DE2716836A1

DE2716836A1 - Antibiotische verbindungen

Info

Publication number: DE2716836A1
Application number: DE19772716836
Authority: DE
Inventors: Spaeter Genannt Werden Wird
Original assignee: Bristol Myers Co
Current assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1976-04-15
Filing date: 1977-04-15
Publication date: 1977-11-03
Also published as: FI55353C; DK165077A; KE3237A; NL7704032A; BE853369A; FR2348224A1; US4064014A; CA1091601A; HK53182A; JPS52128365A; YU39388B; SE7704194L; AU2382077A; FI771142A; JPS6046960B2; DK144978C; FI55353B; IE44818L; LU77114A1; CY1161A

Description

Die Erfindung betrifft neue Anthracyclin-Antibiotika sowie deren Herstellung und Gewinnung.

In der Literatur sind mehrere Anthracyclinglykoside beschrieben. Von diesen stehen auf dem Gebiet der Krebschemotherapie insbesondere Daunomycin und Adriamycin im Vordergrund des Interesses. Die beiden Glycoside wurden bereits klinisch zur Krebsbehandlung in der Humanmedizin eingesetzt.

Die Herstellung von Adriamycin durch Fermentation von S. peuceticus var. caesius ist in der US-PS 3 590 028 beschrieben. Aus der US-PS 3 803 124 ist die chemische Umwandlung von Daunomycin in Adriamycin bekannt.

Daunomycin (hergestellt durch Fermentation von S. peuceticus gemäß GB-PS 1 003 383) entspricht möglicherweise dem Wirkstoff 13057 R.P. von Rhone-Poulenc (früher Rubidomycin und nunmehr Daunoribicin; vgl. die GB-PSen 985 598, 1 188 262 und 1 241 750 sowie die US-PS 3 616 242) und ist vermutlich mit dem in der US-PS 3 092 550 und der GB-PS 901 830 beschriebenen Danubomycin von Ciba identisch (vgl. auch die US-PS 3 686 163 hinsichtlich Dihydro daunomycin ) .

Cinerubin A und Cinerubin B (Glykoside des Aglykone ε-Pyrromycinon) sind in der GB-PS 846 130 beschrieben [vgl. auch die US-PS 3 864 480 sowie Keller-Schierlein et al., "Antimicrobial Agents and Chemotherapy" (1970), Seite 68, und "Chemical Abstracts", 54 (1960), 1466i].

Dem in J. Antibiotics 27 (1974), Seiten 254 bis 259, in der DT-PS 2 362 707 und in J. Amer. Chem. Soc. 97 (20) (1975), Seiten 5955 bis 5956 beschriebenen Anthracyclinglykosid Carminomycin wurde Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Tumorsystemen bei Warmblütern zugeschrieben.

Aus Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1, (1972), Seiten 385 bis 391 geht hervor, daß Trypanomycin eine starke Aktivität gegen Protozon entfaltet. Es weist ein Aglykon auf, das £-Pyrromycinon ähnlich, mit diesem jedoch nicht identisch ist.

Das in "Chem. Ber." 92 (1959), Seiten 1904 bis 1909 beschriebene Antibiotikum Pyrromycin enthält das Aglykon

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t-Pyrromycinonund den glykosidisehen Zucker Rhodosamin.

Zur weiteren Erläuterung und Zusammenfassung von Anthracyclin-Antibiotika betreffenden Literaturstellen wird auf den "Index of Antibiotics from Actinomycetes¹¹ (1967)» Hamao Umezawa , Hauptherausgeber, University Park Press, State College_t Pennsylvania, V.St.A. wie folgt hingewiesen:

Antibiotikum	Seitennummer
Aklavin	111
Cinerubin A	220
Cinerubin B	221
Danubomycin	242
Daunomycin	243
Pyrromycin	542
Rhodomycin A,B	561
Rubidomycin	574

Das Lehrbuch "Antibiotics"» Band 1: Wirkungsmechanismus (1967)» herausgegeben von David Gottlieb und Paul D. Shaw» Springer-Verlag, New York, Inc., N.Y., N.Y., enthält auf den Seiten 190 bis 210 eine Abhandlung von A. DiMarco mit dem Titel "Daunomycin and Related Antibiotics¹¹.

In "Information Bulletin" Nr.10 (Dezember 1972), Internationales Informationszentrum für Antibiotika (in Zusammenarbeit mit der WHO)» Belgien» werden Anthracycline und ihre Derivate besprochen.

Die Erfindung betrifft neue Anthracyclin-Antibiotika. Im besonderen betrifft die Erfindung einen hier als "Bohemeäurekomplex" bezeichneten Anthracyclin-Antibiotikumkomplex. Dieser Komplex wird dadurch erzeugt, daß man einen Bohemsäure (bohemic acid) bildenden Stamm von Actinosporangium sp. (vorzugsweise Actinosporangium sp. A.T.C.C. 31127) so lange

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in einem assimilierbare Stickstoff- und Kohlenstoffquellen enthaltenden wäßrigen Nährmedium unter Submersen aeroben Bedingungen kultiviert» bis der Mikroorganismus im Kulturmedium eine relevante Menge des erwähnten Bohemsäurekomplexes produziert hat» und gegebenenfalls den Komplex aus dem Kulturmedium gewinnt. Die Erfindung stellt ferner zwei neue bioaktive Anthracyclinkomponenten des Bohemsäurekomplexes zur Verfügung, die dadurch hergestellt werden, daß man die gesamte Gär- bzw. Fermentationsbrühe mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert und anschließend die einzelnen antibiotischen Verbindungen - beispielsweise nach chromatographischen Methoden - voneinander trennt und isoliert. Der Bohemsäurekomplex und seine bioaktiven Komponenten (hier als "Musettamycin" und "Marcellomycin" bezeichnet) weisen sowohl antibakterielle als auch Antitumor-Aktivität auf.

Der Bohemsäurekomplex und seine Bestandteile Marcellomycin und Musettamycin können durch Fermentation eines neuen Vertreters der Gattung Actinosporangium mit der Bezeichnung "Actinosporangium sp. Stamm C-36,145" hergestellt werden. Dieser Mikroorganismus wurde aus einer in Ontario» Canada» entnommenen Bodenprobe erhalten. Eine Kultur des Mikroorganismus wurde in der American Type Culture Collection» Washington» D.C. hinterlegt und in deren ständige Mikroorganismensammlung unter der Bezeichnung "A.T.C.C. 31127" eingereiht.

Wie bei vielen Antibiotikum bildenden Kulturen entsteht bei der Fermentation von Actlnosporangium sp. Stamm C-36»145 (A.T.C.C. 31127) ein Gemisch oder Komplex aus verschiedenen Komponenten. Zwei bioaktive Anthracyclin-Komponenten» nämlich Musettamycin und Marcellomycin» wurden von den durch den vorgenannten Mikroorganismus gebildeten Bohemsäurekomplex abgetrennt.

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Es wurde festgestellt» daß Musettamyein und Marcellomycin die nachstehenden Formeln aufweisen:

CH,CH,

Musettamycin

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CH₃CH₂..	COOCH-	1	OH	O	OH
	Cx		U
		O	OH

CH

OH ^0H

Marc eilomycin

Wie die obigen Formeln zeigen» sind beide Komponenten Anthracyclinglykoside des Aglykone £-Pyrromycinon. Musettainycin enthält zwei glykosidische Zuckereinheiten, d.h. 2-Deoxy-L-fucose und L-Hhodosamin, während Marceilomycin zwei 2-Deoxy-L-fucose-Einheiten und eine L-Rhodosamin-Einheit aufweist. Sie Strukturen der beiden

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Bestandteile wurden durch Analyse ihrer IR- und NMR-Spektren bestimmt und stehen im Einklang mit den nachstehend angeführten physikalischen Daten.

Die punktierten Linien in den obigen Formeln zeigen an» daß sich die betreffende gebundene Gruppe teilweise unterhalb der Ebene des Rings, mit dem sie verknüpft ist» befindet. Die spitzen Symbole zeigen an» daß die gebundene Gruppe oberhalb der Ringebene angeordnet ist.

Der Bohemsäurekomplex und seine Komponenten Musettamycin und Marcellomycin bilden sowohl mit Säuren als auch mit Basen Salze. Die pharmakologisch verträglichen Salze des Komplexes und seiner Komponenten fallen ebenfalls unter die Erfindung. Beispiele für solche pharmakologisch verträgliche Salze sind die Salze mit starken Säuren» wie Chlorwasserstoff-» Bromwasserstoff-, Schwefel-, Salpeter- oder Phosphorsäure» sowie mit Metallkationen, z.B. Alkalimetalloder Erdalkalimetallkationen, wie Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Magnesiumionen.

