KR101340597B1 - 천연 휴믹 물질로부터 다기능성 추출물 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 천연 휴믹 물질로부터 다기능성 추출물을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 천연 휴믹 물질의 농도가 5~10중량%가 되도록 정제수를 부가한 후 3 내시 6시간 동안 교반한 다음 원심분리기를 이용하여 상등액을 취하는 것을 특징으로 하여 투명하고 노란색을 띠며 자외부 260 ~ 280nm범위에서 최대흡광파장을 가지는 추출물 제조방법을 제공한다. 본 발명은 여러 단계의 추출과정을 거쳐야하는 번거러움과 비용 증가의 문제점, 강산 및 강염기를 사용하여 화학적으로 안전하지 않은 문제점이 있기 때문에 활성성분을 실용적으로 활용하기에는 부적절한 종래의 추출법이 가자는 한계를 극복하여 정제수와 부가적으로 자몽 또는 레몬 껍질의 추출물만을 이용하여 간단하고, 비용적으로 저렴하며, 더더욱 화학적으로 안전한 추출법을 제시한다. 또한 본 발명에 따라 제조된 추출물은 식물 생장 촉진 효능, 식물의 병충해 방지 효능, 탈취 효능, 수절 정화 효능, 항균 효능, 항알러지 효능, 간 기능 회복 효능, 세포 독성 예방 효능을 보이는 등 다양하고 우수한 생리 활성을 가진다.

Description

천연 휴믹 물질로부터 다기능성 추출물 제조방법{Manufacturing method of multi functional extract from natural humic material}

본 발명은 천연 휴믹 물질로부터, 상세하게는 휴믹산, 풀빅산, 울빅산 등을 포함하고 있는 천연 휴믹 물질로부터 다기능성 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

유기농에서 식물의 생육을 촉진시키기 위해 활용하고 있는 대부분 작기 중에 엽면시비 또는 토양관주를 통한 처리로 효과에 비해 처리경비가 많이 소요되는 문제점이 있다. 유기재배 농가에서는 휴믹토나 휴믹산, 풀빅산 등을 다양하게 활용하고 있으나 작물의 생육촉진 효과 및 환경 장해 개선에 관한 구체적인 연구사례는 미비한 상황이다. 유기농 병해충 방제에 있어 친환경자재를 활용한 직접적인 방제보다 식물자체의 저항성이나 면역력을 증진시켜 방제효과를 높이는 기술이 중요하다.

선진국에서는 휴믹토와 휴믹산, 풀빅산 등이 천연물질로 다량의 식물 유래 페놀화합물과 미량원소들을 함유하고 있어 작물의 생리활성이나 저항성 증진에 효과가 있는 것으로 보고되어 왔다.

농업용 미생물 Pantoea ananatis 등과 같은 그람음성균 배양배지로 유채박과 휴믹산(1%) 및 당밀 배양기에서 가장 생육이 우수하였다 (영농활용기술, 2011). 오이 육묘시 상토에 휴믹산 2%를 첨가하였을 때 무처리에 비해 오이생육이 양호하다는 보고가 있었다 (영농활용기술, 2010).

일반적으로 천연 휴믹 물질 중 활성유기산 성분으로 알려진 휴믹산 (humic acid)과 풀빅산 (fulvic acid)의 분리는 휴믹산에 대한 국제적인 학회인 International Humic Substances Society (IHSS)가 제시한 방법을 사용한다. 이 방법은 휴믹토 원료에 pH 10의 0.1 M NaOH 용액을 처리하고 난 후 6 M 염산을 용액의 pH가 1 부근이 될때까지 처리하여 휴믹산을 침전시키고 상등액으로부터 풀빅산을 분리한다. 휴믹산과 풀빅산의 정제법으로는 흡착크로마토그래피 (adsorption chromatography), 양이온교환수지 크로마토그래피 (cation-exchange chromatography), 투석 (dialysis) 등의 방법을 사용한다 (도 1 참조).

또한 도 1과 유사한 방법은 대한민국 특허 공개 번호 제10-2012-0108816호에도 개시되어 있다.

도 1에 의해 제시된 종래의 추출 방법은 여러 단계의 추출과정을 거쳐야하는 번거러움과 비용 증가의 문제점이 있기 때문에 활성성분을 실용적으로 활용하기에는 부적절하다.

따라서 본 발명은 상술한 종래의 문제점을 해결하여 단순한 추출 과정에 의해 추출될 뿐만 아니라 화학적으로도 안전한 물질에 의해 추출이 되며 다양한 생리 활성을 가져 응용 범위가 매우 넓은 추출물을 제조할 수 있는 추출 방법을 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은

천연 휴믹 물질의 농도가 5~10중량%가 되도록 정제수를 부가한 후 3 내시 6시간 동안 교반한 다음 원심분리기를 이용하여 상등액을 취하는 것을 특징으로 하여 투명하고 노란색을 띠며 자외부 260 ~ 280nm범위에서 최대흡광파장을 가지는 추출물 제조방법을 제조한다.

본 발명에 따른 추출물 제조방법은 정제수를 부가한 후 정제수의 온도를 60~70℃로 상승시켜 온탕에서 추출되도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 추출물 제조방법은 정제수를 부가한 후 자몽 또는 레몬 껍질의 분쇄물을 전체 중량에 대하여 0.05 내지 0.2 정도의 비율 더 부가하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 자몽 또는 레몬 껍질의 분쇄물이 자몽 또는 레몬 껍질을 소금물에 2 내지 7시간 동안 침지시킨 후에 세척하여 소금물을 제거한 후 분쇄하여 제조된 것을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 추출물 제조방법에 있어서, 상기 추출물은 식물 생장 촉진 효능, 식물의 병충해 방지 효능, 탈취 효능, 수절 정화 효능, 항균 효능, 항알러지 효능, 간 기능 회복 효능, 세포 독성 예방 효능을 가진다.

