DE1470190A1 - Verfahren zur Herstellung eines Therapeuticums - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines Therapeuticums

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DE1470190A1 DE19631470190 DE1470190A DE1470190A1 DE 1470190 A1 DE1470190 A1 DE 1470190A1 DE 19631470190 DE19631470190 DE 19631470190 DE 1470190 A DE1470190 A DE 1470190A DE 1470190 A1 DE1470190 A1 DE 1470190A1
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RYSTAN Co MOUNT VERNON
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Description

  • Verfahren zur Herstellung eines Therapeuticums Die Erfindung betrifft ein Verfahren sur Herstellung eines neuen therapeutischen Mittels, das als aktiven Bestandteil einen Wirkstoff enthält, der aus ?ilakulturen gewonnen wurden die Hyphen oder einzellige Faden-Abzweigungen haben und die lan etwa vorgleichen hain alt solchen Gebilden, wie sie üblicherweise als Schi@@elpils-Überzüge und Bakterien (myceliated solds and moldlike bacteria) benannt werden. Im Nachfolgenden werden der Einfachheit halber diese Schimmelpilzartigen Überzüge und Baktérien als "Myzelium" bezeiochnet. Unter der ii nachfolgenden verwendeten Bezeichnung $"Myzelium-artige Substanz" wird ein Myzelium verstanden, das erfindungsgemäss behandelt worden ist.
  • Das W@sentliche der vorliegenden Erfindung und die damit erreichten Vorteile werden in der nachfolgenden Beschreibung und den Beispielen 11 einzelnen dargelegt und ergeben sich aus den in den Ansprüchen aufgeführten Verfahrensschritten, Verfahren@@aßnahmen und Substanzzusammensetzungen.
  • Gegenstand der Erfindung sind die neuen Verfahrensschritte, die Verfahrenssaßnahmen und die Substanzzusammensetzungen, wie sie nachstehend beschrieben sind.
  • R 54/1 Die folgenden Definitionen sollen das Verständnis der Erfindung erleichtern: der Ausdruck " unviable" oder "nicht-viable" bedeutet, s-it er aut Myzelium angewendet ist, die tote Filzmasse oder die schwammertigen Bacterisiden Körper der keimfähigem Form dieser Organismen, wie sie von ihren Nährmedium getrennt existieren und bei der Abseheidung und Aufarbeitung der ia üblicher Weise in den Nährmedien während der vorhergakenden Washstumsperiode dieser Organismen entstehenden Produkte anfallen. Der Ausdruck "Protoplasma", wie er im Folgenden benutzt wird, bezeichnet das wesentliche Material einer Zelle, das das Protoplast bildet. Du Protoplast ist in diesen Fall der Myzeliumkörper ohne seine Zellwände.
  • Es wurde gefunden, das wertvolle therapeutische Wirkstoffe erhalt.n werden können, wan man du Myzelium in einer solchen Art bhandelt, das die therapeutisch wirksamen Substanzen, die in dessen Protoplasma @a enthalten sind, der Assimilation besser zugänglich gemacht werden, ohne das die chemischen Bindungen in den wirke-en Substanzen, auf die die therapeutische A@tivität zurückzuführen ist, in Desorganisation geraten.
  • WEnngleich das Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht bgrenzt werden soll durch eine bestimmte Reaktionstheorie, so ag dennoch die nachfolgende Mögliche Irklirung zum Verständnis der Erfindung beitragen. Man hat bisher unmodifiziertes Myzelium an bestimmte Tierarten, insbesondere an Geflügel und Schweine alsQuelle eines sogenannten "undefinierten Wachstumsfakters" verfüttert. Offensichtlich waren solche Tiere, wenn diese Art Myzelium ingestiert wurde, fähig. daraus die Nährkomponente zu extrahieren. F@lglich besitzen solche Tiere Stoffe in sich, die die Zellwände von Myzelium zerreissen können, so das die Nährmaterialien der nachträglichen Extraktion zugänglich werden.
  • Dies ist jedoch nicht der Prall bei menschlichen Wesen (oder Ratten), was sich daraus ergibt, daß, wenn solches Myzelium von @e@schlichen Wezen verschrt und dann die Extr@sente dieser Ver@@chspersamen untersucht wern, man das Myzelium, das unver-@@dert den Verdau@ngstrakt pasziert hat, identifizieren kann, und dessen Chitim-Wände unserstört und dessen Protoplast unversehrt verfindet. Daraus folgt, daß die therapeutisch wirksammen Substammen ve Myselium, wie es erfindungsgemäss verwendet wird, unverwertbar sind, wem dieses Myzelium In unmodifizierter Per. an Menschen verabreicht wird. Die vorliegende Erfindung befasst sich demzufolge sit dem Modifizieren von solchem Myzelium in der Weise, daß die wirksamen Bestandteile zur Assimilation von Lebewesen einechl. Menschen, denen solche Stoffe verabreicht werden, s-ssbt werden.
  • Wenn, wie nachstehend in Einzelnen beschrieben, die aktiven Be-@ta@dteile von Myzelium für die ASsimilation geeigneter gemacht wurden, dann luss darauf geachtet werden, daß mögliche Desorgnisation der aktiven Substanzen, die für die therapeutische Wirkung von Bedeutung sind, vermieden wird. Obwohl, wie schon gesagt, die vorliegende Anmeldung nicht auf irgendeine mögliche Neaktionstheorie begrenzt ist, sag die nachfolgende Irklirung für das weitere Verständnis der diskutierten Einzelheiten von Bedeutung sein.
  • Es wird angenommen, daß die wirksammen Bestandteile der erfindungsgemäss hergestellten therapeutischen Mittel, chemisch gesehen, Polynucleotide sind@ und zwar insbesondere solche, die eine ganz bestimmte Folge von Nucleotiden besitzen, die für die therapeutische Wirksamkeit der Produkte bestimmend sind. Ein mögliche Erklärungstheorie geht dahin, daß die therapeutische Wirksamkeit der erfindungsgemäss hergestellten Myzelium-Produkte zurückgeführt werden kann auf die Anwesenheit von kurzen Segmenten der Mukleinmäurekette, ia der eine gewisse übliche Folge von einzelnen Meklectiden ein. "Instruktiion" an eine andere Zelle vermitteln, wodurch der Vorgang der Differentiation beginnt.
  • Infolgedessen erscheint es, wenn man die aktiven Wirkstoffe für die Assimilation besser geeignet machen will, wünschenswert, rauhe Behandlungsmethoden zu verseiden, die eine Desorganisation der einzelnen Muklectid-Gruppen bewirken könnten, beispielsweise ein Abspalten der Phosphtgruppe, wodurch das Muklectid in ein Nuklecaid umgewandelt würde. Konditionen, die vermieden werden sollen. sind ja einzelnen nmachstehend in der speziellen Beschreibung des Verfahrensablaufes z erläutert.
  • Wie vorstehend bereits gesagt, bezieht sich du Verfahren der vorliegenden Erfindung darauf. die aktiven Substanzen, die in den Protoplasms von Myzelium, wie es vorstehend beschreieben ist, ent-@alten sind, fur die Assimilation geeigneter zu machen. Demgemäss ist das Verfahren der Erfindung wie folgt ausgebildet: (1) Man behandelt das Myzelium, das üblicherweise zur Entfernung der unerwünschten Verunreinigungen ausgewaschen worden ist, in war solchen Weise, daß das Myzelium unviable wird, ohne daß Desorganisation der chemischen Strukturen in den Protoplasma, die für die therapeutische Wirksamkeit verantwortlich sind, eintritt; Led (2) man behandelt du unviable Myzelium in einer solchen Art, daß dessen Zellwände zerstört werden und dadurch die therapeutisch aktiven Komponenten für die Assimilation geeignet werden, ohne daß Desorganisation der chemischen Strukturen in den Protoplasma, die für die therapeutische Wirksamkeit verantwortlich sind, eintritt.
  • Au der nachfolgenden, ein Einzelheiten gehenden Beschreibung, wird ersichtlich, daß gemäss einer vorzugsweisen Ausführungsform der Erfindung das Myselium in einer solchen Art behandelt wird, daß die Polynuklectid-Komponenten des Myseli@@-Protoplasma teile weise Depolymerisiert werden, ohne daß jedoch Desorganisation der chemischen Strukturen in dem Protoplasma, die für die therapeutische Wirksamkeit von Bedeutung sind, eintritt. Stroh die teilweise Depolymerisation der Polynuklectid-Komponenten Wird die Assimilierbarkeit der therapeutisch wirksammen Komponenten verstärkt. Im allgeseinen liegt der Grad der Depolymerisation so, daß eine merkliche Abnahme des Molekulargewichte der Polynukleotid-Komponenten erfolgt; beispielsweise beläuft sioh der Depolymerisationgrad dahin, daß die resultierenden Oligopolynukleotide Molekulargewichte in der Größenordnung von 600 bis 1.000.000, vorzugsweise 600 bis 30.000 aufweisen. Die vorstehand Jedoch bereits gesagt, zur die Depolymerisation ii solcher Art verlaufen, daß keine Desorganisation der chemischen Strukturen in de. Protoplamma, das für die therapeutische Wirk@@@keit ausschlag@gebend ist, eintritt.
  • Vorteilhaft wird das erfindungsgemäss Verfahren se ausgestaltet, daß die aktiven Wirkstoffe des Myzelium-Protoplasma gereinigt werden in der Weise, daß abgebaute Karbohydrate oder Pretein-artige Stoffe von den Polynukleotid-Komponenten des Myselium-Protoplasma abgetrennt werden. Spesifische Verfahrenssehritte für diese Arbeitsstufe werden nachstehend im einselnen beschrieben werden. Die vorgenannte Reinigungsstufe Ist insbesondere dann wünschenswert, wenn die therapeutischen Mittel zum parenteralen Gebrauch oder zum Injizieren bestimmt sind, um möglicher allergische Reaktionen oder sonstige unerwünschte Nebeneffekte zu verhindern.
  • Du erfindungsgemäss Verfahren gibt ferner eine Möglichkeit, die Polynukleotid-Komponenten des Myzelium-Protoplasma zu konzentrieren und dabei therapeutische Kompositionen von gesteigerter Wirkungskraft zu erhalten. Technische Einzelheiten, lit denen bh dies erreichen lässt. werden im Einzelnen nachstehend beschrieben werden.
  • Du erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht es ferner, die gewonnenen Produkte mit einem @odierungsmittel zu behandeln, wodurch, wie es scheint, die therapeutische Wirksamkeit dieser Produkte weiterhin erhöht wird. Verfahrenseinzelheiten fur diese Arbeitsstufen werden nachstehend beschrieben werden.
  • Die folgende Beschreibung besicht sich auf eine spezielle Erklärung der Materialien, Arbeitsvorgänge und Bedingungen, die bein Verfahren der Erfindung zur Anwendung korrrn.
