WO1999042115A1 - Verwendung eines presssaftes, verdauungssaftes oder extraktes von fleischfressenden pflanzen zur hemmung von proteinkinasen - Google Patents

Verwendung eines presssaftes, verdauungssaftes oder extraktes von fleischfressenden pflanzen zur hemmung von proteinkinasen Download PDF

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carnivorous
protein kinases
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PCT/EP1999/001176
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Helmut Keller
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Carnivora Forschungs-Gmbh
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the invention relates to the inhibition of protein kinases by using a press juice, digestive juice or extract from carnivorous plants.
  • Recent research in the field of active pharmaceutical ingredients focuses on the field of medicinal products manufactured on a natural basis.
  • medicinal products produced on a natural basis often have the surprising advantage of better tolerability compared to synthetic active ingredients, which often cause strong, undesirable side reactions.
  • Carnivorous plants are an interesting example of a source of natural active ingredients.
  • the pressed juice of certain carnivorous plants is used to combat malignant diseases such as cancer, chronic disease, ulcerative colitis, herpes and AIDS. This is exemplified in EP-A-249465, EP-A-219295 and DE-A-2920631.
  • Chemotherapy for cancer is associated with serious side effects.
  • Protein kinases play a central role in the growth, division and differentiation of cells. Growth signals, which bind to specific recognition structures (receptors) in the form of growth factors on the outside of the cell membrane, are passed on to the cell nucleus via various kinase cascades, where they lead to changes in transcription signals. As a result, specific genes are activated or the transcription of other genes is stopped.
  • the juices used according to the invention are particularly suitable for controlling plasmodia, chlamydia, trypanosomes, phototropic bacteria, staphylococci, streptococci, pneumococci, Klebsielle, Candida, Mucor, Aspergillus and bacteria around Pyocyaneus.
  • the above-mentioned germs, bacteria or fungi are presumably inactivated by inhibiting the protein kinases.
  • Pressed juice, an extract or the digestive juice of carnivorous plants are particularly suitable for controlling Heliobacter pylori, one of the most common causes of stomach ulcers.
  • Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia Coli, Staphylococcus epidermis, Group B Streptococcus (hemolysing), Streptococcus pyogenes (A), Candida albicans, Aspergillus bumactucus, pneumumucus mucus. Pyocyaneus, Bact. Proteus vulgaris, Klebsieila oraeanae, Candida mycod., Candida tropicaus and Mucor racemosus.
  • the carnivorous plant can be any carnivorous plant. It preferably belongs to one of the genera Heliamphora, Sarracenia, Darlingtonia, Cephalotus or Nephentes. Carnivorous plants of the Drosera family are further preferred, in particular the Dionaea muscipula, the Venus fly trap.
  • Pressed juice, an extract or digestive juice from carnivorous plants can be used.
  • the use of the digestive juice has the advantage that the plants do not have to be destroyed to obtain it, since the digestive juice can be drawn off. A substantial increase in the yield can be achieved by continued feeding of the plants.
  • the carnivorous plants are usually fed with pieces of meat of the same tissue over a long period of time. This also leads to the fact that the composition of the digestive juice is stabilized, ie that the individual constituents of the digestive juice are present in similar proportions in plants of the same type. This is not possible without feeding, so that the active ingredients are present in different concentrations from plant to plant and thus the therapeutic effect leads to therapeutic success only by mixing the digestive juices of several plants.
  • stimulation of the secretion can be carried out.
  • Spraying the plants with uric acid has proven to be particularly suitable, the remaining residues of uric acid not showing any negative effects.
  • Other suitable agents for stimulating secretion are Baktopeptone, Kalifora, Glutamic acid, yeast extract, Peptone, Taurin, Proli ⁇ and Asparagin.
  • the digestive juice is expediently removed by pipetting off or by teaching small puncture wounds on the inside of folds and then collecting the secretion in micropipettes.
  • the pressed juice can also be used.
  • the press juice is preferably produced using fresh plants, that is to say plants in which no withered enzymatic process has yet begun.
  • harvested plants are washed first, whereby foreign components are separated.
  • the cleaned plants are then chopped, grated or mustard and then pressed in the wet state. It is preferable to treat with steam under tension for a few seconds before pressing in order to inactivate enzymes, to achieve disruption by partially destroying the cell walls and by protein precipitation to facilitate a later clarification. Shock freezing can be performed in a similar manner.
  • the pressed juice can then be treated by conventional methods, such as filtration, centrifugation or separation. If necessary, it is then uperized and then filled into aseptic bottles. It is then preferably cooled to temperatures below 70 ° C. as quickly as possible.
