DE2219552A1

DE2219552A1 - Photometrisches analysenverfahren

Info

Publication number: DE2219552A1
Application number: DE2219552A
Authority: DE
Inventors: Albert Dipl Chem Dr Schmitt; Toma Dipl Ing Tomoff; Hans Vogel
Original assignee: Bodenseewerk Perkin Elmer and Co GmbH
Current assignee: PE Manufacturing GmbH
Priority date: 1972-04-21
Filing date: 1972-04-21
Publication date: 1973-11-08
Also published as: US3874794A; FR2199882A5; JPS4922185A

Description

Patentanmeldung

Bodenseewerk Perkin-Elmer & Co₀ GmbH., 777 Überlingen/Bodensee

Photometrisches Analysenverfahren

Die Erfindung "betrifft ein Verfahren zur quantitativen photometrischen Bestimmung farbloser oder nur wenig farbiger Bestandteile in einer Probe durch Umsetzung mit einem farberzeugenden Reagens und anschließende Bestimmung der Extinktion des farbigen Reaktionsproduktes bei einer bestimmten Wellenlänge oder in einem bestimmten Wellenlängenbereich ο Das Verfahren betrifft auch die Bestimmung mindestens zweier Bestandteile in einer Probe,, wobei ein erster Bestandteil direkt und ein zweiter erst nach Zusatz eines weiteren Reagens bestimmbar ist. Es bezieht sich- ebenfalls auf die Bestimmung eines in einer "freien" und in einer "gebundenen" Teilmenge vorliegenden Bestandteils der £robe< >

Die Erfindung betrifft weiterhin eine Vorrichtung zur selbsttätigen und wiederholbaren Ausübung des Verfahrens, die.aus einem Photometer zur Messung der optischen Durchlässigkeit f aus einer damit verbundenen Einrichtung zum Auswerten der Meßwerte und zum Aufzeichnen von Extinktions- bzw. Konzentrationswerten, aus einer nach dem

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Diluterprinzip arbeitenden Vorrichtung zur verlustlosen und verunreinigungsfreien Abmessung und Förderung einer Probenmenge in ein Reaktionsgefäß unter Verdünnung durch eine abgemessene Menge eines Verdünnungsmittels besteht und aus Vorratsgefäßen, Fördervorrichtungen und Zuführungen für die Einführung abgemessener Mengen von Reagentien in das Reaktionsgefäß„

Photometrische analytische Bestimmungen werden gewöhnlich so ausgeführt, daß zunächst ein Leerwert ermittelt wird, indem ©ine abgemessene Probenmenge, die der Analysenmenge gleich ist, in gleicher Weise wie bei der eigentlichen Bestimmung umgesetzt wird, außer daß anstelle des 'farberzeugenden Reagens ein farbloses Verdünnungsmittel zugesetzt wird. Die photometrische Bestimmung mehrerer Bestandteile in einer Probe wird üblicherweise so ausgeführt, daß jeder der zu messenden Bestandteile in einer getrennten Probenmenge mit den erforderlichen Reagentien umgesetzt und bestimmt wird. Zusätzlich wird dabei für jede einzelne Messung ein Leerwert in der genannten Weise ermittelt. Man benötigt daher immer mindestens das Doppelte der für die Bestimmung an sich notwendigen Probenmenge, und das ist nachteilhaft, besonders im Zusammenhang mit klinisch-chemischen Analysen, da dort diese Probenmengen nicht immer zur Verfügung stehen. Die u.U„ mehrfache Bestimmung des Leerwertes und der Einzelwerte bringt darüber hinaus eine an sich unnötige Verminderung der Meßgenauigkeit mit sich. Bin weiterer Nachteil besteht darin, daß viele Umsetzungen gewisse Zeit zur quantitativen oder nahezu quantitativen Ausbildung des farbigen Produktes benötigen, in dessen Absorptionsbande die photometrische Bestimmung erfolgen soll. Dabei wird im allgemeinen die Messung nicht am Ende der Farbbildungsreaktion vorgenommen, sondern zu einem bestimmten Zeit-

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Punkt, der aus Sicherheitsgründen viel spaten' gewählt ■ ist ο Man -kann diesen Nachteil awsr teilweise dädu3?ah aufhellen-,. daß- Man mehrere solcher Bestimmungen ''ineinander Verschachtelt",, jedoch "bringt dies eine erhöhte fS-IP-wechslungsgefahr in der Zuordnung der Meßergebnisse . zu den -jeweiligen Proben mit sieh«