  • Wie vorstehend gesgt, sind die für das Verfahren der Erfindung verwendeten Myzelien selche, die von Filskulturen iit Hyphen oder einzelligen Fadenversweigungen erhalten wurden. Typische Beispiele von Myzelien, die für das erfindungsgemässe Verfahren eingesetzt werden kännen, und wertvolle therapeutische Mittel ergeben, sind die Streptomysin-Myzelien, Die Gattung Streptomyces besteht aus schimmelpilzartigen Mikroorganismen, von denen zahlreiche Arten Bedeutung gewonnen haben für die gewurbliche Gewinnung von @ahlreichen wichtigen pharmazeutischen Produkten, Antibiotika und Vitaminen, durch Absonzur aus @ährböden, ii denen diese Streptomyces gesüchtet werden. Gemäss diesen Herstellungsverfahren lässt man geeignete Streptomyces-Arten oder einen Stamm solcher Spezies auf geeigneten Nährböden wachsen, und dies Nährböden oder Nährflüssigketten werden von den wachsenden Bakterienkörpern - oder n, zelien, wie man sie nennt - durch einen Filtrationsprozess nach einer gewissen Zcit abgetrennt. Das Mährmedium, das die erzeugten stoffe gelöst enthält, geht als Filtrat durch das Filter hindurch, während das Myzelium, das aus besonderer organischer Substanz zusammengesetzt ist, von den Filter zurückgehalten wird.
  • Beispiele von erfindungsgemäss verwendbaren Myzelien sind folgende: Art Beispiel Penicillium P. notatum Aspergillus A. oryzas oder A.ntger Zygomycete Z.iucor Saccharomycetes 8. l@dwigii Ustilage U. tritici.
  • Wie vorstehend bereits gesagt, werden die Mymlien, die erfindungsgesäss verwendet werden sollen, in allgemeinen zwecks Entfernung von Verunreinigungen gewaschen, bevor sie erfindungsgemäss behandelt und die darin enthaltenen therapeutisch wirksammen Substanzen für die Assinilation besser ausnutzbar gemacht werden.
  • Normalerweise sollen die M. zelten gewaschen werden, bevor ian je in den unviablen Zustand überführt, Jedoch kann man, falls dies gewünscht wird, stattdessen das Waschen auch vornehmen, nachdem sie @nviable gemacht worden sind. Es kann Jedes geeig-..ete Waschmittel verwendet werden.
  • Wie man weiss, ist das Protoplasma das organische Material der Zellen und besteht aus relativ polymerisierten Kohlehydrat-und Lipoid-Molekülen, die komplexgebunden sind mit Protein und Polynuklectiden. Neim Waschen mit Wasser oder mit einem anderen geeigneten wässrigen Medium werden vom den Myzelium und dem darin vorhandenen Protoplasma solche Substanzen entfernt, die Keine organischen Bestandteile der Zelle darstellen und daher Fre@dstoffe ii Vergleich alt den für den Stoffwechsel unentbehrlichen Substanzen bilden.
  • Beispielsweise kann das Myzelium zunächst mit einer Alkohollösung (90 %ig) Led dann mit Wasser gewaschen werden. Die Akkoholwäsche dient zur Entfernung von Lipoiden und trägt auch dazu bei, das Myzelium unviable zu machen. Durch die Wasserwäsche werden Feptene und wasserlösliche Verunreinigungen, die anwesend sein können, entfernt.
  • Pur das Waschen der Myzelien mit Wasser oder wässrigen Lösungen vermeidet sen zweckmässig solche Lösungen, die einen pH-Wert oberhalb "physiologischer Neutralität" (die alt einer oberen Grenze von etwa pH 7,5 - 8,0 definiert ist), denn oberhalb dieses Bereiches können in dem Waschwasser bereits solche Protoplasmatische Bestandteile löslich sein, die sen in des ARzneimittel-Endprodukt zurückzubehalten wünscht.
  • Wenn man, wie oben beschrieben, alt einem Losungsmittel auswäscht, so ist es wünschenzwert, daß sen die Verwendung solcher Lösungsmittel vermeidet, die eine Auflösung einer @erkbaren Menge von Polynukleotiden und deszufolge einen Verlust an diesen bewirken.
  • Wie zuvor angezeigt, werden die erfindungsgemäss verwendeten Myzellen durch Abtöten der Myzelien in irgendeiner üblichen Weise unviable gemacht. Dabei soll jedech, wie bereits gesagt» die verwendete Mothods nicht so scharf sein, daß Desorganisation der individuellen Nukleotide der Polynukleotid-Komponenten des Myzelium-Protoplasmas eintritt. Es liegen zwei Grände vor, de@etwegen das Myzelium in einen unviablen Zustand übergeführt werden muss. hinab ist es nicht wünschenswert, lebende Ortni@men der ii Zusammenhang itt der vorliegenden Erfindung verwendeten Art (z.B. Streptomyces mycella) Patienten nit ernsten Krankheitssymptomen einzugeben. So weiss san beispielsweise, da obgleich alle bekannten Streptomyces alter Ublichen Bedingungen Saprophyten sind, einige Saprophyten pathogene Wirkungen haben können, wenii sie in Berührung kommen mit einem möglichen Wirt, dessen Widerstandsfähigkeit oder Abwehrbereitschaft durch Krankheit geschwächt ist. Die Streptomyces-Gattung gehört zu der Gruppe der Actinomycetales in denen Man als artverwandte Gattung das Mycobakterium (zu dem der Tuberkelbazillus) gehört), die Actionoiyces (zu denen viele patogene Arten Gehören) und die Ncardia findet; diese Verwandtschaft und auch die Überlegung, daß eine Umwandlung in eine möglicherweise patogene Anordnung nicht g@@ßerhalb der Möglichkeiten liegt, hat es wünschenswert gesucht, die lebenden Organismen abzutöten oder zu devitalizieren, bevor sie verabreicht werden.
  • Es können vielerlei Methoden angewendet werden, um die Myzelien, abzutöten Land die verbleibende Masse an abgetöteten Organismen für die Zwecke der Verabreichung an den Menschen zu formen, beispielsweise chemische Behandlung (z.B. Phenol, Formaldehyd), Zephiran usw.) oder physikalische Behandlungen (z.B. Ausfrieren Vibrationsbehandlung mittels Supersonator), wie dies ii einzelnen in den nachfolgenden Beispielen angegeben ist. Manche diese Behandlungsarten ergeben Präparationen, die nicht anar oral, s@ndern auch parenteral verabreicht werden können, z.B. auf subkutanen, intramuskularem, Intraperitonalem, intraple@ralem oder intravenösem Wege. In den nachfolgenden Beispielen st dies Jeweils angegeben.
  • Wie suvor angezeigt, besteht eine wichtige Stufe bei der erfindungsgemässen Behandlung von Myzelium, dessen aktive Komponente für die Assimilation erfindungsgemäss besser geeignet gemacht wird, darin, daß @nviable Myzelium derart zu behandeln, daß die Myzelium-Wände zerstört werden. Bei dieser Behandlung dürfen Jedoch, wie dies vorstehend ausgeführt wurde, die chemischen Strukturen in dei Protoplaama, die die therapeutische W@rksamkeit bedingen, #keiner Desorganisation unterliegen. Zu den Methoden, die ian zum Zerstören der Zellwände des Myzeliums benutzen kann, gehören (a) Zerkleinerung oder andere Arten von mechanischer Zerstörung der Zellwände, oder (b) chemische oder enzymatische Zerstörungen.
  • Unter (a) fallend wurde beispielsweise gefunden, daß maß durch Vermahlen des Myzeliums in einer Pulverisiermühle einen ttserapeutischen Effekt erzielen kann, der nicht auftritt, wenn unmodifizierte Masse verfüttert wird. Ein einzelner Mahlvorgang oder ein solcher, bei den die Teilchen in einer durchschnittliegen Größe von etwa lo Mikron anfallen, erbringt etwas therapeutische Wirkung, Jedoch keineswegs eine so grosse, wie sie itt wiederholtem Mahlen erreicht werden tann, bei dem die Tellchengröße ii Durchschnitt in der Größenordnung von etwa 1 Mikron anfällt. Man kann die Myzelium-Wände auch durch wiederholtes Gefrieren und Auftauen oder durch ültraschallbehandlung zerstören.
  • Unter (b) fällt eine Arbeitsweise, bei der die Zerstörung der Zellen durch Eintauchen der trocknen Myzelium-Masse in Wasser wihrend einer langeren Zeitspenne erreicht wird und dabei werden die Aminopolysaccharid-Gruppen der Chitinwändeoder die Hydroxylgruppen der Cellulosewände vollständig hydratisiert.
  • Ein andere geeignete chemische Methode, lit der sich eine Zerstörung der Zellwlnde erreichen lässt, besteht darin, die Masse mit einen Mittel Zu behandeln, das Cellulose oder Chitin aufzulözen vermag, wie beispielsweise ammoniakalisches ZinkchlorId oder Kupfersulphat. Auch Enzy@@ kannen verwendet werden, um die Zellwände des Myzeliums zu zerstören, beispielsweise Lysoxym, Chitinase und Cellulase. Wenn man chemische Mittel verwendet, um die gewünschte Zerstörung der Myzeliumwände zu erzielen, so muss dafür Sorge getragen werden, daß die aktiven Wirkstoffe des Protoplasmas in des d Myzelium flieht merklich desorganisiert werden, da die Bestandteile des Protoplasmas so weit wie iöglich intakt gehalten werden sollen.
  • Wie vorstehend angezeigt, ist es vorteilhaft, daß die Polynukleotid-Bestandteile, die in dem Myzelium-Protoplasma enthalten sind, teilweise depolymerisiert werden, weil dadurch anscheinend die Assimilierbarkeit der therapeutisch wirksammen Komponenten des Protoplasmas erhöht wird. Bevor die verschiedenen Arbeitsweisen, die zu dieses Zwecke angewendet werden können, näher @lä@tert werden, erscheint es uns bracht, eine Erläuterung im Hinblick auf den Ausdruck "Polynukleotide zu geben.
  • Als Polynukleotid wird ein Komplex definiert, der eine Ureld-Base enthält, die mittels eines Teiles eines Carbohydrates dit einem Phosphat-Rest kombiniert ist. Eine weitere Bindung -dieses Phosphatrestes ist verestert oder salzartig gebunden mit einsi anderen ureidähnlichen Teil, wahrscheinlich einem Bestandteil in einem Lipoid, Protein, Carbobrdrat, oder einer anderen nukleotiden Base. Beispiele solcher Polynukleotide dieser Art, die als protoplasmatische Bestandteile des Myzeliums vorhanden sein können, werden nachstehend beispielsweise zur V@eranschaulich angeführt; sie sollen jedoch nicht als Begrenzung verstanden werden (1) Ribonucleoprotein, (2) Besoxyribonuclech@ston, (3) Pentose Nucleinsäure, (4) Coenzym 1, (5) Coenzym A, (6) Phosphogalactose Isomerase-uridindiphosphatglucose-Komplex, (7) Flavin adenin dinucleotid, (8) Triphosphopyridinnucleotid, (9) Uridylomuraminsäurepeptid, (lo) Folch-Usman Liponucleoprotein, (11) Polyorotinsäureglucosephosphat und (12) Polyhydroxycytiddyl insäure.
