CN1201148C - 药用植物制品的品质管制及标准化方法 - Google Patents
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Abstract
一种建立药用植物物料标准规格的方法包括:(i)制备药用植物物料样品的试验溶液或试验萃取物,此物料所具有的每一性质都需标准化;(ii)将该溶液或萃取物送至二个或更多的分析方法,此等方法包括(a)结合NMR谱及以电脑为基础的花样认知技术的方法,及(b)一或多种生物学定性技术;(iii)由步骤(ii)所用的方法取得结果;及(iv)以步骤(iii)所取得结果为基础建立该植物物料的标准规格。药用植物物料的待用药品可再试验其是否符合标准。此等物料视其分析结果是否符合步骤(iv)所建立的任一规格而接受或拒绝。此一标准化及品质管制的进行特别适用于药用植物物料混合物。
Description
本发明是关于药用植物物料的标准化及品质管制中NMR谱及生物学定性结合以电脑为基础的统计方法的用途。
世界上许多社会多个世纪以来已发展成传统医药系统,此系统主要依赖使用植物和草药作为治疗物质。此处所谓“植物”一词包括各种植物,包括了草药及真菌。
近几年来,人们对直接使用植物及植物萃取物作为健康改良剂的兴趣有明显的增加,例如使用人参(Panax ginseng),大蒜(Alliumsativum),白果(Ginkgo biloba),金丝桃(Hypericum perforatum),球菊(Echinacea angustifolia)及芦荟(Aloe vera)。这些都可从市场上当作草药制品及食物补品购得,全世界此等制品的年销售量已达几百亿美元。尽管市场潜力如此之大,医药工业的主流到目前为止仍未将其注意力转向衍生自植物的医药制品的开发上。这部分是因为植物材料的复杂性质及其先天的非划一性,包括尚未建立起一套系统,以此系统保证此类制品得到药物规范的批准。
用于以草药及植物为基础的药物上的物料一般都是全植物、植物的一部分或植物或真菌的萃取物。由于植物及真菌物料含多种不同的化学成分,从定义上说,此等物料是复合混合物。所以此等物料在标准化及品质管制上有相当的困难。上述的传统中药及印度药所用的许多药方都是二种或更多种以植物为基础的成分的混合物。所以此类药物都是混合物的混合物,较单一植物物料为基础的草药更难分析。而且,此类药物的制造方法又常是尚未揭示的。此诸多因素使取自表面一样而本质不同来源的同一给定药物的二个样品都难以确保是含相同的成分的混合物。此一导致难以就此类药物作品质管制的问题,一直限制了西方草药师接受东方草药。
草药中所用的植物常不能从当地取得,所以需由距使用者很远的地方取得。而此类植物由远地供应又可能是不稳定的或不准确的。尤以此等植物缺少详细的论述时为然,如缺少认证及品质标准。药用植物内的各成分的复合混合物,可能因多种因素而在型式及浓度上有很大的出入,这包括植物来源、产地;收获时此植物已长了多少年、物料储存及加工条件、所用萃取方法等。当此等植物又与其他植物混合时,例如根据传统中国草药处方混合,所生成的制品的变化就更大了。
事实上,现在远无法确保,由不同来源的给定植物物料会有相同的均一性及生物活性。本发明通过提供一种标准化药用植物物料的方法而得以解决此问题。此法注意植物物料内各成分的总量,而不管其内在性质及其在植物内的生化作用。此法包括对植物物料在化学含量及生物学作用上的一致性的探究。
是以,本发明方法提供一种以已知的具有特定所需性质的物料的样品作为标准而定义给定的植物物料的标准的方法。标准的规格是将已知样品送至(a)NMR谱与以电脑为基础的花样认知技术结合,及(b)一或多种生物学定性技术而确定的,以如此所得结果作为标准规格。然后将该植物料的“待用”样品做试验,看是否与标准相符。视其分析结果是在已确定的规格范围内还是部分或完全在规格范围之外而决定是否采用。
因之,本发明提供一种确立药用植物物料的标准规格的方法,此法包括
(i)制备药用植物物料样品的试验溶液或试验萃取物,此物料所具有的每一性质都需标准化;
(ii)将该溶液或萃取物送至二个或更多的分析方法中,此等方法包括(a)结合NMR谱及以电脑为基础的花样认知技术的方法,及(b)一或多种生物学定性技术;
(iii)由步骤(ii)所用的方法取得结果;及
(iv)以步骤(iii)所取得结果为基础建立该植物物料的标准规格。
是以,由步骤(iv)所得标准规格是建立于NMR谱及以电脑为基础的花样认知及一或多种生物特性技术所得结果之上的。然而,当试验待用药用植物物料样品是否与标准相符时,并不须将样品都作NMR谱分析及生物学特性定性。而是,将所有待用样品都作NMR谱及花样认知,只有选出的待用样品,例如从批量药用植物物料定期抽出的样品,作是否与标准规格相符的生物学特性试验。此目的在原则上有赖于分析方法,此法最适用于大量生产时的方便而快速操作。此即NMR谱及花样认知分析。此生物技术一般以NMR谱及花样认知结果为基础在随机的基础上用于使采用或不采用待用样品的决定更加合理和有力。
根据本发明,还提供一种供应药用植物物料样品的方法,此样品是与前面所定义的该植物物料标准规格相符的,此法包括:
(i′)制备药用植物物料待用样品的试验溶液或试验萃取物;
(ii′)将该溶液或萃取物作NMR谱及以电脑为基础的花样认知技术的分析;
(iii′)从步骤(ii′)的分析取得结果;及
(iv′)如果步骤(iii′)所取得结果符合该植物物料于上步骤(iv)所作的标准规格,则选用此待用样品。
此法可使用于大批量。由不同批的相同植物物料取得的待用样品作步骤(i′)至(iv′)分析。当选取待用样品除NMR谱及花样认知试验外还作生物学特性试验时,步骤(iv′)可用下述步骤代替:
(iv′a)将步骤(i′)所制备的溶液或萃取物送至一或多种生物特性试验技术;
(iv′b)从用于(iv′a)每一技术得到结果,及
(iv′c)如果由步骤(iii′)及(iv′b)所得结果与该物料于上述步骤(iv)所确立的标准规格相符,则选用该待用样品。
有关生物特性定性技术后面会有详细说明。
