DK144978B - Fremgangsmaade til fremstilling af et antibiotisk anthracyclinkompleks kaldet bohemesyrekompleks eller dets bestanddele mysettamycin og marcellomycin - Google Patents

Description

(19) DANMARK

|j| (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT <n> H1+978B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 1 650/77 (51) Int.CI.3 C 12 P 19/56 (22) Indleveringsdag 15· apr. 1977 C 07 H 15/24 (24) Løbedag 13· apr. 1977 (41) Aim. tilgængelig 1 6. okt. 1977 (44) Fremlagt 1 9 · jul. 1 982 (86) International ansøgning nr.

(86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. ~

(30) Prioritet 15· apr. 1976, 677480, US

(71) Ansøger BRISTOL-MYERS COMPANY, New York, US.

(72) Opfinder Donald E. Nett leton Jr., US: Richard H. _Sehreiber, US: James A. Bush, US: William T. Bradner, US.

(74) Fuldmægtig Th. Ostenfeld Patentbureau A/S.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af et antibiotisk anthracyclin® kompleks kaldet bohemesyrekomr= pleks eller dets bestanddele musettamyein og marcellomycin.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt antibiotisk anthracyclinkompleks kaldet bohemesyrekompleks eller dets bestanddele musettamyein og marcellomycin med formlen . COOCH^ O OH

CH„CH_. j- ^ J-L -As.

2 / i I J

ί fi^ 0 OH

S

"I

···' 2 144978 hvori R er hydrogen (musettamycin) eller et radikal med den følgende formel: OH (marcellomycin)

Et antal anthracyclinglycosider er beskrevet i litteraturen.

Blandt disse er især daunomycin og adriamycin blevet iagttaget med stor interesse på cancerkemoterapi-området og allerede blevet anvendt klinisk mod cancer hos mennesker.

Fremstilling af adriamycin ved fermentering af S. peuceticus var, caesius er onhandlet i U.S.A. patentskrift nr. 3.590.028. Kemisk omdannelse af daunomycin til adriamycin er beskrevet i U.S.A. patentskrift nr. 3.803.124.

Daunomycin (fremstillet ved fermentering af S. peuceticus ifølge britisk patentskrift nr. 1.003.383) kan være det samme som Rhone-Poulenc's 13.057 R.P. (tidligere rubidomycin og nu daunoribicin; se britisk patentskrift nr. 985.598, 1.188.262 og 1.241.750 og U.S.A. patentskrift nr. 3.616.242) og er sandsynligvis identisk med Ciba's danubomycin, som omhandles af U.S.A. patentskrift nr.

3.092.550 og britisk patentskrift nr. 901.830. Se også U.S.A. patentskrift nr. 3.686.163 angående dihydrodaunomycin.

Cinerubin A og cinerubin B, glycosider af aglyconen £-pyrro-mycinon, omhandles af britisk patentskrift nr. 846.130 [se også U.S.A. patentskrift nr. 3.864.480 og Keller-Schierlein, et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, p. 68 (1970) og Chemical Abstracts, _54, 1466i (I960)].

Det er blevet anført, at anthracyclinglycosidet carminomycin, som er beskrevet i J. Antibiotics 22:254-259 (1974), i vesttysk patentskrift nr. 2.362.707 og i J. Amer. Chem. Soc. 97(20):5955-5956 (1975) er aktivt mod adskillige tumorsystemer i dyr og mennesker.

De.t er i Antimicrobial Agents and Chemotherapy jL; 385-391 (1972) beskrevet, at trypanomycin har stærk antiprotozoal aktivitet. Det har en aglycon, som ligner, men ikke er identisk med £-pyrromycinon.

3 1-44978

Det i Chem. Ber. 92:1904-1909 (1959) omtalte antibiotikum pyrro-mycin indeholder aglyconen £-pyrromycinon og den glycosidiske sukkerart rhodosamin.

Med henblik på yderligere belysende og sammenfattende omtale af anthracyclin-antibiotika se Index of Antibiotics from Actinomycetes, ' Hamao Umezawa, Editor-in-Chief, University Park Press, State College, Pennsylvania, U.S.A. (1967) som følger:

Antibiotikum Side nr.

Aklavin 111

Cinerubin A 220

Cinerubin B 221

Danubomycin 242

Daunomycin 243

Pyrromycin 542

Rhodomycin A,B 561

Rubidomycin 574 Lærebogen Antibiotics, Vol. 1, Mechanism of Action, udgivet af David Gottlieb og Paul D. Shaw, Springer-Verlag New York, Inc., N.Y., N.Y. (1967) indeholder på siderne 190-210 en redegørelse af A. DiMarco med titlen Daunomycin and Related Antibiotics.

Information Bulletin, No. 10, International Center of Information of Antibiotics, i samarbejde med WHO, december 1972, Belgien redegørelse for anthracycliner og derivater deraf.

Det har nu vist sig, at en hidtil ukendt mikroorganismeart danner et antibiotisk anthracyclin-kompleks, som heri betegnes som bohemesyre-kompleks, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved, at man dyrker en stamme af den art, som Actinosporanglum A.T.C.C. 31127 tilhører, i et vandigt næringsmedium indeholdende assimilerbare nitrogen- og carbonkilder under submerse, aerobiske betingelser og udvinder komplekset fra dyrkningsmediet og, om ønsket, adskiller de enkelte musettamycin-og marcellomycin-antibiotika fra det udvundne kompleks.

Adskillelsen af de enkelte musettamycin- og marcellomycin-ant'i-biotika fra det udvundne kompleks kan ske ved ekstraktion af det fulde fermenteringsnæringssubstrat med et organisk opløsningsmiddel, * 4 144973 som er ikke-blandbart med vand efterfulgt af adskillelse og isolering af de enkelte antibiotiske forbindelser, såsom ved kromatografiske fremgangsmåder. Bohemesyre-kpmplekset og dets bestanddele musettarrycin og marcellomycin udviser både antibakteriel og antitumor aktivitet.

Den anvendte mikroorganisme er et hidtil ukendt medlem af slægten Actlnosporangium betegnet Actino sporangium sp. stamme C-36.145. Denne organisme opnåedes fra en jordprøve, som blev taget i Ontario, Canada. En kultur af organismen er blevet deponeret i American Type Culture Collection, Washington, D.C. og er der blevet indføjet i den permanente samling af mikroorganismer som A.T.C.C.

31127.

Musettamycin og marcellomycin er begge anthracyclinglycosider af aglyconen £-pyrromycinon. Musettamycin indeholder to glycosidiske sukkerenheder, nemlig 2-deoxy-L-fucose og L-rhodosamin, mens marcellomycin indeholder to enheder af 2-deoxy-L-fucose og en L-rho-dosamin-enhed. Bestanddelenes strukturer bestemtes ved analyse af deres infrarøde spektre og deres kememagnetiske resonansspektre og er i overensstemmelse med de herunder anførte fysiske data.

I den ovenfor anførte formel skal de punkterede linier vise, at den tilknyttede gruppe befinder sig delvist under den rings plan, hvormed den er forbundet. Pilespidserne skal vise, at den tilknyttede gruppe befinder sig over ringens plan.

Bohemesyre-komplekset og de enkelte musettamycin- og marcello-mycin-bestanddele danner salte med både syrer og baser. Eksempler på sådanne farmaceutisk acceptable salte er salte med stærkere syrer, såsom salt-, hydrogenbromid-, svovl-, salpeter- eller phosphorsyre, og med metalliske kationer, f.eks. alkalimetal- eller jordalkalimetal-kationer, såsom natrium, kalium, calcium eller magnesium.

Fremgangsmåden til fremstilling af de hidtil ukendte anthracyclin-antibiotika ifølge den foreliggende opfindelse er yderligere beskrevet herunder.