  • Es muss darauf hingewiesenwerden, daß die oben aufgeführten Nucleotide in der lebenden Zelle existieren und auch in der nicht-viable gemachten Zelle als Bestandteile des Gesamtplasmas einer solchen Zelle vorliegen; jedoch ist lhre Klassifikation als individuelle Materialien, die als solche existieren, eine rein operative Angelegenheit, da das Protplasma seinen Charakter vollständig ändent, wenn diese Mukleotide als Einzelbestandteile abgetrennt sind. Daher lassen sich letztlich die chemischen Charakteristiken zwar beschreiben, aber nicht definieren. wie dies auch der Fall ist bei den Proteinen, die in gleicher Weise fundamentale Bausteins des Protoplasmas sind und untrennbar von dieser, falls dieses seinen pro@plasmatischen Charakter behalten soll. Zwarhat sen einmal geglaubt, man könnte Proteine chemisch definieren aRd ihrer Kristallisierbarkeit, wie man dies mit einfachen Substanzen wie beispielsweise Glucose, Natriumchlorid oder Bleisulphi@ tun kann, Jedoch hat sich herausgestellt, daß selbst kristallines Protein keine Homogenität der Moleküle aurweist, sondern eher ein "Spektrum" von eng verwandten, Jedoch individuell verschiedenen (bis zu einem gewisen Grad verschiedenen ) Molekülen darstellt (vgl. O,J. Martin, Clinioal Snzymology, Little Bro@n@ Co., 1959).
  • Pur die teilweise Depolymerisierung der Polynuklectidbestandteile des Myzelium-Protoplasmas werden vorzugsweise enzymatische Präparat ionen, die Nukleassenzyme (Polynukleason) enthalten, verwendet. Beispiele fUr Materialien, die flir solche Zwecke geeignet sind und in denen sen Nukleaseenzyme gefunden hat, sind Pankreatin wo Rind gewonnen, getrocknetes Pulver der Ohrspeicheldrüse vom Schwein, Streptococale Varldas, ungereinigtes Papain und Aspergillus, gewonnen von ungereinigter Carbohydrase. Wie aus den nachfolgenden Erläuterungen entnommen werden kann, dienen solche Enzympräparationen nicht nur duu, die gewünschte teilweise Depolymerisation zu bewirken, sondern sie enthalten auch ausreichend zusitzliche wirksame proteolytische Enzyme, um proteinartige Substanzen aus den Polynukleotidkomponenten zu depolymerisieren und deren Abtrennung zu bwirken.
  • Wie vorstehend angezeigt, ist es vorteilhaft, das proteinartige Material von den erfindungsgemäss gewonnenen therapeutischen Produkten abzusondern. Verschiedene Arbeitsweisen können dafür benutzt werden. Ein Weg, die Abtrennung der proteinartigen Substanzen zu bewirken, besteht darin, die M@@ylien mit Chloroform starken Bewegungen auszusetzen, wodurch die Wasserstoffbindung, durch die die Nukleotide chemisch mit den Proteinhülsen verbunden sind, zerstört werden, und danach kann man die freigemachten Polynukleotide aus der Chloroform-Myzelium-Kmulsion mit geeigneten Salzlösungen oder mit verdünnter Ammoniaklösung extrahieren. Die Arbeitsweise ist geeignet zur Abtrennung der proteinartigen Materialien von den Polynukleotidbestandteilen, jedoch erreicht man damit nicht die gewünschte teilweise Depolymerisation der Polynukleotidbestandteile. Wenn man dagegen dio üblichen Enzympräparationen der Polynukleaxoart, wie oben angegeben, verwendet, so hat man eine zweifache Funktion einerseits k ann man die pro@einhaltigen Bestandteile von den Polynukleotiden abtrennen, andererseits erreicht man die gewünschte teilweise Depolymerisation der Polynuklei@komponenten. Einen ähnlichen Effekt erreicht man in den Fällen, in denen der keimende Organismus einen hohen inneren proteolytischen Enzymgehalt aufweist, wie dies der Fall ist, bei thermophilen Aotinomyces oder Aspergillus, wenn man die Kulturen bei einer Temperatur unterhalb des Inaktivierungspunktes solcher proteolytischen Knzyme stehen hast; beispielsweise bei irgendeiner Temperatur zwischen 20 und 36°C über mehe-re Stunden oder Tage.
  • In dieser zeit Iluft in den Zdllen ein Prozess ab. der als Autolyse oder "Selbst-Digestion" bekannt ist und bei dem die Polynukleotid-Bestandteile von den proteinartigen Substanzen freigesetzt werden und wobei gleichzeitig die Polynukleotid-Bestandteile teilweise Depolymerisation unterliegen.
  • WUr du erfindungsgemässe Verfahren ist es weiterhin zweckmässig. die Polynukleotid-Bestandteile des erfindungsgemäss behandelten Myzeliums zu reinigen und zu konzentrieren. Eine mögliche Arbeitsweise dafür besteht darin, daß mit verdünntem Alkuli (beispielsweise mit lo %igen Ammoniumhydroxyd oder k0 %igem Pyridin) extrahiert und dann mit Säure wieder ausgefällt wird. Weitere vorteilhafte ARbeitsweisen für diese Zwecke sind beispielsweise (a) Klution aus einer chromatographischen Säule, (b) differenzierte Elektrophorese und (c) fraktionierte Fällung der Schwermetallsalce wie beispielsweise der Cupriuder Cupro-Nukleotide.
  • Weiterhin wurde festgestellt, daß Ln vielen Fällen die therapeutische Wirksamkeit der erfindungsgemäss hergestellten therapeutischen M ttel noch verstärkt werden kann durch Jodierung des erfindungagemäss hergestellten Myzeliummaterials.
  • Es hat den Anschein, als ob das Jod in dem jodierten erfindungsgemäss hergestellten Myzelium-Produkt ein chemische Bindung eingeht mit den aktiven Komponenten des Myzelium-Materials.
  • In eine. solchen Jodierten Produkt wird nicht-ionisches Jod im allgemeinen in einer Menge von etwa 0,1 bis 5 Teilen und vorzugsweise etwa o,75 bis 3 Teilen Je loo Teile Myzelium-Material eingebaut.
  • Als J dierungsmittel können für die Zwecke der vorliegenden Erfindung vorzugsweise solche verwendet werden, die Jod als Moleküle oder als Element abgeben oder die Jod in einer Form enthalten, in der es als Elektronen abgebenden oder oxydierendes Mittel im Sinne der Klektronenlehre vorliegt. Beim Jodieren des jodierfähigen Materials ist es wesentlich, daß Wasser in einer so ausreichenden Menge vorhanden ist, daß das Jod in chemischem Kontakt mit der reaktiven Verbindung der zu jodierenden Substanz gebracht werden kann. Eine wirksame Jodierung kann man beispielsweise dann erreichen, wenn Wasser in einer Menge von wenigstens 20 % des Gesamtgewichtes an jodierendem Material anwesend ist. Es soll erwähnt werden, daß das für die Jodierung erforderliche Wasser sowohl durch die in den zu kodierenden M terlallen vorhandene Feuchtigkeit als auch durch vo@ @@ zugefügtes Wasser eingebracht werden kann. Das zu Jodierende Material soll mit dem Jodierungsmittel eine ganügend lange Zeit in Kontakt belassen werden, damit das vorhanden elementare Jod vollständig verbraucht werden kann. Im allgemeinen ist eine Zeit von lo Minuten bis zu 3 Tagen angebracht.
  • Der vollständige Verbrauch des Jods kann durch Prüfung auf freies Jof in dem zu jodierenden Material vermittels der üblichen Jod-Stärke-Prtirung bestimmt werden.
  • FUr praktische Zwecke besteht das Jodierungsdttel aus (a) Jod in kristalliner Form, das zu des Jodierenden Material zugefügt wird, oder (b) Jod in verd@@pfter Form, das durch das zu Jodierende Material durchgeleitet wird, oder Jod, das in irgendeinem mindestens etwa mit dem in wässriger Phase gelöstem oder suspendiertem zu jodierenden Material mischbaren Lösungsmittel gelöst ist. In einer wässrigen Lösung ist elementares Jod in einer Menge von etwa 30 Milligram Je loo com Wasser bei Raumtemperatur löslich, und diese Lösung ist für die vorliegenden Zwecke sehr gut geeignet: die Löslichkeit von Jod kann durch Zugabe von Alkohol oder Kaliumjodid erhöht werden, so dab man das Volumen an wässriger Lösung, das zuzufügen ist, geringer halten kann. Alkohol erhöht die Löslichkeit von Jod in Wasser, und Kaliumjodid bildet mit molekularem Jod eine Kompoexverbindung KJ3. in der der oxidative Effekt des Jod erhalten bleibt, jedoch nimmt man an, daß unter diesen Bedingungen das molekulare Jod als Jodierungsmittel wirkt.
  • Diese Ausführungen sollen nicht bedeuten, daß Kalium, Natrium, Kalzium oder andere lösliche Jodide unter allen Umständen unwirksam seien, denn wenn man eine Lösung von beispielsweise Natriumjodid in einer solchen Konzentration oder Menge verwendet, daß man chemisch gebunden und in ausreichender Menge elementares Jod zur Verfügung hat, dann kann man eine solche Lösung, falls sie Im sauren Medium wirksam ist, oder falls die Reaktionsmischung Wasserstoffperoxyd oder andere Oxydationsmittel enthält, die molekulares oder elementares Jod aus dieser ionischen Form freimachen, ebenfalls einsetzen. Unter diesen Umständen ist es das elementare oder molekulare Jod, das als Jodierungsmittel wirksam wird.
  • Wenn man Myzelium erfindungsgemäss behandelt, so sollten sowohl hohe als auch niedrige pH-Werte vermieden werden, da bei jedem solcher hohen Grade an Acidität oder Alkalinität Hydrolyse der Polymeri sat ionabindungen zwischen benachbarten Nukleotiden in der Nukleotid-Sequenz, die oben erwähnt wurde, eintreten kann. Im allgemeinen ist ein pH-Bereich zwischen etwa 2,7 und 11,3 ausreichend sicher; in diesem Bereich wird Desorganisation der Nukleotid-Sequenz nicht auftreten. Natürlich lässt sich der Desorganisationseffekt bei pH-Werten oberhalb oder unterhalb des vorgenannten Bereiches zurückdrängen dadurch, das man die Dauer von scharfen Anstiegen hinsichtlich Acidität oder Alkalinität begrenzt - so kann beispielsweise ein zeitweiliger Anstieg der Acidität auf einen pH-Wert von 2, wie er beispielsweise an @rtlich begrenzten Teilen der Lösung, wenn diese mit Schwefelsäure oder Hydrochlorsäure angesäuert wurde, auftritt, von der Myzeliummischung verkraftet werden, ohne daß Inaktivierung der wirksamen therapeutischen Bestandteile auftritt. Unkontollierbares Ansteigen der Alkalinität oder Acidität, das Desorganisation der Nukleotid-Gruppierungen bewirken kann, sollte vermieden werden.
  • Die vorbeschriebenen erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen sind wenn sie Patienten eingegeben werden, wirksam bei der Behandlung von Krankheiten. Unter den Patienten, die mit dem erfindungsgemäss hergestellten therapeutischen Mittel behandelt wurden, befanden sich solche mit rheumatischen Beschwerden und Osteoarthritis, mit Magenkrankheiten, infektiöser Monoukoeose, wiederkehrender Furunkulose, thrombopenischer Purpura und chronischer Neuropathte. Die erfindungsgemäss hergestellten therapeutischen Mittel erwiesen sich in vergleichaweise geringen Dosen wirksam. Um beispielsweise eine chronische infektiöse Monon@kleose zum Abklingen zu bringen, waren nur zwischen 4 - 10 g Je Tag (bei einer mittleren Dosis Von 7 g) an erfindungsgemäss behandelter Streptomyces mycelia erforderlich, un optimale Heilung des Patienten unter diesen Bedingungen zu erzielen. Weiterhin wurden ähnlich niedrige Dosen fUr zweckmässig bei der Behandlung anderer oben aufgeführter Zustande befunden.