Die Synthese der erfindungsgemäßen Anthracyclin-Antibiotika wird nachstehend beschrieben.

Der Mikroorganismus

Der Stamm C-36,145 weist folgende morphologische Merkmale auf. Der Stamm bildet einen sporangiumartigen Körper (falsches Sporangium) an der Spitze des Sporenträgere (Sporophors), welcher eine Agglomerierung einer dicht verknäuelten bzw. zusammengerollten Sporenkette darstellt. Die Sporenkette ist häufig mit den benachbarten Lufthyphen (aerial hyphae) verflochten und entwickelt sich zu der eporangiumartigen Struktur, die durch ein viskoses Material bedeckt ist. Der sporangiumartige Körper und das Luftmyzel

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bilden eich an Glukose/Asparagin-Agar, Tyrosinagar, Hefeextrakt /Malzextrakt-Agar und Hafermehlagar. Außer einer grossen Zahl falscher Sporangien entstehen auch (allerdings wesentlich weniger) gewöhnliche Sporenketten, welche offene Spiralen bilden. Die Sporen im sporangiumartigen Körper besitzen eine glatte Oberfläche und ellipsoide Form und sind nicht freibeweglich. Die Sporen in der gewöhnlichen Sporenkette weisen eine ovale Form und eine glatte oder gelegentlich warzige Oberfläche auf. Das primäre Myzel ist verzweigt, nicht-septiert und nicht-fragmentiert.

Tabelle I zeigt die an verschiedenen Medien erzielten Kultureigenschaften. Der Stamm C-36,145 gedeiht an den meisten getesteten Agarmedlen gut, die Bildung des Luftmycels und die Sporenbildung verlaufen jedoch etwas langsam. Die Massenfarbe (absolut deckende Farbe) des Luftmycels ist ein leicht grünliches Grau. Die Rückseite der Wachstumskultur ist in Glukose/Asparagin-Agar, anorganische Salze/Stärke-Agar, Hefeextrakt/Malzextrakt-Agar und Hafermehlagar rötlichorange bis rot gefärbt. In Tyrosinagar und Pepton/Hefeextrakt/ Eisen-Agar bildet sie ein melanoides Pigment.

Die physiologischen Merkmale bzw. die Kohlenhydratverwertung des Stammeβ C-36,145 sind aus den Tabellen II bzw. III ersichtlich. Die KultivierungBtemperatur liegt im Bereich von 20 bis 37⁰C; bei 43⁰C ist kein Gedeihen zu beobachten.

Der Stamm C-36,145 enthält in der Zellwand als charakteristische Aminosäurekomponenten !»!-Diaminopimelinsäure (LL-DAf) und Glycin. Diagnostisches Kohlenhydrat ist nicht vorhanden.

Die morphologischen, physiologischen und Kultivierungsmerkmale des Stammes C-36,145 entsprechen jenen des Stammes Streptomyces mit Ausnahme der Bildung des sporangiumartigen Körpers. Die Zellwandzusammensetzung entspricht ebenfalls

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jener der Gruppe Typ I (Streptomyces-Typ) gemäß der Klassifikation von lechevalier and Lechavalier in "Int.J.Syst. Bacteriol. 20 (1970), Seiten 435 bis 443. Der sporangiumartige Körper des Stammes C-36,145 unterscheidet sich anscheinend von dem durch die einwandfrei definierten sporangiumbildenden Gattungen erzeugten normalen Sporangium darin, daß

(1) die letzteren in einer frühen Wachstumsstufe kleine Sporangien bilden» welche im Verlauf der Zeit reifen» und

(2) die gewöhnlichen Sporangien in der Regel nicht von einem viskosen Material bedeckt sind.

Krassilnikov und Tsi-Shen haben 1961 die neue Gattung Actinosporangium innerhalb der Familie Actinoplanaceae (später übertragen in die Familie Streptosporangiaceae) für den Mikroorganismus vorgeschlagen, der eine Sporenmasse bildet, die dem Sporangium sehr ähnlich ist; vgl. Isv. Akad. Navk. UdSSR, Ser.Biol. (1961), Seiten 113 bis 116. Später wurde gefunden, daß der sporangiumartige Körper eine zähe, sporenbildende Masse darstellt und sich vom wirklichen Sporangium unterscheidet. Die Gattung Actinosporangium wurde aufgrund ihrer morphologischen Eigenschaften und der zur Gruppe vom Typ I gehörenden Zellwandzusammensetzung in die Familie Streptomycetaceae eingereiht .

Auf der Grundlage sämtlicher verfügbaren Merkmale ist der Stamm C-36»145 somit als eine neue Art des Genus Actinosporangium anzusehen. Es sei jedoch festgestellt» daß in der Literatur nur zwei Arten der Gattung Actinosporangium erwähnt werden und daß diese Gattung daher noch nicht voll bestätigt wurde; vgl. H.Prauser» "Die Aktinomycetalen"» Int. Symposium der Systematik» 1968» Veb.

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Gustav Fischer Verlag, Jena (1970), Seiten 329 bis 335.

Die vorliegende Erfindung beschränkt sich nicht auf die Verwendung des speziellen Stammes C-36»145 oder auf Mikroorganismen, welche völlig mit der vorstehenden Beschreibung übereinstimmen. Insbesondere sollen andere Bohemsäure bildende Stämme oder Mutanten dieses Mikroorganismus miteinbezogen sein» welche aus dem beschriebenen Mikroorganismus durch verschiedene Methoden, wie Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder UV-licht, Behandlung mit Stickstoff-Senfgasen (nitrogen mustards) oder Einwirkenlassen von Bakteriophagen, erzeugt werden können.

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	Rohrzucker/ Nitrat-Agar	TABELLE I	rückseitige Farbe	36,145	öo
	Glukose/Aspara- gin-Agar	Kulturmerkmale des Stammes C	gelblich-rosa	Luftmyzel	§ diffundi erbares Pigment
	Glycerin/Aspara- gin-Agar	Wachstum	rötlich-orange bis rot	spärlich, weißlich	keines
	anorganisches Salz/Stärke-Agar	mäßig	rosarot	üppig, gräuliches Blatt	keines oder röt lich-orange
	Tyrosinagar	gut	rötlich orange bis tiefrot	mäßig, hellgrau bis blaßrosa	keines oder röt- lich-rosa
O co	Nähragar	gut	braun bis tief pur pur-braun	gering, gräuliches Blatt	hellorange, teil- , weise hellgelb "
-F-	Hefeextrakt/ Malζextrakt-Agar	mäßig	farblos	gering, gräuliches Blatt	dunkelbraun
O _k CD -*	Hafermehlagar	gut	tiefrot	keines	keines
" I	Pepton-Hefe- extrakt/Eisen- Agar	schlecht	lebhaftes Röt lich-orange	mäßig, gräuliches Blatt, teilweise gräulich-rosa	hellbraun
		gut	schwarz	mäßig, gräuliches Blatt	lebhaftes Orange
	mäßig		keines	schwarz ro cn co U) co
	mäßig

TABELLE II

Physiologische Eigenschaften des Stammes C-36»145

Tests

Nitratreduktion in
anorganischem Medium

Nitratreduktion in
organischem Medium

Magermilchagar

10#Lge Magermilchlösung

Gelatineplatte
Melaninbildung
Wachs turnst emperatur

NaCl-Verträglichkeit

Reaktionen

stark positiv
stark positiv

üppiges Wachstum; negative Hydrolyse; tief gelblich-rotes bis tief rötlich-purpurnes Myzelpigment

bräunliche Brühenfarbe; rötlich-oranges Ringwachstum; weder Peptonisierung noch Koagulierung

rasche und vollständige Verflüssigung

stark positiv

optimales Wachstum bei 28⁰C; mäßiges Wachstum bei 20 bis 37⁰C; langsames Wachstum bei 15⁰C; kein Wachstum bei 1O⁰C bzw. 43⁰C

mäßiges Wachstum bei 0,5 bis 4 Ί» NaCl; kein Wachstum bei θ i» NaCl

angewendete Methoden und Materialien

Rohrzucker/Nitrat-Brühe nach Czapek

Nitratmedium; 0,5 Ί» Hefeextrakt» 1,0 % Glukose, 0,5 # KNO, und 0,1 % CaCO₃ °

Leudemann-Medium [Intl.J.Syst. Bacteriol. 21 (1971)» Seiten 240 bis 247]