Stamme C-36.145 har de følgende morfologiske kendetegn. Stammen danner et sporangium-lignende legeme (falsk sporangium) på sporofo-rens top, hvilket er en agglomeration af en tæt opspolet sporekæde. Sporekæden sammenfletter sig ofte med nabo-lufthyferne, og den udvikler sig til den sporangiumlignende struktur, som er dækket af et slimagtigt stof. Det sporangiumlignende legeme og luftmyceliet dannes på glucose-asparagin-agar, tyrosin-agar, gærekstrakt-malteks- 144978 5 trakt-agar og havremelsagar. Foruden dannelsen af et stort antal falske sporangier dannes der også sædvanlige sporekæder, men dog meget færre, hvilke danner åbne spiraler. Sporer i det sporangium-lignende legeme har glat overflade, ellipsoid form og er ikke-bevæge-lige- Sporer i den sædvanlige sporeskæde er ægformede og har en glat eller undertiden nupret overflade. Det primære mycelium er forgrenet, ikke-septeret og ikke-fragmenteret.

Tabel I angiver de dyrkningsmæssige egenskaber, som er opnået på forskellige medier. Stamme C-36.145 gror godt på de fleste af de testede agarmedier, men dannelsen af luftmycelium og sporulatio-nen er noget langsom. Luftmyceliets massefarve er lysegrønligt-grå. Bagsiden af væksten er rødligt-orange til rød i glucose-asparagin-agar, uorganiske salte-stivelsesagar, gærekstrakt-maltekstraktagar og havremelsagar. Den danner melaninagtigt pigment i tyrosinagar og pepton-gærekstrakt-jernagar.

Stamme C-36.145's fysiologiske kendetegn og carbonhydrat-udnyt-telse er vist i henholdsvis tabel II og III. Væksttemperaturen lå fra 20 til 37°C, og der sås ingen formering ved knopskydning ved 43°C.

Stamme C-36.145 indeholder LL-diaminopimelinsyre (LL-DAP) og glycin som karakteristiske aminosyre-bestanddele i cellevæggen. Diagnostisk carbonhydrat var ikke til stede.

Stamme C-36.145's morfologiske, dyrkningsmæssige og fysiologiske kendetegn ligner de tilsvarende kendetegn for slægten Strepto-myces med undtagelse af dannelsen af sporangium-lignende legeme. Cellevægssammensætningen ligner også cellevægssammensætningen for type I gruppen (Streptomyces-type) efter klassifikationen ifølge Lechevalier og Lechavalier i Int. J. Syst. Bacteriol. 2^0:435-443 (1970). Stamme C-36.145's sporangiumlignende legeme ser ud fil at være forskelligt fra detnormale sporangium, som dannes af de veldefinerede sporangium-dannende slægter, idet,for det første, sidstnævnte danner små sporangier på et tidligt vækststadium, hvilke modnes med tiden, og,for det andet,sædvanlige sporangier er sædvanligvis ikke dækket af et viskost materiale.

Krassilnikov og Tsi-Shen foreslog i 1961 en ny slægt kaldet Actinosporangium i familien Actinoplanaceae (senere overført til familien Streptosporangiaceae) for organismer, som producerede denne sporemasse , som meget lignede sporangium (Isv. Akad. Navk. USSR,

Ser. Biol., 113-116, 1961). Derefter viste det sig, at det sporangiumlignende legeme var en slimagtig sporedannende masse og var forskel 6 144978 lig fra det virkelige sporangium, og slægten Actinosporangium anbragtes i familien Streptomycetaceae på basis af dens morfologiske kendetegn og cellevægsammensætningen af type I gruppen.

Således anses på basis af alle de tilgængelige data stamme C-36.145 at være en hidtil ukendt art af slægten Actinosporangium.

Det skal imidlertid bemærkes, at kun to arter indenfor slægten Actinosporangium er blevet omtalt i litteraturen, og følgelig er slægten endnu ikke blevet fuldstændigt fastslået (se H. Prauser: The Actinomycetales. The Jena Intl. Syrn. on Taxonomy. Sept., pp. 329-335, 1968. Veb. Gustav Fischer Verlag, JENA, 1970).

7 144978

P

P 4J P tO

G O' Oi H

<D *H *H

g 1—1 1—< H

O' Ό Ό 0 •H -s & Ό ® a p p S' - c p p p tu <o H φ <U O' P p 1) HH £ P C P o

O ,-H Η P (0 H 0 C

•H φ Φ TO P £ P 3 P

rn φ Όι O O' P P O'

3 Jj 4J tr -P Vi <U P Λ -H

KH Φ Φ C φ Φ +i ±> X <U <U "-I P

IH+J p (O P M U) Μ P P tn > H

HG C P C >i !>1 >1 «· p >1 Tj O

PH hOHiH p H 2 H p P æ

P

O' P I

h 01 ,<ϋ "i0 ^ in i—i -η pi tn p 0> Ό H 0> (U Ή Øl Ή

H H ·(!} Φ tn O' O' iHPP

. g > ρ μ >, h p *n) P ό «β

10 p P O' >irl rH rH Ρ Φ Ό. P

m -[Η rH *(t) wfl O' *H P O’

| H " - Ρ Ρ Ρ > (U

Γ) φ 4J - O' O' O' * H tø »

O g O' P <0 P(U>iP

φ >·0 H (0 > - - , (dOrHlO

g g cn pjjMtn O) η ¢) η P P *, P jj -C g P ίΗ PI rff φ P O'· m 017: <U 0) Jj P Φ 7n <n m p S (oS cjj cS +* ’Oto 5 'S* t!

p o ft μ-S O-ri-S P'3 -^¾ C o i? Ή Q| G

in P W SPH H

P > o

P

GO +1 tji ©. φ tn g .O' O) p O' O' C P - p tn tn c g ό ρ ρ η

φ > tn (0 itf Ό- >|P [O

Ό p >1 P P P 'O I ©· G ιΰ rH O O P p Φ p P rH (L) tn Ό X ΦΡ ΡΌ pp-HrHS. Ό. p

Ό O' O'·®· O' > Ρ O P P O' (U

0) -Η -ri Η P ·Η T3 -ri tu p O'

O' ϋ] rH i—1 (tj rHfi>>P P C P

•H ϋΊ H TJHtn Τ3-Η0ΌΡ Λ > j! P

tn ttsp-a-HO ·& p P S. ni >1 προ

tg p O ft P ft KP fflp fe Q P o W

s tn O'

G

ti P p P P

4 03 RJ <0(0 P P P l-i 0) |rf > tn tu <u θ' <n <u D Λ! "O Ό Ό Ό Ό C Ό τίΌ

«000 OO-HO O O

>|2 o u 2 O ft U 22

H

0) i ml P 1 1 C ·* rfrf n) p c ·η i tu x H ft) -H O' tu IP Ri p 01 10 p PH p

prtfpH (0 (0 P P

η p π) top Pg to tn G ιϋ Ά cofdPPi O' ,¾ icotn O' (0 tn p to <u tu tn to tutcoipASP i p, tn (0 I Pi in fO P <0(0 tn «Ρ o i h tncui tn ρο>η o><o m tu o HtnG tn Pn) tu 1 O' dj cn p Gh-h O' tn 1 S C <0 r) o tu m (U μ c x p tu 01

OPUPOP 0<>0 ΗΡΦΛΙ P PC

Ut00(0>i(0 P-ΗΡ p (0 P (t) > OjP

(!) O' H O' H O' OP >1 « o> I P (0 <U tu tfliOOCUiO p tn H ZtOUP K ft ή 8 144978 -Ρ

