DE1807181A1 - Farbreagenz zur Kreatininbestimmung - Google Patents

Description

B. ,Merck

Aktiengesellschaft

Darmstadt 5. November 1968

Farbreagenz zur KreatininbeStimmung

Zusatz zu DBP ... (deutsche Patentanmeldung P 16 48 977·3

(früher M 74 850 IXb / 42 I))

Das Hauptpatent ... (deutsche Patentanmeldung P 16 48 977.3 (früher M 74 850 IXb / 42 I)) betrifft ein Alkalipifcrat und Alkalihydroxid enthaltendes Farbreagenz zur SeStimmung von Kreatinin durch Messung der Lichtabsorption des gebildeten Kreatininpikrats, das dadurch charakterisiert ist, daß als Alkalipikrat Lithiumpikrat und als Alkalihydroxid Lithiumhydroxid verwendet wird, sowie ein Verfahren zur Kreatininbestimmung, in dem dieses Farbreagenz angewandt.wird bzw. die Verwendung von Lithiumpikrat und Lithiumhydroxid zur Bestimmung von Kreatinin. . .·

Die Verwendung dieses neuen Farbreagenzes für die Kreatininbestimmung bringt Vorteile im Vergleich zu den bisher bekannten Bestimmungsmethoden, wie sie z.B. in Zeitschrift für physiologische Chemie, Band 10, Seite 391 (1886) und Band 41, Seite 223 (1904), Biochemische Zeitschrift, Band 291, Seite 354 (1937) und Ärztliches Labor, Band 11, Seite 175 ff., insbesondere Seite 177 (1960) beschrieben sind.

So ist z.B. vorteilhaft, daß. nur geringe Mengen der zu messenden Probe, z.B. 0,2 ml Serum, für die KreatininbeStimmung mit dem neuen Reagenz erforderlich sind und trotzdem die Lichtabsorption bei beliebigen Wellenlängen zwischen 500 ' und 550 nm, insbesondere bei der günstig gelegenen Wellenlänge von 546 nm, die mit den üblichen Filterphotometern, mit der Quecksilberlampe gemessen werden kann, möglich ist.

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ORfGtNAL !N$J*ECTED

Ferner 1st von Vorteil, daß die Komponenten des Farbreagenzes, Lithiumpikrat und Lithiumhydroxid, vor der Messung gemischt werden können. Das Farbreagenz kann bei/roessung in Lösung in einer einzigen Pipettierung ssugegeben werden, wodurch zusätzliche Meßfehler, wie sie. bei 2 getrennten Plpettierungen auftreten, vermieden werden« Die einfachere Handhabung bringt insbesondere bei Serienuntersuchungen eine merkliche Arbeitsersparnis. Außerdem kann das Farbreagenz auch in trockener Form für eine Einzelmessung dosiert werden. Ferner ist bemerkenswert, daß die KreatininbeStimmung mit dem neuen Farbreagenz schon kurze Zeit nach Zusatz des Reagenzes zu der zu messenden Probe vorgenommen werden kann. Ein weiterer Vorteil liegt darin, daß bei Anwendung des " neuen Reagenzes die zu bestimmende Probe, z.B. kreatininhaltiges Serum, nicht mit Wasser verdünnt werden muß, wie dies nach den Vorschriften der bekannten Verfahren erforderlich ist.

Es wurde nun gefunden, daß diese Vorteilte besonders ausgeprägt sind, wenn in der zu messenden kreatininhaltigen Probe, insbesondere einer Körperflüssigkeit, nach Zugabe des Farbreagenzes ein pH von 11 bis 13 vorhanden ist.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein ^ , ι Lithiumpikrat und Lithiumhydroxid enthaltendes Farbreagenz ) zur Kreatininbestimmung, insbesondere in Körperflüssigkeiten, durch Messung der Lichtabsorption des gebildeten Kreatinin-.--pikrats nach DBP ... (deutsche Patentanmeldung P 16 48 977.3 (früher M 74 850 IXb/ 42 Ir)), dadurch gekennzeichnet, daß das Lithiumhydroxid in einer solchen Konzentration enthalten ist, daß nach Mischung des Farbreagenzes mit der kreatininhaltigen Probe ein pH von 11 - 13 vorliegt. . · '