本发明说明中所谓“所需的标准性质”可以是药用植物物料所具有的任何性质或品质,或属于药用植物物料的任何性质或品质。此性质的例子包括已临床证明了的治疗效果,医药级的品质,给定植物属的特定多样性,已证明的来源(以生长处所或商业批量)及特定病理状况。所涉及的病理状况可以是给定的成熟程度,此成熟程度是以,例如,收获时间所决定的,或是对寄生虫、除草剂、杀虫剂或其他对所涉及植物可能构成损害的药剂的确定的耐受性。
在本发明较佳方面,“已知具有标准所需的性质或每一性质”的药用植物物料样品是产地已知的经证实的及查证的样品。其标准规格是以样品经上述NMR谱/花样认知和生物学特性定性的分析确立的。相同植物物料的以后的样品,其来源或品质是未知的或有疑问的,可以所确立的标准规格试验其是否相符以作为此物料的证实及查证。
核磁共振谱(NMR)本身是已知的,可作为研究植物物料的分析工具。其应用之一例是验证源于水果的饮料。其用法之一是以位置特异天然同位素分离技术(SNIF-NMR)使用氢-2 NMR谱作为确定证实水果汁的手段。例如,于Martin等的JAOAC Int.1996 Jul-Aug.79(4):917-928中即说明了使用氢-2 NMR谱(SNIF-NMR法)测定曾掺了甜菜糖的水果汁。此技术有赖于这样的事实,当水果汁或水果浓缩物发酵时,甲基位置上的单氘化的乙醇分子的含量会因甜菜糖的加进而降低。是以,任何加了甜菜糖的水果汁样品,较对应的证实的样品会有明显低的(D/H)同位素比。此一技术也用氢-2 NMR谱使用于检测酒是否加了糖,如Martin等于J.Chim.Phys.Chim Biol.1983,vol 80,293-297页所报告。
氢-1 NMR不宜用于植物物料,因为其所生成的谱太难以用眼睛分析。此问题的解决,如Kowalski and Bender于J.Am.Chem.Soc.1972,
94.5632-5639所报告,是以适宜的多变数统计分析分析所得数据,例如主成分分析(PCA)。此为一种花样认知技术,其中数据的维数被合并的相关变数(谱中的峰)所降低,形成新的较小的独立正交变数集合(set),称作主成分(PCs)。此等PCs依据其能力排序以解释原始数据中所含的变数。将样品投入由第一PCs跨越的空间即可发现与样品在生物化学组成上的相似性或不相似性。也可将未知的或试验样品投于此空间,以观察与对照样品的比较(Vogels et al,J.Agric.Food Chem.44,175-180,1996)。
氢-1 NMR谱与花样认知技术的结合曾于桔汁的证实上用作筛检工具(Vogels et al,1996 loc.cit)。可以此法测定怀疑掺有别的东西的样品。然后以PCA结果与原始NMR谱中特定共振的相关性测定所涉及的污染物。
结合氢-1 NMR谱及碳-13 NMR谱与PCA也曾用于辨别各种酒的来源(Vogels et al,Chemometrics and Intelligent LaboratorySystems:Laboratory Information Management,21(1993)249-258)。来自德国不同酒产区的不同的酒以统计分析法观察时,显示不同区的酒的样品有不同的丛集。然后再由PCA数据重新构成的谱以显示出特定酒成分(例如,单糖,如葡萄糖、甘露糖、鼠李糖及半乳糖)的NMR谱峰。类似的研究在别处也有报道,例如Vogels et al.于Trends inFlavour Research,Maarse & Van de Heij(Eds),Elsevier,Amsterdam(1994)99-106页所述。
氢-1 NMR谱及主成分的分析的另一种应用由Trerisan et al.于“Characterisation of cell suspension cultures of hop,Humulus lupulusL.”第8章报告过,此文献见于University of Leiden,the Netherlands,95-122页,1997年出版。作者将氢-1 NMR谱及PCA用于处理细胞萃取物,其目的在证实细胞经处理后特定代谢物的积蓄。他们的兴趣在于追踪NMR谱的峰,此等峰是因个别细胞成分而不同。
与前述报告方法目反,本发明所用NMR谱及花样认知方法不需研究要分析的植物的生物化学,也不是要找出植物物料的花样认知结果与特定NMR谱共振的相互关系。而是依赖NMR数据所产生的丛集固有的花样所供给的资料,而此等数据又反映出植物物料内对所用的NMR谱技术有反应的化合物的总体。
本发明所用的以电脑为基础的花样认知与NMR谱的结合(后称NMR谱/花样认知)一般包括:
(a)将试验溶液或试验萃取物作NMR谱分析并记录一个或多个NMR谱;及
(b)将NMR谱分析取得的数据作多变时分析,在图表(scoreplot)上产生一或多个点。
当用NMR谱/花样认知分析确定药用植物物料的标准规格时,上述步骤(ii)所得的图表上的一个或数个点的周围可界定出可接受的范围。此范围构成规格的一部分。然后根据待用样品所作的上述NMR谱/花样认知分析,依其步骤(ii)中所得的点是在范围内或外决定其可接受或不能接受。
NMR谱/花样认知分析本身可用作标准化药用植物物料的方法。因之,本发明一方面提供供应与已确定的物料标准规格相符的此药用植物物料样品的方法,此法包括:
(i″)制备该植物物料待用样品的试验溶液或试验萃取物;
(ii″)将试验溶液或萃取物作NMR谱分析并记录一个或多个NMR谱;
(iii″)将每一NMR谱所得数据送至多变数分析,在图表上产生一或多个点;及
(iv″)只在于步骤(iii)图表上所产生的点落于标准规格所定义的可接受范围时才选出待用样品作为符合该标准规格的样品。
本发明此方面的标准规格可以下法提供,此法包括:
(i)制备已知具有标准所需性质的该植物物料的试验溶液或试验萃取物;
(ii)将试验溶液或萃取物作NMR谱分析并记录一个或多个NMR谱;
(iii)将每一个NMR谱所得数据送至以电脑为基础的多变数分析,于图表上产生一或多个点;及
(iv)定义出步骤(iii)所产生的点的周围作为可接受范围,此范围即该植物物料的标准规格。
