DE3844244A1

DE3844244A1 - Verbindungen mit antibiotischer cytostatischer und/oder antiviraler wirkung aus karnivoren pflanzen

Info

Publication number: DE3844244A1
Application number: DE3844244A
Authority: DE
Inventors: Florian Draenert
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-12-19
Filing date: 1988-12-29
Publication date: 1990-06-21

Description

Vor 60 Jahren entdeckte der britische Arzt Alexander Fleming das erste Antibiotikum, nämlich das Penicillin. Im Rahmen der mit dieser Entdeckung begonnenen Antibiotikaforschung wurden bis zum heutigen Tage zahlreiche weitere antibiotisch wirksame Stoffe entdeckt, wie Cepholosporine, Tetracycline oder Aminoglycoside. Neben den Antibiotika wurden weitere Chemotherapeutika entdeckt, wie Cytostatika oder antiviral wirksame Verbindungen.

Im Krankenhausbereich treten aber immer wieder Mikroorganis men auf, die gegen die herkömmlichen Antibiotika resistent sind. Außerdem ist das Wirkungsspektrum der derzeit bekann ten Cytostatika und Antivirusmittel noch nicht befriedigend.

Somit liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, neue anti biotisch, cytostatisch und/oder antiviral wirksame Verbin dungen bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung von Verbindungen mit antibiotischer, cytostatischer und/oder antiviraler Wir kungen aus karnivoren Pflanzen gelöst.

Antibiotisch, cytostatisch, antiviral oder in ähnlicher Weise biochemisch wirksame Substanzen werden von Organismen üblicherweise zur Abwehr gegen andere Lebensformen gebildet. Zu diesen Organismen gehören auch die karnivoren (fleischfressenden) Pflanzen. Karnivore Pflanzen bessern ihren Nährstoffgehalt auf, indem sie Insekten mit Duftstof fen anlocken, fangen und verdauen. Daher können sie auch auf äußerst nährstoffarmen Substraten, wie Hochmooren oder Vul kanasche gedeihen.

Die Nährstofflieferanten der karnivoren Pflanzen, die Insek ten, sind aber Träger von Mikroorganismen aller Art. Bei der Nährstoffabsorption ist die karnivore Pflanze gezwungen, die Permeabilität ihrer schützenden Epidermis zu erhöhen. Daher können die durch die Insekten eingeschleppten Mikroorganis men bei der Nährstoffaufnahme ins Pflanzeninnere gelangen und eine Infektion verursachen. Deshalb produzieren karni vore Pflanzen chemische Abwehrstoffe zum Schutz vor Infek tionen.

Erfindungsgemäß werden die von den karnivoren Pflanzen ge bildeten Verbindungen mit antibiotischer, cytostatischer und/oder antiviraler Wirkung bereitgestellt. Diese Verbin dungen sind erhältlich durch Extraktion der karnivoren Pflanzen mit den folgenden Schritten:

a) Abtrennung der Fallen von der Pflanze;
b) Zerkleinerung der Fallen, vorzugsweise in 0,5 cm² große Stücke;
c) Zugabe eines polaren Lösungsmittels, wie Wasser, vor zugsweise 1 ml Lösungsmittel/g Pflanzenfrischmaterial und Inkubation des Gemisches, vorzugsweise 24 Stunden bei Raumtemperatur;
d) Durchführung einer Perkolation bis der abtropfende Ex trakt keine nennenswerte Färbung mehr aufweist; und
e) Filtration des Extraktes.

Gegebenenfalls kann der Extrakt in üblicher Weise eingeengt werden und/oder die erfindungsgemäßen Verbindungen können durch eine Acetonfällung erhalten werden.

Bisher war lediglich bekannt, daß von Dionaea muscipula eine Verbindung gebildet wird, die in vitro eine cytostatische Wirkung aufweist. Diese Verbindung wurde aber bisher weder isoliert noch charakterisiert. Die cytostatische Wirksamkeit wurde lediglich anhand eines Preßsaftes von Dionaea musci pula ermittelt. Es wurde angenommen, daß dieser Preßsaft als lokales Phyto-Onkologikum (pflanzliches Krebsbehandlungsmit tel) verwendbar ist.

Erfindungsgemäß werden Verbindungen bevorzugt, die in Wasser löslich, in Diäthyläther unlöslich und mit Aceton ausfällbar sind.

Besonders bevorzugt wird das aus Dionaea muscipula erhältli che Dionin.

Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen weisen das folgende antibiotische Wirkungsspektrum auf:

a) positiv gegen Staphylokokken, wie S. aureus;
b) positiv gegen Lactose-positive Enterobacteriaceae, wie E. coli, Klebsiella, Enterobacter oder Serratia; und
c) positiv gegen Clostridien, wie C. perfringens, C. novyi, C. septicum oder C. histolyticum.

Die cytostatische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgt durch eine Verminderung der Mitoserate und eine Er höhung der Phagocytoseaktivität. Das antibiotische Wirkungs spektrum umfaßt zahlreiche humanpathogene Bakterien. Wegen der zunehmenden Resistenzbildung von humanpathogenen Bakte rien gegen bereits bekannte Antibiotika sind sie daher sehr interessant und versprechen zahlreiche medizinische Anwen dungsmöglichkeiten.

Ferner weisen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine anti virale Wirkung auf, so daß sie sich beispielsweise zur Be handlung von RNA-Virus-Infektionen, wie Retrovirusinfek tionen, z. B. von Aids, eignen.

Da die erfindungsgemäßen Verbindungen, insbesondere Dionin, bei Eukaryonten, Prokaryonten und Viren eine Verlangsamung der Mitose bzw. der Vermehrung bewirken, wird davon ausge gangen, daß sie in einen diesen Organismen gemeinsamen Me chanismus eingreifen, beispielsweise in die DNA-Replikation, die Transkription oder Translation.

Im Rahmen der DNA-Replikation könnten die erfindungsgemäßen Verbindungen durch Anlagerung an Nucleotide die DNA-Replika tion zum Erliegen bringen oder die DNA-Replikation als Sub strat-Analoga von daran beteiligten Enzymen hemmen, z. B. als Nucleotid-Analoga.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Her stellung einer der vorstehend genannten Verbindungen, bei dem man folgende Schritte durchführt:

a) Abtrennung der Fallen von der Pflanze;
b) Zerkleinerung der Fallen, vorzugsweise in 0,5 cm² große Stücke;
c) Zugabe eines polaren Lösungsmittels, wie Wasser, vor zugsweise von 1 ml Lösungsmittel/g Pflanzenfrischmate rial, und Inkubation des Gemisches;
d) Durchführung einer Mazeration, vorzugsweise durch 3-tä gige Inkubation des Gemisches, wobei dieses alle 12 Stunden gerührt wird; und
e) Filtration des Extraktes; und
f) gegebenenfalls Einengung des Extraktes und/oder Ausfäl lung der Verbindungen mit Aceton.

Außerdem ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Her stellung einer der vorstehend genannten Verbindungen, bei dem man folgende Schritte durchführt:

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind als Arzneistoffe, insbesondere als Antibiotika, Cytostatika oder Antivirusmit tel verwendbar.

Schließlich sind Gegenstand der Erfindung Arzneimittel, die eine der vorstehenden Verbindungen enthalten, insbesondere Antibiotika, Cytostatika oder Antivirusmittel. Die erfin dungsgemäßen Arzneistoffe können in an sich bekannter Weise in übliche Dosierungsformen konfektioniert werden, wie Ta bletten, Kapseln, Dragees, Pillen, Granulate, Aerosole, Si rupe, Emulsionen, Suspensionen und Lösungen. Dabei können inerte, nicht-toxische pharmazeutisch verträgliche Träger stoffe oder Lösungsmittel verwendet werden. Die zu verabfol gende Dosierung der erfindungsgemäßen Verbindungen hängt vom Zustand, den Symptomen, vom Gewicht und vom Alter des jewei ligen Patienten ab.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Material und Methoden 1 Versuchsstoffgewinnungsmethoden 1.1 Mazeration

Das Wort Mazeration stammt vom lateinischen Verb macerare (einweichen) ab. Das pflanzliche Material, aus dem die er findungsgemäßen Verbindungen isoliert werden sollen, wird bei einer Mazeration zerkleinert und mit einem Extraktions mittel (Lösungsmittel) versetzt.

Aus den bei der Zerkleinerung zerstörten Zellen gehen die Inhaltsstoffe sofort in Lösung, die Inhaltsstoffe der übri gen Zellen diffundieren durch die Cytoplasmamembran aus den Zellen heraus (Osmose) und lösen sich, bis ein Konzentra tionsausgleich zwischen Cytoplasma und Extraktionsmittel er reicht ist.

Den Zeitraum zwischen Beginn der Mazeration und dem Errei chen des Konzentrationsausgleichs bezeichnet man als Mazera tionsdauer. In der Regel treten nach 3 bis 7 Tagen keine we sentlichen Konzentrationsänderungen mehr ein. Dies kann bei spielsweise makroskopisch durch Farbveränderungen des Ex trakts beurteilt werden. Nach Beendigung der Mazeration wird das Extrakt filtriert, um noch vorhandene Zellbestandteile und weitere Verunreinigungen zu entfernen.