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¹ 1 ι "' PIP"" ■

Bas verbesserte Farbreagenz nach der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise in Form einer wäßrigen Lösung eingesetzt* Das Farbreagenz kann z.B. aus Idthiumpikrat und Lithiumhydroxid bzvr. deren wäßrigen Lösungen hergestellt werden. Besonders bevorzugt ist die Herstellung des Reagenzes aus einer Pikrinsäurelösung und einer Lithiumhydroxidlösung, wobei dann in der gebrauchsfertigen Reagenzlösung das aus der zugesetzten Pikrinsäure und dem Lithiumhydroxid gebildete Lithiumpikrat vorliegt« Ia allgemeinen werden hierbei wäßrige Lösungen verwendet. Gegebenenfalls können die wäßrigen Lösungen noch einen Zusatz eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels wie Alkohol enthalten.

Sie verwendete Pikrinsäurelösung kann gegebenenfalls zur Erhöhung ihrer Löslichkeit einen Zusatz an Lithiumhydroxid _H' enthalten. Im allgemeinen wird jedoch Pikrinsäurelösung ohne Zueatz von Lithiumhydroxid für die Zubereitung des Farbreagenzes eingesetzt. Die verwendete Lösung enthält vorteilhafterweise die Pikrinsäure in einer Konzentration von mindestens etwa 0,1 j6. In Manchen Fällen kann die Verwendung einer bei Zimmertemperatur gesättigten, wäßrigen Pikrinsäurelösung (Pikrinsäuregehalt etwa 1,2 ^) zweckmäßig sein. In einer -besonders bevorzugten Ausführungeform wird der Pikrineäuregehalt so bemessen, daß das fexrtfge Farbreagenz die Pikrinsäure in 0,005- bis 0,025-molarer, insbesondere in 0,019-molarer Konzentration enthält.

Der Gehalt an Lithiumhydroxid ist so bemessen,- daß nach Zugabe des Farbreagenzes zu der zu messenden kreatininhaltigen Probe ein pH von 11 - 13 erreicht wird. Sofern die zu messende Probe, z.B. durch vorausgehende saure Enteiweißung bei der Messung des Kreatiningehalts von Körperflüssigkeit ten, eauer ieti muß ein entsprechender überschuss an Lithiumhydroxid Ib Farbreagens enthalten sein, Mit dem der gewünschte pH erreicht wird.

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Bas Farbreagenz wird besonders vorteilhaft unm±telbar vor der Anwendung durch Mischen einer Pikrinsäurelöeung und der zugehörigen Lithiumhydroxidlösung hergestellt. Gegebenenfalls kann das vorgemisehte Reagenz auch einige Stunden vor der Ingebrauchnahme aufbewahrt werden.

, Sofern das Reagenz in fester Form vorliegt» wird wegen der ; 'explosiven Eigenschaften von Pikrinsäure bzw. Lithiumpikrat zweckmäßigerweise durch Zusatz eines inerten Verdünnungsmittel β die Brisanz des Gemisches herabgesetzt. Als Verdünnungami ttel sind vorzugsweise wasserlösliche inerte Salze» z.B. entsprechende Alkalisalzej wie Lithium-, Natrium- oder Kaliumhalogenide wie Lithiumchlorid, -bromid oder jodid» h Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder geeignete wasserlösliche Sulfate, z.B. Natriumsulfate, geeignet. Gegebenenfalls kann das Farbreagenz nach der Erfindung au,ch in gefriergetrockneter Form eingesetzt werden. .'■'"...

In einer besonderen Aueführungeform werden die Komponenten des Farbreagenzes in einer solchen Konzentration gemischt« daß eine abgemessene Dosis für eine einzelne Kreatininbe-.Stimmung anzuwenden ist.