Ad I

Φ I Ό- Μ -4-) Μ -Ρ I Η (U Φ -Ρ tn Η -Ρ Λ Η Ρ οι Ο (0 Ad Ο (d -Ρ Ad -ρ ε · (0 •Η 03 Q) ο\ο 03 . ο'Ρ Ρ ο\° Ρ Λ Ρ ιο tp— -'S' -Ρ 04 ,· J) 3 Β » 0)Η ο\° ' 03 Ρ -Ρ 03 οιο Γ"* «3· Ο Λ! '04 (di · σ> - Φ +) &> g 4J IH PI ΟΦΡ Ad Φ td id ο ^ 03 (Β Λ tjip js · -Ρ ο t n -Ρ Ρ <λ° Ο +> -Ρ« Η r- Ad ϋ ι Ad -Ρ ιη •prd -Ρ ^ Φ Ρ β Φ οι - Ρ β 03 * β CS Ρ t-l ο Ρ Ad <-ι Ο) | β ο\° HI +)&>+>+> Φ rr) φ φ Ο —ι Ο 030)03 Ρ tn Ο 01 8 *> ^ Ad t n φ Ad ft} Ο -Ρ Ο §Η ε<Ν Φ Ο Ο. Φ tn ø pcd Ο«· Ρ -Ρ Φ g (d 03 φ ·Ρ .-4| I# tJ Η ο\ο 03 ,β 01 Ό (Ν| Ο Ο Ο Φ Η Η <υ ο - ο φ -ε φ .ρ y g o# g · β η ρ ρ ^ Ό (d ί3 s —ι ι—ι ε Φ · -Ρ ε·ρ C 03 ·ρ Η - οι Ο Ρ -Ρ Οι Ρ Ad 3 -Ρ (1) Ό ΟΌ - ·Ρ -Ρ Ad Φ Φ Φ Ή 03 ιη > 03 Φ β Ρ Ό « I tj) H Ό ^ β - ε ^ 'ίλφ φροφ+) φ ο r-ι << Ad -Ρο^οε-ρ ε -ρ ·ρ ο 03 ε·ρ . Ο) Ιίΐηα Φϋ ι-Ι 01 01 Ρ ϋ Η Η νο (¾ Ρ ~ Φ Ό Φ «3d ΟΦ Φ Φ Φ ro (d 4JOO 3® 03 Φ Ρ ·η Ρ 0103 ι Ν ·Ρ φ Φ >ι tø Φ

υ U !3 ΡI « ΕΗ Ο CQ

οι ι ο> ο ι

g 0 35 · Ή+1 I Φ I

g Ρ >ι·Ρ Η ft · +) Ό tn id ΦΦ C Φ Φ tJ) Η Ο β ο\ο +) >ι Φ Ό. 0) S Φ g « « ^ 03 ij ιΗ ε 1¾ Ή S PI φ λ° ρ Οι βρω tn · ι οο

Ρ > -Ρ ·Ρ · φ Φ U · β U

ο ·ρ Ο) Φ tnr-4 O' ο oho ιηΦ Μ-Ι 4-> -Ρ Φ > β Ρ ·Ρ COO m «· φ «Φ·γ4 Ρ η Ο» Ό (Μ . -Ρ Ο > c tn «· η (0 Φ c mu Οι φ Μ Φ U-4 · Ο tø Φ ΙΟ & φ+) αι s Οι ο -Ρ -Ρ Ad -Ρ ®ow ο Φ οι +J -P>,(d0103 > CM ι-4 > Ad φ >> ? Η ε Ρ Λ! Ρ Ό > Uf« Γβ β -Η ·Ρ 4JP 4J g Φ Η ·Η -Ρ Ό ΌΟ -Ρ > β ο -Ρ -Ρ 01 Ρ -Ρ 03 ί> Η β -Ρ 03 Φ Φ Ο 03 Q) ·Η ·Ρ ·Η 3d ΟΦ Λ »Η Ρ ·Ρ ^ > > Η Ad β

Ad -Ρ 03 03 tø Η β β φ 03 g) ftj Φ χ Ο Ο > 33 0 01Ή Οι Ο >-P-P'd>tn 0) φ (¾ β) >ι·Ρ Ρ Ο Ο Q) 03 03 Φ β X φ OiQ>tnC Η Ad A! ΐ> -Ρ Η 03 « +J -Ρ ·Ρθι·ΡΦ·Ρθΐ-Ρ Φ aj RJ Φ •η α: α: +)«·ΗΗθΐρ·Η αι ε ί> > -ρ ρ · 01 Ρ Ρ Μ-ί φ ι—4 ββφ -Ptn Ρ ·Ρ 01 ΦΗΗ ο ε a) φ(οφ 3Φοι pc s -ρ -ρ ε Ad ό υ υ Η -Ρ -Ρ Ρ >ι·5 Ρ Ρ·γ1 3·Η -ρ & Φ Ο « Ο Φ Φ ο w en ί^ΗΡίΏΟβϋίβιη ο ρ οι > s s a •Η 03 >1 fe Η Η

ι—I

<15 Λ g β -η ρ -ρ ε ι Εη -Η Ρ Ρ 03 β Ό β ·Ρ φ Ad ΦΡ Ο Φ Ο Ό t n Η 03 Ρ φ -Ρ ε ·Η φ φ ε φ η -Ρ υ -p-pgoi ε Ό Φ Φ Ρ

AdAdAi Ad -ΡΟιΦβΡ φ 03 Ρ03ΡΑίΗ Φ β *“4 β Φ Ρ +) Ό·Ρ Φ 01 S ε·Η Ρ) Φ Ρ) Φ 03 φ β φ -ρ ε ε β φ ό s η φ Ρ Φ Ρ β -Ρ ΡΟΙββΦ Ο g) -Ρ Οι -Ρ Φ Φ AdO.-P-P-P -Ρ

Φ Ρ Φ tn 8 03 γΡ -Ρ β -Ρ I

ρ ο ρ ρ ε Ρ)ΦΦοι 11 +) Ρ +3 ο Ρ 0\0 ο Η Η Ad υ •ρ ·ρ α: Ο φ φ (Β Φ 13 2 ω Η O S > 2 9 144978

Tabel III. Carbonhydrat-udnyttelse for _stamme C-36.145 D(-)-arabinose L(+)-arabinose ++ D-xylose ++ D-ribose ++ L-Rhamnose ++ D-glucose ++ D(+)-galactose ++ D-fructose ++ D-mannose ++

Saccharose ++

Maltose ++

Lactose ++

D(+)-melibiose ++X

Raffinose ++x D(+)-melezitose

Opløseligt stivelse ++

Cellulose

Glycerol ++

Inositol ++

D-mannitol ++X

Sotbitol

Dulcitol

Basalmedium: Pridham-Gottlieb medium x Rig produktion af rødligt-orange pigment 10 144978

Det anvendte næringsmedium indeholder en assimilerbar carbækilde, fx. et assimilerbart carbonhydrat. Eksempler på egnede carbonkilder er saccharose, lactose, maltose, mannose, fructose, glucose, glycerol og opløselig stivelse· Næringsmediet bør også indeholde en assimilerbar nitrogenkilde, såsom fiskemel, pepton, soyabønnemel, jordnøddemel, bomuldsfrømel eller majsstøbevæske. Uorganiske næringssalte kan også inkorporeres i mediet. Sådanne salte kan omfatte et hvilket som helst af de sædvanlige salte, som er i stand til at tilvejebringe natrium-, kalium-, ammonium-, calcium-, phosphat-, sulfat-, chlorid-, bromid-, nitrat- og carbonationer eller lignende ioner.

Fremstilling af bohemesyre-komplekset kan udføres ved en hvilken som helst temperatur, som bidrager til organismens tilfredsstillende vaskst, f.eks. 20-37°C, og udføres bekvemt ved en temperatur på ca.

27°C.

Mediet er normalt svagt alkalisk, men den nøjagtige pH-værdi kan varieres vidtgående afhængigt af det særlige medium, som anvendes.

Fermenteringen kan udføres i erlenmeyerkolder eller i laborato-riefermentorer eller i industrielle fermentorer med forskellige kapaciteter. Når der skal anvendes tankfermentering, er det ønskeligt at fremstille et vegetativt inoculum i et næringssubstrat ved podning af et lille volumen af dyrkningsmediet med organismens sporeform.

Efter opnåelse af et aktivt inoculum på denne måde, overføres dette aseptisk til fermenteringstankmediet til fremstilling i stor skala af antibiotikaene. Det til det vegetative inoculum anvendte medium kan være det samme som det til større fermenteringer anvendte, skønt andre medier dog kan anvendes.

Som sædvanlig i aerobiske submerse dyrkningsprocesser blæses steril luft gennem dyrkningsmediet. Omrøring kan opretholdes ved hjælp af omrørere, sædvanligvis i lighed med de i fermenteringsindustrien anvendte, I almindelighed opnås optimal fremstilling af bohemesyre-komplekset efter inkuberingsperioder på ca. 190 - 210 timer i røre-ryste-fermentorer eller tankfermentorer. Fermenteringens forløb kan følges n 144970 ved afprøvning af fermenteringsmediet fra tid til anden mod en organisme, som er følsom overfor bohemesyre-komplekset, f.eks. D. pneumoniae, St. pyogenes eller S. aureus.