본 발명은 여러 단계의 추출과정을 거쳐야하는 번거러움과 비용 증가의 문제점, 강산 및 강염기를 사용하여 화학적으로 안전하지 않은 문제점이 있기 때문에 활성성분을 실용적으로 활용하기에는 부적절한 종래의 추출법이 가자는 한계를 극복하여 정제수와 부가적으로 자몽 또는 레몬 껍질의 추출물만을 이용하여 간단하고, 비용적으로 저렴하며, 더더욱 화학적으로 안전한 추출법을 제시한다. 또한 본 발명에 따라 제조된 추출물은 식물 생장 촉진 효능, 식물의 병충해 방지 효능, 탈취 효능, 수절 정화 효능, 항균 효능, 항알러지 효능, 간 기능 회복 효능, 세포 독성 예방 효능을 보이는 등 다양하고 우수한 생리 활성을 가진다.

도 1은 종래의 추출방법을 도시한 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 추출방법을 도시한 흐름도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 추출물과 풀빅산의 성상 비교를 위한 사진이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 추출물(1)과 풀빅산(2)의 자외가시부흡수스펙트럼 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 추출물의 화학적 안전성에 대한 시험 결과이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 추출물의 탈취효과를 시험을 위한 검지관과 대조구의 검지관 사진이다.
도 7은 본 발명의 일시예에 따른 추출물의 수질정화 효과 시험을 측정하기 위한 대조구와의 비교 시험이다.
도 8은 슬러지 분해력과 응집력에 대한 실험 결과 사진이다(외국제품: 일본 무사시 제품, #3: 본 발명의 실시예에 따른 추출물).
도 9는 본 발명의 일시예에 따른 추출물의 항균 효과에 대한 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일시예에 따른 추출물의 항산화 효과에 대한 그래프이다.

본 발명은 기존의 추출법에서 사용하는 산과 염기 등을 사용하지 않고 정제수 (purified water)만을 사용하여 활성유기산 함유 추출물을 제조하는 방법을 개발하여 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 추출물은 천연 휴믹 물질에 정제수를 원료가 5~10중량%의 농도가 되도록 가하고 3 내지 6 시간 동안 고속 믹서로 교반한 후 고속 원심분리기를 이용하여 천연토 성분을 침전시킨 후 상등액을 취해 필터, 바람직하게는 종이필터 또는 공경 0.45㎛의 멤브레인 필터로 여과하여 제조된다.

본 발명에 따른 추출물 제조방법에 있어서 추출 효율을 향상시키기 위하여 정제수를 가하고 고속 믹서로 교반하기 전에 정제수의 온도를 60~70℃로 상승시켜온탕에서 추출되도록 한다.

상술한 바와 같은 본 발명에 따른 추출물 제조방법은 도 2로 표시하였다.

본 발명에 따른 추출물 제조방법과 종래의 IHSS에서 추천한 방법으로 추출하여 분리한 풀빅산의 성상을 비교했을 때 본 발명에 의해 제조된 추출물은 풀빅산과 유사하게 노란색을 띠나 풀빅산보다 진한 색을 나타냄을 볼 수 있었다(도 3 참조).

두 물질을 자외가시부흡광광도법 (UV-Vis spectrophotometry)으로 비교 분석한 결과에서 휴믹천연토 추출물의 최대흡광파장은 풀빅산과 동일하게 273nm에서 관찰되었으며, UV 200~600 nm 범위에서 흡수스펙트럼을 관찰한 결과 230nm이하 부근에서 약간의 차이를 보이나 그 이상의 파장 범위에서는 둘 간의 스펙트럼 패턴이 거의 유사함이 관찰되었다 (도 4 참조).

따라서 본 발명에 따라 제조된 추출물은 약간의 차이를 보이긴 하나 성상과 자외가시부흡광도 분석 결과 풀빅산과 매우 유사한 특성을 가짐을 확인할 수 있었다.

상기 본 발명에 따라 제조한 추출물을 탈취제로서 허가를 위하여 한국화학융합시험연구원에 의뢰하여 하였으며, 그 의뢰 결과를 도 5에 첨부합니다. 도 5를 보면 유해성분이 전혀 함유되어 있지 않은 화학적으로 안전한 추출물이 제조되었음을 확인할 수 있습니다.

또한 본 발명에 따른 추출물 제조방법은 추출 효율을 높이기 위하여 다음과 같은 과정이 추가될 있다.

추가되는 과정은 정제수를 가한 후 또는 정제수를 가하고 가온을 한 후에 자몽 또는 레몬 껍질의 분쇄물을 더 부가하는 과정이다. 이와 같은 과정은 추출 효율을 향상시켜 최종 추출물을 동결건조하여 건조 중량을 측정하여 원료 물질의 동일한 양을 가지고 비교하였을 때 최종 추출물의 동결 건조물의 중량에서 약 10 내지 15%의 증가를 확인할 수 있었다.

상기 자몽 또는 레몬 껍질 분쇄물의 부가 중량은 원료 물질에 정제수가 부가된 전제 중량에 대하여 약 0.05 내지 0.2 정도의 비율로 부가하는 것이 바람직하다.