Das Farbreagenz, nach der Erfindung eignet sich für die Bestimmung von Kreatinin in wäßrigen Lösungen, die z.B. als Standardvergleichslösungen bei KreatininbeStimmungen in f biologischen Flüssigkeiten angewandt werden. Insbesondere ist das Reagenz geeignet zur KreatininbeStimmung in biologischen Flüssigkeiten wie. Serum, Plasma, Blut, Harn oder Gerebrospinalflüssigkeit. Auch für die Bestimmung von Kreatinin in Futtermitteln oder Nahrungsmitteln, z.B. in Fleischextrakt, kann das Reagenz nach der Erfindung eingesetzt werden.

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ORIGINAL INSPECTED

- Eiweißhaltige Körperflüssigkelten, z.B. Serum, Blut oder ,- Plasma und bei manchen Messungen auch Harn,werden vor der Kreatininbestimmung mit dem Mittel der Erfindung in üblicher Weise enteiweißt. Bevorzugt ist hierbei die saure Entei-¹ weißung, beispielsweise mit Trichloressigsäure, Perchlorsäure, Pikrinsäure, oder mit Wolframat oder Molybdat/Schwefelsäure bzw. mit m-Phosphorsäure oder SuIfοsalizylsäure. Anschließend wird dann in üblicher Welse zentrifugiert. Be-. sonders vorteilhaft ist die Anwendung des neuen Reagenzes nach der vorliegenden Erfindung für die Bestimmung von Kreatinin in Körperflüssigkeiten, die mit Trichloressigsäure enteiweißt wurden. In diesem Pail hat es sich als günstig herausgestellt, die Körperflüssigkeiten mit etwa 1- bis 3-molarer, insbesondere mit etwa 1,5-molarer Tricliloressigsäure vor der Kreatininbestimmung zu enteiweißen.Das Gemisch Körperflüssigkeit/Trichloressigsäure enthält dann die TricKU»· essigsäure in 0,6 bis 2,0 molarer Konzentration. In einer besonderen Ausführungsform wird mit 1,5-molarer wäßriger Trichloressigsäurelösung enteiweißt. Beispielsweise kann man hierzu einem Volumenteil der Probe der Körperflüssigkeit 2-2,5 Volumenteile einer 1,5-molaren wäßrigen Trichloressigsäurelösung zusetzen. Das Gemisch enthält dann die Trichloressigsäure in 1- bis 1,2-molarer Konzentration. Mr die eigentliche Kreatininbestimmung wird dann einem Volumenteil enteiweißter Körperflüssigkeit dasselbe Volumei^Twelches Pikrinsäure in 0,019-mölarer Konzentration und Lithiumhydroxid in 1,45-molarer Konzentration enthält, zugesetzt. Nach einer Inkubationszeit von vorzugsweise etwa 8 bis 20, insbesondere von 15 Minuten, wird die Iiichtabsorption (Extinktion bzw. Transmission) des gebildeten Kreatininpikrats in üblicher Weise gemessen.

/eines larbreagenzes nach der Erfindung Bevorzugt wird die Extinktion in dem Bereich zwischen 500 und 550 nm, beispielsweise bei 520, 546 oder 509 nm, gemessen. Für die Bestimmung wird vorteilhaft eine Temperatur zwischen etwa 10 und 30°, vorzugsweise zwischen 20 und 25°, ' eingehalten. Die gemessene Mchtabsorption ist proportional der in der Probe enthaltenen Kreatininmenge.

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A. Beispiele für das Farbreagenz

1) 10 ml wäßrige 0,05-molare Pikrinsäurelösung werden mit 10 ml wäßriger 0,85-molarer lösung von Lithiumhydroxid gemischt.

. 2) 1 Teil einer wäßrigen 0,038-molaren Pikrinsäurelösung wird mit 1 Teil einer wäßrigen 2,9-molaren Lithiumhydroxidlösung gemischt.

3) 1 Teil einer wäßrigen 0,030-molaren Pikrinsäurelösung wird mit 5 Teilen einer wäßrigen 3,3-molaren Lithiumhydroxidlösung gemischt. ,

4) 1 Teil einer wäßrigen 0,020-molaren Pikrinsäurelösung wird mit 3 Teilen einer wäßrigen 3,47-molaren Lithiumhydroxidlösung gemischt.