Bohemesyre-komplekset kan udvindes fra fermenteringsmediet ved ekstraktion med et organisk opløsningsmiddel, som er ikke-blandbart med vand, fortrinsvis et polært opløsningsmiddel, såsom ethylacetat,· methylisobutylketon eller en (højere)alkohol (f.eks. n-butanol), og i særlig høj grad foretrækkes methylisobutylketon. Størstedelen af den antibiotiske aktivitet findes i substratet, og således kan substratet filtreres før ekstraktion. Ved den foretrukne fremgangsmåde ekstraheres imidlertid det fulde fermenteringssubstrat med det organiske opløsningsmiddel ved en pH-værdi på mellem ca. 7,5 og 8,5. Den organiske fase kan derpå filtreres og tørres til opnåelse af det faste bohemesyre-kompleks. Alternativt kan den organiske ekstrakt koncentreres, og det faste kompleks udfældes ved fortynding med et passende anti-opløsningsmiddel, såsom "Skellysolve B".

Anthracyclin-antibiotikaene musettamycin og marcellomycin kan adskilles fra hverandre og fra de andre bohemesyre-kompleks-bestand-dele ved kromatografi af bohemesyre-kompleks-opløsninger på søjler, som er pakket med et passende adsorptionsmiddel, såsom "Sephadex LH 20” (varemærke for dextranderivater, som anvendes som gelfiltreringsmidler i organiske opløsningsmidler og fremstilles af Pharmaceia Fine Chemicals, Inc.). Bohemesyre-kompleks-bestanddelene elueres derefter fra adsorptionsmidlet med et passende organisk opløsningsmiddel, såsom chloroform. Multiple fraktioner samles,, og med passende fortynding bestemmes deres specifikke ekstinktioner ved 490rryu. Disse af-bildes grafisk mod de tilsvarende fraktionsnumre til bestemmelse af toppe for de fra søjlen eluerede bestanddele. De fra elueringsrække-følgen bestemte, passende fraktioner kombineres og inddampes til dannelse af de faste, enkelte antibiotika. Faststofferne kan delvis oprenses ved omkrystallisation fra et passende organisk opløsningsmiddel, såsom acetonitril, chloroform-"Skellysolve B" eller methanol.

Musettamycin-og marcellomycin-bestanddelene kan yderligere oprenses under anvendelse af højtryksvæskekromatografi-fremgangsmåden, som er beskrevet i detaljer i eksempel 10 og 11. Denne fremgangsmåde har vist sig at give yderst rene prøver af de to antibiotika.

12 144978

Bohemesyre-kompleks eller dets musettamycin- og marcellomycin-bestanddele kan omdannes ved i og for sig kendte fremgangsmåder til de ovenfor beskrevne, farmaceutisk acceptable salte.

Den minimale inhiberingskoncentration in vitro (MIC) af musettamycin og marcellomycin bestemtes for et antal mikroorganismer under anvendelse af standard-rørfortyndingsfremgangsmåden.

13 144978

Tabel IV. Antimikrobielt spektrum for Mucettamycin og Marcellomycin_

Testorganisme MIC i ^ug/ml

Bakterier: Mar. Mus.

Streptococcus pneumoniae A-9585 0,03 0,06

Streptococcus pyogenes A-9604 0,03 0,06

Staphylococcus aureus A-9497 1 0,5

Staphylococcus aureus A-9537 1 1

Escherichia coli A-15119 125 >125

Escherichia coli A-21780 32 32

Klebsiella pneumoniae A-9977 125 >125

Proteus mirabilis A-9900 >125 >125

Fungi:

Candida albicans A-9540 125 125

Candida tropicalis A-15051 125 63

Candida krusei A-15052 125 125

Cryptococcus neoformans A-1503 125 63

Trichophyton mentagrophytes A-98 70 >125 >125

Mar. = Marcellomycin Mus. = Musettamycin 144978 14

Den akutte intraperitoneale LD50 i mus er 9,8 - 21,12 mg/kg for musettamycin og 6,35 - 10,56 mg/kg for marcellomycin.

De omhandlede forbindelser testedes også mod forskellige transplantable gnaver-tumorsystemer. De anvendte metoder er i detaljer beskrevet i Cancer Chemoth. Reports 3:1-87 (del 3), 1972.

Den første iagttagelse af tumor-inhiberende virkninger udførtes med Walker 256 carcinosarcoma, som implanteredes som en fast intra-muskulær tumor i rotter. Behandling af dyrene med fermenteringssubstrat indeholdende bohemesyre-kompleks forårsagede 73% hæmning af tumorvæksten sammenlignet med ubehandlede kontroltumorer.

Typiske terapi-virkninger med delvist renset musettamycin på to lymfatiske leukemia i mus, nærmere bestemt P-388 og L-1210, er vist herunder i tabel V. Signifikant tumor-hæmning over et 16-fold dosisinterval iagttoges med P-388 leukemia.

15 144978 φ xs

G

Ο) in > vo vo vo VO I i Φ cn \ Χ X \ i i h id vo m vo vo i i

p XS

ft > 0 01 (d ·Ρ

•ri -P

ε -η φ u

M 01 -P

G ft G

d) -'UftEnOonr-l 1 h \ u cn cm n o i i ·

01 OEhOSHHH·—III 'O

01 H P

^ cm a +J

g H “ M I 0) p J ε “ gi ·· O 1-1 ΰ 11 II 11 οι +j tn > +J DlH ~ <5 S 5 c ftl Φ tm Ό ®

(d > ,¾ m in m η ι I -PM

r-H H 0) - -- -- I I -H 51 φ ft φ P U CM CN Η H 1 1 Id > 01 ΤΙ Ο I I I I I , 1g M °

C Ti m Eh -P h -P

& .p ft- H +j Φ 01

u g id οι λ +J

il φ φ φ G 01 m p on) φ O r-H CN1 >1 ft Xj -P ft Η Ό C Ή !> 1Λ c®

C Φ m P Φ -P

.,-1 SvDVDVOVOVOVD Φγ-Η P

ϋ ftDi\\\V\\ PiPUg >, rHIdVDVDVOVOVOVD ft Φ \ > g p XJ P > Eh

ft ft -P Ο HH

4J 1> C< · fo +J Λ o -H H o flj J1J φ Ο Φ MO) Η Ό i-H 01 d -P Ό 1-1 5 +J U> -P X Φ -t <5 6 0»

ilj n 4J 1υ rH C

id Φ c 11 0 «

ΦυΦΕποιηιηοιηο G pH

tn ^ \ uoi 10 >f vj vr η N OEh-PP

G EnOgHHHHHH TlSSiR

-p CO p -p g 0 <P

G 00 ft ’Jj’ Λ’ ,

vi ro Φ H-> \ -P

pi -n G Φ G

•HO) G Φ Ό Cd

*> -P Ο Φ M

^ O H -P

+J 4J P Tl «Ρ

. tJiH H ft G -P

> ft) Φ ft ft 5 £.

>Λί r^OOOOVDH A! U ·£ ftl

Η H01------- C \ ft H

φ ftPUHMCMCMHCM MEhXIO]

J3 XS O I I I I I I I

(d χ} 4H Eh u ~ ίί» tr

G G

•Η 1H

rH M XS φ 01 01 G ft -P M 2 m\ N vo co M· n n ft

Oft------ φ>

QgVOHHOOO 03W

16 144973

Renset musettamycin og marcellomycin (fremstillet ifølge fremgangsmåderne beskrevet i eksempel 10 og 11 herunder) testedes mod L-1210 museleukemia, og resultaterne er vist i tabel VI. Disse data viser, at marcellomycin er omkring fire gange så kraftigt som mysetta-mycin med hensyn til inhiberende virkninger på denne tumortype.

