DE3012441C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der spezifischen Aktivität von Dehydrogenasen in einer Probe, hergestellt durch einen ersten Verfahrensschritt, bei dem die zu messende Dehydrogenase in der Gewebeschuppe bzw. Gewebeflocke mit einem Substrat über einen vorgewählten Zeitraum umgesetzt und mit einem Tetrazoliumsalz eingefärbt wird, und einen zweiten Verfahrensschritt, bei dem das Protein in der Schuppe bzw. Flocke mit Naphtholgelb eingefärbt wird, wonach man die Probe einer Mikrophotometrie unterwirft und aus den Meßwerten die spezifische Aktivität bestimmt. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines herkömmlichen Mikrophotometers zur Durchführung dieses Verfahrens.

Hauptsächlich in der Biochemie ist bislang schon die Enzymaktivität von Geweben bestimmt worden. Bei der hierzu verwendeten Meßmethode wird das gesamte Gewebe verrührt und die zu bestimmende Komponente wird durch Zentrifugaltrennung oder dergleichen extrahiert. Danach wird die Enzymaktivität durch eine kolorimetrische Methode bestimmt. Bei solchen biochemischen Messungen wird jedoch das Gewebe verrührt und es ist daher unmöglich, die Lokalisierung des Enzyms in dem Gewebe zu ermitteln. Dazu kommt noch, daß es nicht möglich ist, die angestrebte Komponente vollständig abzutrennen, so daß solche Messungen eine schlechte Genauigkeit haben. Andererseits wird es auf dem Gebiet der Enzymgewebechemie angestrebt, vom jeweiligen Bereich des Gewebes in Erfahrung zu bringen, wieviel der interessierenden Verbindung dort enthalten ist. Auf diesem Gebiet ist schon ein Verfahren entwickelt worden, bei dem man das Enzym der Gewebezellen mit einem Enzymsubstrat unter vorgewählten Bedingungen reagieren läßt, das Substrat durch Einwirkung des Enzyms zersetzt, das Zersetzungsprodukt als reagierende Substanz am Teil der Wirkung abfängt und durch ein Reagenz sichtbar macht. Bei einer solchen Meßmethode erfolgt jedoch die Bewertung, ob die Enzymaktivität stark oder schwach ist, visuell und empirisch von der die Messung durchführenden Person.

Das Ergebnis dieser Messung ist daher sehr subjektiv, was zu dem Nachteil führt, daß eine exakte Bestimmung unmöglich ist. Meßmethoden in der Biochemie und in der Enzymgewebechemie haben hinsichtlich der Messung der Enzymaktivität im Gewebe ihre eigenen Vorteile und Nachteile. Bei diesen Methoden ist es schwierig, die Enzymaktivität zu bestimmen und zur gleichen Zeit in Erfahrung zu bringen, wie die Lokalisierung des Enzyms in dem Gewebe ist.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein vollständig neues Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die Lokalisierung der Dehydrogenasen im Gewebe und die genaue Bestimmung der spezifischen Aktivität von Dehydrogenasen gestattet.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst mit einem Verfahren der eingangs genannten Art, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen dritten Verfahrensschritt vorsieht, bei dem man die durch Enzymaktivität eingefärbte Schuppe mit Alkohol über einen vorgewählten Zeitraum nach dem genannten ersten Verfahrensschritt wäscht, und die Probe, die durch den ersten, zweiten und dritten Verfahrensschritt hergestellt worden ist, bei drei Wellenlängen in der Nachbarschaft von 450 nm, 570 nm und 700 nm mißt.

Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1 die Beziehung zwischen der Reaktionszeit und der zersetzten Menge des Substrats, wenn L-Lactat : NAD-Oxidoreduktase als photometrisch zu bestimmende Substanz verwendet wird;

Fig. 2 die Beziehung zwischen der Reaktionszeit und der zersetzten Menge des Substrats, wenn L-Malat : NAD-Oxidoreduktase als photometrisch zu bestimmende Substanz verwendet wird;

Fig. 3 eine Vorrichtung zur spektrophotometrischen Messung einer Probe;

Fig. 4 eine Absorptionsspektralkurve (a) einer Probe, erhalten durch das herkömmliche Verfahren, die Absorptionsspektralkurve (b), wenn das Protein mit Naphtholgelb eingefärbt worden ist, und die Absorptionsspektralkurve (c) einer Probe, erhalten durch Zugabe eines Substrats zu den gleichen Dehydrogenasen wie das zu messende Enzym und Färbung mit einem Tetrazoliumsalz;

Fig. 5 die Absorptionsspektralkurve (a) einer mit Alkohol gewaschenen Probe, die Absorptionsspektralkurve (b), wenn das Protein mit Naphtholgelb gefärbt worden ist, und die Absorptionsspektralkurve (c) einer Probe, erhalten durch Zugabe eines Substrats für die gleichen Dehydrogenasen wie das zu messende Enzym und Färbung mit Tetrazoliumsalz und anschließendes Waschen;

Fig. 6 die Beziehung zwischen dem Lichtabsorptionsgrad A₂₈₀ des Dünnschichtmodells bei der Absorptionswellenlänge 280 nm, die üblicherweise als Parameter für die Dichte des ungefärbten Proteins verwendet wird, und dem Lichtabsorptionsgrad A₄₅₀ bei der Absorptionswellenlänge 450 nm, wenn das Protein mit Naphtholgelb gefärbt worden ist;