  • Bestimmte erfindungsgemäss gewonnene therapeutische Mittel haben sich als wirksamer Schutz gegen die txischen Effekte von Strahlung erwiesen.
  • Die erfindungsgemäss hergestellten therapeutischen Mittel sind in vergleichsweise niedrigen Dosen wirksam. Dies ergibt vielerlei Vorteile. Beispielsweise können auch solche Patienten, die sich in einem sehr ernsten Krankheitszustand befinden, mit dem erfindungsgemäss hergestellten Mittel wirksam behandelt werden, ebenso wie stark entkräftete Patienten oder solche, die Ekel davor empfinden oder in anderer Furm Magen oder Darbeschwerden haben, so daß die Einnahme größerer Mengen von Medikamenten listig oder sogar unmöglich ist. Damit ist gemeint, das die Vordriess@chkeit, die schon mit der Krankheit als solcher verbunden ist, durch derartige Einnahmen verstärkt wird.
  • Auch können die Medikamente gänzlich verweigert werden oder in nur unzureichenden Mengen eingenommen werden. Patienten der vorbeschriebenen @rt können mit den erfindungsgemäss hergestellten therapeutischen Mitteln behandelt werden» ohne daß unangenehme Enwirkungen auftreten, weil die Wirksamkeit dieser Mittel bereits in relativ geringen Dosen eintritt.
  • Außerdem sind die erfindungsgemäss hergestellten therapeutischen Mittel solcher Art und in so geringen Mengen wirksam, daß keine Gefahr von ernsten Nebenwirkungen infolge Anwenseheit toxischer Materialien in nennenswerten Mengen gegeben ist.
  • Die nachfolgenden Beispiele zeigen Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens zur Herstellung von therapeutischen Mitteln.
  • Beispiel 1 1 kg Myzeliumausbeute, wie sie bei der Züchtung von Streptomyces @@niceus var Floridae nach 24 Stunden Wachstumsperiode auf einem Nährboden aus einem Aufguss von S@jabohnenmehl gbildet wurde, wurde von dem Nwhrbodel. abgetrennt und durch wirkbeltrocknen von de anhaftenden Spuren von überschüssiger Kulturlösung in einer S@arples -Zentrifuge befreit. Die Myzelium-Masse, die beim Zentrifugieren anfiel, wurde dann drei Mal mit 3 1 absoluten Propylalkohol gewaschen bis das Waschwasser nicht länger bräunlich gefärbt war. Die vorbeschriebene Alkoholbenandlung erbrachte eine teilweise Zerstörung der Zellwände. aer überschüssige Alkohol wurde seinerseits von dein jetzt nicht viablen gewaschenen Myzelium @n einerSharples-Zentrifuge abgetrennt; das nicht viable Myzelium blieb zurUck. Die Myzelien wurden mit einem Produkt behandelt, das depolymerisierte Enzyme (Pancreatin) enthielt. Diese enzymatische Behandlung, die nachstehend im einzelnen beschrieben wird, erbrachte eine teilweise Depolymerisation der Polynmkleotid-Bestandteile der Myzelich.
  • Es wurde auch die @lakosität der Myzelium-Masse verringert und dadurch wurde die weitere handhabng und die nachfolgende Tablettierung des Materials erleichtert. Die enzymatische Behandlung wurde wie folgt durchgeführt: o,6 6-o, kg des vorerwähnten Myzelien-Materials wurdenin 5 1 einer M/5 Kaliumphosphat-gep@fferten Lösung mit einem pH-Wert von annähernd 8,0 suspendiert. 5 ccm einer lo %igen Suspension von Pacreatin U.S.P. in einer 0,5 %@g Magnesiumsulphat enthaltenden wässrigen Lösung wurden dann zugegeben und der Behälter wurde in eine Virbrations-Schüttelvorrichtung eingestellt und 3 Stunden darin belassen, wobei darauf geachtet wurde, daß die Temperatur in den Grenzen zwischen 32 und 410C gehalten wurde.
  • Zu diesem Zweck wurde der Behälter mit einem Warmhaltementel umgeben. Am Ende dieser 3 Stunden (die Zeitdauer ist eiz»e angenäherte und mag um 1/2 Stunde nacrl jeder Rüchtung variieren) war die Masse der hochpolymerisierten Polynukleotide n dem Myzelium, die die hohe Viskosität der Masse bewirkt, und die die nachfolgende Lyophilisation schwierig macht, ixl weniger viaose Oligopolynukleotide umgewandelt ( e ein Zustand, ilA dem die therapeutisch aktiven Bestandteile besser assimilierba@ sind), und der Behälter mit sein. Inhalt wurde schnell gefroreli, um die Wirksamkeit der Enzyme in dem zugegebenen Pancreatin abzustoppen. Aus diesem gefroreren Zustand heraus wurde der Inhalt e@sgetrocknet (lyophilisiert), wobei ein volumindöses, cremfarbenes oder bräunliches Pulver anfiel.
  • Gow.-teile Lactosepulver wurden zu dem nun zu di#gestierenden Myzelium-Rückstand in dem Behälter zugegeben und darin innig zu einem körnigen Pulver vermischt, das zum Tablettieren geeignet war. Es können daraus Tabletten Jeglicher üblichen Größe hergestellt werden, was allein abhängig ist von der Indikation.
  • Als Beispiel mag angeführt sein, daß dio Wirksamkeit des endgüultigen, mit Lactose vermischten Reaktionsproduktes als ein antirheumatisches Mittel und als ein Antientzündungsmittel fUr einen P; tienten mit rheumatischer Arthritis zur Linderung der Schmerzen, der Schwellungen, ausreichend war, wenn das Präparat in Dosen von 3 - 500 mg-Tabletten vier Mal pro Tag gegeben wurde.
  • Beispiel 2 Dle Ausbeute einer Kultur von Streptomyces cinnamoneus r. tum azacoluta NRRL B-1699, die nach 48stündigem Waschszeit auf 1 qm von 2 cm dicken Kartofelstücken entstanden war, wurde durch Abschrabben der Myzelien von der K rtoffelscheibenoberfläche aufgearbeitet; das abgeschrabbte Material wurde in einem Mischer homogenisiert und dann wurde es mit einer etwa 7,6 cm diefen Schicht an absolutem Xthylalkohol bedeckt. Der Alkohol wurde 5 Stunden lang auf der zerkleinerten Masse stehen gelassen, danach wurde dekantiert und der Alkohol beseitigt, wobei gleichzeitig gewisse unerwünschte Heptanbestandteile abgeführt wurden, und gleichzeitig wurden die Zellen unviable gemacht und eine Zerstörung der Zellwände der Myzelien bewirkt. Die zerkleinerte Masse wurde danach in einem Liter einer 2%igen Papein-Suspension in M/30 glycinpuffer bei einem pH-Wert von 7,8 - 6,8 suspendiert und 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur stehengelassen. Dabei wurden die Proteinbindungen der Polynukleotide erzetzt, und die letzteren freigesetzt. Danach wurde eine rUr die Erniedrigung des pH- ertes auf 3,2 erforderliche Menge an 10 %iger Hydrochlorsäure zugegeben, und die Suspension wurde zwecks Rückgewinnung des Sedimentes, das einen bräunlichen Schlamm bildete, zentrifugiert. Zudem Schlaum wurde eine ausreichende Menge anStoffen wir wasserfreies Calciumsulphat zugegeben, ul eine geeignete Konsistenz zur Herstellung von je 500 mg Wirkstoff enthaltender Tabletten zu erzielen. Diese Tabletten können oral als anabolisches Mittel bei Patienten mit Kachexie gegeben werden; beispielrweise konnen einem Patienten mit nach außen gehenden, nicht entfernbarem und in anderer Weise unbehandelbaren Karzinom auf dem Gehärmutterhals 20 - 50 solcher Tabletten täglich aber eine unbestimmte Zeit hinweg während des Verlaufs der Krankheit gegeben werden.
  • Beispiel 3 lo kg von Myzelien wurden abgeschrabt von dem Filzfilter des Fermentationsprozesses, bei dem ein St reptomycid/Carbomycin in eine Nährflüssigkeit absondert. Das zurückbleibende Nährmebiur weist dann aufeinander folgende freie Stellen dort auf, wo das Streptomyces abgeschabt wurde. Die Myzelien werden dann fünfmal hintereinander mit 50 1 einer 0,05molaren Hydrochlorsäurelösung gewaschen und die Waschwässer, die corticotropinähnliches Material enthielten, wurden abgetrunnt.
  • Die gemaschenen Myzelien wurden von der überschüssigen Hydrochlorsäurelösung durch Dekantierung getrennt und lo 1 einer lo %igen wässrigen Ammoniaklösung wurden zugeführt. Das System wurde mittels eines Pressdeckels geschlossen, und die ammonakalische Lösung wurde auf 86°C während zwei Stunden erhitzt.
  • Gemäss $des oben beschriebenen Verfahren wird folgendes erreicht: (1) eine Zerstörung der Zellwände der Myzelien, (2) eine Dissoziation des Nukleoproteins und (3) eine teilweise Depolymerisation der Polynukleotidbestandteile der Myzelien. Das System wurde dann sich selbst zum Abkühlen überlassen, und nach dem Abk2hlen wurde die überstehende Flüssigkeitsschicht mit eine.
  • Flüssigkeitsheber abgehoben. Die überstehende 7 Flüssigkeitsschicht (10 - 25 % halt an Polynukleotiden) wurde gesammelt. Sie wurde dann durch tropfenweise Zugabe von konzentrierter Hydrochlorsäure auf einen pH-Wert zwischen 2,0 und 4,o gebracht, bis ein voluminöser, flockiger Niederschlag (ein Polynukleotid-Konzentrat), der auch bei weiterer Zugabe von SC1 nicht mehr wurde, anriel. Dieser Niederschlag wird dann im Ofen bei 50°C getrocknet und lasst sich dann in entsprechende 500 mg enthaltende Kap@s@@ einbringen. Diese Kapseln können einem Patienten mit bösartigem Lymphom als @@@ @@@tisches Mittel eingegeben werden, und zwar in Dosen von etwa 5 Gramm (lo wie beschrieben dosierte Kapsein@ pr. Tag.