De omhandlede antibiotiske forbindelser, omfattende bohemesyre-kompleks, dets bestanddele musettamycin og marcellomycin og salte og blandinger deraf kan fremstilles i en hvilken som helst farmaceutisk form, som er passende til den pågældende administreringsvej. Eksempler på sådanne præparater er faste præparater til oral administrering, såsom tabletter, kapsler, piller, pulvere eller granulatpartikler, flydende præparater til oral administrering, såsom opløsninger, suspensioner, siruper eller elikserer, og præparater til parenteral administrering, såsom sterile opløsninger, suspensioner eller emulsioner.

17 144978

Tabel VI; Virkning af bohemesyre-produkter på L-1210 leukemia virk ning dosis dag for totalt antal MST MST middelvægt overlevende

Forbindelse mg/kq/dag behandling injektioner dage %T/C ændring i g dag 5_

Mus. 12,8 1 1 10,5 150 -0,6 6/6 6.4 1 1 10,0 143 +0,5 6/6 3.2 1 1 9,0 129 +0,3 6/6 1.6 1 1 9,0 129 +0,3 6/6 0,8 1 1 8,5 121 +1,2 6/6 0,4 1 1 8,0 114 +1,3 6/6

Mus. 6,4 1-+5 5 6,0 86 -1,5 5/6 3.2 l-*5 5 11,0 157 -1,3 6/6 1.6 1-» 5 5 10,0 143 +0,3 6/6 0,8 1-,5 5 9,5 136 +0,4 6/6 0,4 1-,5 5 9,0 129 +0,6 6/6 0,2 1-,5 5 9,0 129 +1,8 6/6

Mar. 12,8 1 1 10,0 143 -0,7 3/6 6.4 1 1 11,0 157 -0,7 6/6 3.2 1 1 11,0 157 -0,7 6/6 1.6 1 1 10,0 143 +0,1 6/6 0,8 1 1 10,5 150 0 6/6 0,4 1 1 9,0 129 -0,8 6/6

Mar. 6,4 l-»5 4 toxisk toxisk toxisk 0/6 3.2 1-,5 5 6,0 86 -1,2 3/6 1.6 1-,5 4 6,0 86 -0,1 5/6 0,8 1-,5 5 10,0 143 -0,2 6/6 0,4 1-,5 5 9,0 129 0 6/6 0,2 1-, 5 5 9,0 129 -1,1 6/6

Kontrol saline 1-,5 5 7,0 - +3,0 10/10 6

Inoculum: 10 ascitiske celler, i-p. i BDF^ hunmus

Behandling: i.p. i 0,5 ml volumen

Evaluering: MST = middel overlevelsestid i dage; %T/C = MST behandlede / MST kontrol x 100.

Kriterier; T/C J 125 betragtes som signifikant tumor-hæmning (forlængelse af værtsdyrets overlevelsestid)

Mus. = musettamycin Mar. = marcellomycin 18 144978

Med henblik på anvendelse som et antibakterielt middel administreres præparaterne således, at koncentrationen af aktiv bestanddel er større end den minimale inhiberingskoncentration for den bestemte organisme, som skal behandles. En foreslået dosering med henblik på anvendelse som et antitumor middel i pattedyr eller mennesker er 2 2,5 - 10 mg/M for en enkelt intravenøs injektionsbehandlingskur med 2 marcellomycin og 10 - 40 mg/M for en enkelt intravenøs behandling med musettamycin.

De følgende eksempler skal belyse opfindelsen yderligere, "^u STYRAGEL", "phenyl/CORASIL" og "phenyl/PORASIL B" er varemærker, som indehaves af Waters Associates, Inc. for gelpermeations-kromatografiske pakningsmaterialer, fremstillet ved kemisk at binde organo-silaner til silica. "Sephadex LH-20" er varemærket, som indehaves af Pharmacia Fine Chemicals, Inc., for en modificeret tværbundet dextran, som anvendes i adsorption og gelfiltreringskromatografi .

Eksempel 1

Rystekolbefermentering

Organismen Actinosporangium sp. stamme C-36.145 (A.T.C.C. 31127) dyrkes på et agarplademedium, indeholdende 2 g D-glucose, 20 g havremel, 2 g soyapepton og 2 g agar, som er fyldt op til 1 liter med destilleret vand. Efter mindst 6 dages vækst ved 27°C overføres sporer til en 500 ml Erlenmeyerkolbe, som indeholder 100 ml sterilt medium, bestående af 30 g D-glucose, 10 g soyabønnemel, 10 g "Pharma-media" (Traders Oil Mill Co., Fort Worth, Texas) og 3 g CaCO^, som er fyldt op til 1 liter med destilleret vand. Denne vegetative kultur inhiberes ved 27°C på en roterende reolryster (model G52, New Brunswick Scientific Co., Inc.),som er indstillet ved 210 omdr./min., hvor kulturen beskriver en cirkel med en 5,1 cm diameter. Efter 48 timers forløb overføres 4 ml af kulturen til en 500 ml Erlenmeyer-kol-be, som indeholder 100 ml sterilt produktionsmedium bestående af 50 g glycerol, 20 g soyabønnemel, 10 g jordnøddemel og 10 g CaC03, som er fyldt op til 1 liter med destilleret vand. Kulturen inkuberes ved 27°C i 144 timer på ryster, som er indstillet ved 230 omdr./min..

Til denne tid findes antibiotisk aktivitet, bestående af bohemesyre-kompleks, i kulturfiltratet og -myceliet.

Eksempel 2 Røre-ryste-fermentering

Bohemesyre-kompleks fremstilles i røre-ryste-fermentorer under 19 U4978 anvendelse af en 48 timer gammel vegetativ kultur, som beskrevet i eksempel 1. 400 ml kultur overføres til 10 liter sterilt produktionsmedium, som beskrevet i eksempel 1, og indeholdende 0,01% Hodag F1 silicone-antiskum (Hodag Chemical Corp., Skokie, 111.) i en røre-ryste-beholder med 14 liters kapacitet. Røre-ryste-beholderen installeres i et Fermentor-drivapparat (model FS-614, New Brunswick Scientific Co., Inc., New Brunswick,N.J.). Temperaturen opretholdes ved 27°C, luftstrømshastigheden er 6 liter/min., og omrøreren indstilles til 300 omdr./min.. Hodag Fl antiskum indføres automatisk, som det er nødvendigt til regulering af skumning. Efter ca. 210 timers forløb afsluttes inkuberingen, og bohemesyre-kompleks findes i kultur-filtratet og -myceliet.

Eksempel 3 Tankfermentering

En tankfermentor med 37,8 liter sterilt produktionsmedium (som i eksempel 1) podes med 1,89 liter vegetativ kultur (fremstillet som i eksempel 1), omrøres med en omrørehastighed på 300 omdr./min., beluftes med 85 liter/min. og inkuberes ved 27°C i 190 timer. Boheme-syre-komplekset findes i kulturfiltratet og -myceliet.

Eksempel 4 Tankfermentering

En tankfermentor med 3028 liter produktionsmedium (som i eksempel 1) podes med 152 liter vegetativ kultur (fremstillet som i eksempel 1), omrøres med en omrørehastighed på 155 omdr./min., beluftes med 141,6 liter/min. og inkuberes ved 27 C i 190 timer. Til denne tid findes tilstedeværelse af bohemesyre-kompleks i kulturfiltratet og -myceliet.

Eksempel 5

Isolering af bohemesyre-kompleks

Fuldt fermenteringssubstrat (7 liter) opnået ved dyrkning ifølge eksempel 2 ved dets endelige pH-værdi 8,1 omrørtes med et omtrent lige så stort volumen methylisobutylketon i 20-30 minutter. En stor mængde diatoméjord-filterhjælp tilsattes derpå, og efter grundig omrøring til indblanding af dette filtreredes blandingen på filterhjælp under anvendelse af vakuumsugning. Filtratet adskilte sig i to faser, hvoraf den nederste (vandige) bortkastedes. Den organiske fase inddampedes under vakuum til et lille volumen (50-100 ml) og fortyndedes med "Skellysolve B" (varemærke for en petroleumsetherfraktion med 144978 20 med kogepunkt 60-68°C, i det væsentlige bestående af n-hexan og som sælges af Skelly Oil Co.) til udfældning af et mørkerødt faststof, som tørredes i vakuum til opnåelse af 1,9 g bohemesyre-kompleks.

