deutlich unterscheidbaren Farbtones einzeln für das Auge sichtbar gemacht und so auf bisher nicht bekannte, einfache und schnelle Weise direkt nasschemisch nachgewiesen werden kann.
Durch Verfeinerung des Verfahrens konnte zusätzlich eine optimale, besonders leicht ablesbare Abstufung, sowie eine mehrere Stunden anhaltende Beständigkeit der entstandenen Farbtöne erreicht werden.
Auf diese Weise ist es erstmals auch möglich, frisches, unbehandeltes Probematerial und sogar Frischpflanzen in vorbehandelter oder unbehandelter Form auch ohne vorherige Trocknung z.B. am Feld direkt der Untersuchung zu unterwerfen und nach phenolischen oder cannabinoiden Bestandteilen zu analysieren.
Besonders bewährt hat sich das erfindungsgemäße Verfahren beim Nachweis von Cannabinoiden, den pharmakologisch interessanten Hauptwirkstoffen des Hanfes. Damit ist erstmals eine Unterscheidung von Drogen- und Industriehanf bei jungen oder erwachsenen, männlichen oder weiblichen Pflanzen ab einem Alter von zwei Wochen möglich. Des weiteren - 5 - kann die Bestimmung des Reifegrades von Hanfpflanzen auf schnelle und einfache Weise sogar direkt an Frischpflanzen vorgenommen werden.
Die Einsatzbereiche des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen den land- wirtschaftlichen Hanfanbau (Industrie), die Hanfzüchtung, die Hobby- Gärtnerei ("Home Grow"-Bereich), die Cannabis-Forschung und Medizin, den Cannabis-Konsum (Qualitätskontrolle) und behördliche Anwendungen (Drogen-Kontrolle). Weiterhin kann das Verfahren zum Nachweis von Cannabis-Präparaten in biologischen Probenmaterialien, insbesondere humanen Proben, z.B. Körperflüssigkeiten wie Blut, Speichel oder Urin, oder Gewebeproben wie Haaren oder Nägeln eingesetzt werden.
Durch spezielle Modifikationen der Reagenzien und der Verfahren konnten neue Methoden zum selektiven nasschemischen Nachweis einzelner spezi- fischer Cannabinoide gefunden werden.
Die Verfahren können auch für die Identifizierung und Qualitätsbeurteilung von ätherischen Ölen und Pflanzenmaterialien durch Bestimmung vorhandener Phenolkörper eingesetzt werden. Durch die einfache Durchführung und die Verwendung möglichst ungiftiger Reagenzien und Lösungsmittel ist es auch für den ungeübten Laien möglich, die beschriebenen Tests ohne Schwierigkeiten durchzuführen.
Aufgrund der einfachen Konzeption des Verfahrens und der dazu nötigen Reagenzien, eignen sich diese Verfahren besonders für Analysenpackungen (Testkits) die direkt an Ort und Stelle eingesetzt werden können. Mittels dem Fachmann bekannter, photometrischer Messung der Absorptions- hauptmaxima der entwickelten Farbtöne können die Verfahren auch zur quantitativen Bestimmung der nachgewiesenen Phenolkörper herangezogen werden. In der Reagenzlösung A werden als Lösungsmittel vorzugsweise ein- oder mehrwertige Alkohole alleine oder deren Gemische verwendet, welche einerseits eine optimale Extraktion der Wirkstoffe und andererseits - 6 - aber auch gute Lose-Eigenschaften für das verwendete Reagenz und eine störungsfreie Farbreaktion garantieren. Die zur Farbentwicklung notwendigen Reagenzlösungen B wurden so konzipiert, daß sie zwecks möglichst einfacher und effektiver Handhabung nur in Tropfenmengen dem Reagenzgemisch zugegeben werden können. Durch die Zugabe von Salzen organischer Säuren zu der Reagenzlösung B konnte weiters eine bessere Ablesbarkeit der entwickelten Farbtöne, sowie eine verbesserte Haltbarkeit derselben erzielt werden.
Die Erfindung soll anhand der folgenden Beispiele erläutert und illustriert werden, ohne sich jedoch auf diese zu beschränken.