B. Beispiele für KreatininbeStimmung

1) 1 ml einer wäßrigen Lösung von Kreatinin, deren Kreatiningehalt bestimmt werden soll, wird mit 1 ml Jfarbreagenz nach Beispiel A. 1) gemischt und 10 Minuten bei 20 bis 25⁰C stehengelassen. Innerhalb einiger weiterer Minuten (vorzugsweise 8 bis 10 Minuten) wird die Extinktion des Gemisches mit einem Spektralphotometer zwischen 500 und 550, vorzugsweise bei 520 nm oder z.B. bei Hg 546 oder Cd 509 bei einer Küvettenschichtdieke von 0,5 bis 2 cm gemessen. Der Kreatiningehalt ergibt sich durch Vergleich mit der Extinktion einer Standardlösung, die eine bekannte Menge reines Kreatinin enthält. ·"

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ORiGiNAL INSPECTED

2) Zu 1 ml Serum, dessen Kreatiningehalt zu bestimmen ist, gibt man zur Enteivreißung 2 ml einer wäßrigen 1,5-molaren Trichloressigaäurelösung. Nach Zentrifugieren erhält man den für die Kreatinlnbestimmung einzusetzenden eiweißfreien Überstand.

Ferner werden 0,5 ml einer Standardlösung, die 4 mg Kreatinin in 100 ml 0,5n HOl enthält, mit 0,5 ml 1,5-molarer wäßriger Lösung von Trichloressigsäure gemischt.

Außerdem wird eine Blindprobe durch Mischen von 0,5 ml wäßriger 1,5-molarer Trichloressigsäurelösung mit 0,5 ml destilliertem Wasser hergestellt.

Zu 1 ml des eiweißfreien Analysenüberständeβ bzw. zu der Standard- und der Blindprobe wird jeweils 1 ml des Farbreagenzes nach Beispiel A. 2) gegeben. Anschließend wird gemischt und 15 Hinuten bei Zimmertemperatur stehengelassen. Hierauf wird die Extinktion jeder Probe mit einem Spektralphotometer In Üblicher Weise zwischen 500 und 550 nm, TO^BUgsweiee bei 520 nm, 546 nm oder 509 nm, gerne ββen. Der Kreatiningehalt ergibt sich nach der folden formel:

Ε.

Kreatiningehalt im Serum = W= . 6 mg/100 ml

³⁵S

E_A * Extinktion der Serumprobe gegen die Blindprobe j Eg * Extinktion der Standardprobe gegen die Blindprobe

3) Analog Beispiel B. 2) wird eine Mikrobe Stimmung von Kreatinin im Serum durchgeführt. Hierzu werden 0,2 ml Serum mit 0,5 ml 1,5-molarer TrichloresBigsäurelösung enteiweißt. ■

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⁰^lNAL INSPBOTED

Eine Standard- bzw. Blindprobe stellt man in diesem Beispiel durch Mischen von jeweils 0/1 ml 1,5-molarer Trichloressigsäure mit O₁1 ml Standardlösung (4 mg Kreatinin in 100 ml 0,5n HCl) bzw* mit 0/1 ml Wasser her. ■--

Für die eigentliche KreatininbeStimmung werden Q,2 ml des eiweißfreien AnalysenÜberstandes bzw* die Standard-, und die Blindprobe jeweils mit 0,2 ml Farbreagenz nach Beispiel A. 2) gemischt. Die Kreatininkonsentration er-• gibt sich in diesem Beispiel nach der Formel:

Kreatiningehalt im Serum - ηΑ · 7 mg/100 ml.

4) 1 ml einer Serumprobe wird durch Zusatz von 1 ml 1,5-molarer wäßriger Trichloressigsäure analog Beispiel B. Z) enteiweißt. Eine Standard- bzw. Blindprobe wird ebenfalls analog Beispiel Z) hergestellt, wobei man jedoch in diesem Fall eine Standardlösung verwendet, die aus 4 mg Kreatinin in 100 ml verdünnter Salzsäure besteht, .

