DE112009005041T5

DE112009005041T5 - Verfahren der Extraktzubereitung aus Longankern und die Anwendung des Longankernextrakts

Info

Publication number: DE112009005041T5
Application number: DE112009005041T
Authority: DE
Inventors: Wen-Tien Huang; Chien-Wei Hou; Giao-Zhi Huang; Ying-Chung lee; Huang-Chung Tseng; Jer-Yi Liao; Chieh-Wei Huang; Chun-Lan Keng
Original assignee: JOBEN BIO MEDICAL CO; JOBEN BIO-MEDICAL Co Ltd
Current assignee: JOBEN BIO MEDICAL CO; JOBEN BIO-MEDICAL Co Ltd
Priority date: 2009-07-08
Filing date: 2009-07-08
Publication date: 2012-09-27
Also published as: US20150079205A1; WO2011003236A1; US9999645B2; JP2012532148A; CN102481327B; US20120177761A1; US20150079204A1; CN102481327A

Abstract

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Longankernextraktes und dessen Verwendungen bereit. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: die Formulierung einer Extraktionslösung mit einer bestimmten Konzentration, das Erwärmen der Extraktionslösung auf eine bestimmte Temperatur, die Zugabe von pulverförmigen Longankernen zu der Lösung und deren Extraktion, das Filtrieren des Extraktes und dessen Anreicherung, das Gefriertrocknen der konzentrierten Lösung; das Erhalten eines Extraktes aus Longankernen. Es wird gezeigt, dass der mit dem Verfahren gemäß der Erfindung hergestellte Longankernextrakt in Organismen dazu verwendet werden kann, eine entzündungshemmende Reaktion zu erzeugen, die Produktion von Harnsäure zu reduzieren, die bakterielle Aktivität zu hemmen, das Wachstum von Hautkeratinozyten zu verbessern und die Wundheilung zu fördern, ohne innere Organe zu schädigen oder die Belastung der inneren Organe zu erhöhen.