더욱 바람직하게는 자몽 또는 레몬 껍질 분쇄물에 포함될 수 있는 당류 성분을 제거한 후에 부가하는 것인데, 당류 성분을 제거된 분쇄물은 자몽 또는 레몬 껍질을 소금물에 2 내지 7시간 동안 침지시킨 후에 세척하여 소금물을 제거하고 이를 분쇄하여 제조하는 과정을 통하여 얻을 수 있다.

이하 상술한 바와 같은 분 발명에 따른 제조방법에 의해 제조된 추출물의 다양한 생리 활성, 기능성에 대한 시험예를 기술하고자 한다. 본 시험예는 도 2의 제조 방법에 따라 제조된 추출물 이용하였다.

1. 작물 생육 촉진, 질병 예방 및 치료 효과 시험

1) 고추 수량 증진 및 고온장해 경감 효과

상토처리 방법 : 고추 육묘에 사용되는 상토에 천연휴믹물질과 본발명에 따른 추출물을 각각 500~1000배 물에 희석하여 상토에 고르게 섞은 후, 고추 종자를 파종하여 고추묘를 온실에서 육묘하였다.

유묘침지처리 : 고추 정식 전 고 추유묘 트레이를 천연휴믹물질과 본발명에 따른 추출물 0.1~0.2% 용액에 30분간 침지 후 본답에 정식하여 뿌리활착 및 생육을 증진시켰다.

처리효과

- 고추육묘 시 상토에 천연휴믹물질과 본발명에 따른 추출물을 각각 0.1%, 0.2% 1회 처리 65일 후 고추유묘의 지상부 길이 및 뿌리 무게를 조사하였더니 휴믹토추출물은 23.6% 이상, 휴믹토는 4% 이상 생육이 촉진되었다(하기 표 1 참조)

처리구		지상부 길이(cm)	지하부 무게 (g)
무처리		59.3d	28.0d
본발명의 추출물	0.1%	73.3ab	42.8b
	0.2%	80.0a	50.3a
천연 휴믹 물질	0.1%	69.7bc	41.3b
	0.2%	61.7cd	35.3c
통계적 유의수순 <0.05

- 유기농 고추재배시 고추유묘를 천연휴믹물질과 본 발명의 추출물 0.1% 단독 및 혼합 1회 침지 후 정식하였더니 무처리에 비해 생육 및 수량이 11.4% 높았으며, 천연휴믹물질과 본 발명의 추출물+천연휴믹물질 처리구는 무처리구에 비해 13.5% 고온장해를 경감하였다(표 2 참조).

	청고추(개)	고온장해(개)	초장(cm)
무처리	26.4ab	5.2b	88.4d
본 발명의 추출물 0.1%	23.7b	5.5b	100.8a
천연 휴믹 물질 0.1%	29.4a	4.5a	96.4b
추출물+천연휴믹물질 0.1%	26.3ab	4.2a	92.2c
통계적 유의수순 <0.05

2) 휴믹토추출물 농도별 채소종자 발아에 미치는 영향(표 3 및 표 4 참조)

희석배수	종자별 발아율(%)
	오이	고추	무	평균
무처리	90.0	96.7	93.3	93.33
100배	93.3	90.0	96.7	93.33
250배	96.7	86.7	93.3	92.23
500배	100	93.3	90.0	94.43
1000배	93.3	100	93.3	95.53
2000배	93.3	100	93.3	95.53

좌: 무처리, 우: 본발명의 추출물 +100배	고농도의 휴믹토추출물 침지종자

-고찰-

- 전체적으로 본 발명의 추출물이 채소 종자 발아에 미치는 영향은 크지 않으나 고추종자는 고농도로 희석할 경우 (100배와 200배) 종자 발아율과 뿌리 생장이 억제되는 경향을 보였다.

- 이는 본 발명의 추출물이 종자에 묻어 있는 종자소독제(농약)의 침투를 도와 약해가 나타났을 가능성도 있다.

3) 본 발명의 추출물과 난각칼슘의 고추 배꼽썩음병 (석회결핍증상) 억제효과(표 5 참조)

처리별		배꼽썩음 피해 과실수					감소 비율 (%)
		1차조사 (7/29)	2차조사 (8/13)	3차조사 (9/3)	4차조사 (9/29)	계
본 발명 추출물 (100배 희석)	A-1	45	15	6	0	66	39.7
	A-2	52	35	8	0	95
난각칼슘 (100배 희석)	B-1	47	35	17	0	99	26.2
	B-2	64	14	14	6	98
본발명 추출물 +난각칼슘 (각 100배 희석)	C-1	35	11	18	2	66	51.3
	C-2	43	12	5	4	64
무처리	D-1	49	38	33	3	123	-
	D-2	68	36	37	3	144

-고찰: 본 발명의 추출물이 칼슘결핍에 의한 배꼽썩음병 억제 효과가 있으며, 난각칼슘과 혼용 살포시 그 효과가 다소 높아진다.

4) 휴믹토추출물과 난각칼슘의 고추 담배나방 피해 억제효과(표 6 참조)

처리별		담배나방 피해 과실수					감소 비율 (%)
		1차조사 (7/29)	2차조사 (8/13)	3차조사 (9/3)	4차조사 (9/29)	계
본 발명 추출물 (100배 희석)	A-1	13	107	43	6	169	22.8
	A-2	22	100	30	17	169
난각칼슘 (100배 희석)	B-1	14	109	41	10	174	30.4
	B-2	8	62	39	22	131
본 발명 추출물 +난각칼슘 (각 100배 희석)	C-1	15	74	32	2	123	38.6
	C-2	25	71	43	7	146
무처리	D-1	19	130	69	8	226	-
	D-2	14	146	48	4	212

-고찰: 휴믹토추출물이 고추의 담배나방 피해를 억제하는 효과가 있으며 난각칼슘과 혼용 살포시 그 효과가 다소 높아진다.