1. Nasschemische Bestimmung von Phenolen und Cannabinoiden in verschiedenen Materialien und Frischpflanzen
a) Reagenzien:
Reagenz A: Lösung von 0,01 % p-Aminophenol in Isopropanol
Reagenz B: 10%ige Lösung von Natriumhydroxid in H2O-lsopropanol (2: 1 )
b) Durchführung:
20 bis 100 Milligramm des Probenmaterials werden in einem klaren, farblosen Reagenzröhrchen mit 2 ml Reagenz A versetzt, mehrmals geschüttelt, mit 2 Tropfen Reagenz B versetzt, wieder geschüttelt und die entstandene Färbung nach 10 Minuten abgelesen.
c) Farbreaktionen
I. Blindwert → gelblichgrau (negativ) - 7 -
II. Hanf-Frischpflanzen
unreifer Drogenhanf violett rötlich ausgereifter Drogenhanf blaugrün reifer EU-Industriehanf (Feiina 34) violett rötlich
III. Ätherische Ole
Rosmarinöl → olivgrün
Oreganoöl → blau Thymianöl → blau
IV. Phenolische Verbindungen:
Thymol tiefblau
Cannabidiol (CBD) → violettrosa
Tetrahydrocannabiol (THC) → grünblau Cannabinol (CBN) → blau
Selektiver nasschemischer Nachweis von Tetrahydrocannabinol (THC)
a) Reagenzien
Reagenz A: 0,15% Eisen-(lll) Chlorid in absolutem Ethanol Reagenz B: 1 % Ammonium-Acetat in absolutem Ethanol
b) Durchführung:
10 bis 100 mg des Probematerials werden in einem klaren, farblosen Probenröhrchen mit 1 ,5 ml Reagenz A versetzt und geschüttelt. Dann versetzt man mit 5 Tropfen Reagenz B. Die Farbtöne werden nach 1 Minute abgelesen. - 8 - c) Farbreaktionen:
Blindwert → schwach bräunlichgelb = negativ
Cannabidiol → (schwach bräunlichgelb) = negativ Cannabinol → (schwach bräunlichgelbt) = negativ
THC → orange rotbraun = positiv
3. Selektiver nasschemischer Nachweis von THC
a) Reagenzien:
Reagenz A: 0,01 %ige Lösung von Echtschwarz K in Ethanol Reagenz B: 5%ige Natriumhydroxid-Lösung in Ethanol 50%ig
b) Durchführung:
50 bis 100 mg Probenmaterial werden in einem klaren, ungefärbten Probenröhrchen mit 5 ml Reagenz A versetzt und mehrere Male durchgeschüttelt. Ein Tropfen Reagenz B wird zugegeben, abermals durchgeschüttelt und die entstandene Färbung innerhalb von 1 Minute abgelesen.
c) Farbreaktionen:
Blindwert = hell violettrosa = negativ Cannabidiol = hell violettrosa = negativ Cannabinol = hell violettrosa = negativ THC = bräunl. orangerot = positiv - 9
Selektiver nasschemischer Nachweis von Cannabinol
a) Reagenzien:
Reagenz A: 0,01 %ige Lösung von 2,6-Dichlorchinon-chlorimid in
Isopropanol Reagenz B: wässrige, gesättigte Kaliumcarbonat-Lösung
b) Durchführung:
10 bis 50 mg Probe werden in einem glasklaren, ungefärbten Proberöhrchen mit 5 ml Reagenz A versetzt, mehrere Male durchgeschüttelt. Dann wird mit 1 Tropfen Reagenz B versetzt, eine Minute kräftig durchgeschüttelt und die entstandene Färbung sofort abgelesen.
c) Farbreaktionen:
Blindwert → hell bräunlichgelbe Färbung = negativ Cannabidiol → hell bräunlichgelbe Färbung = negativ THC hell bräunlichgelbe Färbung = negativ
Cannabinol = blaue Färbung = positiv
Anwendung des Tests für die Cannabinoid-Bestimmung (Reagenzien siehe Beispiel 1 )
a) Probenauswahl
Art der Analyse Art der Probe
Hanf-Reifetest weibliche Fruchtstände
Unterscheidung zwischen Industrie- völlig entwickelte fingrige Blätter und Drogenhanf männlicher, weiblicher oder junger Pflanzen von 2 Wochen Mindestalter
Cannabis-Präparate-Qualitäts- Marihuana, Haschisch, Haschisch-Öl, Kontrolle Hanf-Kraut 10 -
Für die Bestimmung des Reifegrades wird frisches, nicht getrocknetes Pflanzenmaterial verwendet, da beim Trocknen der Cannabinoid-Gehalt verändert werden kann (z.B. Umwandlung von Cannabidiol zu THC).