Eksempel 6

Isolering af bohemesyre-kompleks i stor målestok

Fuldt fermeriteringssubstrat (3000 liter) opnået.ved dyrkning ifølge eksempel 2 ved pH-værdi 8,0 - 8,5 afkøledes ved 25°C og omrørtes kraftigt med 3000 liter methylisobutyl-keton i 30 minutter ved 20 - 30°C. Til emulsionen sattes 360 kg filterhjælp, og blandingen omrørtes kraftigt i endnu 1 time. Den henstilledes derpå til bundfældning i ca. 30 minutter, hvorefter 2300 - 2500 liter organisk fase fradekanteredes og afkøledes ved 0 - 10°C. Yderligere 800 liter methylisobutylketon omrørtes med blandingen i 20 minutter, fradekanteredes efter bundfældning i 30 minutter og kombineredes med den afkølede første fraktion til dannelse af et totalt ekstraktvolumen på 3300 - 3400 liter. Dette blankfiltreredes til opnåelse af en endelig 3100 - 3200 liters methylisobutylketonekstrakt, som var fri for faststoffer og uopløselig vandig fase. Den organiske ekstrakt vakuum-koncentreredes ved 0 - 10°C til et endeligt volumen på 6 liter. Dette sattes til 60 liter "Skellysolve B" under omrøring ved 20 - 25°C. De udfældede faststoffer opsamledes på et nutschfilter, udvaskedes med 10 liter "Skellysolve B" og sugedes tørt til opnåelse af 900 - 1000 g af noget olieagtigt og mørkerødt, amorft produkt. Dette omrørtes med overskydende ether, filtreredes på en buchnertragt, rensedes med yderligere ether, sugedes tørt og tørredes i vakuum til opnåelse af 351 g amorft, mørkerødt bohemesyre-kompleks.

Eksempel 7

Fraktionering af bohemesyre-kompleks "Sephadex LH-20" opblødt i 68 timer i chloroform pakkedes i form af opslæmning i en Pharmacia SR 25/100 søjle (25 mm inderdiameter x 100 cm højde), som var forsynet med justerbare teflon-endestykker i hver ende. Søjlen pakkedes således, at den var fuldstændig fyldt fra endestykke til endestykke med en effektiv lejehøjde på 90-95 cm. Bohemesyre-kompleks (500 mg) opnået ifølge eksempel 6 opløstes i 10 ml chloro-- form og overførtes, til søjlen, som derefter udvikledes med chloroform ved neds trømning ved en udtagshastighed på 1 ml/min.. Elueret væske opsamledes i 6 ml portioner i en fraktionskollektor. Prøver af fortløbende nummererede rør fortyndedes 80 gange med chloroform og aflæstes i en Bausch 21 144378 og Lomb Spectronis 20 kolorimeter ved 490iryu. Fire adskilte bånd for anthracyclin-pigmenter bemærkedes som følger: Rør nr. Vægt efter inddampning 1-4 5-11 første bånd 66 mg 12-14 15 - 21 andet bånd 36 mg 22-35 36 - 44 tredie bånd 18 mg 45 46 - 57 fjerde bånd 48 mg 58 - -

De opnåede faststoffer kromatograferedes på Brinkmann 60F254 silicagel-tyndtlagsplader under anvendelse af et 80:20 toluen:methanol-opløsningsmiddelsystem. Det første bånd, som elueredes, viste sig ved tyndtlagskromatografi at være en fuldstændig inaktiv blanding.

Det andet bånd gav en karakteristisk lyserødlig rød zone ved ca. - 0,75. Denne fraktion var også inaktiv og viste sig at omfatte hovedsagelig -pyrromycinon. Den tredie fraktion, som elueredes, gav en enkelt zone med R^ ~ 0,3. Denne fraktion bestemtes til at være musetta-mycin og var stærkt aktiv, når den blev testet på både L-1210 og P-388 museleukæmisystemerne. Det sidste bånd, som elueredes, gav en zone ved * 0,3 og omfattede hovedsagelig marcellomycin. Denne bestanddel udviste også stærk aktivitet, når den blev testet på de to museleukæmier. Skønt både musettamycin og marcellomycin ved tyndt-lagskromatografi har Rf-værdier omkring 0,3, bevæger musettamycin sig lidt hurtigere. Ved blanding opspaltes musettamycin og marcellomycin derfor i to meget nære farvezoner.

Eksempel 8

Fraktionering i stor målestok.

En ca. 15,2 cm (6") (diameter) x ca. 195,6 cm (77") (højde) glassøjle forsynedes ved basis med et ikke-lukket filter, på hvis top der anbragtes et glasuldlag efterfulgt af en cirkulær polyethylen-fritte. Denne var tilskåret med en diameter på ca. 14,9 cm (5 7/8") til muliggørelse af opsvulmen i chloroform. "Sephadex LH-20" (8,73 kg) omrørtes i 3 timer i chloroform, filtreredes, og faststoffet genop-slæmmedes i chloroform og henstilledes i 16 timer. Blandingen omrør- 22 144978 tes derefter i 15 minutter og overførtes til søjlen. En 30 g’s prøve af bohemesyre-kompleks (fremstillet som i eksempel 6) opvarmedes med 1,5 liter chloroform i 15 minutter og omrørtes derefter i 16 timer. Efter filtrering fraskiltes 7,5 g uopløst materiale, som indeholdt nogen aktivitet. (Ved senere forsøg viste det sig, at prøven kunne opløses fuldstændigt i 30 - 40% methanol. Kromatografiske resultater var de samme ved denne fremgangsmåde.) Filtratet overførtes til søjlen, og nedadrettet udvikling påbegyndtes med chloroform. En strømningshastighed på 16 ml/min. ved udløbet opretholdtes under hele gennemløbet. Et oprindeligt volumen på 1445 ml elueringsmiddel udtoges før farve nåede bunden af gel-lejet. Til dette tidspunkt påbegyndtes opsamling af 100 ml fraktioner, og denne fortsattes, indtil væsken var helt lys igen, et totalt antal på 906 portioner. Aliquote mængder af hver femte fraktion fortyndedes og analyseredes som beskrevet i eksempel 7. Fire bestanddele viste sig at være udskilt som anført nedenfor.

Vægt efter

Fraktion Beskrivelse inddampning 1-20 1. bestanddel, blanding* inaktiv 6,74 g 21-44 2. bestanddel, blanding, inaktiv* 4,18 g 45 - 53 gennem - bortkastedes 385 mg 54 - 70 3. bestanddel, enkelt forbindelse-musettamycin, aktiv 1,45 g 71 - 75 gennem - bortkastedes 198 mg 76 - 110 4. bestanddel, blanding indeholdende hovedsagelig marcellomycin, aktiv 4,03 g 111 - 200 efterløbsportion 1,72 g x vist ved tyndtlagskromatografi xx hovedsagelig pyrromycinon.

Eksempel 9

Delvis oprensning af musettamycin

Faststoffet (421,4 mg) opnået fra den tredie bestanddel i eksempel 8 opløstes i overskud af kogende chloroform, og opløsningen filtreredes varm gennem riflet filterpapir. Filtratet kogtes ned til mindre end 20 ml på dampbad. "Skellysolve B" sattes derefter dråbevis til den 23 144978 varme opløsning, indtil damppunktet nåedes, hvorefter der tilsattes adskillige dråber chloroform. Efter henstilling til afkøling til omgivelsestemperatur anbragtes blandingen i en fryser ved -20°C natten over. De dybtråde krystallinske småplader opsamledes og tørredes i vakuum til dannelse af 358 mg musettamycin, smeltepunkt 162-163°C.