1.2 Perkolation

Der Begriff Perkolation stammt vom lateinischen Verb perko lare (durchtropfen) ab. Das Pflanzenmaterial, aus dem die erfindungsgemäßen Verbindungen isoliert werden soll, wird ebenso wie bei der Mazeration zerkleinert und in einer be stimmten Menge Extraktionsmittel suspendiert. Hier wird al lerdings vom Extraktionsmittel im Zeitraum t kontinuierlich eine bestimmte Volumenmenge V ₁ durch Abtropfen entfernt und gleichzeitig eine weitere Volumenmenge V ₂ frisches Extrakti onsmittel zugeführt. Dabei gilt: V ₁=V ₂=V _k (V _k= konstantes Volumen). Der Quotient V _k/t wird als Abtropfgeschwindigkeit bezeichnet. Somit handelt es sich bei einer Perkolation um eine stufenweise erfolgende Mazeration. Infolgedessen wird bei der Perkolation eine höhere Ausbeute an erfindungsge mäßen Verbindungen als bei der Mazeration erzielt. Die Per kolation läßt sich beispielsweise in einem Perkolator durch führen.

2. Plattendiffusionstest

Der Plattendiffusionstest wird auch als Disk-Test bezeichnet und ist ein Verfahren zum Nachweis der antibiotischen Wirk samkeit einer Substanz.

Die zu testenden Mikroorganismen werden auf einem geeigneten Nährboden ausplattiert, beispielsweise durch Ausstreichen oder Besprühen. Nach dem Eintrocknen der Mikroorganismen wird die zu testende Verbindung auf den Nährboden aufge bracht. Dies erfolgt entweder durch Auflegen eines mit der Verbindung versehenen Löschpapierplättchens oder durch In jektion der Verbindung in ein in den Nährboden gestanztes Loch. In der Regel ist die Löschpapierplättchenmethode bei aeroben Mikroorganismen und die Lochmethode bei anaeroben Mikroorganismen besser geeignet.

3. Die erfindungsgemäß verwendete karnivore Pflanze

Als beispielhafte Versuchspflanze wird Dionaea muscipula ge wählt, die unter ihrem Trivialnamen Venusfliegenfalle allge mein bekannt ist.

Beispiel 1 Isolierung von Dionin

Die Isolierung von Dionin aus Dionaea muscipula wird nach der Mazerationsmethode wie folgt durchgeführt:

5 g Fallen von Dionaea muscipula werden mit einem Skalpell zerkleinert, so daß etwa 0,5 cm² große Stücke erhalten wer den. Die zerkleinerten Fallen werden in ein Reagenzglas überführt und mit 5 ml deionisiertem Wasser versetzt. Das Gemisch wird 3 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen, wobei alle 12 Stunden umgerührt wird. Sodann wird die wäßrige Lö sung mit einem Schleicher & Schüll-Filter, Nr. 5893, abfil triert. Die weitere Isolierung des Dionins kann durch Ein engen der wäßrigen Lösung und/oder durch eine Fällung mit Aceton durchgeführt werden.

Die Isolierung von Dionin aus Dionaea muscipula nach der Perkolationsmethode wird wie folgt durchgeführt:

40 g Fallen von Dionaea muscipula werden mit einem Skalpell in 0,5 cm² große Stücke zerkleinert. Sodann werden die zer kleinerten Fallen in einen Tropftrichter überführt und mit 40 ml deionisiertem Wasser versetzt. Anschließend wird der Tropftrichter luftdicht verschlossen. An den Tropftrichter wird ein Lösungsmittelbehälter mit deionisiertem Wasser luftdicht angeschlossen. Der Lösungsmittelbehälter muß für die Perkolation eine Öffnung aufweisen, die sich oberhalb des Flüssigkeitsspiegels befindet. Nach einer 24-stündigen Inkubation des wie vorstehend erhaltenen Gemisches wird mit dem Abtropfen begonnen, wobei die Abtropfgeschwindigkeit etwa 0,15 ml/Minute beträgt. Das Abtropfen wird ausgeführt, bis das abtropfende Extrakt keine nennenswerte Färbung mehr aufweist. Zu diesem Zeitpunkt sind die Inhaltsstoffe bereits im wesentlichen extrahiert.