Zur Unterscheidung von Industrie- oder Drogenhanf werden voll ausgebildete fingrige Normalblätter (frisch oder getrocknet) der Pflanze und nicht die Blüten- oder Fruchtstände verwendet. Durch einen Test der normalen, fingrigen Blätter einer bestimmten, mindestens zwei Wochen alten Jungpflanze kann deren maximal erreichbares zukünftiges Cannabinoid-Spektrum ermittelt werden.
b) Probenmengen
Probenart Hinweis frisch getrocknet
Pflanzenmaterial weibliche Blütenzerkleinert ohne etwa 100 mg etwa 10 mg oder Blätter und junge ( ~ 2 (kleine Samenstände Triebe Messerspitzen) Messerspitze)
Hanfblätter voll ausgebildet etwa 300 mg etwa 50 mg von männlichen (große (eine oder weiblichen Messerspitze) Messerspitze) oder jungen
Pflanzen
Cannabis-Präparate
Marihuana zerkleinert - etwa 10 mg
Haschisch fein zerkleinert - etwa 5 mg
(sehr kleine
Messerspitze)
Haschisch-Öl - - etwa 2 mg
Wenn die entwickelten Farbtöne zu intensiv und damit schwer ablesbar sind, sollte der Test mit reduzierter Probenmenge wiederholt werden. Zu kleine Probenmengen können wiederum blasse, undeutliche und ins gelbe verschobene Farbtöne ergeben. In diesem Fall sollte der Test mit größerer Probenmenge wiederholt werden. - 1 1 - c) Durchführung der Tests
Eine kleine Menge der Proben (siehe unter Probenmengen) wird in ein Glasröhrchen gegeben. Das Röhrchen wird bis zu Hälfte mit Reagenz A aufgefüllt, mit einer Kunststoffkappe verschlossen und innerhalb von etwa 1 min mehrere Male durchgeschüttelt.
Dann wird das Röhrchen geöffnet und mit einem Tropfen Reagenz B versetzt, sofort wieder verschlossen und wieder durchgeschüttelt. Innerhalb einer Minute kann die entstandene Färbung der überstehenden Lösung abgelesen werden. Die besten Ergebnisse werden bei durchscheinendem Tageslicht oder gegen eine weiße Fläche erhalten.
Durch Trennung der gefärbten, überstehenden Lösung vom Bodensatz des Probenmaterials mittels Abgießens in ein anderes Glasröhrchen kann die erhaltene Färbung lichtgeschützt und unter Verschluß länger stabil gehalten werden.
so d) Farbreaktion und Bedeutung *-
verwendete Probe gelblich rötlich oliv braun grün blaugrün blau weibliche negativ unreifer halb reifer reifer Drogen- vbllig reifer überreifer Fruchtstände Drogenhanf oder Drogen-Hanf Hanf Drogen-Hanf Drogen-Hanf reifer EU-
Industrie-Hanf
(Felina34) normale Blätter negativ Industrie-Hanf Drogen-Hanf Drogen-Hanf Drogen-Hanf Drogen-Hanf von jungen oder alten, männlichen i
10 oder weiblichen
Pflanzen
Cannabis negativ sehr wenig THC wenig THC mittelmäßig THC sehr viel THC alt Präparate THC + CBN
Cannabinoid- negativ vorwiegend CBO CBD und THC vorwiegend THC sehr viel THC THC und CBN
15 Gehalt
Verhältnis CBD- negativ > 2: 1 2: 1 < 2: 1 < 1 : > 1 THC und CBN THC
O
so
SO
- 13 -
Die mit den angefärbten Verfahren erreichbaren unteren Nachweisgrenzen sind für CBD = 0,04 mg, THC = 0,02 mg und CBN = 0,02 mg.