Fig. 7 eine Ausführungsform einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens;

Fig. 8A, 8B und 8C den Anfangseinstellvorgang in der Vorrichtung gemäß Fig. 7;

Fig. 9 eine weitere Ausführungsform einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens;

Fig. 10 die Abgabewellenform eines Kontrollkreises 202;

Fig. 11A ein spezifisches Beispiel des Dispergierungs- bzw. Streuelements 201;

Fig. 11B ein spezifisches Beispiel der Filtervorrichtung 205;

Fig. 12 ein spezifisches Beispiel des Null-Haltestromkreises 210;

Fig. 13A und 13B Diagramme, die den Betrieb des Null-Haltestromkreises zeigen; und

Fig. 14A und 14B die Wirkungen der Dämpfungsglieder 213 A bis 213 C in der Vorrichtung gemäß Fig. 9.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Probe der Gewebeschuppe bzw. -flocke durch die folgenden Verfahrensschritte (a) bis (f) hergestellt:

• (a) Das zu untersuchende Gewebe wird eingefroren, wonach eine Schuppe bzw. Flocke daraus herausgeschnitten und auf ein Deckgläschen aufgeklebt wird.
• (b) Unter Verwendung von Tetrazoliumsalz als Wasserstoffempfänger wird die Schuppe mit einer Substratmischflüssigkeit umgesetzt, die gemäß den zu bestimmenden Dehydrogenasen ausgewählt worden ist. Dieser Verfahrensschritt wird üblicherweise als Enzymeinfärben bezeichnet.
• (c) Nachdem die Schuppe eine vorgewählte Zeit bei etwa 37°C umgesetzt worden ist, wird sie mit Formalin oder dergleichen fixiert, wodurch die Enzymreaktion abgebrochen wird. Diese vorbestimmte Zeit wird für jedes Enzym vorgewählt. Für L-Lactat : NAD-Oxidoreduktase wird sie als 15 min oder weniger und für L-Malat : NAD-Oxidoreduktase als 25 min oder weniger gewählt. Dies geschieht wegen der unten angegebenen Gründe. Die Beziehung zwischen der Reaktionszeit und der zersetzten Menge des Substrats, wenn L-Lactat : NAD-Oxidoreduktase als zu photometrierendes Objekt ausgewählt wird, ist in Fig. 1 gezeigt. In Fig. 1 gibt die Abszisse die Reaktionszeit t nach dem Vermischen des Enzyms mit dem Substrat wieder. Die Ordinate gibt die Menge (A) des Substrats wieder, die durch L-Lactat : NAD-Oxidoreduktase zersetzt worden ist, um die Menge des Proteins auszugleichen, die sich von einem photometrierten Bereich zu einem anderen unterscheidet, und zwar als Verhältnis zu der Menge (B) des Proteins im gleichen photometrierten Bereich, um die zersetzte Menge des Substrats zu zeigen. Aus Fig. 1 wird ersichtlich, daß, wenn ein Substrat L-Lactat : NAD-Oxidoreduktase zugesetzt wird, das Zersetzungsprodukt durch das Enzym innerhalb von 15 min linear erheblich erhöht wird. Wenn daher die Reaktion von L-Lactat : NAD-Oxidoreduktase innerhalb 15 min nach der Zugabe des Substrats abgebrochen wird, kann die Enzymaktivität bestimmt werden. Die Fig. 2 ist ein ähnliches Diagramm wie Fig. 1, zeigt aber den Fall, daß L-Malat : NAD-Oxidoreduktase photometrisch bestimmt werden soll. Die Zersetzungsgeschwindigkeit des Substrats durch L-Malat : NAD-Oxidoreduktase ist etwa ein Viertel der Zersetzungsgeschwindigkeit des Substrats durch L-Lactat : NAD-Oxidoreduktase. Es wird jedoch festgestellt, daß innerhalb von 25 min das Zersetzungsprodukt durch das Enzym erheblich linear erhöht wird. Es wird daher ersichtlich, daß zur Bestimmung der Dehydrogenasenaktivität die Reaktion innerhalb von 25 min, nachdem das Substrat zugesetzt worden ist, abgebrochen werden kann. Auf diese Weise unterscheiden sich die einzelnen Dehydrogenasen im Verlauf der Reaktion nach der Zugabe des Substrats. Es ist jedoch möglich, eine feste Zeit zu bestimmen, die für jedes Enzym geeignet ist, indem zuvor die Charakteristik gemäß Fig. 1 oder 2 ermittelt wird.
• (d) Die Schuppe wird mit Alkohol gewaschen. Die Zeit, während der die Schuppe mit Alkohol gewaschen wird, beträgt etwa 10 min im Falle von Bernsteinsäuredehydrogenase und etwa 3 min im Falle anderer Dehydrogenasen, wie von L-Lactat : NAD-Oxidoreduktase und von L-Malat : NAD-Oxidoreduktase. Beim Waschen kann geeigneterweise ein einwertiger Alkohol, wie Äthanol, verwendet werden, da er leicht verfügbar und zu handhaben ist.
• (e) Die Schuppe wird mit Wasser gewaschen, wonach das Protein in der Schuppe mit Naphtholgelb eingefärbt wird. Dieser Verfahrensschritt wird gewöhnlich als Proteineinfärbung bezeichnet.
• (f) Die Flocke wird gewaschen und danach in flüssiges Paraffin eingehüllt.

