DE4300222C2 - Phosphopeptide und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Phosphopeptide aus Kalbsthymuszellker­ nen, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung.

Es ist bereits bekannt, daß DNA aus Kalbsthymuszellkernen trotz aufwendiger Reinigungsverfahren einen Restgehalt an Phosphopeptiden aufweist, der von unterschiedlichen Autoren im Bereich zwischen 0,7 bis etwa 2% angegeben wird. Dieses restliche Proteinmaterial ist so fest an die DNA gebunden, daß man davon ausgeht, daß diese Proteine nicht als Verunreinigung anzusehen sind, sondern mindestens teilweise mit der DNA in kovalent gebundener Form vorliegen. DNA aus Kalbsthymuszellkernen, im folgenden N-DNA genannt, ist sehr eng, sei es chemisch oder physikalisch, mit Peptiden verbunden, die durch ihren hohen Gehalt an Phosphoaminosäuren auffallen. Allerdings lassen sich diese Phosphopeptide aus der N-DNA nur in äußerst kleinen Mengen gewinnen, so daß eine nähere Untersuchung bisher noch nicht durchgeführt werden konnte.

Es ist aber bekannt, daß eine andere Gruppe relativ niedermolekula­ rer Peptide, die als Deprimerone bezeichnet werden, sich aus Kalbs­ thymus und aus der DNA der Zellkerne durch alkalische Extraktion isolieren lassen. Diese Deprimerone sind aber nicht phosphoriliert, aber sie zeigen Antitumoraktivität, nämlich eine negative Wirkung auf Transkription, Translation und Replikation.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, zu versuchen, aus Zellker­ nen aus Kalbsthymus weitere Peptide zu isolieren, die eine Antitu­ moraktivität zeigen.

Zur Lösung der Aufgabe werden Phosphopeptide mit den im Hauptanspruch angegebenen kennzeichnenden Merkmalen sowie Verfahren zu deren Herstellung vorgeschlagen.

Überraschenderweise hat sich herausgestellt, daß sich Phosphopeptide nicht nur aus der N-DNA, sondern direkt aus den ganzen Zellkernen von Kalbsthymus isolieren lassen und daß bestimmte Fraktionen dieser Phosphopeptide selektiv gegen die Proliferationen von Tu­ morzellen wirksam sind, aber dabei keine Auswirkungen auf die normale Zellpopulation zeigen.

Die Isolierung der Phosphopeptide aus Kalbsthymusgewebe erfolgt nach Isolierung und Reinigung der Zellkerne bei Temperaturen um etwa -10 bis -15°C durch Dialyse, nachdem die Zellkerne in an sich bekannter Weise durch Zugabe von EDTA und Natrium-dodecylsul­ fat lysiert worden waren. Die Dialyse wird bei -4° bis 0°C gegenü­ ber 30%-igem Glycerin mehrfach wiederholt. Die vereinigten Dialy­ sate werden durch Anionenaustauscherchromatographie gereinigt und schließlich zur Entfernung von zweiwertigen Metallionen mit Ionenaustauscher und Natrium-nitrilotriacetat behandelt.

Im Vergleich zu der Extraktion von Phopsphopeptiden aus N-DNA ergibt die Extraktion aus Zellkernmaterial eine etwa um das 50- fach höhere Ausbeute.

Die so erhaltenen Phosphopeptide lassen sich durch Anionenaus­ tauscherchromatographie fraktionieren und desgleichen kann eine Fraktionierung nach dem Molekulargewicht durch Gelchromatographie erfolgen.

Bei der Anionenaustauscherchromatographie stellt sich heraus, daß die gewonnene Peptidmischung im wesentlichen aus zwei größeren Fraktionen besteht, die im folgenden als P1 und PS bezeich­ net werden. Gelchromatographie ergibt, daß die Fraktion P1 in wässriger Lösung ein Molekulargewicht von etwa 9950 aufweist. Qualitative und quantitative Analyse der Aminosäurezusammensetzung ergibt, daß die Fraktion P1 einen Gehalt an Phosphoserinkomplexen, Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Lysin und Arginin im Mol-Verhältnis von 31 : 6 : 1 : 2 : 8 : 13 : 4: 2 : 1 : 3 : 1 : 1 aufweist. Die Summe der Molgewich­ te dieser Aminosäuren beträgt theoretisch 10 262; die Differenz ist exmperimentell begründet.