于一般多变数分析理论中,总数据为分数乘以负载(loading)所得积。此负载图可用以定义出每一变数(光谱描述符)的贡献。“分数图”(score plot)为图形代表,其中样品作投于以二或多个主成分轴所跨越的空间。主成分分析(PCA)是用以分析多变数分析中数据的特别方法。于PCA中,样品的位置可以二向量画于分数图上,其中类似的样品会形成丛集,而不相似的样品会以大距离扩散(Kowalski &Bender,1972,loc.cit.and Trevisan,1997,loc.cit.)。
在确立标准规格时,本发明方法中的分数图上所产生的点的前后关系,必须与分析待用样品是否符合标准时是相同的。在处理待用试验样品的NMR谱的数据时,对用来确定标准的已知试样的分数图上的一个或数个点,用来确定这些点的位置的方法的组成部分必须都存在。操作时,将用作标准的样品的NMR谱所得数据以多变数统计法作适当操作,例如与标准一起作主成分分析或典型变化。以分数图上的限制定义出可接受的范围,此分数图是以一或多个已知样品的点的分数图内的位置为基础确立了的。于本发明较佳一方面,是使用无监督的方法完成多变数分析的。
本发明所用NMR谱分析技术可包括结合多变数分析于高磁场进行氢-1 NMR谱分析。在此特定方面,NMR一般是在400至700MHz测定。然后将所得数据以多变数分析软件分析,例如用市场上可购得的“Pirouette”package。
高解析氢-1 NMR谱分析及花样认知分析的例子已由M.L.Anthony et al于Biomarkers 1996,1,35-43及MolecularPharmacology 46,199-211,1994及J.O.T.Gibb et al于Comp.Biochem.Physiol.vol.118B No.3,587-598页,1997所讨论。
除1-二维高磁场氢-1 NMR谱分析外,本发明也可用其他NMR活性核如碳-13或氢-2作1-二维NMR谱分析。也可用氢-1或其他如上述NMR-活性核作2-二维脉冲顺序谱分析研究。此同样的原理可用于任何情况,结果都是以适宜的多变数分析法进行分析。
NMR谱在作以电脑为基础的花样认知前可进行正规化或非正规化。正规化有除去峰强度(peak intensity)的效果,此纯为作为判别因子的谱的定量参数。所以正规化一般是当操作的主要目的是强调得自不同样品的谱的定性区别时使用。然而有些情形下,在需绝对定量值,例如强度,时可用峰强度作为区别因子。在此情形下谱是非正规化的。
NMR谱/花样认知的重要优点是不受选择性投送或检出系统(detection system)的限制。试验溶液或试验萃取物在纯化前即可记录谱,是以,允许所具有质子的样品的成分都呈现在总NMR谱上。以上述多变数分析技术分析谱即可显现谱的有潜在价值的判别因子,此谱可用于高度准确地说明植物物料内所含的各成分的复合混合物。
但有时在分数图上不易区别植物物料样品时,会发现来自相同给定植物物料样品的点是散开的而非成丛集的。此一相似性损失在植物物料各成份的NMR谱移植有变化时即会发生。此种变化可能由于,例如,植物物料中某一特定化合物浓度太高所致,或是由于导致移动值改变的pH或金属离子所致。如有此问题发生,作NMR谱分析的植物物料的试验溶液或试验萃取物可先行处理以除去错误源而在分数图上产生较佳的丛集。所以本发明方法一方面包括在作NMR谱分析前先纯化待用植物物料样品的又一起始步骤。
此原理可用茶说明。咖啡因所产生的信号主导茶的氢-1 NMR谱,是以在用多变数分析法分析由茶所得的NMR谱的结果时,相同茶样品的分数图的点不形成丛集。如果在作NMR谱分析前除去茶内的咖啡因,例如作反相色层分析,即可出现样品适宜的丛集,相似样品即于分数图上产生清楚的相似性。此可由实例2及附图4A及4B说明。图4A为未处理的茶样品的分数图,其丛集不明显。相反,图4B为处理过的茶样品的分数图,其丛集明显,可清楚判别。
此NMR谱/花样认知分析是高度敏感的,足以区别以其他方法分析看起来相似的植物物料样品。此也可能茶为例说明。比较实例1说明以高效液体色层分析(HPLC)分析的二种不同型的茶叶提取物。所得色层分析图见附图2及3。一实验使用未处理过的样品(图2及3的色层分析图A),另一实验用处理过的样品(各图的色层分析图B)。
此等图首先显示HPLC并不能区别处理过的和未处理过的茶样品,因为色层分析图2A和2B事实上是相同的,正如色层分析图3A和3B相同一样。第二,此等图显示HPLC并没有判别不同型茶的能力,因为图2的色层分析图与图3的一样。在这方面,HPLC与本发明所用NMR谱/花样认知技术相反,此可由实例2及附图4A及4B说明。
本发明方法的重要应用在于植物物料混合物的标准化中。此等混合物的例子包括上述传统中药所用的药物。此等药物为典型的数种不同的植物与真菌的混合物,是依据几百年以前的处方所制备。到现在为止,尚无一种分析技术可供此类物料的生产者有效地及可靠地区别其自己的产品和竞争者以相同名字出售的表面上相同的产品。现已令人惊奇地发现,本发明所用NMR谱/花样认知技术在假定是相同的,但是来自不同来源的给定的植物物料混合物的不同试样之间提供了清晰的区分。此可由实例5及附图7说明。所以本发明方法可区别并标准化植物物料混合物。
结合NMR谱/花样认知技术及生物学定性是经常需要的,因为药用植物物料内的化合物复合混合物可显示出总体上的临床效果,而此效果可能主要来自一特定成分,此效果又可因其他成分的存在而改变或增强。是以生物学定性能对植物及植物萃取物的生物学效果作可以定量测定,从而补足及/或确认由NMR谱分析及花样认知所得的信息。
本发明方法所用生物学定性技术对植物物料样品的生物活性所需的品质管制及标准化方法是一贡献。现已知以植物为基础的药物的总体效果并非来自单一活性成分,而也由于植物内各种物质的复合混合物内有辅助化合物(auxiliary compounds)的关系。本发明方法所用生物学定性技术容许对此等辅助化合物的协同效果作研究,而无须证实此等化合物本身。可观察到的协同效果包括,例如,主成分活性的增强,治疗物质的选择性或生物利用性的增强,以及副作用的抑制。这方面的生物学定性在用以说明使用全植物或植物萃取物优于使用由植物分离出的单一成分上是特别有用的。