Die so hergestellte Probe kann durch eine bekannte Mikrophotometervorrichtung, wie sie in Fig. 3 dargestellt ist, photometrisch gemessen werden. In Fig. 3 kann ein Monochrometer 1 ein Lichtbündel beliebiger Wellenlänge emittieren. Das Lichtbündel von dem Monochrometer 1, das von einem Spiegel 2 reflektiert worden ist, wird auf der Probe 5 auf einem Gestell 4 durch eine Kondensatorlinse 3 kondensiert. Das Lichtbündel, das durch die Probe 5 hindurchgegangen ist, wird durch eine Objektivlinse 6 geleitet. Danach wird es in Richtung auf ein optisches Gesichtsfeldsystem und ein optisches Belichtungsmeßsystem durch einen Überblendungsspiegel 7 ausgewählt. Wenn der Überblendungsspiegel 7 in der ersten Position gemäß der gestrichelten Linie ist, dann wird das durch die Objektivlinse 6 hindurchgegangene Lichtbündel durch ein Prisma 8 zu einem Okular 9 geleitet, so daß die Meßperson die Probe durch das Okular 9 beobachten kann. Wenn der Überblendungsspiegel 7 sich in der zweiten Position befindet, die durch die feste Linie angezeigt ist, dann wird das durch die Objektivlinse 6 hindurchgegangene Lichtbündel durch den Überblendungsspiegel 7 reflektiert und danach auf einem Bildebenediaphragma 11 durch eine Kondensatorlinse 10 kondensiert. Ein photoelektrischer Umwandler 12 wandelt photoelektrisch das Lichtbündel um, das durch das Bildebenediaphragma 11 hindurchgegangen ist. Das photoelektrisch umgewandelte Signal wird in den Lichtabsorptionsgrad oder dergleichen durch einen fakultativen Kreis 13 umgewandelt. Bei einer solchen Konstruktion kann der Überblendungsspiegel 7 in der ersten Position mikroskopisch beobachtet werden und die Position der Probe 5, die abgelesen werden soll, kann bestimmt werden. Danach kann der Überblendungsspiegel 7 in die zweite Position verändert werden, wodurch eine Mikrospektrophotometrie bewirkt wird.

Nachstehend soll die Bedeutung des Verfahrensschrittes (d), der ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, beschrieben, indem die Absorptionsspektralkurve verglichen wird, die durch Spektrophotometrie einer Probe erhalten worden ist, welche gemäß dem Verfahrensschritt (d) hergestellt worden ist. Bei den obengenannten Verfahrensschritten zur Herstellung der Probe wird, wenn eine Probe hergestellt ohne die Durchführung des Verfahrensschrittes (d), spektrophotometriert wird, z. B. die Absorptionsspektralkurve gemäß Kurve (a) der Fig. 4 erhalten. In der Absorptionsspektralkurve der Fig. 4 bedeutet die Abszisse die Wellenlänge λ und die Ordinate bedeutet den Lichtabsorptionsgrad A. Jedoch können die Ablesungswerte der Fig. 4 dadurch erhalten werden, daß man die Reaktion nach einer vorgewählten Zeitspanne nach Beginn der Enzymreaktion abbricht, wie es bei dem obengenannten Verfahrensschritt (b) genannt wurde, wobei die vorgewählte Zeitspanne, die bei den einzelnen Dehydrogenasen variiert, gemessen wird. Die Kurve (b) der Fig. 4 ist die Absorptionsspektralkurve, wenn das Protein mit Naphtholgelb gefärbt worden ist. Die Kurve (c) der Fig. 4 ist die Absorptionsspektralkurve, wenn ein Substrat zu der gleichen Dehydrogenase wie das Enzym in der Flocke, die gemessen werden soll, gegeben wird und das Gemisch mit Tetrazoliumsalz eingefärbt wird. Wie aus der Kurve (b) der Fig. 4 ersichtlich wird, hat die Absorptionsspektralkurve, wenn das Protein mit Naphtholgelb gefärbt worden ist, die Neigung, daß eine maximale Absorption in der Nachbarschaft der Wellenlänge 390 nm und 430 nm vorliegt, und die Absorption wird in der Nachbarschaft der Wellenlänge 560 nm oder mehr praktisch null. Wie weiterhin aus der Kurve (c) ersichtlich wird, hat die Absorptionsspektralkurve, wenn ein Substrat zu Dehydrogenasen gegeben wird und das Gemisch mit Tetrazoliumsalz gefärbt wird, die Neigung, daß ein Teil vorliegt, bei dem die Absorption in der Nachbarschaft der Wellenlänge 450 nm klein ist, und daß eine minimale Absorption in der Nachbarschaft der Wellenlänge 700 nm vorliegt. Weiterhin ist eine maximale Absorption in der Nachbarschaft der Wellenlänge 580 nm vorhanden. Die Neigung der Kurve (c) wird üblicherweise für alle Dehydrogenasen erhalten. Die Addition der Kurven (b) und (c) ergibt die Kurve (a).