Description

Kurzfassung
Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich um die Zubereitungsmethode und die Anwendung des Longankernenextrakts. Die Zubereitungsmethode umfasst die folgenden Schritte: (1) Herstellung einer Extrahierlösung mit bestimmter Konzentration. (2) Die Extrahierlösung wird auf bestimmter Temperatur erhitzt. (3) Gehackte Longankerne werden zur Extrahierlösung zugegeben, um die Stoffe in Langankernen zu extrahieren. (4) Die Extrahierlösung mit dem extrahierten Stoff aus Langankernen wird gefiltert und angereichert. (5) Der angereicherte Extrakt wird gefroren und getrocknet. (6) Herstellung der Extrakt aus Longankernen. Durch Untersuchungen werden bestätigt, dass der nach der Zubereitungsmethode von der vorliegenden Erfindung gewonnene Longankernenextrakt beim Lebwesen anwenden kann. Er ruft Reaktion zum Hemmen der Entzündung hervor und reduziert die Bildung der Harnsäure sowie hemmt die bakterille Aktivität. Des Weiteren kann er auch das Wachstum der Keratinozyten der Haut fördern, die Heilung der Wunde beschleunigen und verursacht keine Organschäden sowie erhöht keine zusätzliche Belastung der Organe.
Das Technische Gebiet
Bei der Erfindung handelt es sich um ein Verfahren zum Trennen der Stoffe aus den Kernen der Longane. Der Longankernextrakt hat die Wirkung von Entzündungshemmen und Konzentrationssenkung der Harnsäure im Blut sowie Wachstumsförderung der Haut-Keratinozyten und Beschleunigung des Prozesses der Wundheilung sowie der Stärkung der Resistenz gegen die bakterielle Aktivität.
I. Entzündung
Entzündung ist in der medikamentösen Behandlung ein Phänomen, das man ignorieren kann. Für den menschlichen Körper ist sie ein Warnsignal vor Krankwerden. Wird Gewebe verletzt, unabhängig davon, ob es durch Bakterien, Traumata, Chemikalien oder sonst andere Ursachen zurückzuführen ist, werden die Makrophagen am beschädigten Gewebe aktiviert, um die Fremdstoffe zu fressen bzw. zu beseitigen. Gleichzeitig werden auch einige Faktoren dabei freigesetzt, um den weiteren Abwehrmechanismus auszulösen. Wird das entzündete Gewebe weiter von Fremdstoffen befallen, kann der Abwehrmechanismus sogar monate- oder jahrelang dauern. Befindet sich das Gewebe im entzündeten Zustand, werden die Menge der oben genannten Faktoren sehr oft mehr freigesetzt. Eine Studie hat bewiesen, dass die freigesetzten Faktoren umfassen Stickstoffmonoxid, (NO), Tumor-Nekrose-Faktor (Tumor-Nekrose-Faktor, TNF), Interleukine (Interleukin, IL), Granulozyten-Kolonie stimulierende Faktor (Granulocyte colony stimulating factor, G-CSF), Monozyten-Kolonie-stimulierender Faktor, M-CSF (Monocyte colony stimulating factor, M-CSF), Granulozyten-Monozyten-Kolonie stimulierende Faktor (Granulocyte-Monocyte colony stimulating factor, GM-CSF). Die Wissenschaftler haben dem von Monozyten und Makrophagen produzierten TNF den Namen TNF-α gegeben während dem von T-Lymphgefäß produzierten T Lymphotoxin (Lymphotoxin, LT) den Namen TNF-β gegeben, um sie zu unterscheiden.
Lipopolysaccharides (Lipopolysaccharides, LPS) ist ein wichtiger Bestandteil von Endotoxin. Durch Tierversche wird es bestätigt, dass LPS die Magenentleerung hinauszögern kann. Der Verzögerungseffekt hängt mit den von LPS induzierten entzündeten Zytokinen und der erhöhten Menge von Stickstoffmonoxid zusammen. Wird der Organismus durch LPS angeregt, werden mehrere Zytokinen wie TNF-α·IL-1 β·IL-6 von Monozyten-Makrophagen-System zusammengesetzt, so dass sie auch an die Abwehrreaktion und Reparatur beteiligen können. Die Zusammensetzung der drei Zellenfaktor ist eine Kettenreaktion, d. h. LPS induziert die Zusammensetzung von TNF-α, das die Zusammensetzung von IL-1 β weiter induziert und schließlich wird die Zusammensetzung von IL-6 von IL-1 β induziert. Aber die überschüssigen Zellenfaktoren haben auch negative Auswirkungen auf dem Körper. Z. B. die überschüssige TNF-α können zum Versagen mehrerer Organen, zur disseminierten intravasalen Blutgerinnung und toxischem Schock und sogar zum Tod führen. Die Anwendung von TNF-Antikörper bei Tieren hat den tödlichen Endotoxinschock effektiv verhindert.
Heutzutage gibt es mehrere Medikamente gegen Entzündung, wie z. B. Antibiotika, Nicht-Steroidale entzündungshemmende Medikamente (Non-steroidal anti-inflammation drugs; NSAIDs), Antihistamine, usw. Sie haben zwar sehr gute entzündungshemmende Wirkung, haben aber auch Nebenwirkung wie Widerstand und Magen-Darm-Schäden.
II. Gicht
Die Ursache der Gicht ist die Abnormalität des Purin-Stoffwechsels oder die verminderte Ausscheidung der Harnsäure durch eine Krankheit, derer klinische Merkmale Hzperurikämie, rezidiverenenen akuten Monoarthritis (Recurrent acute monoarthritis) und Abgelagerung der Tophi aus Harnsäure-Natriumsalz sowie chronische Arthritis sind. Wird diese Krankheit nicht richtig behandelt, entwickelt sich in der Regel schließlich zu einer Gichtische Nephropathie, die sich in zwei Kategorien unterscheidet. Bei knapp 1% unter den Patienten von primären Gichtische Nephropathie wird die Krankheit durch Enzymmangel hervorgerufen, aber bei den meisten Fällen ist die Ursache unbekannt, wobei die wesentliche klinische Manifestation Gicht gilt und oft mit hohem Cholesterinspiegel, Bluthochdruck, Diabetes, Arteriosklerose und koronare Herzkrankheit, etc. verbunden sind; Die sekundäre Gichtische Nephropathie wird häufig durch Nieren-, Bluterkrankungen und Drogen verursacht und die Gicht gilt die Komplikation.
Hyperurikämie ist die wichtigste biochemische Grundlage der Gicht, aber es ist nicht gleichbedeutend mit Gicht. Studie zeigt: ca. 5~18,8% der Hyperurikämie-Patienten werden schließlich unter Gicht leiden. Im Verlaufen der Entwicklungsphase der Gicht sind die Patienten in einer bestimmten Zeit an Hyperurikämie erkrankt.
Im Labor kann das Volumen der Harnsäure im Blut mit Uricase Differential spektrophotometrische Methode genau feststellen. Hyperurikämie kann in absolutem und relativem Typ unterteilt. Wenn die Konzentration der Harnsäure im Blut die obere Grenze der Löslichkeit überschreitet, dann wird sie absolute Hyperurikämie bezeichnet. Der Sättigungswert der Harnsäure im Blut bei 37°C ist 7 mg/dl. Wird dieser Wert überschritten, dann wird nadelförmiger Kristall nach und nach ausgeschieden. Gemäß der epidemiologische Studie wird ein oberer Grenzwert gesetzt, der sich vom durchschnittlichen Wert der Harnsäure im Blut der normalen Menschen zuzüglich zweifach der Standardabweichung ergibt. Daraus folgt, dass man von einer relativen Hyperurikämie spricht, wenn der Wert der Serum-Harnsäure vom 7 mg/dl bei einem Mann und vom 6 mg/dl bei einer Frau überschreitet. Wenn der Harnsäurewert höher als 7 mg/dl, dann ist das Auftreten von einer Gicht oder Nierenstein viel wahrscheinlicher.
Die klinischen Symptome der Gicht sind in vier Stufen unterteilt: Asymptomatischen Hyperurikämie (Asymptomatic hyperuricemia), Akuter Gicht-Arthritis (Acute gouty arthritis), Inter-kritischen Gicht (Inter-critical gout), Chronische Tophi-Arthritis, (Chronic tophaceous gout).