较佳的生物学定性技术是蛋白质分析,特别是蛋白质组学(proteomics)。这是因为蛋白质表达的改变,不论特定作用的机制如酶抑制、受体结合抑制、或信号传递调节如何,都代表最终的生物学效果。蛋白质组(proteome)一词描述了完全的蛋白质集合,它按照在细胞生命中整个基因组来表达和修改。蛋白质组学是使用大规模蛋白质分离及证实技术研究蛋白质组(Nature,vol 402,1999,715页)。蛋白质组学分析于下实例6说明。
是以,本发明较佳方面的生物学定性技术包括:
(i)提供根据药用植物物料有活性的临床症状选择的靶细胞,以该物料的待用样品培养靶细胞;及
(ii)将培养过的细胞于2-D凝胶上作凝胶电泳,观察细胞曝露于试验样品后蛋白质表达的改变结果。
于本发明方法中,上述步骤(i)及(ii)是以植物物料样品进行,此样品具有所需标准的每一性质。于步骤(ii)中观察到的蛋白质表达改变的大体形式定义为该植物物料的标准规格的一部分。然后根据其在上述步骤(i)及(ii)中所作的分析是否给出相同的形式,决定相同植物物料的样品是否可以接受。
于第一步骤中,根据模型的临床适应症,或疾病所需,选适宜的靶细胞。以试验样品将细胞培养后,以二种二维电泳将靶细胞内的蛋白质分离成个别的蛋白质。所得蛋白质花样以电脑化的型像分析技术取得,使用微排序及质谱证实各蛋白质。如有必要,所得结果可作以电脑为基础的花样认知,如主成分分析等,此已于上述。然后,在用试验样品进行靶细胞培养后所检测出的蛋白质表达的变化与用已经对有关临床症状显示出活性的已知样品进行靶细胞培养后检测出的相应变化进行比较。
试验样品的潜在效果可能与医药级的标准相关,此相关关系是以对标准反应反响所必需的试验样品的浓度进行比较而得到的。
另一生物学定性技术是受体结合或酶抑制鉴定。此鉴定可求出植物物料的生物活性定量测量。此种鉴定可根据习用的鉴定方案进行。适宜的鉴定的例子是筛选作为治疗或预防癌或发炎待用植物物料的方法,此法包括测定此物质是否是抑制基因启动区(gene promoter)的刺激,而此基因启动区是与癌或发炎有关的。
在本发明方法中,植物物料一般是源于全植物、植物的一部分、植物萃取物或植物碎片(plant fraction)或由其所构成。较佳是此物料是由植物的一或多种根、叶、芽、花、果、汁及种子构成,或来自此等物料。
植物物料天生的多样性给药物管理局带来特殊的问题,医药管理当局须要确知申请医药证书的待用产物是均一性的,其品质是可证明的。其理由是其剂量及治疗方案都须是能确保的。然而现在尚无一种可靠的系统能测定一种以植物为基础的产物是否符合作为可接受的普遍使用的标准的需求。所以,一方面如上所述的本发明提出了对该问题的解决方案,并提供一种确定治疗物质的医药级标准的方法,此等治疗物质是衍生物自或包括了植物物料的。这方面,此方法包括:
(i)制备一种已知是医药级治疗物质样品的溶液或萃取;
(ii)将此试验溶液或萃取物作二种或多种分析,包括(a)NMR谱分析与以电脑为基础的花样认知技术,及(b)一或多种生物定性技术;
(iii)取得步骤(ii)所得的分析结果;及
(iv)以步骤(iii)所得结果为基础确定出医药级标准规格。
本发明还提供一种制造衍生自或包括植物物料的医药级治疗物质的方法,此法包括:
(i′)制备治疗物质待用样品的试验溶液或萃取物;
(ii′)将该溶液或萃取物作NMR谱及以电脑为基础的花样认知技术的分析;
(iii′)取得步骤(ii′)的分析结果;及
(iv′)如果步骤(iii′)所得结果与步骤(iv)所确立的医药级标准相符,选择此治疗物质为药物。
在所选待用样品除了作NMR谱分析及花样认知分析外还作生物定性时,上述步骤(iv′)以下述步骤代替:
(iv′a)将步骤(i′)所制备的溶液或萃取物作一个或多个生物定性技术分析;
(iv′b)从步骤(iv′a)中每一技术得到结果;及
(iv′c)如果步骤(iii′)及(iv′b)所得结果与上一方法步骤(iv)所建立的医药级标准规格相符,选此治疗物质为医药级。
在这些具体实施例中,NMR谱,花样认知及生物学定性也都可作,如上所述。
下述实例及附图进一步说明本发明,其中:
图1为由实例1所述得自不同供应者的六种人参样品,以因子3(y轴)与因子2(x轴)对比所制成的主成分分析(PCA)分数图。图中所用记号如下:*=供应者1;●=供应者2;+=供应者3;=供应者4;□=供应者5;及=供应者6。
图2显示给克门茶(Kemmun tea)所作的二种HPLC色层分析,使用如比较实例1所述的适于分离儿茶素的系统,其中A代表未处理的茶样品,B代表先用固相萃取柱处理过的茶样品。
图3显示给拉嗓搔重茶(Lapsang Souchong tea)所作的二种HPLC色层分析,使用如比较实例1所述的适于分离儿茶素的系统,其中A代表未处理的茶样品,B代表先用固相萃取柱处理过的茶样品。
图4A及4B为六种不同型的茶所作的以因子2(y轴)与因子1(x轴)相比制成的PCA分图,此六种不同的茶是来自下述实例2。每一型茶的图所用符号如下:
□=乌龙(Oolong);+=克门(Kemmun);=拉嗓搔重茶(LapsangSouchong);●=大吉岭(Darjeeling);*=关普(Gunpowder);◆=阿三(Assam)。
图5为实例3所制的五种不同短舌匹菊(Tanacetum parthenium)(退烧草)的以因子3(y轴)与因子l(x轴)相比制成的PCA分数图。每一样品所用符号如下:
=实例1,*=实例2,□=实例3,●=实例4,=实例5。
图6为在种植后不同时间收获的七种短舌匹菊(Tanacetumparthenium)样品的以因子2(y轴)与因子l(x轴)相比制成的PCA分数图,此七种样品是如实例4所述。所用符号如下:
图7为实例5所分析的传统中药的以因子2(y轴)与因子1(x轴)相比制成的PCA分数图。每一样品所用符号如下:
●=供应者1;*=供应者2;+=供应者3。
图8为下述实例6所制IBR 3人皮成纤维细胞的2-D凝胶蛋白质特性图(银染色),其中A是未处理的对照样品,B是球花醉鱼草(Buddleja globosa)萃取物10微克/毫升处理72小时后的样品。