Eksempel 10

Oprensning af musettamycin Rå ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA)-udvasket musettamycin opnået som i eksempel 8 sendtes gennem en firesøjles tænk af ^u STYRAGEL" (varemærke for et gelfiltreringssøjlepakningsmateriale, som anvendes i gelpermeations-kromatografi, og som består af småkorn, 8-10 mikrometer i diameter, er sammensat af stive, tværbundne styrendivinylbenzenpolymere og fremstilles af Waters Assocates, Inc.) (500-100-100-100 Å) med chloroform som en bevægelig fase med en strømningshastighed på 0,7 ml/min. med henblik på en første oprensning. Ni gennemløb med hver 100 mg udførtes. Elueringen overvågedes ved hjælp af en refraktionsindeksdetektor (Waters Associates), og i hvert gennemløb opsamledes hovedtoppen, som elueredes ved 37,5 - 45 min.. Hovedfraktionen fra de ni gennemløb kombineredes og inddampedes til tørhed i vakuum. Det mørkerøde, amorfe faststof (660 mg) opløstes i 22 ml af en 45:55 opløsningsmiddelblanding af acetonitril:0,01 M natriumacetat, pH-værdi 4,0. Blandingen centrifugeredes til fjernelse af en lille mængde opslæmmet materiale, og den klare supernatant overførtes til et forsegleligt penicillinglas. En portion (1,25 ml a/ 37 mg) af den mørkerøde opløsning overførtes til en U6K injektionssprøjte (Waters Associates, Inc.), og prøven overførtes til søjlen. Prøven kromatograferedes på en 1 meter x 4,6 mm indre diameter rustfri stål-søjle pakket med "phenyl/PO-RASIL B (varemærke for et bundet fase-materiale til fasedelingskromatografi, som fremstilles af Waters Associates, Inc. og er sammensat af en fuldstændig porøs silica, hvortil der kemisk er bundet flydende diphenyldichlorsilan) (37-75^u partikelstørrelse). Den bevægelige fase bestod af en 35:65 acetonitril:0,01 M natriumacetat-blanding, pH-værdi 4,0, med en strømningshastighed på 1,9 - 2,0 ml/min.. Elueringen overvågedes under anvendelse af et refraktionsindeks-overvågningsapparat. Fraktioner opsamledes med 75 sekunders intervaller ved hjælp af en automatisk fraktionskollektor (Scientific Manufacturing Industries). 120 rør opsamledes, og søjlen udvaskedes med en strømningshastighed på 3,0 ml/min., med methanol i 15 minutter, vand i 15 minutter og acetonitril:0,01 M natriumacetat-blanding (35:65), pH- 24 144978 værdi 4, i 15 minutter. Strømningshastigheden nedsattes til 2,0 ml/min., og systemet bragtes til ligevægt i 5 minutter før efterfølgende injektion. En 25yuliter aliquot mængde af elueringsmidlet i hvert femte rør kromatograferedes på et analytisk system til afprøvning af sammensætning før kombinering af rørene. Det analytiske system bestod af en 61 cm x 2,1 mm indre diameter rustfri stål-søjle pakket med "phenyl/CORASIL" (varemærke for et bundet fase-materiale til faseadskillelseskromatografi og fremstillet af Waters Associates, Inc., hvilket materiale består af faste glaskorn, som er overtrukket med et enkelt lag silica, hvortil der er bundet diphenyldichlorsilan) (37 - 50yU partikelstørrelse). Den bevægelige fase var en 45:55 blanding af acetonitril:0,01 M natriumacetat, pH-værdi 4,0, med en strømningshastighed på 0,7 ml/min.. Elueringsmiddel overvågedes med en UV-detektor (LDC) ved 254 nm. Rørkombineringer udførtes på basis af de analytiske kromatogrammer. Rør 61-120 viste sig at indeholde det ønskede musettamycin. Disse rør kombineredes og inddampedes i vakuum (45°C). De mørkerøde remanenser gennemskylledes gentagne gange med methanol og med 2 x 100 ml methylenchlorid. Remanensen tritureredes derefter med 100 ml chloroform og filtreredes til fjernelse af uorganiske salte. Faststoffet inddampedes derpå til tørhed med tør N2 og tørredes under høj vakuum over ?2°5'

Musettamycin oprenset som ovenfor kan karakteriseres ved de følgende data:

Beskrivelse: mørkerøde krystallinsk pulver.

Molekylformel: C3gH45®i4N

Molekylvægt: 715,76

Grunds tofanalys e:

Teoretisk: C. 60,41; H. 6,34; N. 1,95.

Eksperimentel: C. 60,27; H. 6,59; N. 1,99.

Korrigeret for 0,83 E^O og 0,83 remanens: C. 60,27; H. 6,50; N. 1,99.

Infrarødt spektrum: Musettamycins infrarøde absorptionsspektrum (KBr pellets) udviser hovedbånd ved de følgende bølgelængder: 3480, 2970, 2930, 2820, 2770, 1735, 1600, 1450, 1320, 1295, 1220, 1160, 1010 og 990 cm”1.

Ultraviolet spektrum: Ved en koncentration på 0,013 g/liter i methanol udviser musettamycin de følgende maksima og absorptions-koefficienter: 233 nyu, 57,7; 256 nyu, 33,2; 284 nyu, 14,5; 466 nyu, 14,3; 490 nyu, 17,4; 510 nyu, 14,6; 524 nyu, 12,9 og 570 nyu, 3,3.

25 144978

Kernemagnetisk resonans-spektret (a) 100 mHz pmr-spektrum: Ved en koncentration på 25 mg/0,5 ml i CDCI3 udviste spektret de følgende kemiske skift i ppm og de følgende mønsterbeskrivelser: 7,66, s; 7,32, s; 7,21, s (CDC13); 5,50, m; 5,24, m; 5,00, m; 4,48, kvartet; 4,10, s; 3,68, s; 4,2 - 3,4, overlappende m'er; 2,16, s; 2,5 - 1,3, overlappende m'er og 1,3 - 0,9, overlappende dubletter og tripletter [s = singlet, m = multiplet].

(b) 25 mHz cmr-spektrum: Ved en koncentration på 200 mg/ml i CDCl^ udviser spektret de følgende iagttagne kemiske skift og intensiteter:

Nr. Relativ Frekvens i

_ intensitet Hz_ PPM

1 34 4777,66 189,816 2 34 4654,38 184,918 3 60 4303,11 170,962 4 57 4076,06 161,941 5 39 3980,33 158,138 6 45 3961,43 157,387 7 57 3578,36 142,168 8 44 3327,79 132,213 9 52 3299,86 131,103 10 32 3269,30 129,889 11 36 3258,97 129,478 12 32 3021,49 120,043 13 42 2875,63 114,249 14 42 2816,92 111,916 15 37 2812,68 111,747 16 30 2548,48 101,251 17 42 2489,88 98,923 72 1967,51 78,169 78 1935,57 76,900 72 1903,47 75,624 18 27 1852,56 73,602 19 87 1797,79 71,426 20 36 1791,56 71,178 21 34 1775,10 70,525 22 33 1716,43 68,193 26 144978 (fortsat)

Nr. Relativ Frekvens i

_ intensitet Hz_ PPM

23 31 1670,07 66,351 24 30 1649,89 65,550 25 29 1548,63 61,527 26 33 1431,42 56,870 27 64 1318,54 52,386 28 69 1074,95 42,708 29 18 847,88 33,686 30 23 819,21 32,547 31 29 805,76 32,013 32 17 722,16 28,691 33 42 449,34 17,852 34 56 418,12 16,612 35 60 165,37 6,570 Højtryksvæskekromatogram: Retentionstiden for musettamycin viste sig at være 11 min. 20 sek. ved anvendelse af Waters Associates,Inc. modulære bestanddele og ved drift ved de følgende parametre: 61 cm x 2,1 mm "phenyl/CORASIL"-støttesøjle; 45:55 acetonitril: 0,01 M natriumacetat, pH-værdi 4; 0,7 ml/min. strømningshastighed; 254 iryu UV-detektor.

Smeltepunkt: 210-212°C.

Opløselighed: Opløselighed i de fleste organiske opløsningsmidler; vil udkrystallisere fra methanol i højere koncentrationer ved 20°C; uopløseligt i vand, alifatiske carbonhydrider og ether.