Die relativ richtige Methode zum Diagnostizieren der Gicht ist: Bei der akuten Gichtanfall wird Synovialflüssigkeit abgenommen. Wenn die von neutrophilen Phagozytosen gefressenen nadelförmige Uratkristalle (Monosodium urate crystal) unter dem Polarisationsmikroskop negative Doppelbrechung (Negative birefringent) zeigen, dann ist es Gicht. Weitere häufige klinische Manifestationen oder Laborbefund sind die plötzlich aufgetretenen Gelenkschwellungen und Schmerzen im einzelnen Gelenke bei dem Großzeh, der Rückseite des Fußes und dem Knöchel. Für die Patienten, bei denen Wirkung der Colchicin-Behandlung sich aufweist oder die Hyperurikämie haben, können die klinischen Manifestationen nur als diagnostische Referenz für die Gichtdiagnose betrachtet werden.
Bei den Patienten mit primärer gichtischer Nephropathie kann die Ursache nur mangelhaft behandelt werden, so dass sie nicht geheilt werden. Zweck der klinischen Behandlung liegt nur darin: 1. rechtzeitige Kontrolle eines akuten Anfalls von Gicht. 2. die langfristige Behandlung der Hyperurikämie, um die Ablagerung des Harnsäure-Natriumsalzes vorzubeugen, die die Gelenk- und Nierenschäden hervorrufen kann.
Was die Wahl der Medikamenten zur Senkung der Harnsäure angeht, so kann die Medikamente zur Förderung der Harnsäureausscheidung verwendet werden, wenn die Niere sich in normalem Zustand befindet oder nur leicht beschädigt ist und die Harnsäureausscheidung weniger als 600 mg innerhalb 24 Stunden beträgt. Die Medikamente zum Hemmen der Harnsäureproduktion verwendet werden, wenn die Nierenfunktion mittelmäßig eingeschränkt ist (die Reinigungsrat der Kreatinin < 35 ml/min) und die Menge der Urin- und Harnsäureausscheidung in 24 Stunden signifikant erhöht. Die beiden Medikamente können zusammen verwendet werden, wenn deutlich höhere Serum-Harnsäure und größere Menge von Tophi ausgeschieden sind, um progressive Komplikationen der Gicht zu verhindern.
Die oben genannte Medikament Urikosurischen Mittel (Uricosuric agent), das die Urinausscheidung fördert, wirkt hauptsächlich durch die Hemmung der proximalen tubulären Rückresorption der Harnsäure in der Niere, so dass die Ausscheidung der Harnsäure im Urin gefördert wird. Um die Nierenschäden und die Komplikation der Bildung des Nierensteins durch die Ausscheidung der Harnsäure in großer Menge in der Nieren zu verhindern, soll das Medikaments mit kleiner Dosis anfangen und in 7–10 Tagen langsam schrittweise erhöhen, wobei die Salzmenge im Urin beobachtet werden muss. Die Medikamente, die zu dieser Gruppe gehören, umfassen u. a. C Methyl Spezielle (Probenecid) und Benzbromaron.
Das einzige Medikament, das die Produktion der Harnsäure hemmt, ist Xanthinoxidase-Hemmer (Xanthine oxidase inhibitor), (Allopurinol), Seine Struktur ähnelt sich dem Hypoxanthin und kann Xanthinoxidase stärker hemmen, so dass auch die Bildung der Tophi und des Nierensteins hemmen und auch die Auflösung der Tophi fördern. Bei gleichzeitiger Anwendung der Anti-Krebs-Medikamente wie Mercapto Purin (Mercaptopurin) oder Azathioprin kann der Blutspiegel der Anti-Krebs-Medikamente sich erhöhen, hierbei muss die Dosis angepasst oder die klinische Nebenwirkung beobachtet werden.
Wundheilung
Wundheilung ist ein dynamischer Prozess, bei dem viele Zellen interaktiv in mehreren Schritten, einschließlich Zellbewegung, Zellteilung, Zelldifferenzierung, extrazellulären Matrix-Synthese und Gewebeumbaus zusammenwirken. Während des Wundheilungsprozesses der Haut wachsen die Keratinozyten auf Epidermis am Rand der Wunde zu und bewegen sich zur Mitte der Wunde und bilden so die neue Epidermis. Der Prozess der Wundheilung dauert ein paar Tage oder sogar mehrere Wochen.
Die mit der Wundheilung eng zusammenhängenden Wachstumsfaktoren umfassen Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (Fibroblast growth factor 2, FGF2), Platelet abgeleiteter Wachstungsfaktor (platelet derived growth factor, PDGF, Epidermaler Wachstungfaktor (Epidermal growth factor, EGF), Keratinozyten-Wachstumsfaktor (Keratinocyte growth factor, KGF), Transformierende Wachstumgsfaktor a (Transforming growth factor-a, TGF-a), Transformierende Wachstumgsfaktor β (Transforming growth factor-a, TGF-β) und Vascular endothelialer Wachstumgsfaktor (Vascular endothelial growth factor, VEGF). Unter den Wachstumgsfaktoren werden PDGF-, EGF-, TGF-β- und VEGF-Sekretion von den Keratinozyten freigesetzt. PDGF kann Makrophagen (Macrophages) und Fibroblasten (Fibroblasten) (Fresszellen) lock en und die Herstellung von Matrix-Protein (Matrix Protein) fördern; EGF kann in Form der Autokrine (autokrine) eigene Bewegung und Proliferation fördern; TGF-β fördern Fibroblasten (Fibroblasten) Proliferation, Zellmigration und Angiogenese und kann sich in den frühen Phasen der Wundheilung eine große Menge freisetzen. VEGF ist in der Lage, Gefäßpermeabilität, die Ablagerung der vaskulären Regeneration Matrix (Proangiogenic Matrix) zu fördern. Die oben genannten Studien deutet daraufhin, dass die von Keratinozyten freigesetzten Wachstumsfaktoren (Growth factors) eng mit dem Prozess der Wundheilung zusammenhängen.
Auf der anderen Seite gemäß dem „Kompendium der Nationalen Heilkräuter” wirkt der Longankern bei der Behandlung von u. a. Morgenschmerzen, Brandwunde, Verletzungswunde, Blutung, Krätze, Ekzeme. In den alten Zeiten wurde Longankern als Heilmittel für Verletzungen verwendet und hat gute Wirkung bei Blutungsstoppen, Schmerzenstillen und Muskelwachstum. Auf dem „Manuskript der medizinischen Rezepten vom Arzt Huang” steht „Zur Behandlung der Verletzungswunde kann Longankernpulver, das aus gerösteten und gemahlenen Longgankernen gewonnen werden kann, auf der Wunde auftragen werden und die Verletzung kann damit geheilt werden”. In der antiken Literatur steht: „Pulver der Langankerne wurde auf der Messerwunde getragen, wodurch in der Region von Hsi-Ching und im Ba-Li-Kun-Feldlager mehrere Leute geheilt wurden”. Auf „Yin Hong Zhe Chuan Fang” heißt es, dass Longankernpulver, das man durch Rösten und Mahlen der Langankerne gewinnt, zur Behandlung der Blutung durch die Verletzung durch Messer verwendet werden kann, indem das Longankernpulver auf der Wunde aufträgt. Aus den antiken Schriften und medizinische Rezeptsammlung kann festgestellt werden, dass die Langankerne haben Heilwirkung bei Behandlung von Messerverletzung und damit relevanten Krankheiten. Es hat den Effekt zur Förderung der Heilung der Wunde. Die Wirkungsweise und der -mechanismus sind jedoch nicht bekannt.
Die Aufgabe der Erfindung
Der Zweck der Erfindung ist das Verfahren zum Gewinnen des Extrakts aus Longankeren und die Anwendung des Extrakts in den Organismen anzubieten. Die Extratzubereitung bei der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Schritte:

(1) Herstellung einer Extrahierlösung mit bestimmter Konzentration.
(2) Die Extrahierlösung wird auf bestimmter Temperatur erhitzt.
(3) Gehackte Langankerne werden zur Extrahierlösung zugegeben, um die Stoffe in Langankernen zu extrahieren.
(4) Die Extrahierlösung mit dem extrahierten Stoff aus Langankernen wird gefiltert und angereichert.
(5) Der angereicherte Extrakt wird gefroren und getrocknet.
(6) Herstellung der Extrakt aus Longankernen.

Die obengenannte Zubereitungsmethode ist eine bevorzugte Ausführung der vorliegenden Erfindung.
Extrahierlösung ist wässerige oder alkoholische Lösung.
Die alkoholische Lösung ist Ethanol
Die Ethanol-Konzentration beträgt von 20% bis 95%;
Im Schritt (2) wird die Extrahierlösung bis 70X~90°C erhitzt;
Im Schritt (3) ist die Temperatur zum Extrahieren von 70X~90°C.
Im Schritt (3) beträgt die Extrahierzeit von 1–3 Stunden. Der Extrakt aus den Longankernen mit der vorliegenden Methode enthält Corilagin, Ellagsäure und Gallussäure.
Der Extrakt aus den Longankernen mit der vorliegenden Methode haben die folgenden wichtigen Anwendungen:
Der Longankernenextrakt hemmt Entzündung in den Organismen.
Der Longankernenextrakt verringert die Harnsäure in den Organismuen.
Der Longankernenextrakt fördert die Heilung der Wunde bei den Organismen.
Der Longankernenextrakt hemmt die bakterielle Aktivität.
Der Longankernenextrakt, der mit der vorliegenden Methode gewonnen wird, hat die folgenden Vorzüge:
Der Longankernenextrakt, der mit der vorliegenden Methode gewonnen wird, kann in den Organismen verwendet werden, auf Entzündung reagieren und die Entzündung hemmen, Harnsäurebildung reduzieren, die bakteriellen Aktivitäten hemmen. Er kann auch das Wachstum der Keratinozyten der Haut fördern, die Heilung der Wunde beschleunigen, ohne Organschäden zu verursachen und die Belastung der Organe zu erhöhen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein High-Performance-Flüssigkeits-Chromatographie-Analyse-Dia gramm der Standard-Lösung von Gallussäure, Corilagin, Ellagsäure.
2 ist ein High-Performance-Flüssigkeits-Chromatographie-Analyse-Diagramm des vorliegenden Longankernenextrakts.
3 ist ein Diagramm der Brechungslinien aus Tabelle 3.
4 ist ein Diagramm der Brechungslinien aus Tabelle 4.
5 ist ein Diagramm der durchschnittlichen Werte aus der Tabelle 7.
6 ist ein Diagramm der durchschnittlichen Werte aus der Tabelle 8.
7 ist ein Diagramm der durchschnittlichen Werte aus der Tabelle 9.
8 ist ein Diagramm der Brechungslinien aus Tabelle 10.
9 ist ein Diagramm der Brechungslinien aus Tabelle 11.
Wege zur Ausführung der Erfindung
Wege zur Ausführung der vorliegenden Erfindung werden hiermit weiter detaillierter erklärt. Die vorliegende Erfindung kann mit den folgenden Wegen, aber nicht nur darauf eingeschränkt, ausgeführt werden. Die Änderungen mit der vorhandenen Techniken gemacht werden, die inhaltlich jedoch nicht von der vorliegenden Erfindung abweicht, gehört immer noch zu den Schutzansprüche der vorliegenden Erfindung.
Erste Ausführung

(1) Hydrophile Lösungsmittel (z. B. Wasser) oder lipophile Lösung als Extrahierlösung; Bei dieser Ausführung wird Ethanol-Lösung mit einer Konzentration von 20 bis 95% als Extrahierlösung vorbereitet;
(2) Die Extrahierlösung wird auf 70–90°C erhitzt.
(3) Die gehackten Longankernen werden in die Extrahierlösung zugegeben und 1–3 Stunden lang extrahieren lassen, während die Temperatur ständig auf 70–90°C beibehält.
(4) Die extrahierte Lösung wird gefiltert und angereichert.
(5) die gefilterte und angereicherte Lösung wird gefroren und getrocknet.
(6) Herstellung des Extrakts aus Longankernen.