Für die Fraktion P5 ergibt sich praktisch die gleiche Zusammensetzung in den entsprechenden Mol-Verhältnissen, außer daß die Phosposerin­ komplexe doppelt so hoch sind wie in der Fraktion P1. Bei den Untersuchungen hat sich herausgestellt, daß Phosphoserin zu einem Teil nicht in freier Form, sondern als Komplex mit zweiwertigen Metallionen vorliegen muß. Wenn man nämlich Phosphoserin und Mag­ nesiumsulfat 3 Wochen bei 4°C stehen läßt und anschließend mit 6 N HCL hydrolisiert, ergibt eine Fraktionierung vergleichbare R_f-Werte wie sie auch bei der Fraktionierung der Phosphoserinkomplexe selbst erhalten werden. Diese Komplexe werden durch Behandlung mit Ionenaustauscher und NTA wieder zerstört, so daß freies Phospho­ serin nachweisbar ist. Interessant ist in diesem Zusammenhang, daß freies Phosphoserin im Hydrolyseversuch mit 6 N HCL zerstört wird, während die Magnesiumkomplexe selbst nach 24 Stunden bei 130°C stabil sind.

Die erfindungsgemäßen Phosphopeptide weisen eine deutliche Anti­ tumorwirkung auf, wobei in Vorstudien festgestellt wurde, daß die Wirkung bei Zugabe von Magnesiumsulfat und Magnesium ATP deut­ lich ansteigt. Bei der Messung der Reduktion der Zellproliferation von L-1210 Tumorzellen wurde daher mit einer Mischung der jeweili­ gen Substanzmenge in 4,45 mM ATP (M steht im folgenden für mol/l) und 8,9 mM Magnesiumsulfat gear­ beitet. Es wird vermutet, daß die Zugabe der Magnesiumverbindungen den Eintritt der Phosphopeptide in die Zellen erleichtert, da bekannt ist, daß Magnesium-ATP die Zellwandpermeabilität steigert. Die Versuche wurden mit den nativen Phosphopeptidfraktionen durch­ geführt sowie auch mit solchen, die vorher mit 1 M HCL behandelt worden waren. In den Walker Carcinoma Zellen führte die Behandlung mit nativer Fraktion P1 mit Magnesiumzusatz zu einer Verringerung der Aufnahme von ³H-Thymidin, ausgedrückt in Prozent Aufnahme der Probe im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle, zu 76,7%; bei mit 1 N HCL behandelter Fraktion P1 wurde die Aufnahme von ³H-Thymidin auf 63,6% gesenkt. Eine Zugabe von Peptiden der Fraktion 5 zu der mit Salzsäure behandelten Fraktion 1 verringerte die Aufnahme von ³H-Thymidin auf 46,8%. Ähnliche Werte wurden bei Parallelversuchen bei L-5178Y Tumorzellen festgestellt.

Weitere Untersuchungen haben ergeben, daß die Fraktion P1 nachbe­ handelt mit 1 N Salzsäure bei 95°C während einer Zeitdauer von 10 Minuten und anschließender Fraktionierung an einer Anionenaustau­ schersäule einen Aufbau aus 4 Untereinheiten, und zwar 3 großen und einer kleinen, aufweist. Die Molgewichte der 3 großen Untereinheiten betragen etwa 4095, 4442 und 4106 einschließlich und etwa 2800, 2592 und 2256 ohne Phosphoserine. Eine Behandlung mit diesen Untereinheiten der Fraktion P1, also nach einer Salz­ säurebehandlung, ist wirksamer als mit der nicht vorbehandelten Fraktion P1 bei Carcinomzellen. Die Feststellung, daß die Repli­ kation in normalen Zellen durch Zugabe der Untereinheiten der Fraktion P1 nicht beeinflußt wird, läßt den Schluß zu, daß die Spaltung des Phosphopeptidkomplexes P1 in normalen Zellen deutlich höher ist als in Turmorzellen, so daß die Menge an Untereinheiten ausreicht, die normale Zellproliferation zu kontrollieren. Tumor­ zellen, die vielleicht einen Defekt an einem entsprechenden Enzym­ system aufweisen, sind zu dieser Spaltung nicht oder nur verringert in der Lage und dies würde zu einer entsprechenden Verringerung der inhibitorischen Effekte der Untereinheiten und damit zu einer Zunahme des Zellwachstums führen. Dieses entartete Zellwachstum kann dann aber durch Zugabe der gespaltenen Fraktionen P1 bzw. der Untereinheiten reguliert bzw. reduziert werden.