Wenn andererseits eine Probe, die bei der Herstellung dem Verfahrensschritt (d) unterworfen worden ist, spektrophotometriert wird, dann wird eine Absorptionsspektralkurve gemäß Kurve (a) der Fig. 5 erhalten. Die Kurve (b) der Fig. 5 hat die Absorptionsspektralkurve, wenn das Protein mit Naphtholgelb gefärbt worden ist. Sie ist vollständig gleich zu der Kurve (b) der Fig. 4. Die Kurve (c) der Fig. 5 ist die Absorptionsspektralkurve, wenn ein Substrat zu der gleichen Dehydrogenase wie das Enzym in der zu messenden Flocke gegeben wird und das Gemisch mit Tetrazoliumsalz gefärbt wird, wonach es mit Alkohol über einen gleichen Zeitraum gewaschen wird wie die Waschzeit des Verfahrensschrittes (d), dem die Schuppe unterworfen worden ist. Aus dem Vergleich zwischen der Kurve (c) der Fig. 4 und der Kurve (c) der Fig. 5 wird ersichtlich, daß, wenn ein Substrat zu den Dehydrogenasen gegeben wird und das Gemisch gefärbt und danach mit Alkohol gewaschen wird, der Gehalt des Teils verringert wird, bei dem die Absorption in Nachbarschaft der Wellenlänge 450 nm der Absorptionsspektralkurve klein ist. Wenn daher die Schuppe mit Alkohol über die vorgewählte Zeitspanne, die für jedes Enzym, wie vorstehend bei dem Verfahrensschritt (d) erwähnt, untersucht worden ist, gewaschen wird, dann ist es möglich, den Lichtabsorptionsgrad der minimalen Absorption in der Nachbarschaft der Wellenlänge 700 nm an den Lichtabsorptionsgrad in der Nachbarschaft der Wellenlänge 450 nm anzugleichen. In der Fig. 5 ist der Lichtabsorptionsgrad bei der Wellenlänge 450 nm der Kurve (a) gleich der Summe des Lichtabsorptionsgrades der Kurve (b) bei der Wellenlänge 450 nm und des Lichtabsorptionsgrades der Kurve (c) bei der Wellenlänge 450 nm. Weiterhin ist der Lichtabsorptionsgrad der Kurve (c) bei der Wellenlänge 450 nm gleich dem Lichtabsorptionsgrad der Kurve (a) bei der Wellenlänge 700 nm. Wenn daher der Lichtabsorptionsgrad der Kurve (a) bei der Wellenlänge 700 nm von dem Lichtabsorptionsgrad der Kurve (a) bei der Wellenlänge 450 nm abgezogen wird, dann wird der Lichtabsorptionsgrad der Kurve (b) bei der Wellenlänge 450 nm erhalten. Dies kann als der Lichtabsorptionsgrad angesehen werden, der nur von dem Protein abhängt, das in dem Bereich der Probe, die abgelesen werden soll, enthalten ist. Da weiterhin die Absorption des Proteins bei der Wellenlänge 570 nm null ist, kann der Lichtabsorptionsgrad der Kurve (a) bei der Wellenlänge 570 nm als Lichtabsorptionsgrad angesehen werden, der den Standard der Enzymmenge ergibt, welche im Bereich der Probe enthalten ist, die abgelesen wird. Wenn daher die Probe, die durch die vorgenannten Verfahrensschritte (a) bis (f) hergestellt worden ist, bei den Wellenlängen 450 nm, 570 nm und 700 nm abgelesen wird und wenn die folgende Gleichung:

zwischen den Lichtabsorptionsgraden I₄₅₀, I₅₇₀ und I₇₀₀, die bei den jeweiligen Wellenlängen erhalten worden sind, angewendet wird, dann kann die enzymspezifische Aktivität erhalten werden, die die Enzymmenge pro Mengeneinheit des Proteins in dem abgelesenen Bereich darstellt. Die enzymspezifische Aktivität ist ein Wert, der nichts mit der Dicke der Probe in dem abgelesenen Bereich zu tun hat. Sie kann daher als Standard der Enzymmenge angesehen werden.

Die Enzymmenge in dem abgelesenen Bereich der Probe kann ermittelt werden, indem man nach der Menge des Proteins von dem Lichtabsorptionsgrad bei der Wellenlänge 450 nm sucht, wenn das Protein mit Naphtholgelb gefärbt wird, und diese Proteinmenge mit der obengenannten enzymspezifischen Aktivität multipliziert. Die Fig. 6 zeigt die Beziehung zwischen dem Lichtabsorptionsgrad A₂₈₀ eines Dünnschichtmodells an der Absorptionswellenlänge 280 nm, die üblicherweise als Parameter für die Dichte des ungefärbten Proteins verwendet wird, und dem Lichtabsorptionsgrad A₄₅₀ an der Absorptionswellenlänge 450 nm, wenn das Protein mit Naphtholgelb eingefärbt wird. Aus dieser Figur wird ersichtlich, daß eine lineare Beziehung zwischen den zwei Größen ausgebildet worden ist. Wenn man daher nach dem Lichtabsorptionsgrad bei einer entsprechenden Wellenlänge 280 nm von dem Lichtabsorptionsgrad bei der Wellenlänge 450 nm sucht, dann kann die Proteinmenge in dem abgelesenen Bereich aus dem Wert des Lichtabsorptionsgrades ermittelt werden. Demgemäß kann die Enzymmenge durch den oben beschriebenen Vorgang ermittelt werden.