5) 휴믹토추출물과 난각칼슘의 고추 탄저병에 미치는 영향(표 7 참조)

처리별		탄저병 피해 과실수
		1차조사 (7/29)	2차조사 (8/13)	3차조사 (9/3)	4차조사 (9/29)	계	발병지수
본 발명 추출물 (100배 희석)	A-1	1	0	111	199	311	84.2
	A-2	0	1	475	233	709
난각칼슘 (100배 희석)	B-1	0	0	107	506	613	101.7
	B-2	0	0	84	535	619
본 발명 추출물 +난각칼슘 (각 100배 희석)	C-1	0	0	526	400	926	134.7
	C-2	2	0	191	514	707
무처리	D-1	1	0	184	344	529	100
	D-2	0	0	151	532	683

-고찰: 휴믹토추출물이 고추탄저병 억제 효과가 다소 있을 것으로 기대되었으나, 본 시험에서는 단독처리는 미약하나 효과가 있었으나 혼합처리에서는 효과가 없는 것으로 나타났다. 고추 탄저병은 국부적 지역적으로 대 발생되므로 1회 포장시험으로는 결론을 내기 어려운 측면이 있다.

6) 휴믹토추출물의 상토 첨가 농도별 상추 수량에 미치는 영향(표 8 참조)

본 발명 추출물과 상토 혼합비율	수확 시기별 생체중 (g/주) 합계
	1차	2차	3차	4차	5차	합계	증감(%)
0	24.63	12.01	22.44	14.98	20.33	94.39	0
1 : 100	16.09	9.96	29.69	28.68	26.28	110.70	17.3
1 : 250	18.41	11.12	35.21	29.16	24.72	118.62	25.7
1 : 500	20.39	14.48	29.07	14.78	18.04	96.76	2.5
1 : 1,000	24.36	14.15	18.31	8.05	12.74	77.61	-17.8
1 : 2,000	14.50	9.81	25.38	19.78	15.87	85.34	-9.6

-고찰: 휴믹토추출물과 토양 혼합 비율이 500배 이하일 경우에는 상추 생장을 다소 촉진하는 것으로 나타남.

7) 휴믹토추출물의 상토 첨가 농도별 고추 생육에 미치는 영향(표 9 및 표 10 참조)

본 발명의 추출물과 상토 혼합비율	고추 생육 및 증감율 (처리별 10주 평균)
	초장(cm) / 증감율		엽수(개) / 증감율		생체중(g) / 증감율
0	77.13	0	50.00	0	82.06	0
1 : 100	97.60	26.5	84.67	69.3	128.11	56.1
1: 250	96.40	25.2	91.00	82.0	117.42	43.1
1 : 500	88.60	14.9	57.33	14.7	106.82	30.2
1 : 1,000	83.80	8.6	55.33	10.7	87.04	6.1
1 : 2,000	70.25	-9.7	47.33	-5.7	71.97	-14.0

본 발명 추출물 0 vs 250배	본 발명 추출물 0 vs 500배	본 발명 추출물 0 vs 1000배

고찰: 휴믹토추출물의 토양혼합비율이 1,000배 이하에서는 고추생육을 현격히 증가 시켰는데, 토양에 500배로 희석 혼합하는 것이 가장 효과적인 것으로 판단된다.

8) 휴믹토추출물의 상토 첨가 농도별 무 생육에 미치는 영향(표 11 및 표 12 참조)

본 발명 추출물과 상토 혼합비율	무 뿌리 (g/주, 10주 평균)		무 엽수 /주 (10주 평균)
	무게(g)	증감율	엽수	증감율
0	19.82	0	10.67	0
1 : 100	34.11	72.1	13.00	21.8
1 : 250	26.10	31.7	12.33	15.6
1 : 500	41.21	100.9	12.00	12.5
1 : 1,000	24.29	22.5	9.33	-14.4
1 : 2,000	23.52	18.7	10.00	-6.3

좌로부터 본 발명 추출물 0, 1000배, 500배, 250배	본 발명 추출물 무처리 vs 500배 비교

-고찰: 휴믹토추출물의 무 생장촉진 효과는 고추와 비슷하게 1000배 이하로 혼합시 생장을 현격하게 촉진 시켰다.

9) 종합고찰

본 발명에 따라 제조된 추출물의 다양한 기능이 작물 생장 촉진이나 병해충 발생억제 등에 유리하게 작용한다. 난각칼슘 등과 같은 유기농자재와 혼합사용할 경우 칼슘결핍 증상(배꼽썩음병)이나 담배나방 등의 방제효과를 상승시킨다. 채소 육묘시 토양과 500대 1로 (부피비율) 혼합하여 작물을 재배할 경우 고추나 무 등의 생장을 현격하게 증가시키고 건전성을 오래도록 유지시켰다.

2. 탈취 효능 시험

가. 탈취효능 시험 1

1) 물질 및 방법

본 발명에 따른 추출물의 탈취효과를 검사하기 위하여 가스 검지관법을 이용하여 암모니아, methylmercaptan, 유화수소, isovaleric acid, propionic acid의 농도를 측정하였다.