  • Extracts of carnivorous plants can also be used.
  • the following extractants and processes can be used:
  • the products obtained by tapping the digestive juice, by pressing and by extraction can be processed further in the usual way.
  • these juices can be freeze-dried, in particular lyophilized.
  • the usual additives such as mannitol or glycerite can be added during lyophilization.
  • the devices and process parameters required for this are known to the person skilled in the art.
  • various additives can be added to these juices, which have a positive influence on the therapeutic effect when administered, such as, for example, formic acid, benzoic acid, citric acid, malic acid, cyanidin-3-glucoside, sodium, magnesium, potassium, calcium, chlorine, naphthoquinones, L.
  • Arginine L-asparagine, L-serine, L-glutamic acid, L-alanine, L-threonine, L-lysine, glycine, L-tyrosine, L-phenylalanine, L-valine, L-leucine and L-isoleucine.
  • the juices of carnivorous plants can be administered in various ways.
  • the juices can be used directly orally or topically, alternatively they can be diluted beforehand with a harmless solvent.
  • suitable solvents are water, sweet wine, ethanol-water mixtures and salt solutions.
  • the juice of the carnivorous plant can be administered orally in the form of tablets and capsules.
  • the devices and methods for formulation required for this are known to the person skilled in the art. Topical applications in the form of the juices themselves or in the form of ointments are also possible.
  • the devices, substances and processes required for the production of ointments are known to the person skilled in the art.
  • Parentaralia from the juices of the carnivorous plants. These can be administered intramuscularly, subcutaneously or intravenously.
  • the devices, auxiliaries and methods necessary for the production of such parentaralia are known to the person skilled in the art.
  • both samples were stored unopened in the refrigerator until the experiments began.
  • both samples were prediluted 1:10 and 1:100 with H 2 O and DMSO, so that there was a 1:10 and a 1: 100 diluted starting solution in 10% DMSO.
  • a further 1:10 dilution step was carried out.
  • Both samples were tested diluted 1: 100 and 1: 1,000.
  • the DMSO concentration in the assay was 1%.
  • the pre-diluted starting solutions were kept at 4 ° C and used for all measurements over a period of 10 days.
  • Cyclin-dependent kinase 4 (CDK 4) and Cyclin-dependent kinase 2 (CDK 2).
  • Tyrosine kinase of the receptor for the epidermal growth factor (EGF-R-TK)
  • Insulin-like growth factor receptor tyrosine kinase, type 1 IGF-1 -R-TK
  • Insulin receptor tyrosine kinase Ins-R-TK Insulin receptor tyrosine kinase Ins-R-TK
  • PLC- ⁇ Protein kinase C, subtype ⁇
  • PLC- ⁇ Protein kinase C, subtype ⁇
  • the protein kinases were cloned from RNA-suitable cells using RT-PCR. The isolated DNA sections were then subcloned into baculovirus transfer vectors and recombinant baculoviruses were then produced. The proteins were expressed in Sf9 insect cells using the recombinant baculoviruses. The kinases were purified from the insect cell lysates using glutathione agarose gel.
  • kinase assays were carried out in 96-well microtiter plates in a reaction volume of 100 ⁇ l.
  • the test contained 50 mM HEPES-NaOH, pH 7.5, 1 mM EDTA, 1, 25 mM EGTA, 5 mM MgCl 2 , 1, 32 mM CaCl 2 , 5 ⁇ g / ml phosphatidylserine, 1 ⁇ g / ml 1, 2-diolein, 1 mM DTT, 0.1 ⁇ M [ 33 P] -ATP, 50 ng recombinant kinase and 0.5 ⁇ g histone H1 as substrate.
  • test mixture contained 50 mM HEPES-NaOH, pH 7.5, 3 mM MgCl 2 , 3 mM MnCI 2) 3 ⁇ M Na orthovanadate, 1 mM DTT, 0.1 ⁇ M ATP, 100 ng recombinant kinase and one suitable substrate.
  • FGF-R1-TK -70% -100% -67%
  • IGF-1-R-TK -59% -96% -66%
  • Camivora ® press juice (2% dry residue) was administered in three doses of 0.06, 0.6 and 2.83 ml / kg body weight (bw) 3 times a day over a period of 20 10
  • the combination of the three reference substances showed the expected effect on this model.
  • the ulcer index was reduced, the lesion areas of the duodenal ulcer and ventriculi were reduced, and the incidence of Helicobacter pylori was reduced.
  • the three doses of Carnivora pressed juice tested showed very good dose-dependent effects.