In den Fig. 7, 8, 9 und 10 wird eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben.

In der Vorrichtung gemäß Fig. 7 geht ein Lichtbündel von einer Quelle für weißes Licht 100 durch eine Probe 101, die nach den obengenannten Verfahrensschritten (a) bis (f) hergestellt worden ist, und es wird durch einen Halbspiegel 102 A aufgetrennt. Das durch den Halbspiegel 102 A hindurchgegangene Licht geht durch ein Filter 103 A, das nur ein Lichtbündel in der Nachbarschaft der Wellenlänge 450 nm hindurchläßt, und einen Filter mit variierbarer Dichte (nachstehend als ND-Filter abgekürzt) 104 A zu einem Photomultiplikator 105 A, durch den das Licht photoelektrisch umgewandelt wird. Der Photomultiplikator 105 A hat eine Empfindlichkeit, die durch Veränderung eines Widerstandes 106 A einstellbar ist. Das durch den Halbspiegel 102 A reflektierte Licht wird durch einen Halbspiegel 102 B aufgeteilt. Das durch den Halbspiegel 102 B reflektierte Licht geht durch einen Filter 103 B, der nur ein Lichtbündel in der Nachbarschaft der Wellenlänge 700 nm hindurchläßt, und einen ND-Filter 104 B zu einem Photomultiplikator 105 B, in dem das Licht photoelektrisch umgewandelt wird. Der Photomultiplikator 105 B hat wie der Photomultiplikator 105 A eine Empfindlichkeit, die durch Veränderung eines Widerstandes 106 B einstellbar ist. Das durch den Halbspiegel 102 B hindurchgegangene Licht wird durch einen Spiegel 102 C reflektiert und geht durch einen Filter 103 C, der nur ein Lichtbündel in der Nachbarschaft der Wellenlänge 570 nm hindurchläßt, und einen ND-Filter 104 C zu einem Photomultiplikator 105 C, durch den das Licht photoelektrisch umgewandelt wird. Auch bei dem Photomultiplikator 105 C ist die Empfindlichkeit durch Veränderung eines Widerstandes 106 C einstellbar. Bei der Vorrichtung der Fig. 7 sind die Linsensysteme zwischen der Lichtquelle 100 und den Photomultiplikatoren 105 A, 105 B, 105 C nicht gezeigt, doch liegen diese Linsensysteme für den Fachmann auf der Hand (vgl. Fig. 3). Die photoelektrischen Umwandlungssignale der Photomultiplikatoren 105 A, 105 B und 105 C werden jeweils durch Verstärkungskreise 107 A, 107 B und 107 C verstärkt, wonach sie durch logarithmische Umwandlungskreise 108 A, 108 B und 108 C logarithmisch umgewandelt werden. Ein Null-Regulierungskreis 109 ist zwischen dem Verstärkungskreis 107 C und dem logarithmischen Umwandlungskreis 108 C angeschlossen, um den Dunkelstrom des Photomultiplikators 105 C zu entfernen.

Ein Subtraktionskreis 110 zieht die Abgabe des logarithmischen Umwandlungskreises 108 B von der Abgabe des logarithmischen Umwandlungskreises 108 A ab. Ein Divisionskreis 111 dividiert die Abgabe des logarithmischen Umwandlungskreises 108 C durch die Abgabe des Subtraktionskreises 110. Ein Darstellungskreis 112 bewirkt die Darstellung entsprechend der Abgabe des Divisionskreises 111.

Nachstehend sollen die Vorgänge der Vorrichtung gemäß Fig. 7 nacheinander beginnend von der Stufe der Einstellung beschrieben werden.

Zuerst wird der Fall in Betracht gezogen, daß die Probe 101 aus dem Lichtweg entfernt wird und daß die Durchlässigkeiten der ND-Filter 104 A, 104 B und 104 C gleich sind, und die Empfindlichkeiten der Photomultiplikatoren 105 A, 105 B und 105 C werden auf praktisch gleiche Werte eingestellt. Aufgrund der Charakteristik der Lichtquelle 100 und den Spektralempfindlichkeitscharakteristiken der Photomultiplikatoren unterscheiden sich die Abgaben der Photomultiplikatoren bei jeder Wellenlänge, wie es in Fig. 9A gezeigt ist. Es werden die Werte der Durchlässigkeit, des Lichtabsorptionsgrades etc. in Abwesenheit der Probe als Standard ermittelt. Wenn die Werte der Signale für die jeweiligen Wellenlängen in Abwesenheit der Probe sich unterscheiden, dann unterscheidet sich der Wert für S/N und die Schaltkreiskonstruktion wird kompliziert. Daher werden bei der Konstruktion gemäß einer Ausführungsform der Erfindung die ND-Filter 104 A, 104 B und 104 C in den Lichtweg eingesetzt und die photoelektrischen Abgaben der Photomultiplikatoren 105 A, 105 B und 105 C werden auf das niedrigste Abgabenniveau voreingestellt, wie es in der Fig. 8B gezeigt ist (im Falle des gezeigten Beispiels auf ein Niveau von 700 nm). Im Falle des gezeigten Beispiels ist das ND-Filter 104 B nicht notwendig. Danach werden die Empfindlichkeiten der Photomultiplikatoren 105 A, 105 B und 105 C variiert, indem die Werte der Widerstände 106 A, 106 B und 106 C verändert werden, und die Einstellung wird in der Weise vorgenommen, daß die jeweiligen photoelektrischen Abgaben die Standardniveaus gemäß Fig. 8C einnehmen. Die logarithmischen Umwandlungskreise 108 A, 108 B und 108 C werden so eingestellt, daß das gemäß Fig. 8C eingestellte Niveau in einen Null-Lichtabsorptionsgrad umgewandelt wird, und die anderen Niveaus werden zu den entsprechenden Lichtabsorptionsgraden umgewandelt. Andererseits wird die Abgabe des Verstärkungskreises 107 C durch den Null-Regulierungskreis 109 vorgelöscht, so daß, wenn auf dem Photomultiplikator 105 C kein Licht auftritt, die Abgabe des logarithmischen Umwandlungskreises 108 C null wird. Dies ist eine bekannte Technik.