- 가스 검지관법 이용-

냄새주머니(35cm X 50cm)

암모니아 : 암모니아수(28% 특급)에서 발생된 가스

methylmercaptan : methylmercaptan 나트륨 용액(15%)에 희류산을 더해 발생시킨 가스

황화수소 : 유화철(Ⅱ)에 희류산을 더해 발생시킨 가스

isovaleric acid : isovaleric acid(특급)에서 발생된 가스

propionic acid : propionic acid(특급)에서 발생된 가스

가스검지관 (Gastec corporation)

검체와 본 발명의 추출물을 각각 냄새주머니 안에 넣어 heat sealing을 실시한 후, 공기 9L를 봉입하여 설정한 가스농도가 되게 시험대상가스를 첨가한다. 이것을 가만히 두어 경과시간마다 주머니 안의 가스농도를 가스검지관을 이용하여 측정한다. 검체사용량, 초기가스농도 및 측정시간 및 조건은 표 13과 같다.

검체사용량	50g
초기가스농도	암모니아 : 500ppm methylmercaptan : 4.0ppm 황화수소 : 20ppm isovaleric acid : 15ppm propionic acid : 10ppm
온도	실온
측정시간	암모니아, isovaleric acid : 10분, 30분, 1시간, 3시간 methylmercaptan, 황화수소 : 10분, 1시간, 3시간, 6시간, 24시간 propionic acid : 10분, 30분, 60분

3)결과

-암모니아 감소-

표 14를 참조하면 3시간 이후 27 ppm를 나타내어 95%의 암모니아 발생 감소효과를 확인할 수 있다.

		(initial gas concentration : 약 500ppm)
	Times
	10min	30min	1h	3h
본 발명 추출물	290	170	58	27
무처리	500	500	500	490

-methylmercaptan 감소-

표 15를 참조하면 본 발명의 추출물은 methylmercaptan의 발생을 24시간 후 25%의 감소효과를 나타냈다.

		(initial gas concentration : 약 4.0ppm)
	Times
	10min	1h	3h	6h	24h
본 발명 추출물	3.5	3.5	3.5	3.3	3.0
무처리	4.0	4.0	4.0	4.0	3.9

-유화수소 감소-

표 16을 참조하면 유화수소의 발생을 24시간 후 25%의 감소효과를 나타내었다.

		(initial gas concentration : 약 20ppm)
	Times
	10min	1h	3h	6h	24h
본 발명 추출물	19	18	18	18	15
무처리	20	20	20	20	20

-isovaleric acid 감소-

표 17을 참조하면 3시간 이후 1 ppm 이하로 나타나 93.4%의 탈취효과를 나타내었다.

	(initial gas concentration : 15ppm)
	30min	1h	3h
본 발명 추출물	5.6	3.0	<1.0
무처리	15.0	15.0	14.0

-propionic acid 발생 감소

표 18을 참조하면, 프로피온산의 발생을 10분 후 80%의 감소효과를 나타내었으며 1시간 후 0.5 ppm이하로 나타나 95% 이상의 탈취효과를 나타내었다.

		(initial gas concentration : 10ppm)
	Times
	10min	30min	60min
본 발명 추출물	2.0	1.0	<0.5
무처리	10.0	10.0	9.8

나. 탈취 효능 시험 2

춘천시와 협약을 통하여 춘천시 하수 종말 처리장에 본 발명의 일시예에 따른 추출물을 살포 한 후 악취 물질에 대한 농도를 측정하고 이와 대조구로서는 본 발명의 실시예에 따른 추출물을 살포하지 않은 상태에서 농도를 측정하여 탈취 효능을 시험하였다.

농도의 측정을 위한 검지관에 대한 사진은 도 6에 첨부하였으며, 시험 결과를 하기 표 19로 나타냈다. 하기 표 19를 보면 악취 물질의 농도가 현격하게 감소함을 확인할 수 있었다.

No	측정일시	구분	농도(ppm)	비고
1	05월 07일 17:00	추출물 투입	0.5	16:45분에 추출물 투입
		대조구	1.5
2	05월 07일 17:38	추출물 투입	0.5	17:23분에 300㎖ 추가 투입
		대조구	4.0
3	05월 08일 08:50	추출물 투입	0.2
		대조구	0.6
4	05월 09일 09:20	추출물 투입	0.2 이하	대조구: 검지관 측정범위 초과
		대조구	6.0 이상
5	05월 10일 09:10	추출물 투입	0.2 이하	대조구: 검지관 측정범위 초과
		대조구	6.0 이상

3. 수질 정화 효능 시험

1) 하수 종말 처리장의 수질 정화 실험

첨부한 도 7에서 보는 바와 같이 춘천의 하수종말처리장에서 샘플을 채취한 후에 본 발명의 따른 추출물을 넣은 것과 아무것도 넣지 않은 대조구에 대한 사진입니다. 도 7의 사진을 통해서도 본 발명에 따른 추출물의 효과를 충분히 알 수 있으며, 또한 총질소 함량(T-N)과 총인 함량(T-P)를 측정하여 그 결과를 표 20으로 나타냈으며, 표 20을 보면 함량이 상당히 감소하였음을 알 수 있습니다. 또한 현재 총-질소 함량을 약품으로 감소시킬 수 있는 것은 본 발명의 우수성을 명백하게 설명하는 것입니다.

시료명	T-N	T-P	비고
유수지	15.094	1.934	5월 7일 채수 원액
대조구	19.302	2.420	5월 8일 08시 50분 측정
대조구	15.756	1.937	5월 13일 15시 23분 측정
본 발명 추출물 투입	13.068	1.395	5월 8일 08시 50분 측정
본 발명 추출물 투입	10.621	1.308	5월 13일 15시 23분 측정

2) 슬러지 분해력 및 응집력의 비교 실험

액상과 슬러지가 섞이도록 공업용 폐수를 한참 흔들어 각 시료통에 넣은 후, 일본 무사시 제품의 수질정화제와 본 발명의 추출물을 첨가하여 슬러지 분해력과 응집력을 시험하여 그 결과를 도 8에 나타냈다.