  • the ulcer index was reduced, the lesion surfaces of the duodenal and ventricular ulcers were reduced or the ulcer was completely removed.
  • the incidence of Helicobacter pylori has been reduced and the highest dose has caused the eradication of this germ. Further positive effects of the test substance manifested themselves in a reduction in the p.a. spontaneous deaths of the ulcer and a greater weight gain compared to the control over the course of the test of 0-21 days.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Preßsaftes, Verdauungssaftes oder Extraktes fleischfresseder Pflanzen zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung von Proteinkinasen.

Description

Verwendung eines Preßsaftes, Verdauungssaftes oder
Extraktes von fleischfressenden Pflanzen zur Hemmung von Protein kinasen
Die Erfindung betrifft die Hemmung von Proteinkinasen durch Verwendung eines Preßsaftes, Verdauungssaftes oder Extraktes von fleischfressenden Pflanzen.
Neuere Forschungen auf dem Gebiet der Arzneimittelwirkstoffe konzentrieren sich auf das Feld der auf natürlicher Basis hergestellten Arzneimittel. Neben der überraschend großen Wirkstoffvielfalt, die in Pflanzen und natürlich vorkommenden Mikroorganismen gefunden werden kann, haben auf natürlicher Grundlage hergestellte Arzneimittel häufig den überraschenden Vorteil einer besseren Verträglichkeit, verglichen mit synthetisch hergestellten Wirkstoffen, die häufig starke, unerwünschte Nebenreaktionen hervorrufen. Ein interessantes Beispiel einer Quelle für natürliche Wirkstoffe sind fleischfressende Pflanzen. So wird beispielsweise der Preßsaft bestimmter fleischfressender Pflanzen zur Bekämpfung maligner Krankheiten, wie Krebs, Morbus-Chron, Colitis-Ulcerosa, Herpes und Aids verwendet. Beispielhaft ist dies in EP-A-249465, EP-A-219295 und DE-A-2920631 angegeben.
Gleichzeitig gibt es eine ganze Reihe von Krankheiten, bei denen die herkömmliche Medikamentation mit synthetischen Wirkstoffen praktisch keinen Erfolg zeigt. Ein Beispiel einer solchen Krankheit sind Magengeschwüre, zu deren Bekämpfung heute aufwendige chemotherapeutische Behandlungen durchgeführt werden. Die derzeit am häufigsten angewendeten Therapien sind die modifizierten Triplet- Therapien. Diese Therapien sind z.B. in der Fachzeitschrift „Münch. med. WSCHR. 140 (1998) Nr. 7, Seite 90 bis 93" sowie in „Deutsches Ärztemagazin Nr. 51/52, Dezember 1997, der Kassenarzt" auf den Seiten 31 bis 34 beschrieben. Diese Therapien haben allerdings den Nachteil, daß sie wie vergleichbare 2
Chemotherapien bei Krebserkrankungen mit schwerwiegenden Nebenwirkungen verbunden sind.
Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Wirkstoff oder eine Wirkstoffkombination einzugeben, mit der eine Bekämpfung von Krankheiten möglich ist, die auf die Hemmung von Proteinkinasen ansprechen, wobei möglichst keine Nebenwirkungen auftreten sollen.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die Verwendung eines Preßsaftes, Verdauungssaftes oder Extraktes fleischfressender Pflanzen zur Hemmung von Proteinkinasen. Diese werden im folgenden auch zusammenfassend als Säfte benannt.
Proteinkinasen spielen eine zentrale Rolle bei Wachstum, Teilung und Differenzierung von Zellen. Wachstumssignale, die in Form von Wachstumsfaktoren an der Außenseite der Zellmembran an spezifische Erkennungsstrukturen (Rezeptoren) binden, werden über verschiedene Kinase-Kaskaden in den Zellkern weitergeleitet und führen dort zur Veränderung von Transkriptionssignalen. Als Folge hiervon werden spezifische Gene aktiviert bzw. die Transkription anderer Gene wird gestoppt.
Überraschend wurde nun gefunden, daß der Preßsaft, ein Extrakt oder der Verdauungssaft fleischfressender Pflanzen die Hemmung von Proteinkinasen ermöglicht, was gleichzeitig die Bekämpfung von verschiedenen, bislang nur sehr schwierig zu behandelnden Krankheiten ermöglicht.