Nach Beendigung der oben beschriebenen Vorbereitung der Messung wird die Probe in den Lichtweg eingesetzt. Das Lichtbündel von der Lichtquelle 100 wird auf einem geeigneten Bereich der Probe 101 durch das bekannte mikrospektrophotometrische optische System gemäß Fig. 3 kondensiert. Von dem Licht, das durch diesen Bereich hindurchgegangen ist, werden Lichtbündel mit den Wellenlängen 450 nm, 570 nm und 700 nm photoelektrisch durch Photomultiplikatoren 105 A, 105 C und 105 B umgewandelt. Die photoelektrischen Signale werden durch die Verstärkungskreise verstärkt und sodann an den logarithmischen Umwandlungskreis 108 A, 108 B und 108 C angelegt. Die logarithmischen Umwandlungskreise 108 A, 108 B und 108 C stoßen Signale I′₄₅₀, I′₇₀₀ und I′₅₇₀ aus, die logarithmische Umwandlungen der Eingabesignale sind. Der Grund, warum die Abgaben der logarithmischen Umwandlungskreise 108 A und 108 B I′₄₅₀ und I′₇₀₀ sind, besteht darin, daß zwei Abgaben einen gemeinsamen Fehler α enthalten, der von dem Dunkelstrom oder dergleichen herrührt (es wird jedoch darauf hingewiesen, daß die Charakteristiken der Photomultiplikatoren etc. gleich sind). Wenn demgemäß die Werte, die den Lichtabsorptionsgraden entsprechen, als I₄₅₀ und I₇₀₀ bestimmt werden, dann gilt I₄₅₀=I′₄₅₀-α und I₇₀₀=I′₇₀₀-α. Die Abgabe des Subtraktionskreises 110 wird I₄₅₀-I₇₀₀ und der Fehler α wird hierdurch gelöscht. Der Divisionskreis 111 bewirkt den Vorgang

der durch die Gleichung (1) gezeigt wird, und somit wird die enzymspezifische Aktivität auf dem Darstellungskreis 112 angezeigt.

Der Halbspiegel 102 A, der in der beschriebenen Ausführungsform verwendet wird, kann durch einen dichroidischen Spiegel ersetzt werden, der nur ein Lichtbündel in der Nachbarschaft der Wellenlänge 450 nm hindurchläßt. Die Halbspiegel 102 B und 102 C können durch dichroidische Spiegel ersetzt werden, die nur Lichtbündel in der Nachbarschaft der Wellenlängen 700 nm und 570 nm hindurchlassen. In diesem Falle kann die Wirksamkeit der Signale im Vergleich zum Falle, daß die Halbspiegel verwendet werden, erhöht werden.

Bei der vorstehend beschriebenen Ausführungsform werden Werte von drei verschiedenen Wellenlängen zu einem Zeitpunkt erhalten, jedoch kann die Ausführungsform so modifiziert werden, daß Werte von drei Wellenlängen zeitsequentiell erhalten werden. Eine derartige Modifikation ist in Fig. 9 dargestellt.