Basalmedium: 0,4 % Hefeextrakt, 1,0 % Malzextrakt und 0,4 % Glukose

Tyrosinagar und Pepton/Hefeextrakt/ Ei sen-Agar

Hefeextrakt/Malζextrakt-Agar

Basalmedium:
2 £ lösliche
Agar

1 1» Hefeextrakt, Stärke und 1,5 £

OO U)

TABELLE III
Kohlenhydratverwertung des Stammes C-36»145

D(-)-Arabinose -

L(+)-Arabinose ++

D-XyIose ++

D-Ribose ++

L-Rhanmose ++

D-Glukose ++

D(+)-Galactose ++

D-Fructose ++

D-Mannose ++

Rohrzucker ++

Maltose ++

Milchzucker ++

D(+)-Melibiose ++♦)

Raffinose ++♦) D(+)-Melezitose

lösliche Stärke ++

Cellulose -

Glycerin ++

Inosit ++

D-Mannit ++*) Sorbit
Dulcit

Basalmedium: Pridham-Gottlieb-Medium

♦) reiche Bildung eines rötlich-orangen Pigmente

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Herstellung des Bohemsäurekomplexes

Der Bohemsäurekomplex kann durch Kultivierung eines bohemsäurebildenden Stammes von Actinosporangium sp. mit den Merkmalen von A.T.C.C. 31127 oder eines Mutanten davon unter submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium erzeugt werden. Der Organismus wird in einem Nährmedium gezüchtet ι das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle» z.B. ein assimilierbares Kohlenhydrat, enthält. Spezielle Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellen sind Rohrzucker» Milchzucker, Maltose, Mannose» Fructose» Glukose» Glycerin und lösliche Stärke. Das Nährmedium soll ferner eine assimilierbare Stickstoffquelle, wie Fischmehl, Pepton, Sojamehl, Erdnußmehl, Baumwollsaatmehl oder Maisquellwasser (corn steep liquor) enthalten. Man kann dem Medium auch anorganische Nährsalze einverleiben. Beispiele dafür sind beliebige der üblichen Salze, welche dazu befähigt sind, Ionen wie Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlor-, Brom-, Nitrat- oder Carbonationen, zu liefern.

Die Herstellung des Bohemsäurekomplexes kann bei einer beliebigen Temperatur erfolgen, welche ein zufriedenstellendes Wachstum des Mikroorganismus gewährleistet. Man arbeitet beispielsweise bei 20 bis 37⁰C, zweckmäßig bei etwa 27⁰C.

Das Medium ist normalerweise schwach alkalisch; der genaue pH-Wert kann jedoch in Abhängigkeit vom speziellen verwendeten Medium weitgehend variiert werden.

Die Fermentation (Gärung) kann in Erlenmeyer-Kolben oder in Labor- oder Industriefermentera mit verschiedenem Fassungsvermögen durchgeführt werden. Wenn die Fermentation in einem Gärbottich erfolgen soll, stellt man zweckmäßig ein vegetatives Inokulum in einer Nährbrühe her, indem man ein geringes Volumen des Kulturmediums mit der Sporenform des Mikroorganis-

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mus beimpft. Nachdem man auf diese Weise ein aktives Inokulum erhalten hat, überträgt man es zur großtechnischen Herstellung der Antibiotika unter aseptischen Bedingungen in das Gärbottichmedium. Das für das vegetative Medium verwendete Inokulum kann dem für größere Fermentationen verwendeten Medium entsprechen» obwohl man auch andere Medien verwenden kann.

Wie es bei aeroben Submerskulturmethoden üblich ist, wird sterile Luft durch das Kulturmedium geblasen. Das Medium kann mit Hilfe von Bewegungsvorrichtungen bzw. Rührern, wie sie in der Gärtechnik allgemein üblich sind, in Bewegung gehalten werden.

Eine optimale Bildung des Bohemsäurekomplexes wird im allgemeinen nach Inkubaticnsperioden von etwa 190 bis 210 Std. in Eührgefäß- oder Bottichfermentern erzielt. Der Verlauf der Gärung kann dadurch verfolgt werden, daß man das Gärmedium von Zeit zu Zeit gegenüber einem für den Bohemsäurekomplex empfänglichen Mikroorganismus, z.B. D.pneumoniae, St. pyogenes oder S. aureus, testet.

Der Bohemsäurekomplex kann aus dem Gärmedium durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel isoliert werden. Als Lösungsmittel bevorzugt man polare Verbindungen, wie Äthylacetat, Methylisobutylketon oder einen höheren Alkohol, wie n-Butanol. Methylisobutylketon wird besonders bevorzugt. Da die antibiotische Aktivität überwiegend in der Brühe festgestellt wird, kann man diese vor der Extraktion filtrieren. Nach der bevorzugten Methode extrahiert man jedoch die gesamte Gärbrühe mit dem organischen Lösungsmittel bei einem pH-Wert von etwa 7»5 bis 8,5. Anschließend kann man die organische Phase filtrieren und trocknen, wobei man den festen Bohemsäurekomplex erhält. Wahlweise kann der organische Extrakt eingeengt und der

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feste Komplex durch Verdünnen mit einem geeigneten NichtLösungsmittel f wie Skellysolve B, ausgefällt werden.

Auftrennung und Isolierung von Musettamycin und Marcellomycin

Die Auftrennung der Anthracyclin-Antiobiotika Musettamycin und Marcellomycin und deren Abtrennung von den übrigen Komponenten des Bohemsäurekomplexes kann durch Chromatographie von Lösungen des Komplexes an Säulen erfolgen_t die mit einem geeigneten Adsorbens (z.B. Sephadex LH 20; Warenbezeichnung für Dextranderivate» verwendet als Gelfiltrationsmittel in organischen Lösungsmitteln» hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) gefüllt ist. Die Bestandteile des Bohemsäurekomplexes werden dann mit Hilfe eines geeigneten organischen Lösungsmittels, wie Chloroform, vom Adsorbens eluiert. Man fängt mehrere Fraktionen auf und bestimmt unter geeigneter Verdünnung deren Extinktionen (absorbancies) bei 490 πιμ. Man trägt die erhaltenen Werte graphisch gegen die Nummern der entsprechenden Fraktionen auf, um die Peaks für die aus der Säule eluierten Komponenten zu bestimmen. Die auf diese Weise ermittelten richtigen Fraktionen des Elutionsprozesses werden vereinigt und eingedampft. Dabei erhält man die einzelnen Antibiotika in fester üOrm. Die festen Antibiotika können durch Umkristallisation aus einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Acetontril, Chloroform/Skellysolve B oder Methanol, teilweise gereinigt werden.

Die Komponenten Musettamycin und Marcellomycin können nach der in Beispiel 10 und 11 ausführlich beschriebenen Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie-Methode weiter gereinigt werden. Es wurde gefunden, daß diese Methode extrem reine Proben der beiden Antibiotika liefert.

Der Bohemsäurekomplex oder seine Bestandteile Musettamycin

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und Marcellomycin können nach an sich bekannten Methoden in die vorstehend beschriebenen pharmakologisch verträglichen Salze übergeführt werden.

Biologische Aktivität

Die in-vitro-Mindesthemmkonzentration (MHK) von Musettamycin und Marcellomycin wird nach der Standard-Röhrenverdünnungsmethode für mehrere Mikroorganismen bestimmt.

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TABELLE IV

Antiinikrobielles Spektrum von Musettamycin

und Marcellonycin

Test-Mikroorganismus MHK, pg/ml

Marcellomycin

Musettamycin

Bakterien;

Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Escherichia coli Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis

A-9585	0,03	0,06
A-9604	0,03	0,06
A-9497	1	0,5
A-9537	1	1
A-15119	125	>125
A-21780	32	32
A-9977	125	>125
A-9900	>125	>125

Pilze (Fungi):

Candida albicans	A-9540	125	125
Candida tropicalis	A-15051	125	63
Candida krusei	A-15052	125	125
Cryptococcus neofonnans	A-1503	125	63
Trichophyton
mentagrophytes	A-9870	^125	>125

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QQ

Der akute intraperitoneale LDj-Q-Wert bei Mäusen beträgt 9t8 bis 21,12 mg/kg für Musettamycin bzw. 6,35 bis 10,56 mg/kg für Marcellomycin.