  • Beispiel 4 100 Gramm eines Myzelium-Gebindes von Capacidin-produzierenden Streptomycete 5913 wurden durch Zentrifugieren gemäss der in Beispiel 1 beschriebenen Art aus 12 Tage alten statischen Fleisc@ brühkulturen in dem von Anderson u, Nitarb. (Anderson, L.K., Ehrlich J., Sun S.H. und Burkholder P.R. "Strains of Streptomyces the source of azaserine, elaiomycin, griseoverdin, and veridogrisein, Antib. @ Chemo. 6, 100, 1956"@ beschriebenen Medium gewonnen. Das Myzelium-Material wurde einmal mit po ml Aceten und danach mit soo ccm einer 70 %igen Acetonlösung, die mit einem M/15 Phosphatpuffer auf pH 7,4 eingestellt war, extrahiert. Lurch den Extraktionsprozess mit Aceton werden die Zellen unviable und gleichzeitig erfolgt ein Waschvorgang, bei dem toxische Materialien wie Capacidin entfernt werden, ohne daß das Steptomyces-Plasma in Losung geht. 60 g der als RUckstand gewonnenen Festsubstanz aus der Acetonextraktion wurden dann in einem 1-Liter-Becherglas mit 250 ccm einer 0,9 %igen Natriumchloridlösung suspendiert. 1 Milligram von Hühnereinweiß-Lysozym wurde dann hinzugefügt und die Mischung in einem 500 ccm-Becherglas mit einer Schicht von Toluol, die etwa 2, 54 cm tief war, bedeckt und danach für 24 Stunden in einen auf 370C eingestellten arutofen eingebracht. Das Lysozym wurde hinzugefügt, damit die Zellwandbestandteile des Myzeliums aufgelöst werden, so daß das Protoplast, oder die Protoplasmischen Verbindungen innerhalb derä Zellwände nachfolgend leichter zerkleinert werden können und dadurch geeigneter als Mdikament werden.
  • Nach einer Brutzeit von 24 Stunden wurde das Becherglas mit einer Inhalt aus dem Brutofen herausgenommen und die Masse in einen 1-Liter Erlenmoyer-Kolben übergeführt. Dann wurde abgesaugt bis Jeglicher Geruch von Toluol verschwunden war. Unter Beachtung der Sterilitätsvorschriften wurde dann tropfenweise eine vermittels ultravioletter Bestrahlung sterilisierte lo %ige Natriumbicarbonatlösung zugegeben, bis die Suspension des Protoplasma einen pH-Wert von etwa 8,5 aufwies. Danach liess sich erkennen, daß erhebliche Anteile der Masse in Lösung gegangen waren. Die Suspension wurde durch ein Seitz-Filterbett geschickt und das Filtrat gesammelt. Unter weiterer Beachtung der den Fachleuten geläufigen Sterilisationsmaßnahmen ftlr solche perenteralen Medikament-Präparate wurde das Filtrat einer Vakuumbehandlung bei Raumtemperatur unterzogen, bis das Volumen etwa auf 1/4 des uraprünglichen Volumens zurackgegangen war.
  • Die so gewonnene Endlösung wurde in lo ccm-Portionen in Ampullen eingebracht. Etwa 2 ccm-Dosen aus diesen Ampullen können für intramuskulare Anwendung bei einem mit asiatisoher Influenza (eine gewöhnlich nicht kachektische Krankheit) befallenen Pa-@ienten, der in fiebrigem Zustand ist, abgezogen werden. Solche Dosen können als eine "Antiviral@ ärztliche Behandlung Jede 4 Stunden oder öfter nach Anweisungen des Arztes begeben werden, bis die Krankheit abklingt oder bis lo oder o solche Injektionen gegeben worden sind.
  • Beispiel 5 Eine geringe bakteriologische Menge (etwa 1720 ccm) einer 48 Stunden alten Kultur von itreptomyces griseus ATCC 10137, die bei 30°C auf einem Waksman No. 3 Agar-Agar-Nährboden gehalten worden war, wurde in lo ccm steriles destilliertes Wasser eingebracht und darin durch SchUtteln von Hand suspendiert. Gleiche Teile von 1 ccm dieser Streptomyces griseus-Zellkörper-Suspension wurden Je in einen 25o ml rassenden Erlenmeyer-Kolben Ubergefüiirt, in dein sich Je 50 ml eines Gärmediums befanden, so daß die Myzelien dieser Gattung wachsen konnten und gesammelt werden konnten. Das Gärmedium enthielt folgende Bestandteile: Glucose lo g, Pepton (bakteriologisch) 5,0 g, FLeischbrUhextrakt (bakteriologisch) 5,0 g, N triumchlorid 5 g und destilliertes Wasser 1 Liter Die genannten festen Bestandteile wurden in dem Wasser aufgelöst, das dann in einen 2 1 fassenden Erlenmeyer-Kolben eingefüllt wurde und mit einem Baumwollprofen versehen 30 Minuten lang bei 125°C in einem At@oklaven behandelt wurde.
  • Nach 72 Stunden wurden die Myzelien von Jedem der lo Gärmedium-Kolben gesammelt, auf ein Filter aus gesintertem Glas aufgebracht, und 3 Mal mit 0,01 %iger Essigsäurelösung gewaschen, jeweils mit etwa 1 Liter Waschflüssigkeit. Der Zweck dieses Waschvorganges biteht nicht darin, die Myzelien unviable zu machen, sondern darin, die anhaftenden Nährlösungsreste zu entfernen, die beispielsweise Pepton, das für höhere Lebewesen, beispielsweise fUr Menschen, die mit dem Präparat behandelt werden können, giftig wirkt.
  • Bln weiterer Vorteil dieses Waschvorganges lieg darin» daß die Fleischbrühbestandteile der Nährflüssigkeit, die der Mzelium-Substanz anhaften» wie beispielsweise das antibiotische Streptomycin, entfernt werden.
  • Die gewaschenen Myzelien werden von dem Glasfilter entfernt und über Phosphorpentoxyd 96 Stunden bei 40°C getrocknet. Nach dieser Zeit könnens sie als unviable angesehen werden. Die Myzelium-Wande sind Jedoch bei diesem Verfahrensstand noch unzerstört. Die bröcklige Masse wurde dann vollständig in einer Kolloidmühle pulverisiert und dabei die Teilchengröße bis auf etwa 2 Mikron reduziert. Dies hatte ein Zerreissen der Zwllwände aufolge, wodurch die therapeutisch wirksamen Bestandteile für die Assimilation besser zugänglich werden. Ein Gramm dieses zerkleinerten Materials kann oral gegeben werden» entweder allein oder auf einem geeigneten Trägerstoff, beispielsweise durch Suspension in Orangensyrup, und zwar Jede 4 Stunden» als ein Antifieber-Mittel für einen Patienten, der an rekurrenter Furunkolose leidet. Solche 4-standigen Oben können so lange es der behandelnden Person erforderlich erscheint, gegeben werden.
  • Beispiel 6 Zu 45,4 kg einer pastenförmigen Masse von Streptomyces griseus, Myzelien, die von einem Faltenfilter gewonnen wurde, das zur Abtrennung des Myzeliums von der Fleischbrühe während der Herstellung des Streptomycins benutzt worden war, wurden in ein ca 190 1 fassendes, aus nicht rostendem Stahl bestellendes Gefäß eingebracht und dazu 2,75 1 (5 pints) einer gesättigten Formaldehydlösung zugfügt. Die z@vor beschriebene Behandlung dient dazu (1) die Zellwlnde der Myzelien za zerstören; (2) den Gehalt an Protein zu denaturieren und (3) die Polynukleotid-estandteile der Myzelien freizusetzen. Die M schung wird gerührt, so daß der Formaldehyd die Mischung durchdringt, und diese wird danach bedeckt und etwa 24 Stunden Stehengelassen, danach einer Vakuumtrocknung unterworfen, bis der Feuchtigkeitsgehalt auf etwa 3 % zurückgegangen ist und kein Geruch von Formaldehyd verblieben ist. Das getrocknete Material wird dann iu 500 mgm-Pillen tablettiert.
  • Beispiel I Zu loo g luftgetrockneten Myzelien von Streptomyces decoyus var. hydroacopicus, die gewonnen wurden aus einem Fermentationsprozess zur Herstellung von Psicofuranin, und die sich in einem 500 ccm Erlenmeyer-Kolben berx, den, wurden loQ com einer gesättigten wässrigen Phenollösung in Leitungswasser hinzugefügt. Der Inhatl der Flasche wurde 2 Stunden lang auf 62°C erhitzt, damit die M@zelien abgetötet und deren Zellwände zerstört wurden. Danach wurde tropfenweise eine solche Menge einer lo eigen Natriumcarbonatlösung @inzugefügt, daß der pH-Wert der Mischung auf etwa 7,5 gebracht surde. Die gesamte Masse wurde dann einer Lyophilisation unterworfen wld ergab ein flockiges, bräunliches Material, das nach Beigabe von geeigneten Zumischungen in Kapsein von 200 mgm Fassungsvermöen eingebracht werden konnte.
  • Beispiel 8 22,7 kg von Myzelium-Kuchen, der aus S. venezuelae von der Chloramp@e@@@@-Herstellung bestand, wurden durch Zentrifugieren mit aufeinander folgenden Gaben von Je etwa 55 1 (loo pints) Wasser gewaschen, bis die waschflüssigkeiten einen Festgehalt von wenigei al 0,5 % ergaben, Des Zentrifugat wurde danach gesammelt und in etwa 380 1 (6100 gallons) einer 0,1 %igen Zephiran-Lösung (Zephiran: Desinfizierendes, netzendes Präparat aus Benzalkoniumchlorid) resuspendiert. Machdem die Masse 3 Tage lang alt der Zephiran-Lösung in Kontakt gestanden hatte, wobei die Myzelien devitalisiert und die Zellwände zerstört wurden» wurde abermals zentrifugiert und das Zentrifugat in ca. 380 1 (loo gallons) einer Ringer-Laotat-Lösung auspendiert. Von dieser Suspension wurden gleiche Teile von 25 ccm auf Ampullen gefüllt und das Material wurde in 1/2 ccm-Dosen subkutan injkiert.
  • Beispiel 9 500 g Myzelien von einer Streptomyces aureofasciens-Gärung für Chlortetracyclin-Herstellung wurden in einem 2 l-lsolbon mit 500 cci destilliertem Wasser behandelt und die Myzelien darin auspendiert. Der Kolbeninhalt wurde dann abwechselnd tiefgekühlt und aufgetaut, wenigstens lo mal hintereinander, und danach wurde eine kleine Impfprobe entnommen und einer Subkulturprürung zur Feststellung der Viabilität unterworfen. Solange diese positive Ergebnisse erbrachte, wurde das Material weiter gefroren und aufgetaut, und zwar so lange, bis die Imfprobe auf der Subkultur kein Wachatum mehr zeigte. Mikroskopische Untersuchungen, die in die sei Stadium durchgeführt wurden, zeigten, daß die Myzelium-Wänder zer start waren. Des Material wird danach ii Vakuum bei 40°C getrocknet und ist anschliessend fertig zur Pelletisierung oder Tablettierung.
  • Beispiel 10 907 kg (1 ton) feuchter Myzelien von Streptoiyces rimosis wurden in einen breiten irdenen Bottich eingebracht» der ein Fassungs vermögen von 3785 1 (looo gallons) hatte und .in Ultraschallerzeuger (Superschator) wurde unter die Oberfläche eingetaucht.
  • Mit einer Frequenz von 20.000 - 25.000 Hertz pre Schunde wurde beschallt, bis eine kleine Probe unter dem Mikroskop ergab, das die einzelnen Zellen zerstört weren. Der Sonator wurde entfernt und die Myzelium-Paste mit den zerstörten Zellen in 2650 1 (700 gallons) einer 0,2 % Orthokresol enthaltenden wässrigen Lösung suspendiert.