图9为下述实例6所制IBR 3人皮成纤维细胞的2-D凝胶蛋白质特性图(银染色),其中A是未处理的对照样品,B是球花醉鱼草(Budddleja globosa)萃取物10微克/毫升处理72小时后的样品。
实例1:使用NMR谱及多变数分析区别人参的来源
萃取物的制备
由六个不同的商业供应者购得白人参样品。白人参是来自人参C.A.Meyer的根。将此根短暂泡于沸水内,然后腌于蔗糖汁中。再作曝露于太阳下晒干。白人参也称作糖人参。
此干过的植物根物料用“Illico”搅拌器研磨五分钟成细粉。将一克此细粉于20毫升冷水混合,在室温(22℃)下在150转/分钟的振动器上继续搅拌2小时。用Whatman l号过滤纸过滤萃取物,收集过滤物并冻干过夜。将10毫克样品溶于1毫升氘化的水内供NMR谱分析。以800微升用于NMR谱分析,以样品与TSP以0.00ppm作为内部参考。
NMR谱分析方案
将Bruker DRX 600光谱仪上以600.13MHz质子频率,装有BEST流探针,记录氢-1 NMR谱。以64个20ppm扫描宽度扫描所得结果制成谱,并收集于49152数据点内。每次扫描所用时间为2.0秒。在转换前,用宽度为0.3Hz的线,再将谱作傅里叶(Fourier)转换。以0.00ppm作TSP参考。使用AMIX软件分析NMR将谱线还原为“直方图”,内含0.4ppm宽的地址散列表元(buckets)。
主成分分析
将所得文件在Excel中打开,在此处用整谱的和完成正规化。然后将所得数据用Pirouette软件套件作多变数分析。用平均中心(meancentring)(及自动扫描)作未监视PCA。
结果
将此数据转化成PCA分散图上的点。此即为附图1。此图清楚显示每种人参样品有6个不同的丛集点,从而可说明此技术提供区别相同给定植物物料样品的方法。
比较实例1:
茶萃取物的HPLC分析
所用的茶为克门(Kemmun)及拉嗓搔重(Lapsang Souchong)茶。每一萃取物的HPLC分析是如下制备。
未处理的样品
用Moulinex“Illico”混合器将商业茶样品(50克)磨成细粉约1分钟制成均质样品。取出5克粉在室温(22℃)放在100毫升的玻璃锥形烧瓶内。将50毫升沸蒸馏水倒在茶样品上,用塑料棒搅拌,在室温放置30分钟。用Whatman滤纸过滤出萃取物,收集过滤物并冻干过夜。将10毫克样品溶于1毫升蒸馏水内。
HPLC装置:Hewlett Packard系列II 1090液相色谱仪
HPLC柱:C18 RP Hypersil 5μ,150×4.6毫米
HPLC移动相:甲醇∶水∶正磷酸20∶79.9∶0.1容积/容积,流速0.9毫升/分钟,吸收波长210毫米。
所得的色层分析图列于表2A中(Kemmun)及表3A中(LapsangSouchong)。
处理的样品
用Moulinex“Illico”混合器将商业茶样品(50克)磨成细粉约1分钟制成均质样品,将50毫升沸蒸馏水倒在茶样品上,用塑料棒搅拌,在室温放置30分钟。用Whatman滤纸过滤出萃取物,收集过滤物并冻干过夜。将10毫克样品溶于1毫升蒸馏水内,使在真空下流经反相(RP)C18 Isolute柱。用20毫升作HPLC分析,其法如上述未处理样品HPLC分析的作法。
所得色层分析图为附图2B(克门)及3B(拉嗓搔重)。此等图显示HPLC并不能清楚区别处理的和未处理的茶样品,因为色层分析图2A和2B实际上是相同的,3A和3B也相同。此等图也显示,HPLC没有区别不同型的茶,因为图2和图3的色层分析图相同。
实例2:
利用NMR谱与多变数分析区别茶型
所用茶为关普(Gunpowder),大吉岭(Darjeeling),克门(Kemmun),阿三(Assam),拉嗓搔重茶(Lapsang Souchong)及乌龙(Oolong)。。此等茶的未处理的及处理的样品如前述比较实例1制备。
NMR谱分析及主成分分析方案
将10毫克茶样品溶于1毫升氘化的水(D2O)内。用800微升作NMR谱分析,各样品于0.00ppm作内部参考至TSP。每一茶萃取物作实例1所述方法试验。
结果
将数据转化成两个分数图上的点。此即为附图4A及4B。图4B显示处理过的茶萃取物的六种不同的点丛集,而图4A显示处理前的茶的不良丛集。
此NMR谱/PCA技术的区别能力远强于比较实例1所用的HPLC的区别能力。
实例3:
利用NMR谱与多变数分析区别商业草药样品
萃取物的制备
由三个不同的制造厂购得市场上可购得的退烧草胶囊[短舌匹菊(Tanacetum parthenium)]。此等制品表面上相同,为硬明胶胶囊,含“标准化的”退烧粉。
取五个样品,每个样品含10粒胶囊。一个样品取自制造者A。二个样品,各批号相同,取自制造者B。二个样品,各批号不同,取自制造者C。
样品编号 | 制造者 | 批号 | 胶囊内容物 |
1 | A | I | 500毫克 |
2 | B | II | 384毫克 |
3 | B | II | 384毫克 |
4 | C | III | 380毫克 |
5 | C | IV | 380毫克 |
将每一样品的胶囊内容物置于Moulinex“Illico”混合器内,将物料磨成细粉二分钟,成为均质样品。将500毫克粉溶于50毫升冷水内制成作NMR谱分析用的萃取物,将此萃取物在室温(22℃)在摇动器内以150转/分钟搅拌四小时。此混合物用Whatman一号滤纸过滤,收集过滤物,冻干过夜。
NMR谱分析及主成分分析方案
每一萃取物用实例1所述方法分析。
结果
将各数据转变成分数图上的点(平均值)。此即为图5,其中每一点对应于一粒胶囊。此图显示样品1,4及5具有良好丛集,反映此等批量的产品的个别胶囊有一致性。样品2及3的丛集不佳,反映此产品各胶囊间有较大差异。此图也清楚显示同一制造厂的不同批号的同一产品有明显不同(样品4及5),虽则声称此等产品是相同的。
实例4:
NMR谱分析及主成分分析在区别不同成熟度的短舌匹菊 (Tanacetum parthenium)样品上的用途
植物样品的培养及收获
此药用植物短舌匹菊(Tanacetum parthenium)是用购自C.N.Seeds,Ely,UK有保证的种子在英国种植。于4月18日种上,并在玻璃下培养。4月25日发芽,在5月24日插于划成方格的地上以便随机取样。