Insbesondere hat sich gezeigt, daß die Säfte fleischfressender Pflanzen Wirkungen zeigen, die konventionellen Antibiotika entsprechen, wobei allerdings deutlich weniger Nebenwirkungen auftreten. Die Säfte fleischfressender Pflanzen zeigen Wirkung gegen grampositive wie gramnegative Bakterien, Pilze und sonstige Keime. 3
Insbesondere eignen sich die erfindungsgemäß verwendeten Säfte zur Bekämpfung von Plasmodien, Chlamydien, Trypanosomen, phototropen Bakterien, Staphylokokken, Streptokokken, Pneumokokken, Klebsielle, Candida, Mucor, Aspergillus und Bakte um Pyocyaneus. Vermutlich werden die oben genannten Keime, Bakterien bzw. Pilze durch Hemmung der Proteinkinasen inaktiviert. Insbesondere eignen sich der Preßsaft, ein Extrakt oder der Verdauungssaft fleischfressender Pflanzen zur Bekämpfung von Heliobacter pylori, eine der häufigsten Ursachen für Magengeschwüre.
Durch Versuchsreihen wurde weiter bestätigt, daß eine Hemmung der folgenden Keime, Pilze und Bakterien durch den Saft fleischfressender Pflanzen erreicht werden kann:
Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia Coli, Staphylococcus epidermis, Streptokokku der Gruppe B (hämolysierend), Streptococcus pyogenes (A), Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Pneumococcus mucosus, Bact. Pyocyaneus, Bact. Proteus vulgaris, Klebsieila oraeanae, Candida mycod., Candida tropicaus und Mucor racemosus.
Im folgenden werden die Gewinnung eines Preßsaftes, Verdauungssaftes oder Extraktes fleischfressender Pflanzen sowie bevorzugte Darreichungsformen diskutiert.
Die fleischfressende Pflanze kann irgendeine fleischfressende Pflanze sein. Bevorzugt gehört sie einer der Gattungen Heliamphora, Sarracenia, Darlingtonia, Cephalotus oder Nephentes an. Weiter bevorzugt sind fleischfressende Pflanzen der Familie Drosera, insbesondere die Dionaea muscipula, die Venusfliegenfalle.
Verwendet werden können der Preßsaft, ein Extrakt oder der Verdauungssaft fleischfressender Pflanzen. Die Verwendung des Verdauungssaftes hat den Vorteil, daß zu seiner Gewinnung die Pflanzen nicht zerstört werden müssen, da der Verdauungssaft abgezapft werden kann. Dabei kann eine wesentliche Steigerung der Ausbeute durch fortgesetzte Fütterung der Pflanzen erreicht werden. Die Anfütterung der fleischfressenden Pflanzen erfolgt üblicherweise mit Fleischstückchen gleichen Gewebes über einen langen Zeitraum. Dies führt auch dazu, daß die Zusammensetzung des Verdauungssaftes stabilisiert wird, d.h. das die einzelnen Bestandteile des Verdauungssaftes bei gleichartigen Pflanzen in ähnlichen Anteilen vorliegen. Ohne Fütterung ist dies nicht gegeben, so daß die Wirkstoffe in verschiedenen Konzentrationen von Pflanze zu Pflanze vorhanden sind und damit auch der therapeutische Effekt nur durch Mischen der Verdauungssäfte mehrerer Pflanzen eine Art zu einem therapeutischen Erfolg führt. Um die Mengen an Verdauungssekreten, die von den Pflanzen geliefert werden, zu erhöhen, kann eine Stimulation der Sekretion durchgeführt werden. Dabei hat sich insbesondere das Besprühen der Pflanzen mit Harnsäure als geeignet erwiesen, wobei die verbleibenden Reste der Harnsäure keinerlei negative Auswirkungen zeigen. Weitere geeignete Mittel zur Stimulation der Sekretion sind Baktopeptone, Kalifora, Glutaminsäure, Hefeextrakt, Peptone, Taurin, Proliπ und Asparagin. Das Abnehmen des Verdauungssaftes wird zweckmäßigerweise durch Abpipettieren durchgeführt bzw. durch Beibringen kleiner Stichverletzungen an den Innenseiten von Falten und anschließendes Auffangen des Sekretes in Mikropipetten.
Erfindungsgemäß kann aber auch der Preßsaft verwendet werden. Die Herstellung des Preßsaftes erfolgt vorzugsweise unter Verwendung von frischen Pflanzen, d.h. Pflanzen bei denen noch kein enzymatisch ausgelöster Welkprozeß begonnen hat. Üblicherweise werden die geernteten Pflanzen zuerst gewaschen, wobei fremde Bestandteile abgesondert werden. Die gereinigten Pflanzen werden anschließend gehäckselt, geraspelt oder gemust und anschließend im nassen Zustand gepreßt. Vorzugsweise kann vor dem Pressen wenige Sekungen lang mit gespanntem Wasserdampf behandelt werden, um Enzyme zu inaktivieren, ein Aufschließen durch teilweises Zerstören der Zellwände zu erreichen und durch Eiweißausfällung eine spätere Klärung zu erleichtern. In ähnlicher Weise kann eine Schockgefrierung durchgeführt werden.