Anschließend wird das Perkolationsextrakt mit einem Schlei cher & Schüll-Filter, Nr. 5893, filtriert. Es werden 390 ml Perkolationsextrakt erhalten. Die weitere Isolierung des Dionins kann durch Einengen der wäßrigen Lösung oder durch eine Fällung mit Aceton durchgeführt werden.

Beispiel 2 Ermittlung des antibiotischen Wirkungsspektrums von Dionin a) Wirkung von Dionin gegen Staphylokokken

Humanpathogen ist vor allem Staphylocuccus aureus. Dieser weist eine häufige Resistenzbildung gegen chemische Noxen aller Art auf und stellt deshalb einen Problemfaktor im kli nischen Bereich dar (Hospitalismus). Das normale Habitas von Staphylococcus aureus sind Haut und Schleimhäute des Men schen. Zu den von Staphylococcus aureus ausgelösten Krank heiten zählen lokale Infektionen, wie Abszesse, Furunkel, Akne, Karbunkel, Wundinfektionen, Mastitis puerperalis, Sinusitis, Otitis media, Impetigo contagiosa sowie Ostitis aber auch Septikämien, Infektionen nach schweren Eingriffen, wie Herz- und Hüftgelenksoperationen und Pneumonien nach Influenzainfektionen. Außerdem werden durch die von Staphy lococcus aureus hergestellten Exotoxine Toxinosen hervorge rufen. Üblicherweise wird Staphylococcus aureus auf einem Selektivagar nach Vogel und Johnson gezüchtet. Auf diesem wird das Wachstum anderer Bakterien durch Tellurit, Lithium chlorid und eine hohe Glycerinkonzentration stark inhibiert. Staphylococcus aureus baut Mannit unter Säurebildung ab, die mit Phenolrot durch einen Farbumschlag von rot nach gelb nachgewiesen wird. Ferner baut Staphylococcus aureus Tellu rit zu Tellur ab. Dadurch färben sich die Kolonien schwarz. Daher erscheint Staphylococcus aureus nach einer Inkuba tionszeit von etwa 48 Stunden als schwarze Kultur mit gelbem Hof.

Für den Plattendiffusionstest wurde ein Dionin enthaltendes Perkolationsextrakt eingesetzt, das etwa 1,5 bis 2 g Pflan zenmaterial entspricht. Beim Disk-Test ist ein deutlicher Hemmhof erkennbar.

2. Wirkung von Dionin gegen Enterobacteriaceae

Die Enterobacteriaceae sind gramnegative, nicht sporenbil dende, teils begeißelte, teils unbegeißelte, fakultativ anaerobe stäbchenförmige Bakterien. Sie sind im Verdauungs trakt aber auch im Erdboden und in fäkalienkontaminiertem Material vorzufinden und umfassen sowohl kommensale als auch fakultativ pathogene und pathogene Gattungen und Arten. In der Regel beträgt ihre ideale Wachstumstemperatur 37°C.

Entereobacteriaceae gehören zu den heute am häufigsten als Krankheitserreger nachgewiesenen Bakterien. Sie umfassen Salmonella, Edwardsiella, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolica, Yersinia pestis, enteropathogene und enterotoxische Stämme von Esche richia coli, sowie die fakultativ pathogenen Gattungen Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Proteus, Providencia und Morganella. Die von den Enterobac teriaceae verursachten Krankheiten reichen von septischen Allgemeininfektionen (Salmonella typhi) über verschiedenste Arten von Diarrhö (Salmonella enteritidis, Edwardsiella, Shigella, Yersinia enterocolica) und Pneumonien (Klebsiella pneumoniae) bis zur Bubonen- und Lungenpest (Yersinia pestis). Ferner treten eine Vielzahl von Infektionen der Harnwege und des Respirationstraktes sowie Septikämien und Wundinfekte auf, welche durch die vorhergehend erwähnten pathogenen und fakultativ pathogenen Gattungen und Arten ausgelöst werden.

Für den Nachweis der antibiotischen Wirksamkeit der erfin dungsgemäßen Verbindung Dionin werden Gattungen der bereits als empfindlich identifizierten Lactose-positiven Enterobac teriaceae verwendet. Dazu gehören Escherichia coli, Kleb siella, Enterobacter und Serratia. Zur Isolierung und Anrei cherung dieser Gattungen wird als Selektivnährboden ENDO C- Agar verwendet. Lactose-positive Enterobacteriaceae bauen Lactose mit Hilfe des Enzyms β-Galactosidase zu Aldehyd und Säure ab. Das Aldehyd setzt Fuchsin aus einer Fuchsin-Sul fit-Verbindung frei. Daraus ergibt sich eine rote bis vio lettrote Verfärbung der Bakterienkulturen. Bei Escherichia coli ist die Fuchsinfreisetzung so stark, daß ein me tallischer Glanz entsteht. Andere Bakterien werden durch Fuchsin und Natriumsulfit in ihrem Wachstum fast vollständig inhibiert.