도 8에서 외국제품이라고 표시된 일본 무사시 제품의 수질정화제 첨가한 시료나 #3로 표시된 본 발명에 따른 추출물을 첨가한 시료 모두에서 동일한 정도 응집 효과가 나왔으며, 슬러지의 분해력을 비교해보면 본 발명에 따른 #3에서 슬러지 분해력이 높은 것을 확인할 수 있었다.

3) 악취 저감 효과 실험

악취 저감 효과는 상기 시료통을 24 시간이 지난 이후, 관능법에 따라 냄새를 맡을 수 있는 시험대상자 20인을 동원하여 냄새를 맡도록 한 후, 냄새 덜 나는 시료통을 선택하도록 하도록 하였다.

그 결과 20인 모두 본 발명에 따른 풀빅산을 포함하는 시료통인 #3를 선택하여 기존에 사용되고 있는 일본 무사시 제품에 비하여 악취 저감 효과가 뛰어남을 알 수 있다.

4) 기대효과

본 발명의 추출물은 폐수처리공정과 오일류 제거에 탁월한 효과가 있을 것으로 기대된다. 공업용 폐수 특유의 아주 심한 악취가 제거되고, 철판 벽에 오염이 없고 빠득빠득하며 파이프 관로에 막힘이 없고, 녹이 슬지 않는 박리효과가 있을 것으로 사료된다.

또한 본 발명의 추출물은 추가적인 응집제의 사용 없이도 고형물을 응집시켜 액상층과 슬러지층을 확연히 분리시 냉각탑, 하수관, 축사 내 급수라인에 형성된 바이오막(bio film) 제거할 수 있다.

따라서 본 발명의 추출물은 오일제거제, 청소용 세정제, 탈취제로 사용할 수 있으며 축분뇨 저장조의 굳은 슬러지 제거가 수월하며, 슬러지 발생량 및 악취 감소를 통해 용존산소량(DO)을 증가시켜 탁월한 슬러지 분해효과가 기대된다.

5) 응용 사업분야

가. 일반 산업제 / 수질정화제 (공업용 폐수 악취제거 및 응집, 처리시설 박리효과)

- 각 산업단지 폐수발생업체

- 식기세척의 세정제, 부엌 및 욕실청소제

- 수영장등 수질개선(악취/박리)

나. 악취저감제

- 물탱크 악취제거 및 박리효과 (이끼가 끼지 않는다)

- 200톤 축분액비탱크 악취제거 (지자체 보조사업대상) ---> 냄새없는 양질의 액비 생산

- 축산농가, 음식물쓰레기(개인가정, 공공처리장) 악취제거

- 음식물쓰레기(개인가정, 공공처리장) 악취제거

다. 고성능 전용계면활성제

- 해양산업에서 선박의 기름때 세척제, 탈취제

- 섬유가공 공정에서 흡수증진제

- 잉크, 색소, 페인트, 살충제, 제초제, 동물용 사료산업

라. 축산환경 개선제

- 악취저감 효과

- 살처분 매몰지 악취 및 유기분해 효과

- 속성분해(축분 및 폐가축), 유기비료자원화 효과

4. 항균 효과 시험

-박테리아 배양 및 균주( Bacterial culture and strains )-

본 실험의 대표적인 병원성 세균으로는 식중독 및 설사증을 유발하는 Salmonella typhimurium (Sal . typhimurium)을 공시하였으며 증균배지 및 선택배지로는 brain heart infusion (BHI) broth와 XLD agar, MacConkey agar를 이용하였으며 그람양성균으로는 Staphylococcus aureus와 Enterococcus faecium을 공시하였으며 Staphylococcus aurues ( SA )의 증균배지 및 선택배지로는 BHI broth와 5% sheep blood가 함유된 blood agar, mannitol salt agar (MSA) 를 Enterococcus faecium 의 증균배지로는 blood agar와 BHI broth를 사용하였다. 그람양성 항생제 내성균으로는 methicillin-resistant SA (MRSA)와 vancomycin-resistant Enterococcus faecium (VRE)를 공시하였다. 다른 그람음성균으로는 E. coli를 그람음성 항생제 내성균으로는 imipenem-resistant Acinetobacter baumannii (IRA)를 공시하였다.

- Gram 양성균과 음성균에 대한 항균효과-

본 발명에 따른 추출물을 다양한 농도로 그람양성균과 그람음성균과 혼합하여 10시간 반응 후 항균효과를 측정한 바, 그람양성균인 S. aureus에서는 0.01% 농도만으로도 90%이상의 항균효과를 나타내었으며 0.1%이상의 농도에서는 100%의 항균효과를 나타내었다. 하지만 E. faecium은 본 발명 추출물 0.01% 농도에서 10%, 0.1% 농도에선 20%, 그리고 1% 본 발명 추출물 농도에선 80% 이상의 항균 효과를 나타내었다.

항생제에 내성을 보이는 그람양성균인 MRSA와 VRE도 MSSA와 E. faecium의 항균 pattern과 아주 유사하였다. MRSA에서 본 발명 추출물 0.01, 0.1과 1%에서 90% 이상의 항균효과를 나타내었으나 MSSA보다는 감수성이 낮게 나타났다. VRE에서는 농도별로 18%, 23%, 93%의 항균효과를 보여 오히려 항생제 감수성인 E. faecium보다도 높은 감수성을 나타내었다.