Zum Pressen werden üblicherweise sowohl diskontinuierlich arbeitende Spindelpressen, hydraulische Seierpressen als auch kontinuierliche Schneckenpressen benutzt. Die dazu einzustellenden Parameter sowie weitere Verfahrenshandlungen sind dem Fachmann bekannt. Der Preßsaft kann anschließend durch übliche Verfahren, wie Filtrieren, Zentrifugieren bzw. Separation, behandelt werden. Gegebenenfalls wird anschließend uperisiert und dann in keimfreie Flaschen abgefüllt. Anschließend wird vorzugsweise möglichst schnell auf Temperaturen von unter 70°C gekühlt.
Verwendbar sind aber auch Extrakte von fleischfressenden Pflanzen. Dabei können die folgenden Extraktionsmittel und Verfahren verwendet werden:
Extraktionsmittel:
kaltes Wasser, heißes Wasser, verdünnte Essigsäure, Süßwein, Ethanol- Wasser-Gemische, Ethanol sowie fette Öle bzw. Neutralöle und überkritische Gase, wie beispielsweise überkritisches CO2.
Extraktionsverfahren:
ruhende Mazeration, Bewegungsmazeration, Wirbelextraktion, Digestion, Perkolation, Reperkolation, Evakolation, Diakolation, Kombinationen aus Mazeration und Perkolation, Ultraschallextraktion, Gegenstromextraktion und Extraktion mit Seperatoren, Zentrifugen und Dekantem.
Die dazu einzusetzenden Vorrichtungen sowie die üblicherweise verwendeten Verfahrensparameter sind dem Fachmann geläufig. 6
Die durch Abzapfen des Verdauungssaftes, durch Pressen sowie durch Extraktion erhaltenen Produkte können in üblicher Weise weiterverarbeitet werden. Insbesondere können diese Säfte gefriergetrocknet, insbesondere lyophilisiert werden. Dabei können die üblichen Zusatzstoffe, wie Mannit oder Glycerit beim Lyophilisieren zugesetzt werden. Die dazu benötigten Vorrichtungen sowie Verfahrensparameter sind dem Fachmann bekannt. Weiterhin können diesen Säften verschiedene Zusatzstoffe zugegeben werden, die einen positiven Einfluß auf die therapeutische Wirkung bei Verabreichung haben, wie beispielsweise Ameisensäure, Benzoesäure, Zitronensäure, Apfelsäure, Cyanidin-3-Glucoside, Natrium, Magnesium, Kalium, Calcium, Chlor, Naphtochinone, L-Arginin, L-Asparagin, L-Serin, L-Glutaminsäure, L-Alanin, L-Threonin, L-Lysin, Glycin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Valin, L-Leucin und L-Isoleucin.
Die Verabreichung der Säfte von fleischfressenden Pflanzen kann auf verschiedene Art erfolgen.
Die Säfte können direkt oral oder topisch verwendet werden, alternativ kann zuvor eine Verdünnung mit einem unbedenklichen Lösungsmittel erfolgen. Beispiele für geeignete Lösungsmittel sind Wasser, Süßwein, Ethanol-Wasser-Mischungen und Salzlösungen.
Üblicherweise wird auf einen Trockenrückstand von 0,1 bis 10 Gew.-%, bevorzugt 0,5 bis 5 Gew.-%, insbesondere bevorzugt 0,8 bis 2,5 Gew.-%, verdünnt.
Weiterhin kann der Saft der fleischfressenden Pflanze oral in Form von Tabletten und Kapseln verabreicht werden. Die dazu benötigten Vorrichtungen sowie Verfahren zum Formulieren sind dem Fachmann bekannt. Weiterhin sind auch topische Anwendungen in Form der Säfte selbst oder in Form von Salben möglich. Die zur Herstellung von Salben benötigten Vorrichtungen sowie Stoffe und Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Weiterhin ist es auch möglich, Parentaralia aus den Säften der fleischfressenden Pflanzen herzustellen. Diese können intramuskulär, subkutan oder intravenös verabreicht werden. Die zur Herstellung solcher Parentaralia nötigen Vorrichtungen, Hilfsstoffe sowie Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
Die folgenden Versuche erläutern die Erfindung:
I. Hemmung von Proteinkinasen
Probenmaterial Camivora®-Preßsaft verdünnt sowie Camivora®-Preßsaft genuin, hergestellt von der Carnivora Forschungs GmbH.