由地里采取五分样品,每份包括4株植物,采取时间各不相同,以供分析。最后收获时多采取二份样品,冰冻储存,于收获后一及二个月分析。收获样品的日期如下:
样品编号 | 收获日期 |
T0 | 6月30日 |
T1 | 7月14日 |
T2 | 8月4日 |
T3 | 8月19日 |
T4 | 9月18日 |
T5 | 9月18日,储存至10月13日 |
T6 | 9月18日,储存至11月10日 |
萃取物的制备
收集干燥植物物料,立即置于-20℃的冰冻器内。冰冻后,将物料置于冷冻干燥器内12小时,然后检查样品确保是干燥的。将物料置于Moulinex“Illico”混合器内,磨成细粉二分钟,成为均质样品。将500毫克植物物料溶于50毫升冷水内制成作NMR谱分析用的萃取物,将此萃取物于室温(22℃)于摇动器内以150转/分钟搅拌四小时。此混合物用Whatman一号滤纸过滤,收集过滤物,冻干过夜。
NMR谱分析及主成分分析方案
将10毫克上述样品溶于1毫升氘化的水内供NMR谱分析。用800微升作NMR谱分析,以0.00ppm以样品作内部参考。此法如实例1所述。
结果
将此数据转化成PCA分数图上的点(平均值)。此即为附图6。此清楚显示不同样品有清楚的丛集点。此结果显示,植物内的代谢变化,例如随成熟度而起的变化,可用PCA图代表。是以本发明方法提供区别不同生理状态的植物物料样品的方法,以此例言即区别其不同的成熟度。
实例5:
NMR谱分析及多变数分析在区别植物物料混合物上的用途
由三个不同的供应商取得称作六味黄丸(Liu Wei Huang Wan)的传统中药(注明为1,2及3)。
萃取物的制备
将每一供应商的锭各100粒分成10组,称其重量。将各组以杵及臼捣碎,再将1克形成的粉移入玻璃烧瓶内。然后加水(100毫升)于粉上,将此混合物回流30分钟。将此溶液冷却,过滤,冻干。
NMR谱分析及主成分分析
取10毫克上述制备的样品溶于1毫升氘化的水内。以实例1所述方法进行。
结果
将此数据转化成PCA分数图上的点(平均值)。此即为附图7。有清楚的点丛集对应于三供应商的样品。此结果显示,本发明方法能成功地区别看起来相同的多成分植物物料样品。
参考实例1:
醉鱼草(Buddleja spp)试验萃取物的制备及球花醉鱼草 (Buddleja globosa)对人皮成纤维细胞影响的测定
据报告,球花醉鱼草(Buddleja globosa)是具有伤口愈合性质的植物,因此是临床上常用的草药。为要确证此植物具有与此有关的生物学活性,决定选此植物作为实例6所用蛋白质组学分析的待用者,此分析可测定其是否于活体外刺激细胞生长,此法如Hughes andCherry(1997)于Wound Repair and Regeneration 5:159-167所述。为比较起见,也使用了同属的其他不同种的植物(大叶醉鱼草[Buddlejadavidii]),此等植物对伤口愈合有较少影响。使用草作为对照。
萃取物的制备
将球花醉鱼草(Buddleja globosa),大叶醉鱼草(Buddleja davidii)及草的新鲜叶(50克)分别于一公升蒸馏水内在回流下加热一小时。将萃取物冷却,用Whatman一号滤纸过滤,收集过滤物,冻干12小时。将干萃取物(10毫克)溶于水(1毫升)内,用0.2微米过滤器过滤。此萃取物以1∶1000稀释入Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM)内使成为终浓度为10微克/毫升的溶液。此溶液以DMEM稀释至1∶1,制成5毫克/毫升的溶液。
人皮成纤维细胞鉴定
将得自后耳手术的人皮成纤维细胞(HDfs)于37℃于5%CO2下在加有10%胎牛血清(FCS),0.02%两性霉素B及1%青霉素及2%链霉素的Dulbeccos Modified Eagle Medium(DMEM)内培养。任HDfs生长至会合1-5天,以磷酸盐缓冲的生理盐水(PBS)洗后,用0.025%胰蛋白/EDTA由培养瓶取出。将HDfs倾入50毫升灭菌普通液内,再悬浮于50毫升DMEM内,然后以2700转/分钟离心5分钟。再将HDfs悬浮于10毫升DMEM内,用血球计数器计数。作鉴定前24小时将HDfs种于含10%FBS的DMEM的碟内。鉴定使用4×103细胞/微滴定穴的接种密度。
24小时后吸出介质。先将球花醉鱼草(Buddleja globosa)萃取物以10毫克/毫升的浓度溶于水内,再稀释入含0.5% FCS(0.5% FCS为HF生长的维持量,10%为刺激量)的DMEM内,使其终浓度为5,10及100微克/毫升(n=8作为对照及处理)。
以0.2微米的灭菌过滤器过滤后,将萃取物加在含200微升介质的碟内。加醉鱼草(Buddleja)萃取物后使细胞与萃取物保持接触24及72小时。在此二时间点收集上述三种不同浓度的细胞。用下述方法以中性红鉴定细胞。
中性红鉴定
将1.2毫升中性红染料加在78.8毫升Hanks′平衡盐溶液(HBSS)内。在37℃培养10分钟,然后以2600转/分钟离心5分钟,将100微升加在每一穴内,将此碟培养2.5小时,然后倾出介质,先用100微升1%的甲酸洗此细胞,再用100微升1%的醋酸洗。将微滴定碟置于AnthosHill读碟机上,摇动15秒,于550毫微米读剩余细胞的吸光度。通过比较细胞加萃取物的吸光值(吸光值可转换成生长百分比)及对照(0.5%)的吸光值测定出生长百分比。
结果
表:植物萃取物对IBR 3人皮成纤维细胞(HDf)生长的影响
5微克/毫升 | 在550毫微米的吸光值 | ||
第一天 | 第二天 | 第三天 | |
球花醉鱼草#1 | 0.118 | 0.14 | 0.18 |
球花醉鱼草#2 | 0.115 | 0.168 | 0.19 |
大叶醉鱼草 | 0.13 | 0.137 | 0.19 |
草 | 0.135 | 0.14 | 0.2 |
0.5% FCS | 0.18 | 0.21 | 0.24 |
10% FCS | 0.21 | 0.3 | 0.32 |