Die Verbindungen der Erfindung wurden ferner gegenüber verschiedenen transplantierbaren Nagetier-Tumorsystemen getestet. Einzelheiten der angewendeten Methoden sind in "Cancer Chemoth. Reports" 3» Teil 3 (1972), Seiten 1 bis 87 beschrieben.

Die erste Feststellung der tumorhemmenden Wirkungen wurde am Walker 256-Karzinosarkom, das als fester intramuskulärer Tumor bei Ratten implantiert wurde, festgestellt. Die Behandlung der Versuchstiere mit einer den Bohemsäurekomplex enthaltenden Gärbrühe bewirkte eine 73?»ige Hemmung des Tumorwachstums im Vergleich zu den unbehandelten Tumoren.

Tabelle V zeigt typische therapeutische Wirkungen von teilweise gereinigtem Musettamacin gegenüber zwei lymphatischen Leukämien, d.h. P-388 und L-1210, bei Mäusen. Im Falle der Leukämie P-388 ist eine signifikante Tumorhemmung über einen I6fachen Dosisbereich festzustellen.

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	I	Dosis» mg/kg	TABELLE V	(ascitisch)	überleben de Tiere am 5»Tag	transplantierten	Maus-	überleben de Tiere am 5»Tag	3
	ro O	6,4	Wirkung von Musettamycin gegenüber leukämien	B/V prozen tuale MÜD	6/6	1-1210	(ascitisch)	6/6	'18 108
	I	3,2	P-388	160	6/6	mittlerer Gewichts unterschied (B-V), g	B/V prozen tuale MÜD	5/6
		1,6	mittlerer Gewichts unterschied (B-V), g	U5	6/6	-2,5	140	6/6
s· O UD		0,8	-3,4	145	6/6	-2,5	120	6/6
CD		0,4	-3,0	140	6/6	-1,3	133	-	K»
O		0,2	-2,8	135	6/6	-1,1	107	—
CD			-2,0	120		-	-
		-1,6	—	—
	-2,1

Behandlung: einzelne intraperitoneale Injektion am I.Tag

Auswertung: B/V prozentuale MÜD = mittlere Überlebensdauer (in Tagen)der

behandelten Tiere/mittlere Überlebensdauer der Vergleichstiere χ 100;
B/V > 125 wird als signifikante Verlängerung der Überlebensdauer dee
Versuchstieres angesehen.

GO U) OD

Gereinigtes Musettamycin und Marcellomycin (hergestellt nach den in den Beispielen 10 und 11 beschriebenen Methoden) werden gegenüber Mausleukämie L-1210 getestet. Tabelle VI zeigt die Ergebnisse. Aus den Werten geht hervor, daß Marcellomycin bezüglich der Hemmwirkungen gegenüber diesem Tumor etwa viermal so stark als Musettamycin ist.

Die erfindungsgemäßen antibiotischen Verbindungen, wie der Bohemsäurekomplex, seine Komponenten Musettamycin und Marcellomycin sowie deren Salze und Gemische, besitzen sowohl antimikrobielle als auch Antitumor-Aktivität. Die Erfindung betrifft auch Arzneimittel, welche mindestens eine der genannten antibiotischen Substanzen zusammen mit einem verträglichen, pharmazeutisch geeigneten Träger enthalten. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können auch andere antibakterielle und/oder Antitumor-Wirkstoffe enthalten. Man kann die Arzneimittel in jeder beliebigen pharmazeutischen Form zubereiten, die sich für den beabsichtigten Verabreichungsweg eignet. Beispiele für solche Mittel sind Pestpräparate für orale Zwecke» wie Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulver oder Granulate, Flüssigpräparate für orale Zwecke, wie Lösungen, Suspensionen, Sirups oder Elixiere, sowie Präparate zur parenteralen Verabreichung, wie sterile Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen.

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Verbindung

TABELLE VI
Wirkung von Bohemsäureprodukten gegenüber L-1210-Leukämie

Dosis» Tag der InJek- MÜD, Wirkung mittlere überleben-

mg/kg/Tag Verab- tionen Tage auf MÜD, Gewichts- de Tiere

reichung insge- % B/V änderung» am 5.Tag samt g

fvj Cv)

Musettamycin

12,8	1	1	10,5	150
6,H	1	1	10,0	1H3
3,2	1	1	9,0	129
1,6	1	1	9,0	129
0,8	1	1	8,5	121
ο,ι»	1	1	8,0	111»
6,1»	l-*5	5	6,0	86
3,2	1-^5	5	11,0	157
1.6	1—>5	5	10,0	1H3
0,8	1—»5	5	9,5	136
ο,ι»	1—*5	5	9,0	129
0,2	1—>5	5	9,0	129

-0,6 +0,5 +0,3 +0,3 +1,2 +1,3

-1,5 -1,3 +0,3 +0,1» +0,6 +1,8

6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6

5/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6

TABELLE VI (Portsetzung)

	Verbindung	Wirkung von Bohemsäureprodukten "gegenüber L-1210-Leukämie	Tag der	Injek	MUD,	Wirkung	mittlere	überleben
		Dosis,	Verab	tionen	Tage	auf MÜH,	Gewichts	de Tiere
		mgAg/Tag	reichung	insge		<f> B/V	änderung,	am 5«Tag
				samt			g
	Marcellomycin		1	1	10,0	143	-0,7	3/6
		12,8	1	1	11,0	157	-0,7	6/6
«α		6,U	1	1	11,0	157	-0,7	6/6
ο		3,2	1	1	10,0	143	+0,1	6/6
CJD		1,6	1	1	10,5	150	0	6/6
•F-		0,8	1	1	9,0	129	-0,8	6/6
	Marcellomycin	0,1»	1—>5	1»	toxisch	toxisch	toxisch	0/6
O		6,1»	1—*5	5	6,0	86	-1,2	3/6
-_1 .J		3,2	1—»5	1»	6,0	86	-0,1	5/6
ΟΧ*		1,6	1—»5	5	10,0	143	"0,2	6/6
		0,8	1—»5	5	9,0	129	0	6/6
		0,1»	1—>5	5	9,0	129	-i,i	*6/6 }**
	Vergleich	0,2	1—»5	5	7,0		+3,0	10/10 5i
		Kochsalz						CO
	lösung

Inokulum: 10^ ascitische Zellen, i.p. in weibliche Mäuse BDP₁ σ>

Behandlung: i.p. in 0,5 ml Volumen

Bewertung: MÜD = mittlere Überlebensdauer in Tagen:

% B/V = mittlere Überlebensdauer der behandelten Tiere/mittlere Überlebensdauer der Vergleichstiere χ 100

Kriterium: B/V > 125 ist als signifikante Tumorhemmung (Verlängerung der Überlebensdauer des Versuchstieres) anzusehen

Für antibakterielle Zwecke werden die Präparate derart verabreicht, daß die Konzentration des Wirkstoffs höher als die Mindesthemmkonzentration für den jeweils behandelten Organismus ist. Zur Verwendung als Antitumormittel bei Warmblütern werden eine Dosis von 2,5 bis 10 mg/M für eine einzelne intravenöse Injektion von Marcellomycin sowie eine Dosis von 10 bis 40 mg/M für eine einzelne intravenöse Injektion von Musettamycin vorgeschlagen.

Die nachstehenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie jedoch zu beschränken, μ STTRAGEL, Phenyl/ CORASIL und Phenyl/PORASIL B sind Warenbezeichnungen der Fa. Waters Associates, Inc. für handelsübliche Gelpermeationschromatographie-Füllmaterialien, die durch chemische Bindung von Organosilanen an Siliciumdioxid erzeugt werden. Sephadex LH-20 ist die Warenbezeichnung (Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) für ein handelsübliches, modifiziertes vernetztes Dextran, das in der Adsorptions- und Gelfiltrationschromatographie eingesetzt wird.