Die Ergebnisse der Impulscytophotometrie zeigen, daß sowohl die behandelte wie auch die nicht vorbehandelte Fraktion P1 und Frak­ tion PS im Vergleich zur Kontrolle ohne Phopsphopeptide die An­ zahl der Zellen in der frühen S-Phase sehr stark und im geringe­ ren Ausmaß in der G₂-Phase verringern. Dieses Resultat zeigt, daß die Phosphopeptide die DNA-Synthese primär am Beginn der S- Phase verhindern oder, mit anderen Worten, daß die Phosphopeptide an den Stellen des Beginns der DNA-Replikation wirksam sind.

Aufgrund der bisherigen Ergebnisse und der Tatsache, daß Phospho­ peptide aus der DNA nur mit Hilfe eines Chelatisierungsmittels und einer wirksamen Dialyse entfernt werden können, ist anzuneh­ men, daß die Phosphopeptide, und zwar ohne Unterbrechnung des DNA-Rückgrates mit großer Affinität nach außen hin an einem Strang der DNA gebunden sind und eine starke Brückenbildung durch zwei­ wertige Metallionen zwischen den negativen Gruppen der Phosphopep­ tide und jener der DNA zur Stabilisierung erfolgt. Die Analyse von N-DNA hat ergeben, daß diese Ionen der Übergangsmetalle Zink und mangan im zweiwertigen Zustand enthält. Außerdem ist anzunehmen, daß die Phosphopeptide sich an bestimmte Stellen anlagern und der DNA die für die Replikation notwendigen Polymerasen, Enzyme und andere Faktoren zuführen. Die einzelnen Untereinheiten der Phosphopeptidfraktionen scheinen sich fest an bestimmten Stellen der Initiation der Replikation der DNA in den Tumorzellen zu bin­ den und damit diese Stellen für die Proliferation zu blockieren. Im Gegensatz zu Adriamycin, das als bekanntes Antitumormittel als Vergleichssubstanz mit untersucht wurde, und das die Cytostase durch einen mit den Proteinen assoziierten Mechanismus der direkten Brüche im DNA Einzelstrang verursacht, zeigen die Phosphopeptide und ihre Untereinheiten einen Mechanismus, der keine DNA Schädi­ gung oder letale toxische Effekte auslöst, sondern eine Normali­ sierung der Proliferationsgeschwindigkeit bewirkt.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Beispiele näher erläu­ tert:

Beispiel 1: Herstellung der Phosphopeptide

Thymusgewebe vom Kalb wird unmittelbar nach der Schlachtung in flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Nach der Zerkleinerung des Gewebes im gefrorenen Stadium werden die Zellkerne bei Tempera­ turen zwischen -10 bis -15°C im SGC-Medium (Saccharose/Glycero­ phosphat/Citrat) in 40% Glycerin (V/V) isoliert und gereinigt. Nach dem Abzentrifugieren der Kerne aus dem Lagermedium bei 18000 rpm für eine Zeitspanne von 10 Minuten werden die Kerne disper­ giert und von locker gebundener RNA und Eiweißen durch Extraktion bei -2 bis -5°C gereinigt. Der Bodensatz der Kerne wird zu diesem Zweck mit 0,06 M NACL Lösung in 30%-igem Glycerin gewaschen, in 120 ml dieser Lösung suspendiert und 10 Minuten bei 10000 rpm zentrifugiert. Der Bodensatz wird dann in 240 ml 0,055 M-Phosphat/1 mM EDTA in 30%-igem Glycerin bei pH 7 dispergiert. Die Dispersion läßt man 1 Stunde stehen und zentrifugiert dann 10 Minuten bei 10000 rpm. Der Bodensatz wird erneut in 50 ml 0,055 M Phosphat/l nM EDTA/30% Glycerin aufgenommen und wird dann in eine Dialyse­ tasche zusammen mit 6 ml des obengenannten Waschwassers einge­ bracht, wobei die Membran in einen doppelwandigen Zylinder einge­ setzt wird. Die Temperatur der Kühlflüssigkeit in der äußeren Wandung des Zylinders wird auf -4°C einreguliert.