Beide Proben wurden bis zum Beginn der Experimente ungeöffnet im Kühlschrank gelagert. Am Tage des ersten Experiments wurden beide Proben mit H2O und DMSO jeweils 1 :10 und 1 : 100 vorverdünnt, so daß von beiden Proben eine 1 :10 und eine 1 :100 verdünnte Ausgangslösung in 10% DMSO vorlag. Bei der Zugabe zum Test erfolgte jeweils ein weiterer 1 :10 Verdünnungsschritt. Beide Proben wurden 1 :100 und 1 :1.000 verdünnt getestet. Die DMSO-Konzentration im Assay betrug 1 %. Die vorverdünnten Ausgangslösungen wurden bei 4°C aufbewahrt und für alle Messungen über einen Zeitraum von 10 Tagen eingesetzt.
Eingesetzte Proteinkinasen:
Cyclin-dependent kinase 4 (CDK 4) und Cyclin-dependent kinase 2 (CDK 2).
Tyrosinkinase des ß-Rezeptors des Platelet-derived Growth Factor (PDGF-Rß-TK)
Tyrosinkinase des Rezeptors für den Epidermal Growth Factor (EGF-R-TK)
Tyrosinkinase des ERBB2-Rezeptors ERBB2-TK
Tyrosinkinase des Rezeptors-1 des Fibroblast Growth Factor (FGF-R1 -TK
Tyrosinkinase des Insulin-like Growth Factor Rezeptor, Typ 1 (IGF-1 -R-TK)
Tyrosinkinase des Insulin-Rezeptors Ins-R-TK
Proteinkinase C, Subtyp γ (PKC-γ)
Proteinkinase C, Subtyp ε (PKC-ε)
Janus-Kinase 2 (JAK 2) 8
Die Proteinkinasen wurden aus RNA geeigneter Zelle mittels RT-PCR geklont. Die isolierten DNA-Abschnitte wurden anschließend in Baculovirus Transfervektoren subkloniert und anschließend rekombinante Baculoviren hergestellt. Mit Hilfe der rekombinanten Baculoviren wurden die Proteine in Sf9-Insektenzellen exprimiert. Die Reinigung der Kinasen erfolgte aus den Insektenzell-Lysaten unter Verwendung von Glutathion-Agarose-Gel.
Alle Kinase-Assays wurden in 96-well Mikrotiterplatten in einem Reaktionsvolumen von 100 μl durchgeführt. Für das Messen von PKC-Aktivität enthielt der Test 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 ,25 mM EGTA, 5 mM MgCI2, 1 ,32 mM CaCI2, 5 μg/ml Phosphatidylserin, 1 μg/ml 1 ,2-Diolein, 1 mM DTT, 0,1 μM [33P]-ATP, 50 ng rekombinante Kinase und 0,5 μg Histon H1 als Substrat. Für alle anderen Kinasen enthielt der Testansatz 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 3 mM MgCI2, 3 mM MnCI2) 3 μM Na-Orthovanadat, 1 mM DTT, 0,1 μM ATP, 100 ng rekombinante Kinase und ein geeignetes Substrat.
Das Reaktionsgemisch wurde 80 min. bei 30°C inkubiert. Durch Zugabe von 100 μl H3PO4 (2%), wurde die Reaktion gestoppt. Anschließend wurden die Platten dreimal mit H2O gewaschen. Der Einbau von [33P]-Phosphat in das jeweilige Substrat wurde mit Hilfe eines Szintillationszählers für Mikrotiterplatten bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.
Tabelle 1
Prozentuale Wirkung (Inhibierung) verdünnter Preßsaft genuiner Preßsaft
Kinase 1 :100 1 :100 1 :1000
CDK4/Cyclin D1 -66% -109% -41%
CDK2/Cyclin E -89%
PDGF-Rß-TK -78% -98% -64%
EGF-R-TK -78% -96% -68%
ErbB2-TK -62% -88% -82%
FGF-R1-TK -70% -100% -67%
IGF-1-R-TK -59% -96% -66%
Ins-R-TK -68% -99% -75%
PKC-γ -57% -34%
PKC-ε -65% -37%
JAK2 -81% -97% -79%
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Die Ergebnisse zeigen deutlich, daß sowohl der genuine Preßsaft von Carnivora als auch ein verdünnter Preßsaft eine Hemmung von Proteinkinasen hervorruft.