Beispiel

Fermentation im Schüttelkolben

Der Mikroorganismus Actinosporangium ep. Stamm C-36,145 (A.T.C.C. 31127) wird an einem Schrägagarmedium gezüchtet» das aus 2 g D-Glukose, 20 g Hafermehl, 2 g Sojapepton und 2 g Agar (aufgefüllt auf 1 Ltr. mit destilliertem Wasser) besteht. Nach mindestens 6 Tage langem Wachstum bei 27⁰C werden die gebildeten Sporen in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben übertragen, der 100 ml eines sterilen Mediums aus 30 g D-Glukose, 10 g Sojamehl, 10 g Pharmamedia (Traders Oil Mill Co., Fort Worth, Texas, V.Bt.A.) und 3 g CaCO, (aufgefüllt auf 1 Ltr. mit destilliertem Wasser) enthält. Diese vegetative Kultur wird

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bei 27⁰C an einem Kreisel-Reihenschüttelapparat (Modell G53, New Brunswick Scientific Co., Inc.), der auf 210 Upm eingestellt ist und einen Kreis mit 5,1 cm Durchmesser beschreibt, inkubiert. Nach 48 Std. überträgt man 4 ml der Kultur in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben, der 100 ml eines sterilen Produktionsmediums aus 50 g Glycerin, 20 g Sojamehl, 10 g Erdnußmehl und 10 g CaCO, (aufgefüllt auf 1 Ltr. mit destilliertem Wasser) enthält. Die Kultur wird 144 Std. bei 27⁰C an einem auf 230 Upm eingestellten Schüttelapparat inkubiert. Anschließend wird im KuIturfiltrat und Myzel antibiotische Aktivität festgestellt, die auf den Bohemsäurekomplex zurückzuführen ist.

Beispiel

Fermentation im Rührgefäß

Der Bohemsäurekomplex wird in Rührgefäß-Fermentern unter Verwendung einer 48 Std. alten vegetativen Kultur (wie in Beispiel 1 beschrieben) hergestellt. Man überträgt 400 ml der Kultur in 10 Ltr. des in Beispiel 1 beschriebenen sterilen Produktionsmediums, das 0,01 % eines Silikon-Schauminhibitors (Hodag F1 ; Hodag Chemical Corp., Skokie, 111., V.St.A.) enthält und sich in einem 14 Ltr.-Rührgefäß befindet. Das Rührgefäß ist in eine Fermenter-Antriebseinrichtung (Modell FS-614, New Brunswick Scientific Co., Inc., New Brunswick, N.J., V.St.A.) eingefügt. Die Temperatur wird bei 27⁰C gehalten. Die Geschwindigkeit des LuftStroms beträgt 6 Ltr./ Min. und der Rührer wird auf 300 Upm eingestellt. Der Schauminhibitor (Hodag F1) wird nach Bedarf zur Schäumregelung automatisch zugeführt. Nach etwa 210 Std. ist die Inkubierung beendet. Im KuIturfiltrat und Myzel wird der Bohemsäurekomplex festgestellt.

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Beispiel 3 Fermentation im Gärbottich

3718 Ltr. eines in einem Gärbottich vorgelegten» sterilen Produktionsmeditims (vgl. Beispiel 1) werden mit 1,89 Ltr. einer vegetativen Kultur (hergestellt gemäß Beispiel 1) beimpft, mit einem Impellerrührer bei 300 Upm gerührt und mit einem Durchsatz von 85 Ltr./Min. belüftet. Die Inkubierung erfolgt während 190 Std. bei 27⁰C Anschließend wird im Kulturfiltrat und Myzel der Bohemsäurekomplex festgestellt.

Beispiel 4 Fermentation im Gärbottich

3028 Ltr. eines in einem Gärbottich vorgelegten Produktionsmediums (vgl. Beispiel 1) werden mit 152 Ltr. einer vegetativen Kultur (hergestellt gemäß Beispiel 1) beimpft, mit einem Impellerrührer 155 Upm gerührt, mit einem Durchsatz von 141,6 Ltr./Min. belüftet und 190 Std. bei 27⁰C inkubiert. Anschließend ist das Vorhandensein des Bohemsäurekomplexes im Kulturfiltrat und Myzel feststellbar.

Beispiel

Isolierung des Bohemsäurekomplexes

Die gesamte Gärbrühe (7Ltr.) wird beimErnte-pH (harvest pH) 8,1 20 bis 30 Min. mit etwa dem gleichen Volumen Methylisobutylketon verrührt. Anschließend setzt man eine große Menge Kieselgur-Filterhilfe zu und mischt diese durch gründliches Rühren ein. Danach filtriert man das Gemisch unter Absaugen auf eine Filterhilfe. Das Filtrat trennt sich in zwei Phasen

- 26 -

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auf, von denen man die untere (wäßrige) Phase verwirft. Die organische Phase wird im Vakuum stark eingeengt (bis auf 50 bis 100 ml) und mit Skellysolve B (Skelly Oil Co.; Warenbezeichnung für eine Petrolätherfraktion vom Kp. 60 bis 68⁰C, welche im wesentlichen aus η-Hexan besteht) verdünnt. Dabei fällt ein dunkelroter Peststoff aus, der im Vakuum getrocknet wird und 1,9 g Bohemsäurekomplex liefert.

Beispiel

Isolierung des Bohemsäurekomplexes im großtechnischen Maßstab

Die gesamte Gärbrühe (3 000 Ltr.) wird bei einem pH-Wert von 8,0 bis 8,5 auf 25⁰C abgekühlt und 30 Min. bei 20 bis 30⁰C kräftig mit 3 000 Ltr. Methylisobutylketon verrührt. Dann versetzt man die Emulsion mit 360 kg Filterhilfe und rührt das Gemisch eine weitere Stunde gründlich. Nach etwa 30 Min. langem Absitzenlassen dekantiert man 2 300 bis 2 500 Ltr. organische Phase und kühlt sie auf 0 bis 10⁰C ab. Das Gemisch wird 20 Min. mit weiteren 800 Ltr. Methylisobutylketon verrührt. Nach 30 Min. langem Absitzenlassen dekantiert man die organische Phase neuerlich und versetzt sie mit der gekühlten ersten Fraktion, so daß man ein Gesamtextraktvolumen von 3 300 bis 3 400 Ltr. erhält. Nach Klarfiltration erhält man schließlich 3 100 bis 3 200 Ltr. von Feststoffen und unlöslicher wäßriger Phase freien Methylisobutylketonextrakt. Der organische Extrakt wird im Vakuum bei 0 bis 10⁰C auf ein Endvolumen von 6 Ltr. eingeengt. Man fügt 60 Ltr. Sekllysolve B bei 20 bis 25⁰C unter Rühren zu, filtriert die ausgefallenen Feststoffe an einer Nutsche ab und wäscht mit 10 Ltr. Skellysolve B. Durch Trockensaugen erhält man 900 bis 1 000 g eines etwas öligen, dunkelroten, amorphen Produkts. Man verrührt dieses mit viel Äther, filtriert durch einen Büchner-Trichter und spült mit weiterem

- 27 -

7098U/0846

Äther. Nach Trockensaugen und Vakuumtrocknung erhält man 351 g amorphen» dunkelroten Bohemsäurekomplex.

Beispiel

Fraktionierung des Bohemsäurekomplexes

68 Std. mit Chloroform getränkte Sephadex LH-2O wird als Aufschlämmung in eine Pharmacia SR 25/100-Säule (25 mm Innendurchmesser, 100 cm Höhe), die an den Enden jeweils mit einstellbaren Teflonplättchen ausgestattet ist, gegeben. Die Säule wird so gepackt t daß sie von Plättchen (tip) zu Plättchen vollständig gefüllt ist und eine effektive Betthöhe von 90 bis 95 cm aufweist. Man löst 500 mg Bohemsäurekomplex in 10 ml Chloroform und gibt die Lösung auf die Säule auf. Anschliessend entwickelt man im Abwärtsstrom mit Chloroform bei einer Abflußgeschwindigkeit von 1 ml/Min. Das Eluat wird in 6 ml-Anteilen in einem Fraktionssammler aufgefangen. Die in den Röhrchen mit geraden Nummern aufgefangenen Proben werden mit Chloroform auf das 80fache verdünnt und in einem Bausch and Lomb Spektronik 20-Colorimeter bei 490 πΐμ untersucht. Es werden vier ausgeprägte Banden von Anthracyclinpigmenten wie folgt festgestellt:

Röhrchen-Nr. Gewi chtsmenge

nach dem Verdampfen» mg

1 bis 4

5 bis 11 erste Bande 66

12 bis 14

15 bis 21 zweite Bande 36

22 bis 35

36 bis 44 dritte Bande 18

46 bis 57 vierte Bande 48

58 ff.