Von den Lichtbündeln von einer Quelle für weißes Licht 200 wird ein Lichtbündel mit vorgewählter Wellenlänge durch ein Dispergierungs- bzw. Streuelement 201 ausgewählt. Ein Kontrollkreis 202 kontrolliert eine Antriebsvorrichtung 203 derart, daß beim Schluß eines nicht-gezeigten Startschalters das Dispergierungs- bzw. Streuelement 201 die Wellenlängen in der Nachbarschaft von 450 nm, 570 nm und 700 nm nacheinander auswählt. Das Dispergierungs- bzw. Streuelement 201 und die Antriebsvorrichtung 203 können einen Mechanismus mit einem Gitter und einer Zeichenstange oder dergleichen oder einen Mechanismus zur selektiven Einsetzung von drei Wellenlängenauswahlfiltern in dem Lichtweg sein. Die vorliegende Ausführungsform wird anhand der letzteren Möglichkeit, die einfacher ist, beschrieben. Das Lichtbündel mit einer einzigen Wellenlänge, das von dem Dispergierungs- bzw. Streuelement 201 austritt, geht durch die Probe 204 und sodann durch eine Filtervorrichtung 205 zu einem Photomultiplikator 207. Die Filtervorrichtung 205 hat drei ND-Filter, die den Wellenlängen 450 nm, 570 nm und 700 nm entsprechen. Die Antriebsvorrichtung 206 arbeitet so, daß das ND-Filter, das der Wellenlänge entspricht, die durch das Dispergierungs- bzw. Streuelement 201 ausgewählt worden ist, in den Lichtweg in Beantwortung des Kontrollsignals von dem Kontrollkreis 202 eingesetzt wird. Die Funktion dieses ND-Filters ist mit derjenigen des in Fig. 7 gezeigten ND-Filters identisch. Das Lichtbündel, das durch die Filtervorrichtung geleitet worden ist, wird photoelektrisch durch einen Photomultiplikator 207 umgewandelt. Der Photomultiplikator 207 ist ähnlich demjenigen, der in Fig. 7 dargestellt ist. Seine Empfindlichkeit wird durch Einstellung eines Widerstandes 208 eingestellt. Das photoelektrische Umwandlungssignal wird durch einen Verstärkungskreis 209 verstärkt und danach einer Dunkelstromkorrektion durch einen Null-Haltestromkreis 210 unterworfen. Einzelheiten des Null-Haltestromkreises 210 werden näher anhand der Fig. 12, 13A, 13B und 13C beschrieben. Eine Synchronisierungsvorrichtung 211 mit einem Verschiebungsregister oder dergleichen gibt ein Synchronisierungssignal ab, um die Probehaltekreise 212 A, 212 B und 212 C in Aufeinanderfolge entsprechend dem Signal von dem Kontrollkreis 202 in Betrieb zu nehmen. Die Abgaben der Probehaltekreise 212 A, 212 B und 212 C werden auf Dämpfungsglieder 213 A, 213 B und 213 C angelegt. Die Funktionen der Dämpfungsglieder 213 A, 213 B und 213 C werden später beschrieben. Ein Divisionskreis 214 dividiert die Abgabe des Dämpfungsgliedes 213 A durch die Abgabe des Dämpfungsgliedes 213 B. Die Abgabe des Divisionskreises 214 und die Abgabe des Dämpfungsgliedes 213 C werden durch logarithmische Umwandlungskreise 215 und 216 logarithmisch umgewandelt. Ein Divisionskreis 217 dividiert die Abgabe des logarithmischen Umwandlungskreises 216 durch die Abgabe des logarithmischen Umwandlungskreises 215. Das heißt, die Abgaben der Dämpfungsglieder 213 A, 213 B und 213 C sind Signale T₄₅₀, T₇₀₀ und T₅₇₀, die den Durchlässigkeiten bei entsprechenden Wellenlängen entsprechen. Daher wird die Abgabe des Divisionskreises 214 und die Abgaben der logarithmischen Umwandlungskreise 215 und 216 werden ln und ln T₅₇₀. Demgemäß wird die Abgabe des Divisionskreises 217:

nämlich Gleichung (1). Es ist daher möglich, die enzymspezifische Aktivität durch einen Darstellungskreis 218 darzustellen, an den die Abgabe des Divisionskreises 217 angelegt wird.

Nachstehend soll der Betrieb der verschiedenen Teile gemäß Fig. 9 beschrieben werden. Wenn ein nicht-gezeigter Startschalter geschlossen wird, dann gibt der Kontrollkreis 202 einen Antriebs-Impuls einer vorgewählten Zeitspanne gemäß Fig. 10A ab. Die Antriebsvorrichtungen 203 und 206 enthalten jeweils beispielsweise einen Fortschaltmotor und an die Drehwellen dieser Motoren sind die Drehwellen O von Scheiben mit Wellenlängenauswahlfiltern F₄₅₀, F₅₇₀, F₇₀₀ und ND-Filtern Nd₄₅₀, Nd₅₇₀, Nd₇₀₀ befestigt, wie es in den Fig. 11A und 11B gezeigt wird. Demgemäß sind die obengenannten Fortschaltmotoren so gestaltet, daß sie jedesmal, wenn ein Impuls angelegt wird, um 120° rotieren. Daher können sie entsprechend mit den Wellenlängenauswahlfiltern und den ND-Filtern durch die Anfangseinstellung, wie bereits beschrieben, angetrieben werden.