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, das photome-. trisehe Analysen-verfahren der vorgenannten Art so ζΉ vereinfachen, daß für die Durchführung des Verfahrens eine geringere Pröbenmenge erforderlich wird unter, gleieh*- zeitiger Einschränkung des Verbrauchs an fieagentien«.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, die für die Durchführung des Verfahrens benötigte Zeit so weit zu verkürzen, daß die Umsetzungen und Messungen unmittelbar hintereinander vorgenommen werdefi können, wodurch ein Ineinanderschachteln verschiedeneo? Beö'tiiamungen entfallen kann und Fehler in der ^aör-dnung del? Heßergebnisse vermieden werden,

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß in einem ersten Schritt des Verfahrens eine erste? ab"ge« messene Probenmenge unter Verdtinnung durch eine abgeffie^sgne Menge eines Verdiinnungsmittels in eine Küvette einge-»· bracht und nach BurGhmischung elm erstör,- dem Blindwert entsprechender optischer; Burehlässigkeitswert gemessen wird, und, daß in einem zweiten Schritt eine abgemessene Menge eines färberzeugenden iteagens zugesetzt und naöh Durchmischung ein zweiter σρtischer Üürcrhläs-sigkeitswert gemessen wird_o

Zur Bestimmung von mindestens zwei Bestandteilen in einer Probe, wobei ein erster Bestandteil direkt und ein zweiter Bestandteil erst nach Zusatz eines weiteren Reagens bestimmbar ist, wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in einem dritten Schritt eine abgemessene Menge eines zweiten färb er zeug enden Reagens zugesetzt und "nach Ourchmischung ein dritter optischer Durchlässigkeitswert gemessene

lach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann auch ein in einer freien und in einer gebundenen Teilmenge vorliegender Bestandteil der Probe dadurch bestimmt werden, daß im zweiten Schritt eine abgemessene, überschüssige Menge des farberzeugenden Reagens zugesetzt und ein der freien Teilmenge- entsprechender Durchlässigkeitswert gemessen wird, wobei im dritten Schritt eine abgemessene Menge eines die gebundene Teilmenge freisetzenden Reagens zugefügt' und ein der Gesamtmenge entsprechender Durchlässigkeit®-· wert gemessen wird.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden gemessenen-Durchlässigkeitswerte in eine Rechen- und Registriervorrichtung eingespeist und als Extinkiiio-nswert-e bzw* Koin-zentrationswerte aufgezeichnet, ferner kann die Änderung der Extinktion bzw_o Konzentration mit der Zeit aufgezeichnet werden«

Erfindungsgemäß werden die Zuführung der Proben- und Reagensmengen zu der Küvette nacheinander in gesteuertem Zeitablauf und auch die Durchmischung, Messung und Reinigung selbsttätig vorgenommen,,

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Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur selbsttätigen und wiederholbaren Ausübung des vorgenannten Verfahrens sieht eine während des gesamten Verfahrensablaufs im Strahlengang des Photometers feststehende Küvette.als Reaktionsund Meßgefäß vor, sowie eine Steuereinheit zur Steuerung der aufeinanderfolgenden Arbeitsvorgänge,,

Zweckmäßigerweise ist die Vorrichtung nach der Erfindung mit einer Vorrichtung zur Durchmischung des Küvetteninhalts vor jeder Messung der optischen Durch-· lässigkeit versehen, sowie mit einer an sich bekannten Einrichtung zur Reinigung der Küvette vor bzw. nach jedem Verfahrensablauf.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung wird im folgenden an Hand der Abbildungen und Bezugszeichen näher erläuterte

Das Ausführungsbeispiel richtet sich insbesondere auf die Bestimmung des Bilirubingehalts im Serum, das darin in zwei Fraktionen enthalten ist, nämlich als freies und als gebundenes Bilirubin,,

Fig. 1 zeigt den zeitlichen Verlauf der Änderung der Extinktion bei der Bestimmung von freiem Bilirubin nach dem erfindungsgemäßen Verfahren;

Fig. 2 zeigt den zeitlichen Verlauf der Änderung der Extinktion bei der Bestimmung des Gesamt-Bilirubins nach dem erfindungsgemäßen Verfahren;

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Pig» 3 zeigt den zeitlichen Verlauf der- Änderung der Extinktion bei der erfindungsgemäßen Bestimmung von freiem und Gesamt-Bilirubin;