10微克/毫升 | 在550毫微米的吸光值 | ||
第一天 | 第二天 | 第三天 | |
球花醉鱼草#1 | 0.235 | 0.25 | 0.26 |
球花醉鱼草#2 | 0.115 | 0.165 | 0.17 |
大叶醉鱼草 | 0.14 | 0.182 | 0.2 |
草 | 0.14 | 0.151 | 0.19 |
0.5% FCS | 0.18 | 0.21 | 0.24 |
10% FCS | 0.21 | 0.3 | 0.32 |
100微克/毫升 | 在550毫微米的吸光值 | ||
第一天 | 第二天 | 第三天 | |
球花醉鱼草#1 | 0.14 | 0.142 | 0.142 |
球花醉鱼草#2 | 0.148 | 0.151 | 0.125 |
大叶醉鱼草 | 0.12 | 0.1 | 0.15 |
草 | 0.138 | 0.18 | 0.21 |
0.5% FCS | 0.18 | 0.21 | 0.24 |
10% FCS | 0.21 | 0.3 | 0.32 |
此等结果显示,球花醉鱼草(Buddleja globosa)于5微克/毫升及10微克/毫升的中等浓度时,对人皮成纤维细胞的生长有剌激效果,而于100微克/毫升时其效果较小。并可看出此效果维持超过72小时。在较低浓度时的效果是可以再现的,因为同一植物物种的二种不同的萃取物产生类似的结果。反之,大叶醉鱼草(Buddleja davidii)的效果则较低。是以,其活性是因物种而异的,此证实在开发植物萃取物上选择类似待用物时人与植物的关系信息的价值。对照物草的效果则很低。
由于球花醉鱼草(Buddleja globosa)在促进人成纤维细胞的生长上可用作下实例6所述的蛋白质分析技术的适宜的待用植物萃取物。此一活体外鉴定的结果也有助于于蛋白质分析所用的IBR 3 HDf作为靶细胞系的选用。
实例6:
球花醉鱼草(Buddleja globosa)于人皮成纤维细胞蛋白质表 达效果的蛋白质组分析
材料及方法
细胞培养物
用T & 5烧瓶(TPP塑料)于DMEM+10% FCS(Sigma)内培养IBR 3人皮成纤维细胞。将约50毫克干球花醉鱼草(Buddlejaglobosa)萃取物溶在5毫升二次蒸馏水内,制成10毫克/毫升的基础液。此基础液用0.2微米的过滤器过滤,将5毫升在5毫升DMEM+10%FCS(即1∶1000稀释液)稀释成10微克/毫升的溶液。此再在DMEM+10%FCS内作1∶1稀释,成为5微克/毫升的溶液。
用下列各萃取物试验浓度:0微克/毫升,5微克/毫升,10微克/毫升各以一个T75烧瓶培养细胞24小时或3天(总烧瓶数=6)。
用六穴的碟(Costar)给放射标记的培养物,每一萃取物浓度(0微克/毫升,5微克/毫升,10微克/毫升)用2个穴。将[35S]-标记的甲硫胺酸每穴250微居里于无甲硫胺酸的介质内,培养细胞24小时。所有的培养都于37℃在CO2培养器内进行。
2-D电泳
培养完后,T75烧瓶内的细胞用2×5毫升PBS及1×5毫升0.35的蔗糖洗涤,收信200微升细胞溶解缓冲液(9.5M尿素,1% DTT,2% CHAPS,0.8% Pharmalyte pH 3-10 [Pharmacial])内。6-穴碟内每一穴内的细胞用2×2毫升PBS,1×2毫升0.35M的蔗糖洗涤,收入35微升细胞溶解缓冲液内。所有样品都储在-20℃待用。
使用修正的Bradford鉴定测定蛋白质浓度,以萤光计数测定放射活性。由于蛋白质量太少,须以未标记的细胞作丙酮沉淀。完成此步骤后,蛋白质浓度即在鉴定参数范围内,可获准确样品负载。
等电点聚焦
将50微克未标记的蛋白质及1×106CPM标记的蛋白质加在再卖溶液(8M脲,0.5% CHAPS,0.2% pharmalyte pH 3-10[Pharmacia])内,使其最终容积为450微升,用以再膨胀固定pH梯度(IPG)条(即凝胶内脱水)。对于每一萃取条件都用覆盖pH 3-10NL(非线性)及pH 4-7L(线性)范围的IPG条。再膨胀过夜后,将IPGs以0.05mA/条20℃下作60千伏小时聚焦。
2-D电泳
在已聚焦的IPGs作第二维电泳前,先于含1%二硫苏糖醇(DTT)的缓冲液(1.5m Ttis[pH 8.8],6M脲,30%甘油,2%SDS,0.01%溴酚蓝)平衡15分钟制成条,再以含4.8%碘乙酰胺(IAA)的缓冲液平衡15分钟。
用12% T/2.6%C分离凝胶于Hoefer DALT系统内过夜完成SDS-PAGE(20毫安培/凝胶,10℃)。
观察
第二维完成后,将各凝胶置于蛋白质固定液(50%,甲醇,10%醋酸)内过夜,第二天用银染色套件(Daiichi)染色。放射性的凝胶也作类似的固定,但不作银染色且是置于“凝胶干燥”液(3%甘油,30%甲醇)内过夜。然后用Savant凝胶干燥器将凝胶于3 MM纸(Whatman)上干燥,并曝露于BioMax底片(Kodak)总共10天。
将底片于AGFA加工机内显影。
作银染色或底片显影后,将凝胶或底片用Molecular DynamicsPersonal Densitometer SI于100微米扫描解析,使用ImageQuant(Molecular Dynamics)观察影相。用PDQuest(Bio-Rad)作电脑分析,此种电脑宜于使影相作排列,标记,配合及定量分析。
24小时时间点
(1)以250微居里[35S]-甲硫胺酸给细胞作放射标记
(2)未标记的细胞作银染色(每一样品用2×75公分2烧瓶)
72小时时间点
(1)未标记的细胞作银染色(每一样品用2×75公分2烧瓶)
2-DE:第一维:
使用含盖二种不同pH的IPG条
(1)pH 3-10 NL条
(2)pH 4-7条
第二维:
12% SDS-PAGE
样品负载:50微克蛋白质作银染色
106每分钟周数作自动放射线照相
结果
球花醉鱼草(Buddleja globosa)萃取物对人皮成纤维细胞的蛋白质表达的影响见下表:
球花醉鱼草萃取物(微克/毫升) | 24小时点增加>2-倍 | 24小时点减少>2-倍 | 3天点增加>2-倍 | 3天点减少>2-倍 |