An den Null-Haltestromkreis 210, von dem Einzelheiten in Fig. 12 dargestellt sind, wird ein Signal gemäß Fig. 13A von einem Verstärker 209 angelegt. Das Niveau V- ist eine Spannung, die eine Gleichstromfehlerkomponente, beispielsweise einen Dunkelstrom, enthält. Der Antriebs-Impuls von dem Kontrollkreis 202 (Fig. 10) wird von einem Kontrolleingabeterminal a angelegt. Angeschlossen an das Gitter G eines elektronischen Schalters SW, der ein FET enthält, ist eine negative Energiequelle -E durch das andere Ende eines Kondensators C₁, dessen eines Ende an ein Eingabeterminal a, eine umgekehrt angeschlossene Diode d und einen Widerstand R angeschlossen ist. Auch ist das andere Ende eines Kondensators C₂, von dem ein Ende an den Verstärker 209 angeschlossen ist, mit dem Ablauf D des Schalters SW und dem Abgabeterminal b des Null-Haltestromkreises 210 verbunden. Die Quelle S des Schalters SW ist geerdet. Wenn daher der Antriebs-Impuls (Fig. 10) von dem Kontrollkreis 202 angelegt wird, dann wird der Schalter SW an dem Moment (t₁) des Ansteigens geschlossen, wodurch die Spannung des Abgabeterminals b null wird. Wenn sodann ein Signal von dem Verstärker 209 zum Zeitpunkt t₂ angelegt wird, dann wird ein Signal mit dem Niveau A gemäß Fig. 13B am Abgabeterminal b anstelle des Niveaus des angelegten Signals (-V+A) vorgesehen. Indem man die Abgabe des Verstärkers 209 zu dem Null-Haltestromkreis 210 leitet, kann die Fehlerkomponente, die von dem Dunkelstrom des Photomultiplikators 207 herrührt, entfernt werden.

Die Funktionen der Dämpfungsglieder 213 A, 213 B und 213 C sind wie folgt. Bei der Ausführungsform gemäß Fig. 7 sind drei Detektoren vorgesehen worden, nämlich Photomultiplikatoren 105 A, 105 B und 105 C, die den drei Wellenlängen entsprechen. So ist es möglich gewesen, Feineinstellungen der Empfindlichkeit zu bewirken. Bei der Ausführungsform der Fig. 9 wird jedoch nur ein Photomultiplikator verwendet. Selbst wenn die Einstellung der Empfindlichkeit des Photomultiplikators 207 bewirkt wird, nachdem die Menge des Lichts, das auf den Photomultiplikator 207 auftrifft, durch die ND-Filter Nd₄₅₀, Nd₅₇₀ und Nd₇₀₀ eingestellt worden ist (vgl. Fig. 11B), wenn die Probe 204 nicht in dem Lichtweg vorhanden ist, sind die Abgaben bei den drei Wellenlängen nicht immer miteinander in Übereinstimmung, wie in Fig. 14A gezeigt wird. Die Dämpfungsglieder 213 A, 213 B und 213 C sind vorgesehen, um solche Störungen zu korrigieren. Durch ihre Einstellung werden die Abgaben hinsichtlich des Niveaus regulär, wie es in der Fig. 14B gezeigt wird.

Wie oben beschrieben, ist es durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Messung der spezifischen Aktivität der Dehydrogenasen und durch die erfindungsgemäße Verwendung eines herkömmlichen Mikrophotometers zur Durchführung dieses Verfahrens möglich, die Lokalisierung von Dehydrogenasen in Gewebeschuppen sowie die spezifische Aktivität der Dehydrogenasen zu ermittelt, und es ist daher möglich, die Bestimmungen von Dehydrogenasen vorzunehmen.

Claims (5)

1. Verfahren zur Messung der spezifischen Aktivität von Dehydrogenasen in einer Probe, hergestellt durch einen ersten Verfahrensschritt, bei dem die zu messende Dehydrogenase in der Gewebeschuppe bzw. Gewebeflocke mit einem Substrat über einen vorgewählten Zeitraum umgesetzt und mit einem Tetrazoliumsalz eingefärbt wird, und einen zweiten Verfahrensschritt, bei dem das Protein in der Schuppe bzw. Flocke mit Naphtholgelb eingefärbt wird, wonach man die Probe einer Mikrophotometrie unterwirft und aus den Meßwerten die spezifische Aktivität bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß man einen dritten Verfahrensschritt vorsieht, bei dem man die durch Enzym-Aktivität eingefärbte Schuppe mit Alkohol über einen vorgewählten Zeitraum nach dem genannten ersten Verfahrensschritt wäscht, und die Probe, die durch den ersten, zweiten und dritten Verfahrensschritt hergestellt worden ist, bei drei Wellenlängen in der Nachbarschaft von 450 nm, 570 nm und 700 nm mißt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den dritten Verfahrensschritt zwischen dem ersten und dem zweiten Verfahrensschritt durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man beim dritten Verfahrensschritt als Alkohol einen einwertigen Alkohol verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als einwertigen Alkohol Ethanol verwendet.

5. Verwendung eines herkömmlichen Mikrophotometers zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch

• (a) eine Einrichtung, die zu einer Mikrophotometrie bei drei vorgewählten Wellenlängen in der Nachbarschaft von 450 nm, 570 nm und 700 nm imstande ist;
• (b) eine Prozeßeinrichtung mit mindestens einem ersten, einem zweiten und einem dritten Prozeßkreis, entsprechend den drei Wellenlängen;
• (c) eine Kontrolleinrichtung zur Verteilung der Ablesungsausgänge, entsprechend den drei Wellenlängen, an die drei Prozeßkreise; und
• (d) eine fakultative Betriebseinrichtung zur Durchführung der Operation zwischen den Abgabesignalen der drei Prozeßkreise, um die spezifische Aktivität von Dehydrogenasen zu erhalten, wobei I₄₅₀, I₅₇₀ und I₇₀₀ die jeweiligen Lichtabsorptionsgrade bei den drei Wellenlängen 450 nm, 570 nm und 700 nm sind.