J¹Xg₀ 4 zeigt schematisch eine Vorrichtung zur Ausübung des erfindungsgemäßen Verfahrens»

Pig. 5 zeigt eine Schaltungsanordnung zur Signalverarbeitung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren«

Fig, 6 zeigt die verschiedenen in der Schaltung von Pig. 5 auftretenden Signalverläufe_o

Zum besseren Verständnis des erfindungsgemäßen Verfahrens und seiner Ausübung wird im folgenden zunächst das bekannte Verfahren (Lo Jendrassik, P. G-rof; Biochem. Zeitschr. 297, 81; 1938) der Bilirubin-Bestimmung im Serum im einzelnen geschildert:

Dazu werden die folgenden Lösungen verwendet:

Kochsalzlösung: 0,9 ^a/o in Wasser . ■·.·.·.

Tartratlösung: 0,4 M Kalium-Uatriumtarträt in

1 N Natronlauge

Diazo-Reagens: eine Lösung von diazotierter

Sulfanilsäure aus unmittelbar vor der Reaktion gemischten Lösungen von Sulfanilsäure (0,5 ^) in 0,15 η Salzsäure und Natriumnitrat (0,5 f<>) in Wasser

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0-, 1 M Coffelny 0,,15 M Natriumbenzoat, 0y5 M Batriumaoetat

in Wasser.

Bs wird zunächst zur BrEiittlung des Leerwertes eine Probenmenge von 200 al mit; 1250 al Kochsalzlösung versetzt, gemischt, und nach 4 min wer ^ 1000 al TartratlÖsung zugegeben. Ifecii weiteren 4 min - die Probe wird während dieser · Zeit durchmischt - wird die optische Durchlässigkeit dieser Blindprobe im Meßwellenlängenbereich um 600 mn. gemessene

Anschließend wird zur Bestimmung des freien Bilirubins eine Probenmenge von 200 ul mit 1000 ul Kochsalzlösung, sowie 250 ul Diazo—Reagens versetzt, gemischt, und nach 4 min werden 1000 ul (Ear tr at lö sang zugegeben. lach weiteren 4 ϊαΐη - die Probe wird während dieser Zeit 'durchmischt - wird die optische Durchlässigkeit bei '-6OQ. nia gemessen« - ■ - ;

Zur EäMittliaaag 4es iJeerWeriies £ Wc
bestimmung wird eine PrObenmenge von 200 ul iiiit 1250 al Cöff einlösung versetzt^ gemischt, uitd nach 10 min werden 1000 ul Tartratrösung zugegeben, lach weiteren 5 min - die x^Jrobe wird während dieser Zeit durchmischt - wird die optische Durchlässigkeit bei 600 nm gemessen.

Anschließend wird zur Bestimmung des Gesamt-Bilirubins eine Probenraenge von 200 ul mit 1000 ul öoffeinlösang, sowie 250 ul Diazo-Reagens versetzt, gemischt;, uiid nach 10 min werden 1000 ul Tartratlösung zugegeben. Nach weiteren 5 min - die Probe wird während dieser Zeit durchrais&t - wird die optische Durchlässigkeit bei 600 m gemessene

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Aus der Differenz der Durchlässigkeit der jeweiligen Probe und Blindprobe ergibt sich die Extinktion des bei 600 nm absorbierenden Farbstoffe, die nach einer gegebenen Eichkurve proportional der Konzentration an freiem Bilirubin bzw. Gesamt-Bilirubin ist. Der Gehalt an gebundenem Bilirubin ergibt sich dann aus der Differenz von Gesamt-Bilirubin und freiem Bilirubin.

Fig₀ 1 zeigt den zeitlichen Ablauf des erfindungsgemäßen "Verfahrens. Nach Vermischung der Probe mit der Kochsalzlösung stellt sich eine konstante Durchlässigkeit entsprechend dem Extinktionswert E_x ein.; auf Zusatz des