M/18 108 32

Die erhaltenen Feststoffe werden an Brinkmann 60F254-Kieselgel-Dünnschichtplatten tinter Verwendung von Toluol/Methanol (80:20) als Lösungsmittelsystem chromatographiert. Die erste eluierte Bande erweist sich bei der Dünnschichtchromatographie als komplexes» inaktives Gemisch. Die zweite Bande ergibt eine chrakteristische rosarote Zone bei einem R_f-Wert von etwa O»75. Diese Fraktion ist ebenfalls inaktiv; es wird festgestellt, daß sie hauptsächlich η-Pyrromycinon enthält. Die dritte eluierte Fraktion ergibt eine einzelne Zone mit einem R_f-Wert von-^0,3. Es wird festgestellt, daß es sich um Musettamycin handelt, da es sich beim Test gegenüber den Mausleukäniesystemen 1-1210 und P-388 als hochwirksam erweist. Die letzte eluierte Bande ergibt eine Zone bei einem R_f-Wert von etwa 0,3 und besteht hauptsächlich aus Marcellomycin. Auch diese Komponente zeigt beim Test gegenüber den beiden Mausleukämien eine hohe Wirksamkeit. Obgleich sowohl Musettamycin als auch Marcellomycin bei der Dünnschichtchromatographie R_f-Werte von etwa 0,3 aufweisen, wandert Musettamycin etwas rascher. Wenn Musettamycin und Marcellomycin im Gemisch vorliegen, erfolgt eine Auftrennung in zwei sehr nahe beieinanderliegende Farbzonen.

Beispiel 8 Fraktionierung im großtechnischen Maßstab

Eine Glassäule mit einem Durchmesser von 15,24 cm (6 in.) und einer Höhe von 195,6 cm (77 in.) wird an der Basis mit einem nicht-verstopf baren Filter ausgestattet, auf welchen eine Glaswolleschicht und anschließend eine kreisförmige Polyäthylenfritte aufgelegt werden. Die Fritte wird auf einen Durchmesser von 14,92 cm (5 7/8 in.) zugeschnitten, um eine Quellung in Chloroform zu ermöglichen. Man rührt 8,73 kgSephadex LH-20 in 3Std.Chloroform, filtriert, schlämmt den festen Rückstand neuerlich in Chloroform auf und läßt die Aufschläm-

- 29 709844/0846

mung 16 Std. stehen. Dann wird das Gemisch 15 Min. gerührt und danach auf die Säule aufgegeben. Eine 30 g-Probe des gemäß Beispiel 6 hergestellten Bohemsäurekomplexes wird

15 Kin. mit 1,5 Ltr. Chloroform erhitzt und anschließend

16 Std. gerührt. Durch Filtration werden 7»5 g ungelöstes Material mit einer gewissen Aktivität abgetrennt (bei späteren Versuchen wird festgestellt, daß sich die Probe in 30 bis 40#igem Äthanol vollständig löst; die Ergebnisse der Chromatographie sind gleich wie bei diesem Versuch). Man gibt das Filtrat auf die Säule auf und beginnt mit der Entwicklung mit Chloroform in Abwärtsstrom. Während des gesamten Versuchs wird am Ablaß eine Pließgeschwindigkeit von 16 ml/Min, aufrechterhalten. Anfänglich fällt ein Eluatvolumen von 1,445 nil an, bevor die Farbe den Boden des Gelbettes erreicht. Wenn dies der Fall ist» wird das Auffangen von 100 ml-Fraktionen begonnen und so lange fortgesetzt, bis die Flüssigkeit wieder relativ hell wird (nach insgesamt 906 Fraktionen) . Aliquote Anteile jeder fünften Fraktion werden verdünnt und analysiert, wie in Beispiel 7 beschrieben ist. Es zeigt sich, daß die folgende Auftrennung von vier Komponenten stattgefunden hat:

- 30 -

709844/0846

M/18 108

Fraktion

Beschreibung

1 bis 20 erste Komponente» Gemisch*» inaktiv

21 bis 44 zweite Komponente» Gemisch» inaktiv»*

45 bis 53 verworfen

54 bis 70 dritte Komponente» einzelne Verbindung (Musettamycin), aktiv

71 bis 75 verworfen

76 bis 110 vierte Komponente, hauptsächlich Marcellomycin enthaltendes Gemisch» aktiv

111* bis 200 Nachlauf

Gewichtsmenge nach dem Eindampfen

6,74 g

4,18 g 385 mg 1»45 g

198 mg 4,03 g

1,72 g

♦ bestimmt durch Dünnschichtchromatographie ** hauptsächlich r^-Pyrrimicinon

Beispiel 9

Teilweise Reinigung von Musettamycin

Der aus der dritten Komponente von Beispiel 8 erhaltene Peststoff (421,4 mg) wird in überschüssigem siedendem Chloroform gelöst. Die Lösung wird heiß durch geriffeltes Filterpapier filtriert. Man engt das Filtrat am Dampfbad bis auf weniger als 20 ml ein, versetzt die wärme Lösung tropfenweise mit Skellysolve B bis zum Trübungspunkt und fügt anschließend einige Tropfen Chloroform hinzu. Dann läßt man das Gemisch auf Raumtemperatur abkühlen und stellt es über Nacht in einen bei -20⁰C gehaltenen Gefrierschrank. Danach werden die erhaltenen tiefroten Kristallplättchen isoliert

- 31 709844/0846

xxnd im Vakuum getrocknet. Man erhält 358 mg Musettamycin vom Fp. 162 bis 163⁰C

Beispiel 10 Reinigung von Musettamycin

Rohes, mit Äthylendiamintetraessigsäure (ÄDTA) gewaschenes Musettamycin wird durch eine Reihe von vier Säulen mit μ STYRAGEL (Waters Associates, Inc.; Warenbezeichnung für ein Gelfiltrationsmittel» das sich als Säulenfüllmaterial für die Gelpermeationschromatographie eignet, bestehend aus kleinen Perlen mit einem Durchmesser von 8 bis 10 μπι aus steifen, vernetzten Polymeren von Styrol-Divinylbenzol) (500-100-100-100 X) geleitet. Als mobile Phase verwendet man Chloroform mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,7 ml/Min, für eine anfängliche Reinigung. Es werden neun Chargen von jeweils 100 mg gefahren. Die Elution wird mit Hilfe eines Brechungsindex-Meßgerätes (Waters Associates) überwacht. Bei jeder Charge wird die den Hauptpeak aufweisende Fraktion, die nach 37,5 bis 45 Min. eluiert wird, aufgefangen. Man vereinigt die Hauptfraktionen der neun Durchgänge und dampft im Vakuum zur Trockene ein. Der erhaltene dunkelrote, amorphe Feststoff (660 mg) wird in 22 ml eines 45 : 55-Lösungsmittelgemisches aus Acetonitril und 0,01 m Natriumacetat (pH 4,0) gelöst. Man zentrifugiert eine geringe Menge von suspendiertem Material vom Gemisch ab und überträgt den klaren Überstand in eine verschließbare Penicillinampulle. Ein Teil (1,25 ml, etwa 37 mg) der dunkelroten Lösung wird in eine U6K-Spritze (Waters Associates, Inc.) gegeben. Anschließend wird die Probe auf die Säule aufgegeben. Man chromatographiert die Probe an einer Säule aus rostfreiem Stahl (Höhe 1 m, Innendurchmesser 4,6 mm), die mit Phenyl/ PORASIL B (Waters Associates, Inc.; Warenbezeichnung für ein

- 32 J098U/0846

gebundenes Phaseninaterial für die Verteilungschromatographie bestehend aus einem vollständig porösen SiOp mit daran chemisch gebundenem, flüssigem Diphenyldichlorsilan) (Korngrösse 37 bis 75 um) gefüllt ist. Die mobile Phase besteht aus einem 35:65-Gemisch von Acetonitril/0,01 m Natriumacetat (pH 4.0); die Fließgeschwindigkeit beträgt 1,9 bis 2,0 ml/ Minute. Die Elution wird mit Hilfe eines Brechungsindex-Meßgerätes überwacht. In Abständen von jeweils 75 Sekunden werden Fraktionen mit Hilfe eines automatischen Fraktionssammlers (Scientific Manufacturing Industries) aufgefangen. Es werden 120 Röhrchen gesammelt. Die Säule wird bei einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/Min. 15 Minuten mit Methanol, 15 Minuten mit Wasser und 15 Minuten mit einem 35:65-Gemisch von Acetonitril und 0,01 m Natriumacetat (pH 4) gewaschen. Anschließend verringert man die Fließgeschwindigkeit auf 2,0 ml/Min, und läßt das System vor der anschliessenden Einspritzung während 5 Min. ins Gleichgewicht kommen. Man chromatographiert jeweils 25 μΐ des Eluats in jedem fünften Höhrchen mit Hilfe eines analytischen Systems, um die Zusammensetzung vor der Vereinigung des Inhalts der Röhrchen zu prüfen. Das analytische System besteht aus einer Säule aus rostfreiem Stahl (61 cm Höhe, 2,1 mm Innendurchmesser), die mit Phenyl/CORASIL (Waters Associates, Inc.; Warenbezeichnung für ein gebundenes Phasenmaterial für die Verteilungschromatographie, bestehend aus einer festen Glasperle, die mit einer einzigen Schicht von SiO₂ mit daran gebundenem Diphenyldichlorsilan überzogen wurde) (Korngröße 37 bis 50 μη)gefüllt ist. Als mobile Phase dient ein 45:55-Gemisch von Acetonitril und 0,01 m Natriumacetat (pH 4.0); die Fließgeschwindigkeit beträgt 0,7 ml/Minute. Das Eluat wird mit Hilfe eines UV-Meßgeräts (LDC) bei 254 nm überwacht. Die Röhrcheninhalte werden auf der Grundlage der analytischen Chromatogramme vereinigt. Es wird festgestellt, daß die Röhrchen 61 bis 120 das gewünschte Musettamycin enthalten. Man vereinigt deren Inhalt und dampft im Vakuum