5 | 19 | 24 | 31 | 39 |
10 | 33 | 51 | 39 | 32 |
配合的总蛋白质点数:850
附图8及9显示蛋白质点的例子,此等点表示对球花醉鱼草(Buddleja globosa)萃取物的反应所致的表达型的改变。图8说明以10微克/毫升萃取物处理72小时后蛋白质减少的区,而图9说明以10微克/毫升萃取物处理72小时后蛋白质减少的区。在此二图中A都代表未处理器的对照组,而B代表处理的样品。
此等结果显示蛋白质分析技术可用于证实相关的生物活性是以依浓度而定的方式存在。本文说明球花醉鱼草(Buddleja globosa)在改变人皮成纤维细胞内蛋白质表达上是有效的。
Claims (14)
1.确定药用植物材料标准规格的方法,该方法包括:
(i)选择已知具有特定希望性能的药用植物材料的样品作为标准样品,
(ii)制备所述标准样品的测试溶液或测试萃取物;
(iii)将所述溶液或萃取物经受两种或多种分析方法,包括(a)NMR波谱和基于计算机的花样识别的组合,所述组合包括对所述溶液或萃取物进行NMR波谱分析,记录一种或多种NMR谱并对所述一种或每一种NMR谱的数据进行多变量分析,以及(b)一种或多种生物学定性技术,该技术提供植物生物学效果的定量度量,其包括蛋白质组学分析;
(iv)从步骤(iii)使用的分析方法得到结果;以及
(v)在步骤(iv)得到的结果的基础上确定所述植物材料的标准规格;
如此进行该方法,使进行多变量分析的NMR数据反映植物材料中对使用的NMR技术有反响的化合物的总体情况。
2.提供符合如权利要求1的方法所确定的材料标准规格的希望的药用植物材料样品的方法,该方法包括:
(i’)制备药用植物材料待测样品的测试溶液或测试萃取物;
(ii’)将所述溶液或萃取物经受两种或多种分析方法,包括(a)NMR波谱和基于计算机的花样识别的组合,所述组合包括对所述溶液或萃取物进行NMR波谱分析,记录一种或多种NMR谱并对所述一种或每一种NMR谱的数据进行多变量分析,以及(b)一种或多种生物学定性技术,该技术提供植物生物学效果的定量度量,其包括蛋白质组学分析;
(iii’)从步骤(ii’)的分析得到结果;以及
(iv’)按照在步骤(iii’)的结果是否符合如权利要求1中所定义方法的步骤(iv)中确定的所述材料的标准规格,来选择待测的样品;
如此进行该方法,使进行多变量分析的NMR数据反映植物材料中对使用的NMR技术有反响的化合物的总体情况。
3.权利要求1或2的方法,还包括将多变量分析的结果在分数图上表示为一个或多个点。
4.权利要求1或2的方法,其中所述多变量分析是主组分分析(PCA)。
5.权利要求1或2的方法,其中蛋白质组学包括:
(i)按照药用植物具有活性的临床指征提供选择的靶细胞,并用测试溶液或测试萃取物培养该靶细胞;以及
(ii)将培养的细胞经受在二维凝胶上的凝胶电泳,并观察细胞中蛋白质表达的变化,作为在所述溶液或萃取物中曝露的结果。
6.权利要求1或2的方法,其中药用植物材料包括或得自全植物,植物的一部分、植物萃取物或植物碎片。
7.提供药用植物材料标准规格的方法,该方法包括:
(i″)选择已知具有特定希望性能的药用植物材料的样品作为标准样品,
(ii″)制备该标准样品的测试溶液或测试萃取物;
(iii″)将该测试溶液或测试萃取物经受NMR波谱分析,并记录一种或多种波谱;
(iv″)将从所述的一种或每一种NMR波谱得到的数据进行多变量分析,在分数图上产生一个或多个点,所述数据反映了植物材料中对使用的NMR技术有反响的化合物的总体情况;以及
(v″)在步骤(iv″)所产生的点的周围确定可接受的范围,作为所述植物材料标准规格或作为该标准规格的一部分。
8.权利要求7的方法,其中用无监督方法进行步骤(iv″)的多变量分析。
9.提供符合如权利要求8的方法所确定的材料标准规格的希望的药用植物材料样品的方法,该方法包括:
(i)制备所述植物材料待测样品的测试溶液或测试萃取物;
(ii)将该测试溶液或测试萃取物经受NMR波谱分析并记录下一种或多种NMR波谱;
(iii)将从所述的一种或每一种NMR波谱得到的数据进行多变量分析,在分数图上产生一个或多个点,所述数据反映了植物材料中对使用的NMR技术有反响的化合物的总体情况;以及
(iv)如果按照在步骤(iii)中的分数图上产生的点落在权利要求8的方法的步骤(v″)确定的可接受范围内,则选择待测样品作为符合所述标准规格的希望的样品。
10.按照权利要求中7、8或9的方法,其中所述植物材料来自或包括两种或多种不同植物的混合物。
11.按照权利要求10的方法,其中所述混合物是来自使用植物混合物或植物萃取物的传统医药系统的药物。
12.按照权利要求11的方法,其中传统医药系统是传统中药或印度医药。
13.按照权利要求1、2、7或9的方法,其中所述标准样品是已知来源的经证实或核查过的植物材料的样品。
14.确定药用植物材料标准规格的方法,该方法包括:
(i)选择已知具有特定希望性能的药用植物材料的样品作为标准样品,
(ii)制备所述标准样品的测试溶液或测试萃取物;
(iii)将所述溶液或萃取物经受两种或多种分析方法,包括(a)NMR波谱和基于计算机的花样识别的组合,所述组合包括对所述溶液或萃取物进行NMR波谱分析,记录一种或多种NMR谱并对所述一种或每一种NMR谱的数据进行多变量分析,以及(b)一种或多种生物学定性技术,该技术提供植物生物学效果的定量度量,其包括蛋白质组学分析;所述蛋白质组学分析包括
(a’)按照该药用植物具有活性的临床指征提供选择的靶细胞,并用测试溶液或测试萃取物培养该靶细胞;以及
(b’)将培养的细胞经受在二维凝胶上的凝胶电泳,并观察细胞中蛋白质表达的变化,作为在所述溶液或萃取物中曝露的结果;
(iv)从步骤(iii)使用的分析方法得到结果;以及
(v)在步骤(iv)得到的结果的基础上确定所述植物材料的标准规格;
如此进行该方法,使进行多变量分析的NMR数据反映植物材料中对使用的NMR技术有反响的化合物的总体情况。
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