Jj

Diaao-Reagens zum Zeitpunkt t-, findet nach Durchmischung die Reaktion des freien Bilirubins mit dem Reagens unter Bildung des a.uch bei 600 nm absorbierenden Farbstoffes statt. Die Reaktion ist verhältnismäßig langsam, so daß man die der Abnahme der Durchlässigkeit entsprechende Zunahme der Extinktion in dem mit 2 bezeichneten Zeitraum gut verfolgen kann. Zum Zeitpunkt tp wird die Diazokupplung durch Zusatz der Tartratlösung unterbrochen, und es stellt sich ein neuer Durchlässigkeitswert entsprechend der Extinktion E^ des Farbstoffes in dieser Lösung ein, die zeitlich konstant ist₀ Der Anfangswert der Extinktion Ej₁ ergibt nach entsprechender Verdünnungskorrektur den leerwert ^AL* ^{s0 da}^ ^si-^cn &i-^e wahre Extinktion des gebildeten Farbstoffes aus der Differenz E> - E«_L ergibt, die nach der bekannten Eichkurve ein Haß für die Konzentration des freien Bilirubins ist_o

Fig_o 2 zeigt in entsprechender Weise den seitlichen Ablauf der Bestimmung des Gesamt-Bilirubins. Aus dem in dieser I-iessung ermittelten Extinktionswert ergibt sich in gleicher Weise die Gesamt-Bilirubin-Konzentration.

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o 1 und 2 zeigen, daß die erfindungsgemäße Ausübung des Verfahrens erheblich kürzere Zeiten benötigt als das bekannte Verfahren. Im Gegensatz zu den verhältnismäßig großen Wartezeiten von 8 bzw. 14- min bis zur Bestimmung des geforderten Viertes ist die Bildung des zu messenden Farbstoffes bereits nach ca. 20 see abgeschlossen. Die beiden Bestimmungen können daher in wesentlich kürzerer Zeit ausgeführt werden_o

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der Leerwert der Extinktion E._T durch eine - in der Rechenvorrich-

AL

tung vorgenommene - Korrektur aus dem gemessenen Blindwert der Durchlässigkeit entsprechend dem Blindwert E_T der Extinktion errechnet. Der Leerwert E«_T entspricht der Extinktion einer Lösung des Serums in den verwendeten Medien bei der Beobachtungswellenlänge. Der Blindwert E-j- ist der um den Verdünnungsfaktor verringerte Extinktionswert E_g des Serums selbst.

^YS

E = _# E₀

V + V ^b ^VS ^{+ V}R1

darin ist Vg das eingesetzte Volumen an Serum und V_R1 das Volumen zugesetzter Kochsalz- bzw_o Coffeinlösung.

Der Leerwert E^t, der für die korrekte Bestimmung der Farbstoffextinktion erforderlich ist, ist entsprechend

v_s

Ji. _

309845/0591 - 10 -

« ίο -

darin ist V₁₃₀ das zugesetzte Volumen an Diazo-Reagens und V^ das zugesetzte Volumen an Tartratlösung. Es ist fer-

^EAL

wobei der Korrekturfaktor

⁷S ^+VE1

Dieser Eorrekturfaktor kann leicht in der Rechenvorrichtung vorgegeben werden. Am Ausgang der Vorrichtung werden nach Wahl die Extinktionswerte des Farbstoffes (E^ - ^j) oder Konzentrationswerte (nach Wahl in Mol/1, g/ioo ml oder, wie· im Bereich der klinischen Chemie üblich, in mg ^c/o, d.s. mg/100 ml Serum) angezeigt»

Eine weitere Vereinfachung und Verkürzung des Verfahrens ergibt sich aus dem Befund, daß die Farbstoffbildung praktisch nach 20 see abgeschlossen ist. Bei dem bekannten Verfahren mit Wartezeiten von 4 bzw» 10 min bis zur Unterbrechung der Diazokupplung werden in nicht vernachlässigbarem Umfang Kupplungsprodukte des SuI-fanilsäurediazoniumsalzes auch mit anderen Serumbestandteilen, sj. den Proteinen, gebildet. Diese Kupplungsprodukte besitzen wie das Kupplungsprodukt mit Bilirubin eine Absorptionsbande bei 530 nm. Bei dem bekannten Verfahren bewirkt der Zusatz der alkalischen Tartratlösung eine Verschiebung der Absorption des Bilirubin-

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Kupplungsproduktes in den Bereich, am 600 nnu-Da die in der Hebenreaktion gebildeten Kupplungsprodukte eine solche Absorptionsverschiebung nicht erfahren, wird auf . diese Weise eine störungsfreie Messung allein des BiIirubin-Kupplungsproduktes ermöglicht. Die nähere Untersuchung hat nun ergeben, daß die Siebenreaktion der diazotierten Sulfanilsäure sehr viel langsamer verläuft, so daß bei hinreichend kurzer Untersuchungszeit der Tartratzusatz unterbleiben und die Bxtinktionsbestimmung direkt bei der Absorption des Bilirubin-Kupplungsproduktes (530 nm) erfolgen kann₀ Es ergibt sich so die Möglichkeit, das freie Bilirubin und das Gesamt-Bilirubin bzw. das gebundene Bilirubin in einer einzigen Probe zu bestimmen. Dieses Verfahren ist in seinem zeitlichen Ablauf in Pig. 3 dargestellt:

200 ul -^'robenmenge werden mit 1000 ul Kochsalzlösung versetzt, und es wird die Durchlässigkeit entsprechend der Extinktion E^. wie oben gemessen (Zeitraum 6 in Figo 3) ο Zum Zeitpunkt t., werden 250 ul Diazo-Reagens zugesetzt und nach Durchmischen und hinreichendem Abfall der optischen Durchlässigkeit während des Zeitraums 7 wird ein Durchlässigkeitswert entsprechend der Extinktion E-p gemessen. Zum Zeitpunkt t₂ werden 1000 ul Goffeinlösung zugesetzt. Da die anfangs zugegebene Menge an Diazo-Reagens im Überschuß zugesetzt ist, ist auch im Zeitraum 8 noch genügend Reagens vorhanden, um mit dem durch das Coffein aus seiner Bindung freigesetzten Bilirubin zu reagieren. lach Durchmischen und hinreichendem Abfall der optischen Durchlässigkeit wird ein Durchlässigkeitswert entsprechend der Extinktion E_& für das Gesamt-Bilirubin gemessen»

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Aus den hier ermittelten Extinktionswerten ergeben sich nach entsprechender Korrektur und Differenzbildung die bereits oben erwähnten Extinktionswerte für freies und G-esamt-Bilirubin bzw. gebundenes Bilirubin, die mittels der für eine Wellenlänge von 530 nm aufgestellten Eichkurve in geeignete Konzentrationswerte umgerechnet werden können.

Man erkennt aus dieser Schilderung die Ersparnis an Zeit, Reagentien und Probenmengen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren im Vergleich zu dem bekannten Verfahren der Bilirubin-BeStimmungο

Mg₃. 4 zeigt schematisch eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Darin, ist mit 10 allgemein ein Photometer mit einer Lichtquelle 11, einem Linsensystem 12, einer Küvette 17, einem photoelektrischen Empfänger 15 und einem geeigneten Lichtfilter 14 bezeichnet. Der photoelektrische Empfänger ist mit einer bekannten Meß-, Rechen- und Registriervorrichtung 18, 19 verbunden. Die in dem Behälter 20 befindliche Probe wird mittels einer nach dem Diluter-l'rinzip arbeitende Fördervorrichtung 21 unter Zusatz des dem Vorratsgefäß 22 entnommenen Verdünnungsmittels (Kochsalzlösung) über die Zuleitung 23 ir. die Küvette 17 gegeben; die Fördervorrichtung 21 ist mit der Steuereinheit 30 verbunden. Es sind weitere VorratsgeiaSe 24, 25, 26 vorhanden, die über jeweils eine Pördervorrichtung 27, 28, 29 und eine zugehörige Zufvhrur- ein bestimmtes Reagens in die Küvette 17 in ^:oce::assener Menge, überführen; die Fördervorrichtungen

;, 28, 29 sind ebenfalls mit der Steuereinheit 30 verbunden» Die Steuereinheit 30 steht weiterhin mit der Ii^-, Rechen- und Registriervorrichtung 18, 19 in Verbindunge

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Weiterhin sind vorgesehen, aber nicht dargestellt, eine Durchmischungsvorrichtung für den Inhalt der Küvette sowie gegebenenfalls eine Einrichtung zur Reinigung der Küvette vor "bzw., nach jedem Ablauf des Verfahrens sowie Mittel zur Thermostatisierung der Küvette und gegebenenfalls der Reagenzien«

Die Vorrichtung gestattet eine selbsttätige und wiederholbare Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei entsprechend der Programmierung der Steuerein- · heit 30 zu jedem gewünschten Zeitpunkt ein der optischen Durchlässigkeit der Küvette entsprechendes Signal am Empfänger 15 in die Rechen- und Registriervorrichtung eingegeben und als Extinctions- oder Konzentrationswer-t aufgeze-ichnet, z.B. ausgedruckt , werden kann_o