II. Bekämpfung von Heliobacter pylori
Es wurden Untersuchungen am Duodenalulkus-Modell der Ratte bezüglich der Eradikation von Helicobacter pylori durchgeführt. Bei diesem Ulkus-Modell wurden Ratten verwendet, die überwiegend mit Helicobacter pylori besiedelt sind. Nach oraler Gabe des Ulzerogens Cysteaminhydrochlorid waren 48 Stunden post applicationem Ulcus duodenum und Ulcus ventriculi makroskopisch und histologisch 100%ig nachweisbar.
Camivora®-Preßsaft (2% Trockenrückstand) wurde in den drei Dosierungen 0,06, 0,6 und 2,83 ml/kg Körpergewicht (KG) 3 x täglich über einen Zeitraum von 20 10
Tagen nach Ulkus-Induktion oral appliziert. Das gleiche Applikationsregime wurde für die Referenzgruppe (Kombination aus Tetracyclin (6 mg/kg KG), Metronidazol (15 mg/kg KG) und basischem Wismutnitrat (30 mg/kg KG)) sowie für die Kontrolle (isotonische Kochsalzlösung, 0,9% NaCI) angewandt.
2, 5, 8, 14 und 21 Tagen nach der Ulkus-Induktion erfolgte die Überprüfung der Ulkus-Heilung in entsprechenden Tierkollektiven mittels makroskopischer Bewertung, und darüber hinaus erfolgte der Nachweis von Helicobacter pylori. Folgende Parameter wurden erfaßt: mittlere Bewertungszahl (mBZ) auf Grundlage der Schweregrade der Duodenal- und Magengeschwüre, prozentuale Häufigkeit der Ulzera (%U), Ulkus-Index (Ul) (mBZ x %U), Fläche der Ulzera, Körpergewicht und Mortalität.
Die Kombination der drei Referenzsubstanzen zeigte an diesem Model die erwartete Wirkung. Der Ulkus-Index wurde gesenkt, die Läsionsflächen der Ulcus duodeni bzw. ventriculi vermindert sowie die Inzidenz von Helicobacter pylori gesenkt.
Sehr gute dosisabhängige Effekte zeigten die drei getesteten Dosierungen von Carnivora-Preßsaft. Der Ulkus-Index wurde gesenkt, die Läsionsflächen der Ulcus duodeni bzw. ventriculi gemindert bzw. die Ulzera vollständig beseitigt. Die Inzidenz von Helicobacter pylori konnte gesenkt werden, und in der höchsten Dosierung wurde die Eradikation dieses Keimes bewirkt. Weitere positive Effekte der Prüfsubstanz manifestierten sich in einer Verminderung der während der ersten 3 Tage p.a. des Ulcerogens auftretenden spontanen Todesfälle sowie einer im Vergleich zur Kontrolle stärkeren Gewichtszunahme im Prüfungsverlauf von 0-21 Tagen.
Die aufgezeigten Effekte von Carnivora-Preßsaft belegen die herausragende Wirkung an diesem Modell. 11
Tabelle 2
Gruppe d.p.a. 2 5 8 14 21 Ulzerogen
DU MU DU MU DU MU DU MU DU MU
Kontrolle mBZ 2,2 1,9 2,6 18 2,7 1,6 2,2 0,6 2,1 1,2 sd 0,4 0,5 0,4 0,9 0,5 1,5 0,3 0,8 0,4 0,7
%U 100 100 100 100 100 60 100 40 100 80
Ul 219,0 191,0 258,0 204,0 268,0 96,0 220,0 24,8 206,0 96,0
Referenz mBZ - - 2,1 2,0 1,3 1,3 0,3 0,2 0,5 0,3 sd - - 0,5 0,5 1,3 1,3 0,7 0,5 0,8 0,6
%U - - 100 100 60 60 20 20 40 20
Ul - - 206,0 204,0 76,8 76,8 6,0* 4,4 21,6* 5,2
Dosis 1 mBZ - - 2,4 1,8 2,2 1,3 1,8 0,8 1,4 0,6 sd - - 0,6 0,9 0,5 1,2 1,1 1,3 0,9 0,9
%U - - 100 100 100 60 80 40 80 40
Ul - - 238,0 178,0 218,0 78,0 145,6 33,6 115,2 25,6
Dosis 2 mBZ - - 2,1 1,6 1,1 1,1 0,6 0,7 1,2 1,0 sd - - 0,7 1,1 1,0 1,0 0,8 0,9 1,1 1,0
%U - - 100 80 60 60 40 40 60 60