Die Kerne werden dann durch Zugabe von 6,2 ml 0,5 M EDTA mit pH 8,8 (Endkonzentration EDTA 0,05 M) und 0,63 ml einer 30%-igen Lösung von Natrium-dodecylsulfat in Ethanol/Wasser im Verhältnis 1 : 1 (Endkonzentration 0,3%) unter ständigem Rühren lysiert. Die Suspension wird dann 2 Tage bei -4°C ohne Dialyse stehengelassen. Die erste Extraktion erfolgt bei -4°C gegen 700 ml 30%-iges Gly­ cerin über Nacht. Das Dialysat wird dann aus der Kammer absipho­ niert und durch den gleichen Schlauch eine 500 ml Portion frisches Wasser zugegeben. Die Temperatur der Kühlflüssigkeit wird auf 0°C eingestellt. Dieser Vorgang wird in gleicher Weise 7 × wieder­ holt.

Die Dialysate werden dann auf eine Anionenaustauschersäule (Dowex 2 Säule) aufgebracht und chromatographiert. Nach dem Chromatogra­ phieren wird jede Dialysatfraktion mit 0,01 M Natrium-nitrilotri­ acetat (NTA) in Gegenwart eines chelatbildenden Ionenaustauschers (Chelex-100) bei einem pH von 1,5 versetzt. Die Suspension wird über Nacht stehengelassen und die Phosphopeptide vom Ionenaustauscher durch Elution mit 1 M NH₄OH bei pH 9 abgetrennt.

Die so erhaltene Peptidmischung wurde dann in an sich bekannter Weise durch Anionenaustauscherchromatographie weitergereinigt. Die R_f-Werte der Fraktion P1 liegen bei 0,203 und die Fraktion PS bei 0,246.

Die Molekulargewichtsbestimmungen dieser beiden Fraktionen wurden mit Hilfe der Gelchromatographie durchgeführt (Säule 60 × 1 cm mit Sephadex G 10; destilliertes Wasser mit Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/Minute). Zur Kalibrierung der Säule wurden die Peptide Angiotensin I, Eledoisin, Kallidin und reines Phosphoserin unter gleichen Bedingungen benutzt. Das Molekulargewicht ergab sich für die Fraktion P1 mit 9950 und für die Fraktion PS mit 18630 Dalton.

Beispiel 2: Bestimmung des Aminosäuregehaltes

Nach der Entionisierung der Dialysate mit Ionenaustauscher und NTA wurde der qualitative und quantitative Aminosäuregehalt in an sich bekannter Weise nach dem Verfahren von Welsh in Biochem. Biophys. Res. Comm. 163, 1135-1142 bestimmt. Bei der Auswertung der Mol-Verhältnisse aus den Flächen unter den Peaks im Fraktio­ nierungsdiagramm (A₄₄₀ als Funktion der Zeit) unter Verwendung von Ninhydrin wurde die Bewertungstabelle von Moore et al. Analyt. Chem. 30, 421 zugrunde gelegt.

Die Fraktion P1 wies einen Gehalt an Phosphoserinkomplexen, Aspa­ raginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Lysin und Arginin im Mol-Verhältnis von 31 : 6 : 1 : 2 : 8 : 13 : 4 : 2 : 1 : 3 : 1 : 1 auf. Hierbei werden unter Phosphoserinkomplexe freie Aminosäure und deren Verbindungen mit zweiwertigen Kationen zusammengefaßt.

Bei der Fraktion PS ergab sich praktisch die gleiche Zusammensetzung und das gleiche Mol-Verhältnis, allerdings mit der Ausnahme, daß der Gehalt an Phosphoserinkomplexen doppelt so hoch lag.

Beispiel 3: Prüfung der Antitumorwirksamkeit

Die biologische Aktivität der beiden Fraktionen wurde an transplan­ tierten Walker Carcinoma-256 und gesunden Knochenmarkzellen getestet. Die Walker Carcinomazellen wurden nach dem Verfahren von Volm et al., Blut 35, 65-74, isoliert. Als Kontrolle dienten Knochenmark­ zellen aus dem Sternum von weiblichen schwarzen C47 Mäusen. Als Standardlösung wurde eine Mischung aus der Fraktion P1, behandelt mit 1N HCL 10 Minuten im siedenden Wasserbad, und die Fraktion PS in 4,45 mM MgATP und 8, 9 mM MgSO₄ verwendet, wobei das Gewichts­ verhältnis von Fraktion 1 zu Fraktion 5 3,27 betrug.