Die Steuervorrichtung kann beispielsweise von einer mit konstanter vorgegebener Geschwindigkeit angetriebenen Schaltwalze gebildet werden, durch die in der gewünschten zeitlichen Aufeinanderfolge Schaltkontakte zur Steuerung der Fördervorrichtungen 21, 27, 28, 29 und der Rechenvorrichtung 19 geschlossen werden,,

Im ersten Verfahrensschritt wird mittels der Diluter-Vorrichtung 21 über die Zuführung 23 eine aus dem Behälter 20 entnommene Probenmenge von 200 ul und eine dem Vorratsbehälter 22 entnommene Menge von 1000 ul Kochsalzlösung in die Küvette 17 gegeben. Dieser Vorgang wird, wie der Gesamtablauf des Verfahrens, an der Steuereinheit 30 ausgelöst. lach einer von der Steuereinheit 30 vorgegebenen kurzen Zeit wird das der optischen Durchlässigkeit der Küvette entsprechende

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Signal vom Empfänger 15 abgenommen und in der Vorrichtung 18, 19 gespeichert. Darauf wird mittels der Fördervorrichtung 27, die von der Steuereinheit 30 in entsprechender Weise angesteuert wird, aus dem Vorrats'gefaß 24 eine abgemessene Menge von 250 ul Diazo-Reagens entnommen und der Küvette zugeführt. Anschließend wird, ebenfalls über die Steuereinheit 30, die Durchmischungsvorrichtung betätigt und der Küvetteninhalt durchmischt. Dann wird nach einer von der Steuereinheit 30 vorgegebenen Zeit oder auch während dieser Zeit das am Empfänger 15 anliegende, der optischen Durchlässigkeit der Küvette entsprechende Signal auf die Torrichtung 18, 19 gegeben und als korrigierter Extinktionswert bzw_o als Konzentrationswert für das freie Bilirubin aufgezeichnet. Nach dieser Zeit wird von der Steuereinheit 30 die Fördervorrichtung 28 ausgelöst, die eine abgemessene Menge von 1000 ul Coffeinlösung in die Küvette 17 fördert; anschließend wird wiederum die Durchmischungsvorrichtung angesteuert und wie vorher beschrieben der korrigierte Extinktionswert bzw. der Konzentrationswert des Gesamt-Bilirubins aufgezeichnet. Es kann gegebenenfalls vorgesehen sein, bereits in der Recheneinheit die Differenzbildung vorzunehmen und auch den Konzentrationswert für das gebundene Bilirubin aufzuzeichnen. Nach dem Abschluß der Messung kann durch die Fördervorrichtung 29 aus dem Vorratsgefäß 26 in von der Steuereinheit 30 bestimmter Weise ein Reinigungsmittel entnommen v/erden und die Küvette 17 damit gespült werden, so daß sie anschließend für einen weiteren Verfahrenszyklus der vorstehend beschriebenen Art zur Verfügung steht.

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!ig. 5 zeigt im einzelnen die Meß- Rechen- und Registriereinheit 18, 19 von I¹Ig. 4.

Aus den Kurvenverläufen von Fig. 3,ergeben sich für die Feststellung der Konzentrationen folgende mathematischen Zusammenhänge:

c = f₃ (f₂ E_D - f₁ E₁)

Darin sind c und c. die jeweiligen Konzentrationen von direkten bzw. Gesamtbilirubin, f* bzw„ f-i bis f,- sind Eichfaktoren und Er>, E-r» E~ sind die verschiedenen Extinktionen. Die Extinktionen berechnen sich bekanntlich aus der Durchlässigkeit D nach folgendem Ausdruck

E = In 1 .
D

Der photoelektrische Empfänger 15 empfängt das Liehtbündel H von der Lichtquelle 11, welches mittels einer lochscheibe 32 zerhackt wird«, Das Empf anger signal, welches von dem Verstärker 18 verstärkt wird, besteht somit aus der Meßspannung TJL, und der Dunkelspannung U , die abwechselnd auftreten gemäß Signalverlauf TJ-^ in Fig. Durch die kapazitive Kopplung über den Kondensator 34 wird der Gleichstromanteil eliminiert, und es entsteht ein Signalverlauf TJ^₂ (Fig₀ 6)„ Die lochscheibe 32 wird von einem Motor 36 angetrieben. Es werden, wie durch die gestrichelte linie 38 angedeutet ist, Kontakte S1, S2, S3 synchron mit der durch die lochscheibe 32 erfolgenden Bündelunterbrechung gesteuert. Mit Hilfe