Eksempel 11

Oprensning af marcellomycin Rå EDTA-udvasket marcellomycin opnået som i eksempel 8 underkastedes en første oprensning ved anvendelse af en firesøjles bænk af "yu STYRA.GEL" (varerrærke for et gelfiltreringsmiddelsøjlepakningsmateriale, som anvendes i gelpermeationskromatografi og som består af småkorn, 8-10 mikrometer i diameter, er sammensat af stive, tværbundne styrendivinylbenzen-polymere og fremstilles af Waters Associates, Inc.) (500-100-100-100Å) med chloroform som en bevægelig fase. Strømningshastigheden for denne adskillelse var 0,6 - 0,7 ml/min., og elueringen overvågedes med en refraktionsindeks-detektor (Waters Associates, Inc.). Ti gennemløb med hver 100 mg udførtes, og i hvert tilfælde opsamledes hovedtoppen, som elueredes ved 26 - 32 min.. Hovedfraktionen fra hver af 27 144978 de ti gennemløb kombineredes og inddampedes til tørhed i vakuum.

Det mørkerøde amorfe faststof opdeltes i 25, 30 - 35 mg fraktioner.

Hver opløstes i 1,0 ml af en 45:55 acetonitril:0,01 M natriumacetat-opløsningsmiddelblanding, pH-værdi 4,0, umiddelbart før overføring til det kromatografiske system, bestående af en 1 m x 4,6 mm indre diameter rustfri stål-søjle, som var pakket med "phenyl/PORASIL B" (varemærke for et bundet fase-materiale til faseadskillelseskromatografi, hvilket materiale fremstilles af Waters Associates, Inc., er sammensat af en totalt porøs silica, hvortil der kemisk er bundet flydende fase af diphenyldichlorsilan) (37-75^,u partikelstørrelse).

Den bevægelige fase var 45:55 acetonitril:0,01 M natriumacetat, pH-værdi 4,0 med en strømningshastighed på 3,0 ml/min. Elueringen overvågedes ved anvendelse af et differentialrefraktionsindeks-overvåg-ningsapparat (Waters Associates, Inc.). Fraktioner opsamledes med 1,0 minuts intervaller ved hjælp af en SMI (Scientific Manufacturing Industries) fraktionskollektor. 59 rør opsamledes, og søjlen udvaskedes med en strømningshastighed på 4,0 ml/min. med acetonitril, og i 15 minutter med den bevægelige fase før en efterfølgende injektion.

Det i hvert femte rør indeholdte elueringsmiddel kromatograferedes på et analytisk system før rørkombinering. Det analytiske system bestod-af en 61 cm x 2,1 mm indre diameter rustfri stål-søjle med "phenyl/ CORASIL" (varemærke for et bundet fase-materiale til faseadskillelseskromatografi og fremstillet af Waters Associates, Inc., hvilket materiale består af faste glaskorn, som er overtrukket med et enkelt lag silica, hvortil der kemisk er bundet diphenyldichlorsilan) (37-50^u partikelstørrelse). Den bevægelige fase bestod af et 45:55 acetonitril: 0,01 M natriumacetat-opløsningsmiddelblanding, pH-værdi 4,0, med en strømningshastighed på 0,68 - 7,0 ml/min.. Elueringsmidlet overvågedes med en UV-detektor ved 254 nm. 25^uliter elueringsmiddel injiceredes i dette system. Rørkombineringer udførtes på basis af de analytiske kromatogrammer. Sædvanligvis viste rør 18-35 sig at indeholde udelukkende den ønskede marcellomycin-bestanddel. Disse rør kombineredes, inddampedes til tørhed i vakuum ved 45°C. Remanensen gennemskylledes gentagne gange med methanol og med 2 x 100 ml methylenchlorid. Remanensen tritureredes med 75 ml methylenchlorid og filtreredes. Filtratet inddampedes i vakuum (45°C) til tørhed. Mørkerød remanens tørredes derefter under høj vakuum over P20^.

Marcellomycin renset som ovenfor kan karakteriseres ved de følgende data.

Beskrivelse: mørkerødt amorft pulver.

144978 28

Molekylform: 0^2^55^-^7

Molekylvægt: 845,90.

Grundstofanalyse:

Teoretisk: C. 59,64; H. 6,55; N. 1,65; 0. 32,15.

Eksperimentel: C. 56,32; H. 6,64; N. 1,74.

Korrigeret for H-O

og remanens: C. 58,77; H. 6,77; N. 1,82.

Infrarødt spektrum; Marcellomycins infrarøde absorptionsspektrum (KBr-pellets) udviser hovedbånd ved de følgende bølgelængder: 3450, 2960, 2940, 2820, 2790, 1730, 1615, 1600, 1450, 1260, 1095, 1010 og 800 cm \

Ultraviolet spektrum: Ved en koncentration på 0,013 g/liter i metha nol udviser marcellomycin de følgende maksima og absorptionskoefficienter: 233 nyu, 47,5; 256 nyu, skulder, 24,7; 284 iryu, skulder, 10,6; 490 nyu, 15,8; 410 nyu, skulder, 3,4; 465 nyu, skulder, 13,2; 480 iryu, skulder, 14,7; 510 nyu, skulder, 12,5; 524 iryu, skulder, 10,6 og 580 nyu, skulder, 1,1.

Kernemagnetisk resonans spektra: (a) 100 mHz pmr-spektrum: Ved en koncentration på 25 mg/5 ml i CD2C12 udviste spektret de følgende kemiske skift i ppm og de følgende mønsterbeskrxvelser: 7,63, s; 7,24, s; 5,52, m; 5,30, m; 5,33, m (CD2C12); 4,94, m; 4,50, kvartet; 4,30 - 3,90, overlappende m'er; 3,69, s; 2,70 - 0,09, overlappende m'er og 2,19, s [s = singlet, m = multiplet].

(b) 25 mHz cmr-spektrum: Ved en koncentration på 60 mg/2 ml i CD2Cl2 udviser spektret de følgende iafttagne kemiske skift og intensiteter:

Relativ Frekvens i

Nr. intensitet Hz_ PPM

1 38 3454,09 137,574 2 31 3331,45 132,727 3 56 2964,01 118,088 4 37 2739,81 109,156 5 49 2642,13 105,264 6 37 2627,41 104,678 7 52 2246,11 89,487 8 30 1995,14 79,488 9 46 1969,58 78,469 29 144978

Relativ Frekvens i

Nr. intensitet Hz _ PPM

10 38 1926,64 76,759 11 35 1918,43 76,432 12 37 1682,08 67,015 13 26 1543,35 61,488 14 32 1489,08 59,326 15 29 1484,44 59,141 16 45 1213,98 48,366 17 51 1195,68 47,636 18 55 1155,94 46,053 19 50 768,18 30,605 20 54 516,93 20,595 21 91 455,17 18,134 22 64 444,15 17,695 23 43 433,12 17,256 24 49 378,19 15,067 25 54 348,77 13,895 26 50 339,07 13,509 27 57 305,61 12,176 28 63 303,14 12,077 29 49 206,56 8,229 30 53 96,91 3,861 67 54,60 2,175 136 27,27 1,087 175 0,01 0,000 165 - 27,03 - 1,077 67 “ 54,44 - 2,169 31 103 -264,55 -10,540 32 40 -478,75 -19,074 33 38 -491,67 -19,589 34 50 -514,78 -20,509 35 47 -533,08 -21,238 36 32 -610,57 -24,326 37 49 -899,27 -35,828 38 67 -918,94 -36,611 39 80 -926,83 -36,926 40 79 -1202,93 -47,926 Højtryksvæske-kromatografi: Retentionstiden for marcellomycin viste sig at være 10 min. 24 sek. ved anvendelse af Waters Associates, 30 U4978

Inc. modulære bestanddele og ved drift ved de følgende parametre: 61 cm x 2/1 mm "phenyl/CORASIL"-støttesøjle; 45:55 acetonitril: 0,01 M natriumacetat, pH-værdi 4; 0,68 - 7 ml/min. strømningshastighed; 254 nyu UV-detektor.

Smeltepunkt: Blødgøring ved 134 - 135°C; størkner gradvist, men smel ter ikke op til 300°C.

Claims (4)

144978 31

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et antibiotisk anthracyclin-kompleks kaldet bohemeSyrekompleks eller dets bestanddele musetta-mycin og marcellomycin med formlen cooch3 o oh CH„CH0. L J-L xW.

3 I '.s' H°^ I 1 ySA/r £ OH 0 OH

0 N(^CH3^2 I OH hvori R er hydrogen (musettarnycin). eller et radikal med den følgende formel: OH OH (marcellomycin)