Die Zellen wurden in Hanks Lösung homogenisiert und die Zellkon­ zentration des Homogenisates auf 500000 Zellen/ml eingestellt. Ein Cephalosporinantibiotikum (Cephalotin der Fa. Lilly) wurde in einer Endkonzentration von 50 µg/ml eingesetzt. Die Mischung wurde dann im rotierenden Wasserbad bei 37°C 15 Minuten reinku­ biert. Die Standardpeptidmischung hatte eine Konzentration von 12,9 µg/ml, bestimmt aus der UV-Absorption unter Annahme eines Extinktionskoeffizienten von 70 A₁₉₅/mg/ml.

Die Zellsuspensionen wurden dann auf 3 Reihen von Reagenzgläsern in aliquoten Mengen von 0,1 ml verteilt; zur ersten Reihe mit 12 Reagenzgläsern (Kontrollreihe) wurde 0,1 ml TCM-199 (Difco) Kulturmedium zugegeben. Zu der zweiten Reihe (4 Proben, 6 Reagenz­ gläser für jede Probe) wurden verschiedene Volumina der Standard­ phophopeptidmischung und ein Anteil an TCM-199 bis zu einem Ge­ samtvolumen von 0,1 ml zugesetzt. Zu der dritten Reihe (4 Proben, 6 Reagenzgläser jeweils) wurde Adriamycin, gelöst in TCM-199 in verschiedenen Konzentrationen zugefügt. Nach zweistündiger Inkuba­ tion bei 37°C unter Schütteln wurden alle Proben in zwei Teile geteilt, von denen ein Teil für die Impulscytophotometrie verwen­ det wurde, während zu dem anderen Teil 50 µl ³H-Thymidin (mit einem Gehalt an 2,5 µCi) zugesetzt wurde. Nach einer weiteren Inkubationszeit von 1 Stunde bei 37°C wurde ein 100 µl Aliquot jeder der mit 3 H-Thymidin versetzten Proben auf drei Rundfilter­ papiere (Watman Filter, 3 mm, 2,3 cm der Fa. Balston) pipettiert. Die Filterpapiere wurden dann mit Warmluft getrocknet und die nicht inkorperierte Radioaktivität mit eiskalter 5%-iger Trichlor­ essigsäure für 30 Minuten ausgezogen. Anschließend wurden die Filter mit Ethanol/Ether im Verhältnis 1 : 1 20 Minuten gespült. Hieran anschließend wurde für 10 Minuten mit Ether gespült, an der Luft getrocknet und in einem Scintillationsglas wurde dann zu jedem Filter 5 ml Scintillationsflüssigkeit (85 ml Scintil 3 Koch-Light Laboratories Ltd. zu 2,5 1 Toluol) zugesetzt und die Flüssigscintillationsmessung durchgeführt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgelistet und in Fig. 3 gra­ fisch dargestellt. In der Grafik wird das Ausmaß der Inhibierung durch Phosphopeptide auf die Zellproliferation ausgedrückt als Prozent der ³H-Thymidin-Aufnahme in Walker-Carcinoma Zellen und normalen Knochenmarkszellen im Vergleich zu der Aufnahme der ent­ sprechenden Kontrollen als Funktion der totalen Konzentration der zugesetzten Phosphopeptide. Zum Vergleich dient die Inhibie­ rung in Walker Carcinoma- und normalen Knochemarkszellen durch Adriamycin (ADR) als Funktion der ADR-Konzentration. Die Einheit (1 ×) der Phosphopeptidkonzentration entspricht 0,987 µg/ml der mit 1 N HCL behandelten Peptidfraktion P1 + 0,302 µg/ml der Frak­ tion 5, so daß sich eine Gesamtkonzentration von 1,289 µg/ml er­ gibt. Die ADR-Konzentrationseinheit entspricht 0,86 µg/ml. Alle Konzentrationen beziehen sich auf 0,1 ml Zugaben von Phosphopep­ tiden oder ADR zur Reaktionsmischung.

Kurve 1 zeigt normale Knochenmarkzellen unter Zusatz von vorbe­ handelter Fraktion 1 + Fraktion 5.