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einer Klemmschaltung, bestehend aus den Kontakten S1, S2 und einem Verstärker 38 wird ein Kurvenzug U^ (Figo 6) erzeugt. S1 und S2 werden wechselweise im Takt der Lochscheiben-Unterbrecherfrequenz derart geschaltet, daß während der Impulslücke S1 geschlossen und S2 geschlossen ist. Während der Dauer des Impulses, wenn also Licht auf den Empfänger 15 fällt, ist S1 geöffnet und S2 geschlossen. U_M, enthält dann nur noch das Hutζsignal_β

In einer Holdschaltung 40 wird aus dem Meßsignal U,,₇ ein gleichgerichtetes Signal U^, erzeugt. Hinter einer Filterschaltung 42 wird mit dem Umschalter S3 in Takt der Unterbrecherfrequenz zwischen der gefilterten Spannung U_M/! und einer Referenzspannung υ_Ώ hin- und

l'l'i· -ti

hergeschalteto Es entstellt am Eingang einer Logarithmierschaltung 44 ein Signalverlauf U_wc- (Figo 6). Dieses Verfahren ist notwendig, da eine gleichspannungsmäßige Logarithm!erung sehr temperaturabhängig ist₀ Da außerdem Logarithmierverstärker nicht von 0 Volt Eingangsspannung an arbeiten, ist eine einfache Zerhackung der Gleichspannung U^ nicht möglich. Aus diesem Grunde wird zwischen U^. und U_R hin- und hergeschaltet. Bei der nachfolgenden Differenzbildung gemäß den obigen Gleichungen für c bzw» Cj fällt die Ref erenzsjjannung U_R automatisch wieder heraus:

Ep — E-j = In — In

Ur u_r

= In U_{M 42} -InUg- In U^₂ - In U_R

= ^{ln U}M42 - ^{ln U}M41

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Die zum Zeitpunkt t.. (Mg₀ 3) gemessene Durchlässigkeit D_x wird durch die logarithmierschaltung 44 in die Extink

·" 1 ■

tion E_T = In - umgerechnet und über einen Schalter S,

einer Holdschaltung 46 zugeführt. Hier wird das Extinktionssignal gespeichert und kann durch Potentiometer 48 bzw. 50 mit einstellbaren Faktoren f^ bzw. f^· versehen werden. Durch einen Schalter 52 kann der Ausgang der Holdschaltung wahlweise an das Potentiometer 48 oder an das Potentiometer 50 angelegt werden. Die Abgriffe der Potentiometer 48 und 50 sind zusammengeschaltet.

Über einen Schalter Sc wird in einer Holdschaltung 54 im Zeitpunkt tp die'Extinktion E-q gespeicherte Mittels eines Potentiometers 56 kann dieser gespeicherte Wert mit einem einstellbaren Faktor f₂ elektrisch multipliziert werden«,

Die zusammengeschalteten Abgriffe der Potentiometer 48 und 50 liegen über einen Widerstand E^--. an dem invertierenden Eingang eines Differenzverstärkers 58 an. An dem nicht-invertierenden Eingang des Differenzverstärkers 58 liegt der Abgriff des Potentiometers 56 übe-r einen Schalter S7 und einen Widerstand R₂ = R₁« Ein einstellbarer Gegenkopplungswiderstand R™ verbindet den Ausgang des Verstärkers 58 mit dessen invertierendem Eingänge Bei Schließen des Schalters S7 und bei Umschaltung des Schalters 5'2 auf das Potentiometer 48 erscheint am Ausgang 60 des Differenzverstärkers 58 ein der Konzentration c analoges Signal

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wobei Rp ein geeignet einstellbarer Faktor ist.

—— = f „

R₁ '

Dieses Signal kann mittels einer analogen Anzeigevorrichtung 62 angezeigt und außerdem mittels eines Analog-Digital-Wandlers 64 in digitale Form umgesetzt, in einem Speicher 66 gespeichert und mittels eines Druckers 68 ausgedruckt werden,.

Über einen Schalter S6, eine HoIdschaltung 70 mit einem Potentiometer 72 zur Einstellung eines Faktors f. sowie einen weiteren Schalter S8 kann im Zeitpunkt t., (Fig₀ 3) bei Umschaltung des Schalters 52 auf das Potentiometer in entsprechender Weise ein Signal proportional zu

C₁ - — u₄ L₀-I₁ e_l;

R₁

gebildet werden. Der Gegenkopplungswiderstand R₁₅, kann dabei so eingestellt werden, da.ß

R₁,

- J.