Zur Bestimmung des Kreatinins werden 2 ml des Farbreagenzes nach Beispiel A. 3) zu 1 ml des eiweißfreien AnalysenÜberstandes bzw.. zu der Standard- und Blindprobe gegeben* . Die weitere Durchführung der Messung erfolgt analog Beispiel B. Z), wobei die Kreatininkonzentration nach folgender Formel berechnet wird;

Kreatiningehalt =s, |p . 4 mg/100 ml Serum.

5) 1 ml Serum wird durch Zusatz von 2 ml 3-molarer wäßriger Trichloressigsäurelösung enteiweißt. Zur Bestimmung des Kreatinins wird 1 ml des eiweißfreien Überstandes bzw. der Blindprobe und der Standardprobe mit jeweils 1 ml Farbreagenz nach Beispiel A. 4) gemischt. Die weitere Messung erfolgt wie in Beispiel B. 4) beschrieben. * -

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* . / · 0BS6INAL INSPECTED

Claims (11)

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Patentansprüohe

«' Lithiumpikrat und Lithiumhydroxid enthaltendes Farbreagenz zur KreatininbeStimmung, insbesondere in Körperflüssigkeiten, durch Messung der Liehtabsorption des gebildeten Kreatininpikrats nach DBP" ... (deutsche Patentanmeldung P 16 48 977.3 (früher M 74 850 IXb / 42 I)), dadurch gekennzeichnet, daß das Lithiumhydroxid in einer Konzentration, die nach Mischen des Farbreagenzes mit der kreatininhaltigen Probe einen pH von 11 - 13 ergibt, enthalten ist. _/

2. Farbreagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mischung von wäßriger gegebenenfalls Lithiumhydroxid enthaltender Pikrinsäurelösung und wäßriger Lithiumhydroxidlösung verwendet wird.

3. Farbreagenz nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mischung von bei Zimmertemperatur gesättigter wäßriger Pikrinsäurelösung und von wäßriger Lithiumhydroxidlösung verwendet wird.

4. Farbreagenz nach Anspruch 1 und 2, dadurch'gekennzeichnet, daß das Pikrat bzw. die Pikrinsäure in 0,005 - 0,025-molarer, insbesondere 0,019-molarer, Konzentration enthalten ist.

5* Farbreagenz nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, ' daß die Pikrinsäure in 0,019-molarer und das Lithiumhydroxid in 1,45-molarer Konzentration enthalten sind*.

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ORIGINAL INSPECTED

6. Farbreagenz nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeich-, net, daß die für eine einzelne KreatininbeStimmung er- . forderlichen Mengen Pikrinsäure und !lithiumhydroxid verwendet werden.

7· Verfahren zur KreatininbeStimmung, insbesondere in Körperflüssigkeiten, mit einem Lithiumpikrat und !lithiumhydroxid enthaltenden Farbreagenz durch Messung der Lichtabsorption des gebildeten Kreatininpikrats nach DBP ... (deutsche Patentanmeldung P 16 48 977.5 (früher ' M 74 850 IXb/42 I)), dadurch gekennzeichnet, daß als Alkalipikrat Lithiumpikrat und als Alkalihydroxid Lithiumhydroxid entsprechend den Ansprüchen 1 bis 6 verwendet wird. ·

8. Verfahren nach Anspruch'7, dadurch gekennzeichnet, daß der Kreatiningehalt von, vorzugsweise mit Trichloressigsäure, enteiweißten Körperflüssigkeiten gemessen wird.

9. Verfahren nach Anspruch 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Kreatiningehalt einer Probe einer Körperflüssigkeit, insbesondereVon Serum, die zur Enteiweißung mit Trichloressigsäure in solcher Konzentration gemischt ist, daß die Mischung 0,6 bis 2,0 molar an Trichloressigsäure ist, gemessen wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß zur Messung des Kreatiningehalts eine Probe enteiweißter Körperflüssigkeit, die 1- bis 1,2-molar an Trichloressig-• säure ist, mit demselben Volumen des Farbreagenzes nach Anspruch 5 gemischt und anschließend die Lichtabsorption des gebildeten Lithiumpikrats gemessen wird. * *

11.Verwendung von Lithiumpikrat und Lithiumhydroxid zur Bestimmung von Kreatinin entsprechend Anspruch 1 bis 10.

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