Es wird ein Plattendiffusionstest mit einer durch Perkola tion isolierten Dioninmenge durchgeführt, die etwa 1,5 bis 2 g Pflanzenmaterial entspricht. Das Ergebnis gegen Lactose- positive Enterobacteriaceaen ist positiv, d. h. ihr Wachstum wird inhibiert.

3. Wirkung von Dionin gegen Clostridien

Clostridien sind obligat anaerobe, sporenbildende, gewöhn lich grampositive in älteren Kulturen auch gramnegative Stäbchenbakterien und gehören zur Familie der Bacilliaceae. Sie kommen im Erdboden, sowie als Kommensalen im Verdau ungstrakt von Mensch und Tier vor und bilden teilweise To xine. Es gibt zahlreiche Arten. Clostridium tetani ist der Erreger des Tetanus, Clostridium perfringens, novyi, septi cum und histolyticum sind Gasbranderreger. Wachstumsvoraus setzung für Clostridien ist ein niedriges Redoxpotential, d. h. wenig Reduktionsmittel im Medium. Zur Durchführung des Plattendiffusionstests werden die Clostridien auf einem Thioglycolat-Nährboden gezüchtet. Thioglycolat und Cystein sorgen wegen ihrer reduzierenden Eigenschaften für ein anae robes Milieu im Nährboden. Die Petrischalen mit den beimpf ten Nährböden werden in einen Anaeroben-Topf gegeben, dem eine Mischung sauerstoffbindender Substanzen zugesetzt wird. Nach dem Schließen des Behälters entsteht bereits nach 1 Stunde ein streng anaerobes Milieu. Die Identifizierung der Keime erfolgt nach einer Bebrütungsdauer von einigen Tagen lichtmikroskopisch.

Der Plattendiffusionstest mit Gasbranderregern wird nach der Lochmethode oder auch nach der Einrührtechnik durchgeführt. Die Clostridien werden bei der letzteren in noch flüssige, etwa 50 bis 60°C heiße Nährböden eingebracht. Durch die hohe Temperatur sterben eventuell noch vorhandene anaerobe, nichtsporenbildende Mikroorganismen größtenteils ab und nur die Clostridiensporen überlegen.

Zum Nachweis der antibiotischen Wirkung gegen Clostridien wurden eine Dioninmenge verwendet, die durch Perkolation von 0,05 g Pflanzenmaterial erhalten wurde. Bei der Lochmethode weist der Hemmhof dabei einen Durchmesser von etwa 1,5 cm auf.

Claims

1. Verbindungen mit antibiotischer, cytostatischer und/oder antiviraler Wirkung aus karnivoren Pflanzen, erhältlich durch Extraktion der karnivoren Pflanzen mit den folgen den Schritten:

a) Abtrennung der Fallen von der Pflanze;
b) Zerkleinerung der Fallen;
c) Zugabe eines polaren Lösungsmittels, wie Wasser, und Inkubation des Gemisches;
d) Durchführung einer Perkolation bis der abtropfende Extrakt keine nennenswerte Färbung mehr aufweist; und
e) Filtration des Extrakts; und
f) gegebenenfalls Einengung des Extraktes und/oder Aus fällung der Verbindungen mit Aceton.

2. Verbindungen nach Anspruch 1, die in Wasser löslich, in Diäthyläther unlöslich und mit Aceton fällbar sind.

3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, die das aus Dionaea muscipula erhältliche Dionin ist.

4. Verbindung nach Anspruch 1 bis 3, die folgende antibio tische Wirkungen aufweist:

5. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem man folgende Schritte durchführt:

a) Abtrennung der Fallen von der Pflanze;
b) Zerkleinerung der Fallen;
c) Zugabe eines polaren Lösungsmittels, wie Wasser, und Inkubation des Gemisches;
d) Durchführung einer Mazeration; und
e) Filtration des Extraktes; und
f) gegebenenfalls Einengung des Extraktes und/oder Aus fällung der Verbindungen mit Aceton.

6. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem man folgende Schritte durchführt:

7. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Verwen dung als Arzneistoff.

8. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Verwen dung als Antibiotikum, Cytostatikum oder Antivirusmit tel.

9. Arzneimittel, enthaltend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

10. Antibiotikum, Cytostatikum oder Antivirusmittel enthal tend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4.