  • Die Lösung kann dann auf Ampullen gezogen werden in für parenterale Anwendung geeigneter Dosierung.
  • Beispiel 1i Ein kg einer ganzen Streptoiycin-spent s. griseus-Kultur, die mit einer Austrittstemperatur von l3o0C einer Sprühtrocknung unterworfen worden war (wodurch das Myzelium unviable wird) wurde in lo 1 Leitungswasser wieder eingebracht. Diese wässrige Dispersion wurde dann schnell durch ein 15,24 cm-Saugfilter, das mit 2 Whatman 2-Filterpapieren belegt wzr» filtriert. Es wurde weiter abgesaugt, bis das Myzelium, das auf dem Papier verblieb, den größten Teil des Wassers und der wieder entstendenen Fleischbrühe verloren hatte, was an der pastenförmigen Konsistens festgestellt werden konnte.
  • In 670 g dieser feuchten Myzelium-Faste, die auf dem Filterbett zurückblieb, wurden, während sich diese Masse noob auf dem Trichter befand, 30 g 3X(N.F.) Procin panoreatin mit Carbohydrase, Proteinase und Nuklease-Enzymen eingeknetet. Bei dieser Behandlungs art bewirkt das Carbohydrase Enzym die Zerstörung der Myzelium-Wände; das Nuklease Enzym bewirkt die teilweise epolymerisation der Polynukleotid-Bestandteile des Myzelium-Protoplasmmas; und das Proteina se Enzym bewirkt die Proteolyse der proteinartigen Substanzen daß Protoplasmas. Diese verknetete Msichung wird dann in einen Brutofen, der auf 37UC gehalten ist, eingebracht und darin 12 stunden lang gehalten. Die Myzelium-haltige Masse wurde anschliessen aus des Brutofen herasugenommen und auf einem Trichter abgesaugt. tJber die Oberfläche dieser Myzelium-Masse wurden dann schnell loo ccm absoluten Metahols gegossen und schnell durch das Filter abgesaugt. Das Absau@en wurde fortgestzt, bis die Oberfläche trocken war, was sich durch Bildung von Spalten und Rissen in der pastenförmigen Masse beserkbar iachte. Es fi@l eine Gesamtmenge an myzeliumhaltiger Nasse von etwa 500 - 550 g an, die pastenn förmigen Zustand hatte und die sich aus Polyethylen bestehenden Tuben einbringen liess, aus denen sie zur Verwendung als Elexiere oder Syrup in geeigneter Dosierung wieder ausgedrückt werden kann.
  • Beispiel 12 loo g von feuchtem Protoplast, das durch Lysoxymbehandlung von Myzelium wie in Beispiel 4 beschrieben gewonnen worden war, wurde in einem 250 ccm-Bescherglas mit loo ccm einer 2 % Streptococcal desoxyribonuklease-Konzentrat enthaltenden Suspension in M/25 Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,2 - 7,8 behandelt. Die Mischung wurde bei 40°C 4 Stunden lang ii Brutofen gehalten und dann 4 Stunden lang auf 56°C erhitzt. Dabei erfolgte teilweise Despolymerisation der Polynukleotiden Bestandteile, die in dem Myzelium-Protoplasma enthalten sind. Danach wurde trockenes Sorbitol-Pulver eingerührt, bis die Konsistenz der Endiischung syr@pös war. Die Masse kann dann als Syrup ausgegeben werden.
  • Von einer Flächenkultur von Aspergillus niger auf einer 5 %igen bekteriologischen Peptonfleischbrühe in einem halbgefüllten 5 1 -Flourens-Xolben wurden nach 36 stündigem Wachstum mit einem Schaumlöffel etwa 500 g eines feuchten Kuchens von Myzelien abgenommen. Dieser Kuchen wurde in einen 2 1-Leitungswasser mit einem pH-iert zwischen etwa 7,6 und d,5 (dies sind die üblichen pH-Werte von Leitungswasser) enthaltenden Mischer eingebracht. Es wurden lo - 30 Minuten gemischt bis die Myzelien dispergiert waren und nicht länger einen kompakten Kuchen bildeten. Bei diesem Mischprozess wurden die Myzelium-Wände mechanisch zerstört. Die gesamte Mischung wurde dann in einen Brutofen bei 40 - 45°C 3 Stunden lang eingebracht. Dabei bewirkten die autolytischen Enzyme eine Depolymerisation der in dem Myzelium enthaltenen Polynukleotide, Die Masse wurde dann aus dem Brutofen herausgenommen und es wurde tropfenweise Eisessig zugegeben, bis der pH-Wert der Mischung of etwa 3,8 gefallen war. Man konnte dann bechachten, daß die Diapersion "gebrochen" war und daß ziemlich viel des festen Materials sich an dem Boden des Gefäßes angesammelt hatte.
  • Die überstehende Lösung wurde dann sorgfältig dekantiert, so daß das Abgesetzte so wenig wie möglich beeinträchtigt wurde» und dieses wurde wiederum in ein gleiches Volumen 5 %iger Easigsäure in Wasser eingebracht. Danach wurde abermals dekantiert. Das schlammartige Material am Boden wurde dann in einen Trockenbehälter von oo ccm F saungsvermögen eingebracht» es wurden lo ccm Octglalkohol hinzugegeben ad das Ganze 48 Stunden lang bei Raumtemperatur einer Vakuumtrocknung unterworfen. Der trockene Fest stoff, der aus depolymerisertem Protoplasmischem Material bestand, von dem 30 Gew.-% aus depolymerisiertem Polynukleotiden des ursprünglichen Aspergillu@ Myzeliums bestand, kann dann in geeigneter Form zu 500 mgm-Tabeltter tablettiert werden, wobei man etwa 80 - 120 solcher Tabletten gewinnt. Diese Tabletten können in Dosen von 2 Mal täglich 2 Tabletten Uber eine Zeit von 1 Woche zur Behandlung eines Patienten gegeben werden, der an infektiöser Mononukleose leidet.
  • Beispiel 14 Eine Kultur von Euglena viridans wird auf 1 Liter einer fr(Un aus Rinderleberextrakt in einem 3-1 fassenden Fischaquerium gezüchtet, bis eine maximale Population (gewöhnlich innerhalb 48 Stunden) erreicht ist, was sich durch serienmässige Zellzählung feststellen lässt. Diese Kultur wurde dann mit Phycomycete, Polyphagus geimpft, wurde wachsengelassen, bis eine spektroskopische Unter auchung auf Zuglena Chlorophyll, die an einer kleinen Probe der Kultur durchgeführt wurde» die Abwesenheit von Pigment zeigte.
  • Die Kultur wurde dann schnell durch ein Gelman Mikropor-Filter filtriert, auf des die Körper von Phycomycete zurückblieben. D Mikropor-Filter und das darauf befindliche Myselium wurden dann in einen Ofen eingebracht und auf 70 - 760C darin gehalten, bis die Trocknung erfolgt war (die Trocknung b die sei Temperaturbereich bewirkt Dehydration und Zerstörung der Mycelium-Wände, ohne daß die Polynukleotid-Bestandteile des Myzeliums denaturiert werden).
  • Danach wurde das Phycomycet aus des Filter harausgeschüttelt und in einem Erlenmcyer-Kolben von 100 ccm Faszungsvermögen übergeführt. Üblicherweise gewinnt man eine Phycpmycet-Myzelium-Protoplast-Menge bei diesem Vorgang, die etwa 10 g beträgt, jedoch kann diese Menge zwischen den äusen Grenzen von 3 g einerseite und etwa 50 g andererseite variieren, je nach den Wachstumsbedingungen der Kuglena Kultur auf ibrer Mährlösung.
  • Je Oramm gewonnem Myzelium-Protoplast wurden lo com einer konzentrierten Zorbitollösung zugefügt, der Erlenmoyer-Kolben wurde verschlossen und in einen Kühlschrank gestellt. Von dieser S rbitolauspe@@ion des Myzelium-Protoplasts kann täglich 1 Teelöffel eine.
  • Patienten gegeben werden, der an rheumatischer Arthritis leidet.
  • Beispiel 15 lo kg an Zygomycete in Schleimform wurden beim Abschaben und Einsammeln des Schimmelüberzugss auf der Okrillb, von Abfall von aufbewahrten Rinderkadavern gewonnen. Das feuchte Myzelium-Material wurde in 50 1 einer 5 %igen Natriumcarbonstlösung in einem 114 1 (31 gallons) fassenden Kessel bei 35 - 45°C einen Tag lang suspendiert. Der Inhalt des Keszeln wurde periodisch durch Rühren bewegt, während der ersten 12 Stunden etwa in Intervallen von je 1 Stunde. Dann liess an das unlösliche Material absitzen und die überstehende PlUssiSkeit wurde sorgfältig abgehebert, um eine Störung des Sediments zu verhindern. Das Sediment wurde verworfen.
  • Die abgeheberte FlUssigkeit wurde in einem anderen 114 1 (30 gallons) fassenden Kessel übergsführt, und es wurden 0,454 kg (1 pound) an rohem Papain zugefUgt und dieses 3 Stunden lang der Digestion unterworfen. Unter Beachtung der notwendigen Vorsichtemaßnahmen zur Verhinderung des "Überschäumens" wurde die Carbonatlösung anschliessend durch Zugabe von lo %iger Schwefelsäure neutralisiert, bis keine weitere CO2-Entwicklung nhr erfolgte.
  • Als dieser Punkt erreicht war, konnte festgestellt werden. das der Inhalt des Kessels sich plötzlich trübte, weil ein bräunlich gefärbter flockiger Niederschlag auftrat. Dies ist die Folge der Wirkung der Nuklease, die in dem rohen Papain vorhanden ist, durch die die Polynukleotide depolymerisiert worden sind Der Niederschlag bestand aus teilweise depolymerisierten Nukleinsäuren. Die Ausbeute an depolymerisierter Nukleinsäure, die bei 10kg Ausgangsmaterial, wie sie in diesem Beispiel eingesetzt wurden, anfiel, betrug zwischen 1/2 und 1 1/2 kg an feuchtem Miederschlag. Dieses Niederschlag ist das aktive Produkt dieses Beispiels und kann in Sabitol dispergiert werden, in der Weise, das zwei 1 Sorbitol 1 kg des feuchten Niederschlages enthalten, und loo ccm einer solchen Kombination können einem Patienten verabreicht werden, der an fortgeschrittenem Lymphosarkom leidet und zwar in wöchentlichen Gaben mit der Anweisung, einen Teelöffel dieser in Sorbitol suspendierten Substanz dreimal täglich einzunehmen.
  • Beispiel 16 500 kg Fenicillin natatum Myzelium wurden aus einem Fermentationsprozess gewonnen, bei dem Fenicillin hergestellt wurde, und wurden in einen etwa 380 1 (100 gallons) fassenden Kessel aus nichtrostendem Stahl eingebracht, in dem sich ein Dampfeinleitungsrohr befand. Das feuchte Myzelium wurde bei Atmosphärendruck 1 Stunde lang mit Dampf behandelt. Danach waren die Myzeliumwande durch den Ds Frdruwk zerstört und das Ganze wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. 75,7 1 (20 gallons) technischen Chlorotons, das die Nukleoproteine ii Protein und Polynukleotid zerlegbe, wurde hinzugegeben. Wiederum wurde wie bei der ersten Dampfbehandlung beschrieben, Dampf zugeführt, wobei jedoch darauf ge@chtet wurde, daß die chloroform-Dämpfe, die entstanden, abgeleitet wurden, und die Dampfbehandlung wurde so lange fortgesetzt, bis der größte Teil des Chloroforme abdestilliert war. In dieser letzteren Verfahrensstufe wurde das freie Polynuk@otid teilweise durch hydrolytische Spaltung depolymerisiert.