그람음성균인 E. coli는 0.01% 본 발명 추출물 농도에서 30%, 0.1% 추출물에서 58%, 1% 추출물에서 90% 이상의 항균력을 나타내어 아주 농도에 비례하게 항균효과를 나타냈다. 항생제 내성 A. baumannii에서는 추출물 0.01%만으로도 거의 90%가 넘는 항균효과를 나타내었으며 1% 추출물에서는 100% 증식이 억제되었음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과를 종합하여 볼 때 풀빅산은 그람양성균, 그람음성균, 항생제 내성균에 동일하게 항균력을 나타내고 있었으며 균종에 따라 감수성은 차이를 나타내었으며, 항생제 감수성 세균이나 항생제 내성 세균이나 풀빅산에 동일한 감수성을 나타내었다(도 9 참조).

5. 항산화 효과 시험

1) 물질 및 방법

(1) Cell Culture and Cell treatment

MTT 세포생존능을 실험하기 위해 간세포주인 Huh7(Human hepatoma cell line)을 사용하였으며, Huh7 세포주는 10% fetal bovine serum (FBS), nonessential amino acids, penicillin와 streptomycin을 포함한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에서 배양 증식하였다.

(2) MTT cell viability assay

Oxidative stress에 대한 본 발명의 추출물의 항산화작용을 알아보기 위해 MTT cell viability assay를 수행하였다. 96well에 1X10⁵/ml의 농도로 cell을 분주한 후 24시간 배양시킨다. 1% 추출물을 최종 농도가 0, 0.001, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2%되도록 DMEM로 희석하여 각 well에 분주하였다. 48시간 배양 후, 산화적 스트레스 유발을 위해 처리군에는 10mM H₂O₂를 2시간 처리하였다.

세포배양액에 MTT용액을 20μl 첨가하여 37℃에 2hr이상 배양 후, 배지를 조심스럽게 제거하고 반응을 정지시키기 위해 well 당 200μl DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 5분간 혼합하였다. Microplate ELISA reader로 파장 560nm에서 흡광도를 측정하여 세포생존능을 계산하였다. 추출액의 시간별 효과를 알아보기 위해 추출물을 최종농도 0.05%되게 DMEM으로 희석하여 처리한 후 0, 24, 48 시간동안 배양하여 MTT 세포생존률을 확인하였다.

2) Results

본 발명의 추출물의 항산화 효과(Anti-oxidant Effect)를 세포 활성을 알 수 있는 MTT assay를 이용하여 실험하였다. 항산화 효과 실험을 용량 의존적 방식(dose-dependant manner)에서 MTT assay를 실행하여 흡광도를 측정한 결과 정상 세포는 absorbance가 0.189인데 반해 H₂O₂ 처리한 세포는 0.082로 정상세포의 값과 비교하여 절반 정도 낮았다. 본 발명의 추출물을 0.001%, 0.01%, 0.10%로 세포에 처리한 결과 각각의 Absorbance는 각각 0.118, 0.169, 0.150으로 나와 항산화 효과를 확인할 수 있었다(도 10참조).

6. 항알러지 효과 시험

1) 방법

본 발명의 추출물이 체내에서 알레르기를 유발하는 비만세포로부터 알레르기 유발물질의 분비 억제 효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험하였다.

RBL-2H3 세포는 글루타민과, 항생제와 10% 우혈청이 보충된 최소 배지에서 배양하였으며, 분비실험을 하기 위한 세포는 트립신에 의해 수거한 후, 24-well 배양기에 well당 200,000개의 세포를 200 ng/mL DNP-특이성 IgE와 같이 배양하였다

상기 배양된 세포는 PIPES 완충액(25 mM PIPES, pH 7.2, 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 5.6 mM glucose, 및 0.1% BSA)으로 세척한 다음, 항원을 첨가하기 전에 30분 동안 전배양하였다. 전 배양 후 항원을 최종 농도 25 ng/mL로 첨가하여 자극을 유도하였다.

2) 결과

알레르기 유도물질의 분비 정도는 배지 중에 분비된 탈과립의 표식자인 헥소사미니다제(hexosaminidase)의 활성을 p-니트로페닐아세틸-β-D-글루코사미나이드(p-nitrophenylacetyl-β-D-glucosaminide)로부터 유리된 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 양으로 결정하여 그 결과를 하기 표 20에 나타냈다.

		Ag	Ag	Ag	Ag
본 발명 추출물 (%)	0	0	0.01	0.05	0.1
Mean	0.125333	1.187667	1.152	1.040667	0.965667
SE	0.040539	0.018022	0.068061	0.067304	0.036287

상기 표 1을 참조하면 본 발명의 추출물이 첨가되지 않을 때에 비하여 본 발명의 추출물이 첨가되었을 때 농도 의존적으로 감소함을 알 수 있었다. 따라서 알레르기를 유발하는 비만세포 RBL-2H3의 다양한 알레르기 유발물질의 분비를 본 발명의 추출물이 농도 의존적으로 억제함을 확인할 수 있었다.

7. 알콜성 지방간을 가진 쥐에서 본 발명의 추출물의 간 기능회복에 관한 연구( Study on Mechanism of Liver Recovery of Fulvic acid in Rat Experimentally Diseased with Alcoholic Fatty Liver )

1) 실험 방법

(1) 실험동물 및 식이공급

실험동물은 6~7주령 Sprague-Dawley계 수컷쥐를 사용하였으며 실내온도 20~22℃에서 사육하며 실험하였다. group은 총 6개로 분류하여 3주간 실험을 진행하였다(하기 표 21 참조)

쥐에 지방간 및 알코올성 간독성을 유발하기 위해 20% ethanol을 공급하고, 본 발명의 추출물의 지방간 예방효과 및 농도별 효과를 알아보기 위해 0.0001%, 0.001%, 0.01%로 나누어 20% ethanol과 동시에 공급하였다.