Kurve 2 zeigt normale Knochenmarkzellen + ADR.

Kurve 3 zeigt Walker-Carcinoma Zellen + vorbehandelter Fraktion 1 + Fraktion 5

Kurve 4 zeigt Walker Carcinoma Zellen + ADR.

Beispiel 4: Ergebnisse der Impulscytophotometrie

Zur Feststellung der Verteilung der Zellen in den verschiedenen Phasen des Zellteilungszyklus wurden alle Proben mit Hilfe der Impulscytophotometrie analysiert. Hierfür wurden die inkubierten Proben 5 Minuten bei 200 g zentrifugiert, dann der Rückstand 2 × mit isotonischer NaCl Lösung gewaschen und im kalten Ethanol fixiert. Die Zellen wurden dann 5 Minuten bei 200 g zentrifugiert und der Rückstand wurde mit 0,25 ml Pepsinlösung (0,5 g Pepsin/100 ml 0,2%-ig HCl) versetzt und 5 Minuten geschüttelt. Anschließend wurde mit 1 ml einer RNAse-Lösung (0,1 g) und mit Ethidiumbromid in Trispuffer pH 7,5 bis zur Endkonzentration von 0,01 mg/ml ver­ setzt. Die Fluoreszenzhistogramme (Anzahl der Impulse/Fluoreszenz­ intensität) wurden unter Verwendung eines ICP-11 der Fa. Phyde, Göttingen hergestellt. Die Auswertung der Histogramme erfolgte nach dem prozentualen Anteil der Zellen in den Phasen G₁, S und (G₂ + M).

Die Auswertung ist in Fig. 2 grafisch dargestellt. Die Kurve 1 zeigt die Kontrollkurve mit einer Gesamtzählung von 21165 bei Pulsgeschwindigkeit 40. In Kurve 2 sind die Werte für die behan­ delte Probe mit vorbehandelter Fraktion P1 und Fraktion 5 bei einer Gesamtkonzentration von 0,451 µg/l dargestellt. Gesamt­ zählung 16677, Pulsgeschwindigkeit 80 bis 100. Der anfänglich scharfe Peak ist durch die somatischen Zellen bedingt, wie beispiels­ weise aus Stöhr et al. in Beitr. Path. Band 155, 36-43 bekannt.

Claims (4)

1. Phosphopeptide aus Kalbsthymuszellkernen, gekennzeichnet durch ein mittleres Molekulargewicht von 9950 Dalton, R_f- Werte bei der Anionenaustauscherchromatographie von 0,203 und 0,246 in Gradient A (bei einem linearen Gradienten von 0 bis 4 mol/l HCOOH) sowie ein Mol-Verhältnis von Phosphoserinkomplexen, Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Lysin und Arginin von 31 : 6 : 1 : 2 : 8 : 13 : 4 : 2 : 1 : 3 : 1 : 1.

2. Phosphopeptide aus Kalbsthymuszellkernen, gekennzeichnet durch ein mittleres Molekulargewicht von 9950 Dalton, Rf- Werte bei der Anionenaustauscherchromatographie bei 0,031, 0,077 und 0,131 in Gradient B (bei einem linearen Gradienten von 0 bis 2 mol/l HCOONH₄ in 4 mol/l HCOOH) sowie einem Aminosäuren­ molverhältnis von Phosphoserinkomplexen, Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Lysin und Arginin von 62 : 6 : 1 : 2 : 8 : 13 : 4 : 2 : 1 : 3 : 1 : 1.

3. Verfahren zur Herstellung der Phosphopeptide nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Kalbsthymusgewebe im gefrorenem Zustand von anhaftenden Proteinen und RNA gereinigt, die Zellkerne isoliert und in an sich bekannter Weise lysiert und dann bei Temperaturen zwischen -4 bis 0°C mehrfach gegen 30%-iges Glycerin dialysiert, die Dialysate in an sich bekann­ ter Weise durch Anionenaustauscherchromatographie fraktioniert, die Fraktionen bei den R_f-Werten zwischen 0,203 und 0,246 in Gradient A bzw. 0,0031, 0,077 und 0,131 in Gradient B gesammelt und in an sich bekannter Weise deionisiert werden.

4. Verwendung der Phosphopeptide nach Anspruch 1 und/oder 2 als Cytostatikum.