  • Dir Kess@l wurde dann auf eine Temperatur von 7o0C oder darüber erwärmt, und es wurde agbesaugt, bis das modifizierte Myzelium-Material einen Wassergehalt von weniger als 61 aufweies. Die Masse wurde dann herausgenommen und mit geeigneten Zusätzen wie beispiels weise M@2nitol, Lactese oder Calcium-Glucogalactonat im Verhältnis von lo % - 50 % zu dem Myzelium-Material vermischt. Aus 500 mgm eines solchen Myzelium-Materials wurden Tabletten hergestellt und diese T bletten können an Lebewezen gegeben werden, die an einem Karz@nom am Gebärmutterhals leiden mit der Anweizung, 20 solcher Tabletten mit Jeder Mahlzeit einzunehmen.
  • Beispiel 17 Annähernd 45,4 kg (loo pounds) einer myzeliumartigen Form von Saccharomycetes ludwigii wurden durchF ltbett-Filtration einer 48 Stunden alten Kultur dieses Myzeliums in einer Batterie von Gärungskolbene, die gleiche Teile einer Mischung von Kornweichlauge und rohem Ahornsyrup enthielten, gewonnen. Noch auf dem Filzfilter befindlich wurde die Masse mit Leitungswasser swaschen, um die ansitzende Kulturlösung von dem M zelium zu entfernen, und das Myzelium wurde dann in Zinkschalen ausgebreitet und an der Luft getrocknet. Während des Trocknungsvorganges sorgten die autolytischen Enzyme dafür, daß die Zellwände zerstört wurden und die Polynukleotide teilweise depolymerisiert wurden. Nachdem der Feuchtigkeitsgehalt des Myzeliums auf etwa lo * oder weniger reduziert worden war, wurden die Pfannen in einen Ofen übergeführt, der auf einer Temperatur von 9o°C gehalten wurde. Die Pfannen verblieben in dem Ofen, bis sie wenigstens 45 Minuten auf der Ofentemperatur sich befunden hatten, Jedoch nicht länger als 2 Stunden. Das in dieser Weise getrocknete Myzelium karm als Medikament für die Behandlung von erythroblastischer Arrestanämie in Form von Teelöffel-Dosen, die dreimal täglich einem Patienten verabreicht werden können, der an dieser Art von Anämie leidet, verwendet werden. Das trockne Myzelium-Pulver wird gewöhnlich in Fruchtsaft oder Milch suspendiert oder über Getreideflocken gestreut.
  • Beispiel 18 22,7 kg (50 pounds) an brandigen Weizenblüten wurden gesammelt, als sie sich im "Schwarzen" Zustand befanden, wenn der Körper des Materials aus Sporen von echtem Basidomyces, Ustilage tritiot und deren myzeliumartiger Form besteht. Diese wurden in einen etwa 150 1 (4o gallons) fassenden Glasbehälter mit einem ao Boden befindlichen Abzug gegeben und mit 75,7 (20 gallons) einer (60 -80°C) heissen, wässrigen, lo %igen Pyrridinlösung bedeckt. Die Temperatur in dem Gefäß wurde mittels eines Tauchsieders geeigneter Art, elektrisch oder mit Dsipf 24 Stunden lang in dieser Höhe shalten und während dieser Zeit wurde durch das P#yrridin eine alkalische Zerstörung der Zellwände bewirkt. Dabei gingen die nicht-depolymerisierten Polynukleotide in Lösung. Die Pyrridinlösung, die die Nukleoproteine enthielt, wurde dana abgehebert in einen anderen, etwa 150 1 (40 gallons) fassenden Glaskolben, und darin liess man die Lösung auf Zimmertemperatur abk2hlen.
  • Stwa 19 1 (5 gallons) einer 10 %igen wässrigen Hydrochlorsäure wurden dann eingerührt. Wenn dabei nicht ein fülliger, bräunlicher Hiederschlag sich entwickelte, wurden weitere Liter der in gleicher Weise konzentrierten Säure zugegeben, wobei gerührt wurde, bis ein Niederschlag auftrat.
  • 0,272 4 ( 1/2 pound) an Pepsin U.S.P. wurden dann eingerührt, das Gefäß wurde bedeckt und die Zubereitung 12 Stunden lang stehengelassen. Die in dei Pepsin b vorhundene Nuklease depolymerisierte die Polynuklotide.Danach konnte festgestellt werden, daß sich em Boden des Gefäßes eine cremfarbene bis gelbliche schlammige Masse angesammelt hatte, die aus teilweise depolymerisiertem Polynukleotid bestand. Es wurde dann der Abzug - Boden geöffnet und die Schlammese wurde, zusammen mit einer geringfügigen Menge an Mutterlauge, in einer Serie von 1 1 fassenden Zentrifugenschalen aufgefangen. Gewöhnlich werden daffr zwischen 4 und 7 solcher Sch@en benötigt.
  • Dieser die teilweise depolymerisierten Polynukleotide enthaltende Schlamm wird durch Z@entrifugieren mit geeigneten Geschwindigkeiton, beispielsweise mit 1200 UPM Uber eine gewisse Zeit, beispielsweise Uber 15 Minuten, verdichtet. Dann werden die Schalen aus der Zentrifuge herausgenommen und die überstehende Flüssigkeit ab gegossen. Das ursprüngliche Volumen wird dann mit Sorbitol aufgefüllt und die Schlamm-Masse in dieser Flüssigkeit wieder suspendiert. In dieser Form ist das Polynukleotid-Konzentrat aus dem ustilage tritici zur Verabreichung als Medikament geeignet. Es ka:n an Patienten mit allergischer Dermatitis in Dosen von 1 Teelöffel 4 mal täglich verabreicht werden, bir der Zustand. rur den es verschrieben wird, nachlässt.
  • Beispiel 19 loo g von wildwchsendem Saccharosycet, das zur Herstellung von Ayulo's Filtrat (Proc. Int. Congress on Cancer, Tokyo 1960) benutzt wird, wurde wiederholt mit 0,5 einer Resigsäure in asser gewaschen, bis der gesamte Feststoffgehalt, der in der Waschflüssigkeit bestimmt werden konnte, weniger als 1 b betrug. Die Waschflüssigkeit wurde verworfen und das feuchte Myzelium, das gewaschen worden war, wurde in einen Pyrex-Erlemeyer-Kolben mit einem F ssungsvermögen von 250 ccm eingebracht; der Kolben wurde mit steriler Baumwolle verschlossen und in einen Brutofen bei 40°C, oder bei einer Temperatur zwischen 36 und 440 12 Stunden lang eingebracht. Dabei wurden die Zellwände autolytisch zerstört und die Myzellium-Polynukleotide wurden depolymerisiert und ihr Molekulargewicht dabei bis auf den Polymerisationsgrad der Oligonukleotide reduziert.
  • Der Kolben wurde aus dem Brutschrank cherausgenommen und es wurden loo ccm Sorbitollösung hinzugefügt und mit dem Kolbeninhalt vermischt. Die Sorbitolzuspension von Myzelium-Oligonukleotiden stellte du wirksame Medikament dieses Beispiels der, das täglich teelöffelweise gegeben werden kann, um der Giftigkeit einer antimetabolischen Droge wie beispielsweise Amethopterin oder 5-Fluoracil, die zur Behandlung von Krebs verwendet werden, entgegenzuwirken.
  • Die folgenden Beispiele beziehen sich zur die Herstellung von jodiertem M@zelium-Material, das erfindungsgemäss bereitet wurde. Wie vorstehend angezeigt, hat es den Anscheln, daß durch Jodierung des erfindungsgemäss hergestellten Myzelium-Materials dessen therrapeutische Aktivität verstärkt werden kann. Natürlich ist es, wie jeder auf diesem Gebiete Bewanderte weiss, bei der Behandlung bestimmter Patienten nicht wünschenswert, jodierte therapeutische Mittel anzuwenden. Solche Situationen können bei einem Patienten mit gewissen Anzeighen von Kropf auftreten oder such dann» wenn der Patient an Jod-Intertoxikation leidet. In solchen Fällen ist die Verordnung von Jod in jeder Form, auch in kombinierter Form, wie sie in den erfindungsgemäss hergestellten Iodierten Produkten vorliegt, von Nachteil.
  • Für Patienten hingegen, denen man Jod-Produkte mit Sicherheit verschreiben darf, ist die Gabe der erfindungsgemäss hergestellten Myzelium-Produkte in jodierter Form besonders vorteilhaft.
  • Bespiel 20 Zu 1 kg lyophilisierter. mit Pancreatin digestierter Myzelium-Substanz, deren Zellwände zerstört sind und bei der die Polynukleotid-Bestandteile des Myzeliuw-Protoplasmas teilweise depolymerisiert sind, wie sie beim Verfahren der vorliegenden Erfindung anfallen, wurden loo ccm einer 1%igen Jodlösung in absolutem Xthylalkohol zugegeben. Die Mischung wurde i#eine flache Aluminiumpfanne gegossen, so daß die Mischung eine S@icht von weniger als 1,27 cm (1/2 inch) licke ergab@ und bei Zimmertemperatur trocknen gelassen. Der Alkohol verdunstete, und das Jod verblieb mit dem Myzelium-Material kombiniert zurück.
  • Beispiel 21 Ein kg des feuchten Niederschlages von teilweise depolymerisierter Nukleinsäure, wie sie wie am Ende des 2 Absatzes in Beispiel 15 beschrieben gewonnen wurde, wurde in 2 1 einer Lösung aus destilliertem Wasser und einer Menge von inagesamt 5 g gelöstem Kaliumjodid und o, 3 g molekularem Jod suspendiert.
  • Das Cze wurde geschüttelt, bis ein Tropfen der Mischung, der für eine Versuchsprobe abgezogen wurde, auf Stärkepapier keine blaue Färbung mehr zeigte. Die Entfernung des elementaren J ds aus der Mischung durch dessen chemische Kombination mit der Nukleinsäure erfolgt gewöhnlich innerhalb von 15 - 20 Minuten.
  • Der Niederschlag der mit dem Jod umgesetzten ukleinsäure wurde absitzen gelassen, und die Uberstehende FlUssigkeit wurde abgegossen. Der Niederschlag wurde dann mit destilliertem Wasser @@ehrmals hinte@@nander ausgewaschen und anschliessend nach irgendeiner üblichen Methode, beispielsweise Zentrifugieren, Filtrieren oder Absitzenlassen behandelt, bis der Jodgehalt der wässrigen Phase auf ein solchem Maß reduziert war, das bei einer Versuchsprüfung lit 5 %iger Silbernitratlösung kein Niederschlag mehr entstand. Der überwiegende Teil des überstehenden Waschwassers wird dann von dem iederschlag abgetrennt und dieser wird zurückbehalten und bei Zimmertemperatur an der Luft getrocknet.