- 33 7098U/0846

(45⁰C) ein. Die dunkelroten Rückstände werden mehrmals mit Methanol und zweimal mit jeweils 100 ml Methylendichlorid gespült. Man reibt den Rückstand mit 100 ml Chloroform an und filtriert die anorganischen Salze ab. Anschließend dampft man unter wasserfreiem Stickstoff zur Trockene ein und trocknet im Hochvakuum über Ρ?0ε·

Das in der vorstehend beschriebenen Weise gereinigte Musettamycin weist folgende Merkmale auf:

C	41	6	H	1	N	*
60,	27	6	,34	1	,95	*
60,		,59	,99

Beschaffenheit: dunkelrotes, kristallines Pulver

Summenformel: C,/-H._CO' „N 5o 45 14

Molekulargewicht: 715,76 Analyse:

berechnet: gefunden:

korrigiert für 0,83 H₂O und 0,83 Rückstand:

CHN 60,27 6,50 1,99

IR-Spektrum: Das IR-Absorptionsspektrum von Musettamycin (KBr-Pellet) zeigt Hauptbanden bei folgenden Wellenlängen: 3480, 2970, 2930, 2820, 2770, 1735, 1600, 1450, 1320, 1295, 1220, 1160, 1010 und 990 cm"¹;

UV-Spektrum: Bei einer Konzentration von 0,013 g/Itr. in Methanol zeigt Musettamycin folgende Maxima und Extinktionen (absorptivities): 233 πΐμ, 57,7; 256 πιμ, 33,2; 284 πιμ, 14»5; 466 πΐμ, 14,3; 490 πιμ, 17,4; 510 ιημ, 14,6; 524 ιημ, 12,9 und 570 ΐημ, 3,3.

- 34 7098U/0846

Kemresonanzspektrum (NMR-Spektrum):

(a) 100 mHz-PMR-Spektrum: Bei einer Konzentration von 25 mg/O,5 nil in CDCl, zeigt das Spektrum folgende chemische Verschiebungen in ppm undTermsymbolen: 7.66, s; 7,32, s; 7,21, s (CDCl₃); 5.50 m; 5,24,m; 5,00, m; 4.48, Quartett; 4.10, s; 3.68, s; 4,2 bis 3,4, überlappende m; 2,16, s; 2,5 bis 1,3, überlappende m und 1,3 bis 0,9 überlappende Dublette und Tripletts [s = Singulett; m = MultiplettJ.

(b) 25 mHz CMR-Spektrum: Bei einer Konzentration von 200 mg/ml in CDCl, zeigt das Spektrum folgende chemische Verschiebungen und Intensitäten:

Nr. Relative Intensität

1 3*»

2 34

3 60

4 57

5 39

6 45

7 57

8 44

9 52

10 32

11 36

12 32

13 42

14 42

15 37

16 30

17 42

72 78

7 0 9 8 k-U £B 8-4 6

Frequenz, Hz	ppm
4777,66	189,816
4654,38	184,918
4303,11	170,962
4076,06	161,941
3980,33	158,138
3961,43	157,387
3578,36	142,168
3327,79	132,213
3299,86	131,103
3269,30	129,889
3258,97	129,478
3021,49	120,043
2875,63	114,249
2816,92	111,916
2812,68	111,747
2548,48	101,251
2489,88	98,923
1967,51	78,169
1935,57	76,900

FORTSETZUNG:

Nr. Relative Intensität

72

18 27

19 87

20 36

21 34

22 33

23 31

24 30

25 29

26 33

27 64

28 69

29 18

30 23

31 29

32 17

33 42

34 56

35 60

Frequenz, Hz	ppm
1903,47	75,624
1852,56	73,602
1797,79	71,426
1791,56	71,178
1775,10	70,525
1716,43	68,193
1670,07	66,351
1649,89	65,550
1548,63	61,527
1431,42	56,870
1318,54	52,386
1074,95	42,708
847,88	33,686
819,21	32,547
805,76	32,013
722,16	28,691
449,34	17,852
418,12	16,612
165,37	6,570

Hochdruck-Flüssigkeitschromatogramm: Die Betentionszeit für Musettamycin beträgt 11 Min.20 Sek. bei Verwendung von Modularkomponenten (Waters Associates, Inc.) und Anwendung folgender Bedingungen: 61 cm χ 2,1 mm, Phenyl/CORASIL-Trägersäule; 45:55-Gemisch aus Acetonitril und 0,01 m Natriumacetat (pH 4)» 0,7 ml/Min. Fließgeschwindigkeit; 254 ιημ UV-Meßgerät .

Schmelzpunkt: 210 bis 212⁰C.

Löslichkeit: In den meisten organischen Lösungsmitteln löslich; kristallisiert aus Methanol in höheren Konzentrationen

JO 9 8X£?vT8 4 β

bei 2O⁰C aus; in Wasser» aliphatischen Kohlenwasserstoffen und Äther unlöslich.

Beispiel 11 Reinigung von Marcellomycin

Rohes» mit Äthylendiamintetraessigsäure gewaschenes Marcellomycin wird einer anfänglichen Reinigung mit Hilfe einer Reihe von vier Säulen mit μ STYRAGEI (Waters Associates» Inc.; Handelsbezeichnung für ein in der Gelpermeations-Chromatographie als Säulenfüllmaterial eingesetztes Gelfiltrationsmittel» bestehend aus kleinen Perlen mit einem Durchmesser von 8 bis 10 μπι aus steifen» vernetzten Polymeren von Styrol-Divinylbenzol) (500-100-100-100 %). Als mobile Phase dient Chloroform. Die Fließgeschwindigkeit für diesen Trennprozeß beträgt 0,6 bis 0»7 ml/Min. Die Elution wird mit Hilfe eines Brechungsindex-Meßgeräts (Waters Associates» Inc.) überwacht. Es werden zehn Chargen von jeweils 100 mg gefahren; in jedem Falle wird die den Hauptpeak aufweisende Fraktion» die bei 36 bis 32 Min. eluiert wird» aufgefangen. Die bei den zehn Durchgängen aufgefangenen Hauptfraktionen werden vereinigt. Man dampft im Vakuum zur Trockene ein und unterteilt den erhaltenen dunkelroten» amorphen Feststoff in 25 Fraktionen von jeweils 30 bis 35 mg. Die Fraktionen werden jeweils in 1 ml eines 45:SS-Lösungsmittelgemisches von Acetonitril und 0,01 m Natriumacetat (pH 4,0) gelöst. Die Lösung wird auf ein Chromatographiesystem aufgegeben, das aus einer Säule aus rostfreiem Stahl (Höhe 1 m, Innendurchmesser 4»6 mm) besteht» die mit Phenyl/ PORASIL B (Waters Associates» Inc.; Warenbezeichnung für ein gebundenes Phasenmaterial für die Verteilungschromatographie, bestehend aus einem vollständig porösen SiO₂* an das eine flüssige Phase von Diphenyldichlorsilan chemisch gebunden