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Claims

Patentansprüche

Verfahren zur quantitativen photometrischen Bestimmung farbloser oder nur wenig farbiger Bestandteile einer Probe durch Umsetzung mit einem farberzeugenden Reagens und anschließende Bestimmung der Extinktion des farbigen Reaktionsproduktes bei einer bestimmten Wellenlänge oder in einem bestimmten Wellenlängenbereich, dadurch gekennzeichnet, daß in einem ersten Schritt eine erste, abgemessene Probenmenge unter Verdünnung durch eine abgemessene Menge eines Verdünnungsmittels in eine Küvette (17) eingebracht und nach JDurchmischung ein erster, dem Blindwert entsprechender optischer Durchlässigkeitswert gemessen wird, und, daß in einem zweiten Schritt eine abgemessene Menge eines farberzeugenden Reagens zugesetzt und nach Durchmischung ein zweiter optischer Durchiässigkeitswert gemessen -wird»

Verfahren nach Anspruch 1 zur Bestimmung von mindestens zwei Bestandteilen in einer Probe, wobei.ein erster Bestandteil direkt und ein zweiter Bestandteil erst nach Zusatz eines weiteren Reagens bestimmbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß in einem dritten Schritt eine abgemessene Henge eines zweiten farberzeugenden Reagens zugesetzt und nach Durchmischung ein dritter optischer Durchlässigkeitswert gemessen wird.

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Verfahren nach Ansprach 2 zur Bestimmung eines in einer "freien" und in einer "gebundenen" Teilmenge vorliegenden Bestandteils der Probe, dadurch gekennzeichnet, daß im zweiten Schritt eine abgemessene, überschüssige Menge des farberzeugenden Reagens zugesetzt und ein der freien Teilmenge entsprechender Durchlässigkeitswert gemessen wird, und, daß im dritten Schritt eine abgemessene Menge eines die gebundene Teilmenge freisetzenden Reagens zugefügt und ein der Gesamtmenge entsprechender Durchlässigkeitswert gemessen wird.

4ο Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die gemessenen Durchlässigkeitswerte in eine Rechen- und Registriervorrichtung eingespeist und als Extinktionswerte bzw, Konzentrationswerte aufgezeichnet werden,,

Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Änderung der Extinktion bzw» konzentration mit der Zeit aufgezeichnet wird.

6ο Verfahren nach den vorhergehenden Ansprachen, dadurch gekennzeichnet, daß die Zuführung der Proben- und Reagensmengen zu der Küvette (17) nacheinander in gesteuertem Zeitablauf und auch die Durchmischung, Messung und Reinigung selbsttätig vorgenommen werden.

7ο Vorrichtung zur selbsttätigen und wiederholbaren Ausübung des Verfahrens nach iinspr chon 1 bis 5,

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"bestehend aas einem Photometer zur Messung der optischen Durchlässigkeit, aus einer damit verbundenen Meß-, Rechen- und Registriervorrichtung für die Aufzeichnung von Extinctions- "bzw. Konzentrationswerten, aus einer nach dem Diluterprinzip arbeitenden Torrichtung zur verlustlosen und verunreinigungsfreien Abmessung und Förderung einer Probenmerige in ein Reaktionsgefäß unter Verdünnung durch eine abgemessene Menge eines Verdünnungsmittels und aus Vorratsgefäßen, Fördervorrichtungen und Zuführungen für die Einführung abgemessener Mengen von Reagentien in das Reaktionsgefäß, dadurch gekennzeichnet, daß die während des gesamten Verfahrensablaufs im Strahlengang des Photometers (10) feststehende Küvette (17) als Reaktions- und Meßgefäß vorgesehen ist, und, daß die Vorrichtung eine Steuereinheit (30) zur Steuerung der aufeinanderfolgenden Arbeitsvorgänge aufweist«,

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Küvette (17) mit einer Vorrichtung zur Durchmischung des Küvetteninhalts vor jeder-Messung der optischen Durchlässigkeit versehen "ist*

9. Vorrichtung nach Ansprüchen 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine Einrichtung zur Thermostatisierung der der Küvette (17) zugeführten Flüssigkeiten vor-• gesehen ist«,

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10. Vorrichtung nach Ansprach 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine an sich bekannte Hinrichtung zur !Reinigung der Küvette (17) vor- bzw« nach jedem Verfahrensabiauf vorgesehen ist«,

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