Mit Hilfe der High-Performance Liquid Chromatographie (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) wird die Extrakte aus Longankeren analysiert. Es wird festgestellt, dass der Extrakt aus Longankerenen Gallussäure (Gallic acid), Corilagin und Ellagsäure (Ellagic acid) enthält. Ihre Struktur ist wie folgend: Corilagin:
Gallussäure:
Ellagsäure:

Die Bedingung der Analyse der High-Performance Liquid Chromatographie wird in Tabelle 1 gezeigt: Tabelle 1: Die Bedingung der Analyse der High-Performance Liquid Chromatographie

Ausstattung	Agilent 1100
Chromatographies Rohr	Atlantis®T3 5 μm 4.6 × 10 mm, Waters
Pre-Spalte	Cosmosil 5C18-A-II 4.6 × 10 mm, Nacalai Tesque
Säulen-Temperatur	25°C
Flussrate von	1.0 ml/min
Die Detektionswellenlänge war	UV 270 nm
Injektionsvolumen von	10 μl
Zeit (min)	0	5	15	30	45	60	75	85
0,1% H₃PO₄ (%)	98	97	97	87	86	81	79	0
Acetonitril (Acetonitrile, %)	2	3	3	13	14	19	21	100

Eine Standardlösung, zusammengesetzt wird von Gallussäure, Corilagin und Ellagsäure, wird als Referzenz-Lösung angenommen. Die Analyse mit Hilfe der High-Performance Liquid Chromatographie wird bei der Standardlösung wie in Tabelle 1 festgestellt, dass die Retentionszeit von Gallussäure (42.42 g/ml), Corilagin (52.72 g/ml) und Ellagsäure (22.4 g/ml) jeweils 14.409·43.304·63.489 Minuten beträgt. Die Analyse mit Hilfe der High-Performance Liquid Chromatographie wird bei der Extraktlösung aus Longankernen wie in Tabelle 2 festgestellt, dass die Retentionszeit jeweils 14.461·43.302·63.476 Minuten beträgt. Die Folgerung daraus ist, dass die Hauptstoffe der Standardlösung und der Extraktlösung aus Longankernen identisch sind. Also nämlich: die Extraktlösung aus Longankernen enthält Gallussäure, Corilagin und Ellagsäure.
Um die Heilwirkung der Extrakt aus Longankernen zu zeigen, werden verschiedene in vivo und in vitro-Tests durchgeführt.
I. Entzünunghemmung in vivo
(I) Vorbereitung des Materials:
Longankerne-Extrakt (Extraktion Lösung von 50% Ethanol-Lösung), Longankerne- Extrakt A (Extraktionslösung als reines Wasser) und Longankerne-Extrakt B (Extraktion Lösung von 20% Ethanol-Lösung).
(II) in vivo (Fütterung Test):

1. Als Versuchstier werden 24 männliche SD Ratten (Sprague-dawley rats) genommen, dessen Gewicht ca. 200 g~250 g beträgt. In einem kontrollierten Raum wird die Raumtemperatur auf 23°C und je 12 Stunden hell und dunkel eingestellt. Die Ratten werden mit speziellem Futter genährt und das Trinkwasser wird durch Umkehr-Osmose behandelt.
2. Die Ratten werden nach Zufallsprinzip in neun Gruppen zu je sechs Ratten aufgeteilt. Gefüttert werden:
(1) Die Kontrollgruppen wird nur das durch Umkehr-Osmose behandeltem Trinkwasser gegeben.
(2) Mit Longankernextrakt (0,5 g/Kg, d. h. 0,5 g Longankernextrakt für jedes Kg Rattengewicht). Die Ratten werden nach einer Woche Escherichia coli LPS (Lipopolysaccharide, LPS·2.5 mg/Kg, d. h. 2.5 mg LPS für jedes Kg Rattengewicht) intraperitoneal injiziert. 24 Stunden danach;
(3) eine Woche lang Longankernextrakt (0.5 g/Kg) füttern, und dann LPS (2.5 mg/Kg) intraperitoneal injizieren. 48 Stunden danach;
(4) LPS (2.5 mg/Kg) intraperitoneal injizieren. 24 Stunden danach Longankerne-Extrakt A (0.5 g/Kg) füttern.
(5) LPS (2.5 mg/Kg) intraperitoneal injizieren. 24 Stunden danach Longankerne-Extrakt B (0.5 g/Kg) füttern.
(6) LPS (2.5 mg/Kg) intraperitoneal injizieren. 24 Stunden danach Longankerne-Extrakt (0.5 g/Kg) füttern.
(7) LPS (2.5 mg/Kg) intraperitoneal injizieren. 48 Stunden danach Longankerne-Extrakt (0.5 g/Kg) füttern.
(8) Nur LPS (2.5 mg/Kg) intraperitoneal injizieren. 24 Stunden danach;
(9) Nur Longankerne-Extrakt (0.5 g/Kg) füttern. Nach der Beendigung der Injektion, werden die Ratten für eine Nacht nicht gefüttert. Danach werden sie Blut aus intraperitonealer Arterie unter der Äthernarkose abgenommen.
3. serologische Tests: Mit Hilfe der antikörperbasiertes Nachweisverfahren (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) wird der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF-α) Zellen Interleukin (IL-1 β) untersucht.
4. statistische Methoden: Alle Daten in dieser Untersuchung werden mit Ein-Faktor-Varianzanalyse (One-way Varianzanalyse, ANOVA) gewonnen.
5. Ergebnisse der Untersuchung:

Tabelle 2 zeigt: was IL-I β angeht, können sowohl die gefütterten Longankernenextrakte als auch die intraperitoneal injizierten LPS die entzündungshemmende Reaktion bei SD-Ratten hervorrufen. Tabelle 3 und zeigen: was TNF-ct angeht, können die vorab gefütterte Longankernenextrakte als auch die danach intraperitoneal injizierten LPS und ausschließlich gefütterte Longankernenextrakte die entzündungshemmende Reaktion vorweisen. Dagegen zeigt keine entzündungshemmende Wirkung, wenn die SD Ratten zuerst mit der umgekehrten LPS behandelt und dann mit Longankernenextrakte gefüttert werden. Tabelle 2 Vergleich des in vivo entzündungshemmenden IL-1 β-Wertes
Tabelle 3 Vergleich des in vivo entzündungshemmenden TNF-α-Wertes
II. in vivo und in vitro-Test gegen Gicht
(I) Vorbereitung: Longankernenextrakt (Extrahierlösung ist 50% Ethanol-Lösung).
(II) in vivo Test (Fütterung Test):

1. Als Versuchstier werden 24 männliche SD Ratten (Sprague-dawley rats) genommen, dessen Gewicht ca. 200 g~250 g beträgt. In einem kontrollierten Raum wird die Raumtemperatur auf 23°C und je 12 Stunden hell und dunkel eingestellt. Die Ratten werden mit speziellem Füttern genährt und das Trinkwasser wird durch Umkehr-Osmose behandelt.
2. Die Ratten werden nach Zufallsprinzip in 3 Gruppen zu je 8 Ratten aufgeteilt. Eine Gruppe darunter ist die Vergleichsgruppe, der nur das mit Umkehr-Osmose behandeltem Trinkwasser gegeben wird. Eine Gruppe ist Versuchsgruppe, der 300 mg/jKg Rattengewicht von 6-Hydroxy Purin (Hypoxathine) plus 250 mg/kg Ratte Gewicht von Oxonic Säure (eine Art von Uricase-Hemmer) verabgereicht wird. Eine andere Gruppe ist Longankernen-Testgruppe, der 300 mg/jKg Rattengewicht von 6-Hydroxy Purin (Hypoxathine) plus 250 mg/kg Ratte Gewicht von Oxonic Säure und Longankernen 0.1% (Gewicht%) gefüttert wird. Der Hauptzweck des Oxonic-Säure-Zusatzs ist es, die Bildung einer hodhgradigen Harnsäure in SD-Ratten zu induzieren; Die SD Ratten dürfen beliebig viel Wasser trinken. Während der Abreichung der Medikamente werden die Tiere zweimal am Tag beobachtet und Gewicht einmal am Tag gewogen. Nach dem Versuch werden die Ratten für eine Nacht nicht mehr gefüttert. Blut aus dem Schwanz des SD-Ratten wird unter Äthernarkose für Serum biochemische Untersuchung abgenommen.
(1) Vergleichsgruppe: Umkehrosmose-Wasser gegeben.
(2) Versuchsgruppe: gefüttert mit 300 mg/jKg Rattengewicht von 6-Hydroxy Purin (Hypoxathine) plus 250 mg/kg Ratte Gewicht von Oxonic Säure.
(3) Longankernen-Testgruppe: gefüttert mit 300 mg/jKg Rattengewicht von 6-Hydroxy Purin (Hypoxathine) plus 250 mg/kg Ratte Gewicht von Oxonic Säure und Longankernen 0.1 (Gewicht%).
3. Serum-biochemische Tests: Mit Hilfe von biochemischen automatischen Analysegerät (Ciba-cornint 550) wird die Konzentration der Serum-Harnsäure der SD-Ratten untersucht.
4. Statistische Methoden: Alle Daten in dieser Untersuchung werden mit Ein-Faktor-Varianzanalyse (One-way Varianzanalyse, ANOVA) gewonnen.
5. Ergebnisse der Untersuchung:

Tabelle 4 und zeigen, dass die Longankernenextrakt (Extrahierlösung ist 50% Ethanol-Lösung) hat die Wirkung der Reduzierung von Serum-Harnsäure der SD-Ratten. Der Wirkungsgrad beträgt 32%. Tabelle 4 Vergleich der in vivo entzündungshemmenden Harnsäurekonzentration

Zeit	Harnsäurekonzentration der Vergleichsgrppe	Harnsäurekonzentration der Versuchsgruppe	Harnsäurekonzentration der Longankernen-Testgruppe:
0 Std.	7.3 ± 1.5 mg/dl	8.8 ± 1.2 mg/dl	8.2 ± 1.7 mg/dl
1 Std.	7.6 ± 1.6 mg/dl	40.6 ± 12.1 mg/dl	27.7 ± 7.3 mg/dl

(III) in vitro (Xanthinoxidase Inhibition):