Ul - - 214,0 131,2 67,2* 63,6 24,8* 26,4 69,6 62,4
Dosis 3 mBZ - - 2,1 1,3 1,2 0,9 0,7 0,9 1,1 0,7 sd - - 0,2 0,9 1,2 0,9 1,0 0,9 1,0 0,7
%U - - 100 80 60 60 40 60 60 60
Ul - - 208,0* 107,2 74,4* 56,4 28,8* 55,2 66,0 43,2
Figure imgf000013_0001
BZ Bewertungszahl mBZ mittlere Bewertungszahl
%U prozentuale Anteil der Tiere mit Ulzera aller Schweregrade
Ul Ulkus-Index
Signifikationsberechnung, t-Test, p<0,05, versus Kontrolle 12
Tabelle 3
Fläche [mm2] Duodenaiulkus
Tag p.a. Ulzerogen 2 6 i 14 21 Gruppe r/n A r/n A r/n A r/n A r/n A
Kontrolle 8/10 40,9 5/5 25,1 4/5 17,5 4/5 13,0 3/5 14,9
Referenz - - 3/5 20,9 2/5 21 ,2 0/5 0 0/5 0
Dosis 1 - - 4/5 23,4 4/5 12,6 3/5 11 ,3 2/5 5,9
Dosis 2 - - 3/5 39,8 2/5 4,7 0/5 0 1/5 3,1
Dosis 3 - - 4/5 5,7 2/5 8,3 1/5 3,1 0/5 0
Figure imgf000014_0001
Tabelle 4
Fläche [mm2] Magenulkus
Tag p.a. Ulzerogen 2 5 8 4 21 Gruppe r/n A r/n A r/n A r/n A r/n A
Kontrolle 5/10 207,3 3/5 130,9 3/5 110,0 0/5 0 1/5 78,5
Referenz - - 4/5 90,4 2/5 53,4 0/5 0 0/5 0
Dosis 1 - - 3/5 238,8 3/5 93,2 1/5 113,1 1/5 28,3
Dosis 2 - - 2/5 64,4 1/5 28,3 0/5 0 1/5 12,6
Dosis 3 - - 2/5 28,3 1/5 12,6 0/5 0 0/5 0
Figure imgf000014_0002
r/n Anzahl der Tiere mit Ulkus vom Schweregrad 2-3/Anzahl der untersuchten Tiere A Fläche (bestimmt für Ulzera der Schweregrade 2-3) 13
Tabelle 5
Heliobacter pylori (Hp+) [%]
Tag p.a. Ulzerogen 2 5 8 14 21 Gruppe
Kontrolle 80 100 100 80 80
Referenz - 60 40 20 20
Dosis 1 - 100 60 60 60
Dosis 2 - 60 40 40 40
Dosis 3 - 60 20* 0* 0*
Figure imgf000015_0001
Signifikationsberechnung, Exakter Fisher-Test, p<0,05, einseitig, versus Kontrolle
Tabelle 6
(lortalitä t
Tag p.a. Ulzerogen 1 2 3 Gesamt Gruppe e/n e/n e/n e/n
Kontrolle 1/30 3730 5/30 9/30
Referenz 1/20 0/20 0/20 1/20
Dosis 1 0/20 1/20 1/20 2/20
Dosis 2 1/20 0/20 0/20 1/20
Dosis 3 0/20 0/20 0/20 0/20
Figure imgf000015_0002
e/n Anzahl der gestorbenen Tiere/Anzahl der Gesamttiere pro Gruppe

Claims

14Patentansprüche
1. Verwendung eines Preßsaftes, Verdauungssaftes oder Extraktes fleischfressender Pflanzen zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung von Proteinkinasen.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die fleischfressende Pflanze der Gattung Heliamphora, Saracenia, Darlingtonia, Cephalotus oder Nephentes angehört.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die fleischfressende Pflanze der Familie Drosera angehört.
4. Verwendung nach mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt ein wässriger Extrakt ist.
5. Verwendung nach mindestens einem der vorstehenden Ansprüche zur Bekämpfung von phototrophen Bakterien, Plasmodien, Chlamydien, Trypanosomen, Staphylokokkusbakterien, Streptokokkusbakterien, Candida, Mucor und Aspergilus.
6. Verfahren zur Behandlung eines Säugers, umfassend die Verabreichung eines Preßsaftes, Verdauungssaftes oder Extraktes fleischfressender Pflanzen zur Hemmung von Proteinkinasen.
PCT/EP1999/001176 1998-02-23 1999-02-23 Verwendung eines presssaftes, verdauungssaftes oder extraktes von fleischfressenden pflanzen zur hemmung von proteinkinasen WO1999042115A1 (de)

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