  • Der luftgetrocknete Niederschlag wird in Kapseln eingefüllt, von denen Jede Kapsel 250 igi des Materials enthält. Solche Kapseln können einem Patienten verabreicht werden, der an Acne Vulgaris leidet, mit des Maßgabe, 2 Kapseln zu jeder Mahlzeit Uber eine Zeit von 2 Wochen zu nehmen, oder so lange, bis die Aorw nachlässt.
  • Beispiel 22 Is wurde gemäse Beispiel 16 gearbeitet, Jedoch mit der Ausnahme, das die 75,7 1 an technischem Chloroform, die vor der zweiten Dampfbehandlung zugegeben wurde@ loo g molekulares Jod in Lösung enthielten, wodurch dem Chloroform eine lebhafte violette Färbung verliehen wurde.
  • Beispiel 23 Ausgangsmaterial in dieses Beispiel ist der Polynukleotidschl@@@ in der durch Zentrifugation erh@@tenen verdichteten Pore, wie er gemäss der im letzten Absatz im Beispiel 18 beschriebenen Arbeitsweise erhalten wurde. In diesem Beispiel wurde der beim Zentrifugieren verdichtete Schlamm mit Wasser anstelle der im Beispiel 18 beschriebenen 8 rbitollsung wieder aufgelöst. Dann wurde konzentriertes Ammoniakwasser in Gaben von 5 coi zu Jedem der Behälter zugefügt, bis der pH-Wert der Suspension einen Wert zwischen 6,8 und 7,2 annahm. Dann wurde 1 ccm einer lo %igen Kaliumjodidlösung zugegeben und eingerührt und alsdann 5 Minuten später wurde 20 ccm einer 1 n natriumjoda@lösung zugegeben und eingerührt.
  • Nach etwa 30 Minuten, in denen die Jodanlagerung an dem aromatischen Korn der Nukleotid-Einheiten vollständig stattfand, wurden lo ccm Eineseig hinzugegeben und der Inhalt jedes Behalters durch ein Whatman/2 Filterpapier filtriert, wobei der Niederschlag gesammelt wurde. Dieser Niederschlag wurde dann bei 600C oder höherin einem Ofen etrocknet, bis dessen Wassergehalt geringer als 5 % war, und danach liese sich die Masse mit je 250 mgm in Kapseln einbringen, und drei solcher Kapseln sollen wahrend der Dauer der Krankheit einmal täglich von einem Patienten genommen werden, der an chronischer lymphoxytischer Leukämie leidet.
  • Beispiel 24 Hierbei wurde das wie im ersten Absatz im Beispiel 19 beschriebon gewonnene depolymeisierte Myzelium-Polynukleotid als Ausgangsmaterial verwendet. Dieses wurde wiederum mit 0,5 %iger Essigsäure gewaschen, bis die Waschwässer einen Feststoffgehalt von weniger als 1 % aufwiesen.
  • Zu dem feuchten Material (das im Gewicht auf etwa 50 g reduziert war) wurden 150 ccm einer heissen wssrigen Lösung von molekularem Jod, die durch Zugabe von lo mal Jod zu 200 ccm Wasser und Erhitzen bis zur Auflösung des gesamten Jode hergestellt worden war, zugegeben. Diese Jodlözung wurde zugsgeben zu dem Oligonukleotid-Material, während dieses noch heiss geaug war, um das molekulare Jod in Lösung zu walten. Bei diesem Verfahren werden die aromatischen Reste der Oligonukleotide Jodiert innerhalb der Zeit, in der die Mischung auf Raumtemperatur abkühlte; danach ist das Material zur Verabreichung als Medikament geeignet. Vor der Einnahme eines hohen Medikamentes muss dieses zunächst geschüttelt werden, damit die jodierten Oligonukleotide auspendiert werden und danach kann dreimal täglich 1 Teelöffel an einen unter Knochensarkom leidenden Patienten verabreicht werden.
  • Beispiel 25 In diesem Beispiel wird die Jodierung von Myzelium veranschaulicht, wie es bei der Keimung eines Stammes von Streptomyces griseus (act@nomyces gri@eus) in einem Gärmedium bei der Herstellung von Streptomycin anfällt.
  • Die Myzellen, wie sie im Beispiel 1 des Wakaman-Patentes S. 2, Spalte 4, Zeilen 53 - 55 U.S.A. Patent 2 449 866/veröffentlicht sind, wurden 2 Tge lang bei 300C in einem Luftstrom getrocknet. 1 kg des getrockneten Materials wurde duul resuspendiert in 2 1 einer o, og %igen LLliuijodidlösung. Ein ooar Octylalkohol wurde als ein Antiform-Mittel zugefügt und die Mischung wurde stark gerührt. 100 ccm an wässrigem @ Wasserstoffsuperoxyd (20 Vol-%ig) wurden zugegeben und die Mischung wurde weitere 2 Stunden stark gerührt. Das resultierende Produkt wurde im Vakuum getrocknet, bis sein Wassergehalt zu weniger als 5 1 bestimmt werden konnte. Die vorgenannte Behandlung verursachte ein Zerreißen der Myzelium-Wände.
  • 100 g des vakuumgetrockneten Materials wurden in 5oo ccm einer 1 %igen Lösung von Pancreatin in lo s Glyzerin in einem 1 Liter-Becherglas suspendiert. Die Suspension wurde bei Temperaturen zwischen jo und 42°C 12 Stunden lang im Brutschrank behandelt, und während dieser Zeit spalteten die Nukleoproteine des Myzellwms in@ Protein- und Nukleinsäure auf. Das Protein wurde als Proteose gelöst und konnte anschliessend beim Waschen mit schqcher Säure entfernt werden, die Nukleinsäure wurde depolymerisiert zu mittleren Molekulargewichten von Oligonukleotiden mittels der in dem Panoreatin vorhandenen Nuklease.
  • Bei der Inkubation mit Pancreatin lässt sich beobachten, daß diese Oligonukleotide in einem Konzentrat am Boden des Inkubationsgefäßes als ein rötlich-gelb gefärbtes Sediment angesammelt wurden. Die überstehende Flüssigkeit wurde sorgfältig abgehebert und verworfen und das Volumen Uber dem Sediment wurde mit etwa 500 com einer 0,05 n wässrigen Schwefelsäure aufgefüllt. Das Sediment befand sich danach in Suspension in dieser Säure, und die resultierende Suspension wurde abfiltriert und das Filtrat verworfen. Der Rückstand wurde gesammelt und 25 - 30 B dieses Rückstandes wurden alsdann in lou ccn einer 30%igen S@rbitollösung suspendiert und 1 ccm dieser Suspension kann Jeweils in Abständen von 3Stunden einem Patienten verabreicht werden, der an Psoriasis leidet, so lange, bis sein Zustand Besserungen erkennen lässt.
  • Beispiel 26 Dies ist ein Beispiel für die Jodierung von Myzelium, das bei der Züchtung eines Stammes von Streptomyces griseus bei der Herwellung von Vitamin B12 anfällt. i kg (Trockengewicht) eines Myzeliums oder eines wachsenden Orni@mus, wie ar im U.8.A. Patent Nr. 2 695 862 von Rickes in Spalte 5, Zeilen 46 - 47 beschrieben ist, und der in der in Beispiel 1 beschriebenen Art von der Fleischbrühnährlösung abgetrennt ist, wurde mit 20 cci einer 1 %igen Lösung von Jodmonochlorid in Eisesseig gemischt. Diese Mischung wurde 2 Stunden lang gerührt und dann einer Vakuumtrocknung unterworfen. Die vorgenannte Behandlung führt zur Zerstörung der Myzeliumwände infolge der gemeinsamen Wirkung der Essigsäure und des Jodbonochlorids. Darüber hinaus erfolgt eine wirksame Jodierung des Proteins und der Nukleotid-Bestandteile (Nukleop@cteine) des Myzelium-Protoplasmas.
  • 1 kg des vorgenannten Myzelium-Materials wird in 5 1 ron aus ungereinigtem Ananaspflanzen gepresstem Saft, der reich an Proteasen und Nukleasen ist, in eines 10-1-Glaszylinder-Gefäß suspendiert und die Suspension wird bei 20 - 50°C 2 Tage lang im Brutschrank behandelt. In dieser Verfahrensstufe werden die Nukleoproteine in Proteine und Mukl@@insäure (Polynukleotide) aufgespalten. Die Nukleinsäure wird teilweise depolymerisiert. Dabei gehen die Proteinbestandteile und deren Abbauprodukte in Lösung, wohingegen die jodierten, mittlere Molekulargewichte aufweisenden Polynukleotide a Boden des Behältere zum Absetzen kommen und dort durch Dekantieren und Verwerfen der überstehenden Flüssigkeit gewonnen werden können. Das gewonnene Sed@ment, das im gepackten Zustand ein Volumen von etwa 300 ml bat, wird in t 1 Orangensyrup suspendiert und 1 teelöffel dieser Suspension kann täglich gegeben werden, wenn man bei einem Patienten, der an paoriasiartiger Arthritis leidet, einen medizinischen Effekt erreichen will.
  • Das Verfahren der vorliegenden Anmeldung. ist in seinem größten Umfang nicht begrenzt auf die spezifischen Schritte, Methoden und Verbindunnen, wie sie speziell beschrieben sind, sondern bezicht sich auf alle üblichen Abänderungen und dem Fachmann geläufigen @beitsweisen, die sich aus der Beschreibung und den Ansprüchen unter Zugrundelegung des erfindngsgemässen Prinzips ergeben.
  • Patentansprüche

Claims (8)

  1. P a t e n t a n s p r ü c h e 1. Verfahren zum Herstellen eines therapeutischen Mittels, dadurch gekennzeichnet, daß My@@lium-Produkte in unviablem Zustand übergeführt und deren Zellwände zerstört werden, bei die therapeutisch aktiven Komponenten. darin dli Protoplasma dieser Myzelium-Substanz enthalten sind, leichter ausimilierbar gemacht werden.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, das die Myzelium-Substanzen, nachdem die Zellwände zerstört sind, einer eine teilweise Depolymerisation der Polynukleotid-Bestandteile des Protoplasmas in der Myzelium-Substanz bewirkenden Behandlung ausgezetzt werden.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, das die Myzelium-Substanz nach der Zerstörung der Zellvände einer eine Trennung der protelnartigen Substanz von den Polynukleotid-Bestandteilen in dem Myzelium-Protoplasma be@wirkenden Behandlung ausgesetzt wird.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Polynukleotid-Bestandteile des Proteplasmas @erung der Myzelium-Substans einer Konzentration unterzogen werden
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, das die Myzelium-Substanz vor der Zerstörung der Zellwände einer Verunreinigung entfernenden Behandlung unterzogen wird, wobei eine Desorganisation der chemischen Bindungen in dli den therpeutischen Effket verursachenden Protopla saia sorgfältig vermieden wird.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 1 - 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Myzelium-Substanz Jodiert wird.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 1 - 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Myzelium-Substanz Streptomyces-Myzelium-Substanz verwendet wird.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 1 - 7, dadurch gekennzeichnest, daß die Myzelium-Substanzen vor der oder gleichzeitig mit der Überführung in den unviablen Zustand durch Auswaschen von unerwünschten Verunreinigungen befreit werden.
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