Claims

- 14 -Ansprüche
1 . Verfahren zum nasschemischen Nachweis von phenolartigen Substanzen, insbesondere von Cannabinoiden und solche Stoffe enthaltenden Materialien, dadurch gekennzeichnet, daß das Probenmaterial direkt mit einem farbbildenden Reagenz A versetzt, zur Entwicklung der spezifischen Farbreaktion ein zusätzliches Reagenz B zugegeben wird und durch Messung des gebildeten Farbstoffes die zu bestimmende phenolartige Substanz bestimmt und ggf. auch quantitativ erfaßt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß als Reagenz A Lösungen einer farbbildenden Substanz, wie etwa Echtschwarz K, Echtblausalz B, 2,6-Dibromchinon-chlorimid, 2,6- Dichlorchinon-chlorimid, Vanillin, Salicylaldehyd, Formaldehyd, Acetaldehyd, p-Dimethylamino-benzaldehyd, p-Diethylamino- benzaldehyd, Eisen-lli-chlorid, 4-Aminophenol oder Kaliumhexacyanoferrat verwendet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß als Reagenz B Lösungen einer Base, wie etwa einem
Alkalihydroxid oder einem Alkalicarbonat und/oder eines ggf. substituierten Ammonium- oder Alkalisalzes einer organischen Säure oder deren Gemischen verwendet werden. - 15 -
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß dem Reagenz B 0,1 bis 20% eines Ammonium- oder Alkalisalzes einer organischen Säure zugesetzt werden.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß 0,01 bis 500 mg Probematerial in einem Probenröhrchen mit 1 bis 10 ml Reagenz A und nach Schütteln mit 1 bis 10 Tropfen Reagenz B versetzt werden und nach abermaligem Schütteln die entstandene Verfärbung innerhalb eines vorbestimmten Zeitraumes abgelesen wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz A aus einer 0,001 bis 10 %igen Lösung einer farbbildenden Substanz in Wasser oder/und primären, sekundären und/oder tertiären C C10-Alkoholen und Reagenz B aus einer Lösung von 10 bis 50% Alkalihydroxid in Wasser oder Alkoholen oder deren Gemischen zusammengesetzt ist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz A aus einer 0,05 bis 5%igen Lösung von Eisen-Ill- Chlorid in Wasser und/oder primären, sekundären oder tertiären C,-
C10-Alkoholen und Reagenz B aus einer Lösung von 0, 1 bis 5,0 % eines Ammoniumsalzes einer organischen Säure zusammengesetzt ist und die entstandene Farbreaktion nach etwa 2 Minuten ablesbar ist. - 16 -
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Reagenz A aus einer 0,001 bis 5%igen Lösung von 2,6- Dibromchinon-chlorimid in primären, sekundären und/oder tertiären C C10-Alkoholen, und Reagenz B aus einer gesättigten wäßrigen
Lösung von Kaliumcarbonat zusammengesetzt ist und der entstandene Farbton innerhalb von etwa 30 Sekunden abgelesen wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Identifizierung und Qualitätsbestimmung von Cannabis- Präparaten wie Marihuana, Haschisch, Haschischöl und sonstigen Cannabinoid-haltigen Materialien, zur Bestimmung des Reifegrades von Hanfpflanzen, sowie zu Unterscheidung von Drogen- und
Industrie-Hanf bei erwachsenen männlichen oder weiblichen und auch bei jungen Hanfpflanzen in frischer oder auch getrockneter Form, verwendet wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichneit, daß es zum Nachweis von Cannabis-Präparaten in biologischen Probenmaterialien, z.B. Körperflüssigkeiten wie Blut, Speichel oder Urin, oder Gewebeproben wie Haaren oder Nägeln, verwendet wird.
1 1 . Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es zum naßchemischen Nachweis verschiedener phenolartiger Verbindungen, in ätherischen Ölen, Resinoiden, Absolutes, Konkretes, Frischpflanzen, Pflanzendrogen, Pflanzenextrakten- und
Auszügen und Geruchstoffen, sowie zur deren Identifizierung und Charakterisierung und Qualitätsbestimmung verwendet wird. - 17 -
12. Reagenzienkit nach Durchführung eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es die beiden Reagenzien A und B getrennt abgefüllt, z.B. in korrosionsfesten, mit einer Ausgußvorrichtung versehenen Fiäschchen erforderlicher Größe, sowie mehrere kleine verschließbare klare, farblose Proberöhrchen zur Durchführung der Farbreaktion und eine Farbvergleichs-Skala zur Ablesung und Auswertung der entstandenen Farbtöne enthält.
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