- 37 T0 98U/0846

M/18 108

ist (Korngröße von 37 "bis 75 pm) gefüllt ist. Als mobile Phase dient ein 45:55-Gemisch aus Acetonitril und 0»01 m Natriumacetat (pH 4,0); die Fließgeschwindigkeit beträgt 3,0 ml/Min. Die Elution wird mit Hilfe eines Differential-Brechungsindex-Meßgeräts (Waters Associates» Inc.) überwacht. In Abständen von jeweils 1 Min. werden mit Hilfe eines SMI-Fraktionssammlers (Scientific Manufacturing Industries) Fraktionen aufgefangen. Es werden 95 Röhrchen gesammelt. Danach wird die Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von 4»0 ml/Min, mit Acetonitril und hierauf 15 Min. mit der mobilen Phase gewaschen» bevor die anschließende Einspritzung erfolgt. Das in jedem fünften Röhrchen befindliche Eluat wird an einem analytischen System chromatographiert» bevor man die Röhrcheninhalte vereinigt. Das analytische System besteht aus einer Säule aus rostfreiem Stahl (Eöhe 61 cm» Innendurchmesser 2»1 mm) von Phenyl/ CORASIL (Vaters Associates» Inc.; Warenbezeichnung für ein gebundenes Phasenmaterial für die Verteilungschromatographie» bestehend aus einer festen Glasperle, die mit einer einzigen Schicht von SiOp mit chemisch gebundenem Diphenyldichlorsilan überzogen wurde) (Korngröße 37 bis 50 μΐη). Die mobile Phase besteht aus einem 45:55-I»ösungsmittelgemisch von Acetonitril und 0,01 m Natriumacetat (pH 4»0); die Fließgeschwindigkeit beträgt 0,68 bis 7,0 ml/Min. Das Eluat wird mit Hilfe eines UV-Meßgeräts bei 254 nm überwacht. 25 μΙ-Elutionsmittel werden in das System eingespritzt. Die Röhrcheninhalte werden auf Basis der analytischen Chromatogramme vereinigt. Im allgemeinen enthalten die Röhrchen 18 bis 35 ausschließlich das gewünschte Marceilomyein. Die Inhalte dieser Röhrchen werden vereinigt. Man dampft bei 45⁰C im Vakuum zur Trockene ein und spült den Rückstand mehrmals mit Methanol und zweimal mit jeweils 100 ml Methylendichlorid. Dann reibt man den Rückstand mit 75 ml Methylendichlorid an und filtriert. Das Piltrat wird im Vakuum (45⁰C) zur Trockene eingedampft. Der dunkelrote Rück-

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	C	6,	H	1	N	O	*
59	,64	6,	55	1	,65	32,15
56	,32	64	,74

stand wird dann im Hochvakuum über Ρ?^ς getrocknet.

Das in der vorstehend beschriebenen Weise gereinigte Marcellomycin weist folgende Merkmale auf:

Beschaffenheit: dunkelrotes, amorphes Pulver. Summenformel: C₄₂H₅₅NO₁ γ
Molekulargewicht: 845»90

Analyse:

ber.:

gef.:

korrigiert für H₂O und Bückstand:

CHN 58,77 6,77 1,82 <f>

IR-Spektrum: Das IR-Abeorptionsspektrum von Marcellomycin (KBr-Pellet) zeigt Hauptbanden bei folgenden Wellenlängen: 3450, 2960, 2940, 2820, 2790, 1730, 1615» 1600, 1450, 1260, 1095, 1010 und 800 cm"¹.

UV-Spektrum: Bei einer Konzentration von 0»013 g/Ltr. in Methanol zeigt Marcellomycin die folgenden Maxima und Extinktionen: 233 πιμ, 47,5; 256 ιημ Schulter, 24,7; 284 ιημ Schulter, 10,6; 490 πιμ, 15»8; 410 ΐημ Schulter, 3.4; 465 ΐημ Schulter, 13,2; 480 ιημ Schulter, 14,7; 510 χημ Schulter, 12,5; 524 πιμ Schulter, 10,6 und 580 ιημ Schulter, 1,1.

Kernresonanzspektrum:

(a) 100 mHz-PMR-Spektrum: Bei einer Konzentration von mg/5 ml in CD₂Cl₂ zeigt das Spektrum folgende chemische Verschiebungen in ppm und Tennsymbolen:- 7,63, s; 7,24, s; 5.52, m; 530, m; 5,33» m (CD₂Cl₂); 4,94, m;

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la

4f5O» Quartett; 4»30 bis 3»9O, überlappende m; 3t69t β; 2,70 bis 0,09» überlappende m; und 2,19» s [β = Singulett, m = MultiplettJ.

(b) 25 mHz-CMR-Spektrum: Bei einer Konzentration von 60 mg/ 2 ml in CD₂Cl₂ zeigt das Spektrum folgende chemische Verschiebungen und Intensitäten:

Nr.	Relative Intensität	Frequenz, Hz	ppm
1	38	3454,09	137,574
2	31	3331,45	132,727
3	56	2964,01	118,088
4	37	2739,81	109,156
5	49	2642,13	105,264
6	37	2627,41	104,678
1	52	2246,11	89,487
8	30	1995,14	79,488
9	46	1969,58	78,469
10	38	1926,64	76,759
11	35	1918,43	76,432
12	37	1682,08	67,015
13	26	1543,35	61,488
14	32	1489,08	59,326
15	29	1484,44	59,141
16	45	1213,98	48,366
17	51	1195,68	47,636
18	55	1155,94	46,053
19	50	768,18	30,605
20	54	516,93	20,595
21	91	455,17	18,134
22	64	444,15	17,695
23	43	433,12	17,256

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PORTSETZUNG:

Nr. Relative Intensität Frequenz, Hz ppm

24 49

25 54

26 50

27 57

28 63

29 49

30 53

136

175

165

31 103

32 40

33 38

34 50

35 47

36 32

37 49

38 67

39 80

40 79

378,19	15,067
348,77	13,895
339,07	13,509
305,61	12,176
303,14	12,077
206,56	8,229
96,91	3,861
54,60	2,175
27,27	1,087
0,01	0,000
- 27,03	- 1,077
- 54,44	- 2,169
-264,55	-10,540
-478,75	-19,074
-491,67	-19,589
-514,78	-20,509
-533,08	-21,238
-610,57	-24,326
-899,27	-35,828
-918,94	-36,611
-926,83	-36,926
-1202,93	-47,926

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Hochdruck-Flüssigkeitschromatogramm: Die Retentionszeit für Marcellomycin beträgt 10 Min. 24 Sek. bei Verwendung von Modularkomponenten (Waters Associatest Inc.) und Anwendung folgender Bedingungen: 61 cm χ 2,1 mm, Phenyl/CORASIL-Trägersäule; 45:55-Gemisch aus Acetonitril und 0,01 m Natriumacetat (pH 4)» 0,68 bis 7 ml/Min. Fließgeschwindigkeit; 254 πιμ UV-Meßgerät.

Schmelzpunkt: Erweicht bei 134 bis 135⁰C; wird allmählich viskoser, schmilzt jedoch bis 300⁰C nicht.

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Claims

M/18 108 PATENTANSPRÜCHE

1. Antibiotische Verbindungen der Formel

COOCH„ o OH

in der H ein Wasserstoffatom (Musettamycin) oder die Gruppe der nachstehenden Formel (Harcellomycin) ist:

OH

ORIGINAL· INSPECTED

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2. Verfahren zur Herstellung von Musettamycin und Marcellomycin gemäß Definition von Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Bohemsäure" bildenden Stamm von Actinosporangium sp. mit den Charakteristika von A.T.C.C. 31127 oder einen Mutanten davon in einem assimilierbare Stickstoff- und Kohlenstoffquellen enthaltenden wäßrigen Nährmedium unter submersen_f aeroben Bedingungen bis zur Bildung einer wesentlichen Menge des Bohemsäurekomplexes durch den Mikroorganismus im Kulturmedium züchtet, den Komplex aus dem Kulturmedium gewinnt und die einzelnen Antibiotika Musettamycin und Marcellomycin vom isolierten Komplex abtrennt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bohemsäure bildenden Stamm A.T.C.C. 31127 oder einen Mutanten davon verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3» dadurch gekennzeichnet, daß man den Bohemsäurekomplex durch Extraktion der gesamten Gärbrühe mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel isoliert.

5. Verfahren nach Anspruch 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Antibiotika Musettamycin und Marcellomycin durch Gelfiltrationschromatographie vom Komplex abtrennt.

6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß man in einer zusätzlichen Stufe das Marcellomycin und Musettamycin durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie reinigt, wobei man als Adsorptionsmittel ein durch chemische Bindung von Organosilanen an Siliziumdioxid erhaltenes gelpermeationschromatographisches füll- bzw. Packungsmaterial verwendet.

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7. Arzneimittel» bestehend aus mindestens einer Verbindung nach Anspruch 1 und einem pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder üblichen Hilfsmittel.

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