또한 본 발명의 추출물 면역력 강화와 생리활성효과를 알아보기 위해 0.01% 추출물만을 공급하였다. 모든 group의 식이는 자유음수로 제공되었으며 각각의 group은 하루에 한번 일정한 시간에 실험 식이를 바꿔주며 섭취량을 기록하였다.

	Group	Treatment
1	음성 대조군	water
2	양성 대조군1 (Ethanol)	20% Ethanol
3	양성 대조군2(추출물)	0.01% 추출물
4	실험군 1	0.01% 추출물 + 20% Ethanol
5	실험군 2	0.001% 추출물 + 20% Ethanol
6	실험군 3	0.0001% 추출물 + 20% Ethanol

(2) 몸무게 측정

3주 동안 물과 20% 에탄올, 20%에탄올과 농도별 추출물을 급여하여 증체효과 및 에탄올에 의한 체중변화에 대한 추출물의 효과를 알아보기 위해 4일마다 한번씩 몸무게를 측정하여 기록하였다.

(3) 생화학적 분석( Biochemical analysis )

3주(21일째)에 각 군에서 한 마리씩 희생하여 쥐의 심장에서 혈액을 채취하고 채취한 혈액의 일부는 EDTA Bottle에 넣어 응고를 방지시킨 전혈을 이용하여 풀빅산을 처리 하였을 때 면역력이 증가 되었는가를 알아 보기위한 CBC검사를 실시하고 나머지 혈액은 응고반응을 시킨 후 원심(2000xg, 10분, 3℃)하여 혈청 시료를 분리한다. 분리한 혈청으로 혈청학적 검사를 하였다. 검사종목으로는 총 콜레스테롤, triglyceride, AST(GOT), ALT(GPT), r-GTP, Alkaline phosphatase, 빌리루빈 등을 Human사의 autohemalyzer 900S 생화학 분석 장비를 이용하여 각각의 종목을 검사하였다.

2) 결과

(1) 본 발명의 추출물의 증체 효과 ( growth rate )

3주 동안 물과 20% 에탄올, 20%에탄올과 농도별 추출물 급여하여 증체효과 및 에탄올에 의한 체중변화에 대한 효과는 다음과 같다.

물만 급여한 쥐에 비교하여 20% 에탄올을 급여한 쥐에서 4주후 약 30%의 체중감소가 관찰되었으며 0.01% 추출물을 급여한 군에서는 물만 급여한 군보다 약 25%의 체중증가가 관찰되어 20%의 에탄올을 급여한 군보다 약 45%의 체중증가가 관찰되었다.

그리고 20% 에탄올과 0.001% 추출물을 동시에 급여한 군에서는 체중감소가 관찰되지 않았으며 0.01%와 0.001% 추출물 동시에 급여한 군에서도 뚜렷한 체중감소는 관찰되지 않아 본 발명의 추출물이 에탄올에 의한 체중감소를 방지하는 것으로 관찰되었다.

(2) 본 발명의 추출물의 간기능 회복 효과 및 농도별 효과

본 발명의 추출물의 알코올에 의한 간기능손상에 대한 회복효과를 알아보기 위해 GOT, GPT를 분석하였으며, 그 결과 물만 급여한 쥐에 비교하여 20% 에탄올을 급여한 쥐에서 약 2-3배의 GOT 상승이 관찰되었으나 0.0001%에서 0.01% 본 발명의 추출물을 동시에 급여한 군에서는 GOT 수치가 하락하여 0.01% 추출물을 급여한 군에서는 물만 투여한 정상 rat와 비슷한 GOT 수치를 나타내어 알코올로 인한 간손상을 회복시키는 것으로 나타났다.

GPT의 경우도 에탄올에 의한 GPT의 상승이 관찰되었으며 0.0001%에서 0.01% 추출물을 동시에 급여한 군에서는 GPT 수치가 하락하여 0.01% fulvic acid를 급여한 군에서는 물만 투여한 정상 rat와 비슷한 GPT 수치를 나타내어 알코올로 인한 간손상을 회복시키는 것으로 나타났다.

Claims (5)

1. 천연 휴믹 물질의 농도가 5~10중량%가 되도록 정제수를 부가한 후 3 내시 6시간 동안 교반한 다음 원심분리기를 이용하여 상등액을 취하는 것을 특징으로 하여 투명하고 노란색을 띠며 자외부 260 ~ 280nm범위에서 최대흡광파장을 가지는 추출물 제조방법.
2. 제 1항에 있어서, 정제수를 부가한 후 정제수의 온도를 60~70℃로 상승시켜 온탕에서 추출되도록 하는 것을 특징으로 하는 추출물 제조방법.
3. 제 1항에 있어서, 자몽 또는 레몬 껍질의 분쇄물을 전체 중량에 대하여 0.05 내지 0.2 정도의 비율 더 부가하는 것을 특징으로 하는 추출물 제조방법.
4. 제 3항에 있어서, 상기 자몽 또는 레몬 껍질의 분쇄물이 자몽 또는 레몬 껍질을 소금물에 2 내지 7시간 동안 침지시킨 후에 세척하여 소금물을 제거한 후 분쇄한 것임을 특징으로 하는 추출물 제조방법.
   
5. 삭제

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