1. eine 50 mmol/L Xanthine wird aus Phosphat-Puffer-Lösung (PBS) zubereitet.
2. Eine 0.1~0.2 unit/ml Xanthinoxidase wird mit Phosphat-Puffer-Lösung (PBS) hergestellt.
3. die Erstellung verschiedener Arten der Longankernenextrakt-Proben:
(1) Herstellung des reinen Wasser, um Longankernen zu extrahieren.
(2) Herstellung der 20% Ethanol-Lösung, um Longankernen zu extrahieren.
(3) Herstellung der 50% Ethanol-Lösung, um Longankernen zu extrahieren.
(4) Herstellung der 95% Ethanol-Lösung, um Longankernen zu extrahieren.
4. eine positive Vergleichgruppe wird gebildet--klinisch verwendetes Medikament Purin-Alkohol (Allopurinol). In der positiven Vergleichgruppe wird Xanthinoxidase zugegeben und 5 Minuten danach noch Xanthin zusetzen.
5. Eine leere Vergleichsgruppe wird bebildet, in der nur Reinwasser zugegeben.
6. In allen Longankernenextrakt-Proben wird Xanthinoxidase zugegeben und 5 Minuten danach noch Xanthin zusetzen.
7. Mit Hilfe des Spektralphotometers mit einer Wellenlänge 290 nm werden die Extinktionsänderungen der verschiedenen Longankernenextrakt-Proben je 20 Sekunden einmal, insgesamt 5 Minuten untersucht. Danach wird die Enzymaktivität mit Instrument berechnet.
8. Aktivität Inhibierungsrate = 1 Aktivität der Versuchsgruppe und der Vergleichsgruppe
9. Die Ergebnisse der Untersuchung

Aus Tabelle 5 kann erkannt werden, dass die verschiedenen Longankernenextrakte die Aktivität der Xanthinoxidase hemmen können. Der Wirkungsgrad beträgt 60%. Tabelle 5 Vergleich der Ergebnisse in vitro entzündungshemmenden Xanthinoxidase

Probe	Xanthine	Mit Reinwasser extrahierte Longankernenextrakt	Mit 20% EthanolLösung extrahierte Longankernenextrakt	Mit 50% EthanolLösung extrahierte Longankernenextrakt	Mit 95% EthanolLösung extrahierte Longankernenextrakt
Konzentration	5	50	50	50	50
inhibitionssgrad	83	12	36	60	44

III. Test der Anti-Gicht-Toxizität:
(I) Vorbereitung: Longankernenextrakt
(II) Test der akuten Toxizität:
Die SD-Ratten werden in 2 Gruppen zu je 8–10 Ratten geteilt. Vor dem Test werden die Ratten eine Nacht außer Wasser nicht gefüttert. Nachdem sie mit Longankernenextrakt (450 mg/ml) verabgereicht werden, werden die Vergiftungszustand und die Gewichtsänderung sowie Todsfall 14 Tage lang registriert. Die Hälfte der letalen Dosis (LD₅₀) und 95% glaubwürdigsgrenzen werden mit Berechnungsmethode von Litctchfield und Wilcoxon berechnet.
(III) Test der akuten Toxizität durch 28-tätige Fütterung:
Die SD-Ratten werden in 2 Gruppen zu je10 Ratten geteilt. Sie werden jeweils mit den Longankernenextrakten von 1 g/kg·3g/kg und VE-Wasser (1 ml/100 g) 28 Tage lang gefüttert. Während der Zeit der Abreicherung werden die Ratten täglich 2 Mal beobachtet und das Gewicht einmal pro Woche gewogen. Nach der Beendigung der Abreichung werden die Ratten eine Nacht nüchtern lassen. Blut werden aus aus intraperitonealer Arterie unter Äthernarkose abgenommen und zur Serum-biochemischen Untersuchung gegeben.
(IV) Serum-biochemische Tests:
Mit einem biochemischen automatischen Analysegerät (Ciba-COMINT 550) werden Gras-Glutamat-Säure-Transaminase (GOT), Glutaminsäure C-Aminotransferase (GPT) und Albumin sowie Globulin und Kreatinin untersucht.
(V) Statistische Methoden:
Alle Daten in dieser Untersuchung werden mit Ein-Faktor-Varianzanalyse (One-way Varianzanalyse, ANOVA) gewannen und unter Dunnett-Test mit einem P-Wert kleiner als 0.01 als signifikanter Unterschied untersucht.
(VI) Die Ergebnisse der Untersuchung
1. Die akute Toxizität:
Der Hauptzweck der Prüfung der akuten Toxizität ist, die Dosis herauszufinden, bei der die Hälfte der Versuchstiere mit einmaliger Einnahme des Medikaments zum Tod führen. Bei der nüchternen SD-Ratte kann 1.0 ml Dosis mit einer Konzentration von 450 mg/ml für je 100 g des Rattengewichtes verabgereicht werden. Beim Test der akuten Toxizität wird eine Dosis von 15 g/kg verabgereicht, sind alle SD-Ratten nicht tot, dann wird der Test eingestellt.
Bei nur 10 Ratten wird jedes Mal mit einer Dosis mit 15 g/kg von Longankernenextrakten verabgereicht. Nach 14 tägigen Beobachtungen gibt es keine tote Ratte. Das heißt, dass die Hälfte der letalen Dosis (LD₅₀) größer als 15 g/kg ist. Nach 14 tägiger Abreichung der Longankernenextrakten gibt es keinen Gewichtunterschied im Vergleichen mit der Kontrollgruppe.
2. Test mit 28 tägiger Fütterung mit der Toxizität:
Eine fünftel-Dosis der Hälfte der letalen Dosis (LD50), d. h. eine höchste Dosis von 3 g/kg und 1 g/kg genommen. (1) jede Gruppe hat 8~10 SD Ratten. 28 Tage wird Longankernenextrakt mit 3 g/kg und 1 g/kg den Ratten kontinuierlich gefüttert, wobei keine Ratte gestorben ist. Im Vergleichen mit der Kontrollgruppe gibt es keine deutliche Veränderung beim Gewicht.
(2) Serum-biochemische Tests:
In Tabelle 6 zeigt, dass der Serum-biochemische Parameter der Ratten, den 28 Tage lang dauernd Longankernenextrakt mit Dosis von 3 g/kg und 1 g/kg verabgereicht wird, keinen Unterschied im Vergleichen mit der Vergleichsgruppe vorweist.
(3) Gewicht der wichtigen Organe
Das Gewicht der Leber und Nieren der SD-Ratten, den 28 Tage lang dauernd Longankernenextrakt mit Dosis von 3 g/kg und 1 g/kg verabgereicht wird, keinen Unterschied im Vergleichen mit der Vergleichsgruppe vorweist. Das heißt, dass Longankernenextrakt keine Wirkung auf das Gewicht der wichtigsten Organe hat.
(4) Pathologische Untersuchung:
Herz, Leber, Nieren, Milz und Nebenniere, Samenblase und Hoden der SD-Ratten, den 8 Tage lang dauernd Longankernenextrakt mit Dosis von 3 g/kg und 1 g/kg verabgereicht wird, haben nichts verändert.
3. Die Ergebnisse der Untersuchung

Der Longankernenextrakt schadet die in vivo Organe und belastet sie nicht zusätzlich. Tabelle 6 Testergebnisse der kontinuierlichen Verabreichung der Toxizität

	Kontrollgruppe	14 Tage	28 Tage	28 Tage
Anzahl der SD-Ratten	8	10	10	10
Vorheriges Gewicht	19.2 ± 1.8	19.6 ± 1.1	19.1 ± 1.5	19.5 ± 0.8
Nachheriges Gewicht	19.2 ± 1.8	19.2 ± 1.8	19.2 ± 1.8	25.9 ± 1.07
Oraldosis	0	15 g/kg	1 g/kg	3 g/kg
Kreatinin	0.395 ± 0.15	0.435 ± 0.07	0.51 ± 0.084	29.9 ± 14.8
GOT	30.2 ± 15.1	32.88 ± 15.6	38.9 ± 6.2	29.9 ± 14.8
GPT	8.27 ± 5.54	14.95 ± 10.1	7.8 ± 3.8	9.44 ± 3.29
Albumin	2.8 ± 1.37	2.75 ± 1.08	2.63 ± 1.64	2.57 ± 0.8
Globulin	2.5 ± 1.12	2.55 ± 1.5	3.3 ± 1.79	2.84 ± 0.68

IV. Antibakterieller Test:
(I) Vorbereitung des Materials:
Mit dem Produkt des Longankernenextrakts, bezeichnet als „P-Bohnengel”, von einer Konzentration von 2.5 mg/ml, das heißt in 1 ml P-Bohnengel 2,5 mg Longankernenextrakt enthält, und Umkehrosmose-Wasser wird eine isotonische Phosphat-Lösung (isotonische Lösung ist eine Lösung, die den gleichen osmotischen Druck Druck wie das menschliche Blut hat.) in 2facher Menge. Die isotonische Phosphat-Lösung wird mit sterilen Mini Pore gefiltert, um sterile ”P Bohnen Gel” der isotonischen Phosphat-Lösung zu gewinnen.
(II) Die Teststämme:
Escherichia coli und Staphylococcus aureus

1. Escherichia coli und Staphylococcus aureus sowie andere Baterien werden jeweils mit flüssigem Medium LB Brühe, bei 37°C für 16 Stunden hintereinander gezüchtet. Die gezüchtete Kulturbrühe wird mit isotonischer Phosphat-Lösung (1 × PBS) in doppelter Menge 3mal gewaschen. Nach jedem Waschgang wird sie mit 3000 rpm in Zentrifugen 10 Minuten lang geschleudert, um den Überstand zu entfernen. Die Extinktion (OD-Value) der gereinigten Kulturbrühe wird mit einer Absorption-Spektroskopie getestet. Schließlich wird sie mit einfacher isotonischer Phosphat-Lösung verdünnt, um eine Kulturbrühe mit einer OD = 0.3 für Untersuchung herzustellen.
2. In die zubereitete einfache isotonische Phosphat-Lösung (1 × PBS) werden jeweils die 10-fach kontinuierlich verdünnte Bakterienlösung von Escherichia coli und Staphylococcus aureus zugegeben und dann unter der Temperatur von 37°C 1 Stunde lang andauernd behandelt.
3. Aus der 1 Stund lang behandelten Kulturbrühe werden jeweils 5, 10, 20, 50, 100 μl herausgenommen und auf dem LB-Medium aufgebracht. Nach 18 stündig bei 37°C andauernder Züchtung bei 37°C wird die Anzahl der jeweiligen Bakterien pro Medium-Platte gezählt. Die Kulturbrühe, die in isotonischer Phosphat-Lösung mit P-Bohnengel behandelte wird, ist die Versuchsgruppe und die in isotonischer Phosphat-Lösung mit dem Umkehrosmose Wasser aufgebreitet wird, ist die Vergleichsgruppe.
4. Die oben genannten Schritte wurden dreimal gemacht und die endgültigen Ergebnisse berechnet.
5. Die Ergebnisse der Untersuchung

Tabelle 7 und zeigen, dass die Anzahl von Escherichia coli und Staphylococcus aureus in der Versuchsgruppe ist deutlich gesunken als die in der Vergleichsgruppe. Das beweist, dass das P-Bohnengel, die mit dem Longankernenextrakt als wesentlicher Inhaltstoff hergestellt wird, die Hemmwirkung gegen Escherichia coli und Staphylococcus aureus hat und kann zum Hemmen bei der Bildung der Akne verwendet werden. Tabelle 7 Die Ergebnisse des antibakteriellen Tests (Escherichia coli und Staphylococcus aureus)

	Escherichiacoli Kolonie/Platte		Staphylococcus aureus Kolonie/Platte
Testreihenf	Vergleichs	Versuchsg	Vergleichs	Versuchsg
olge	gruppe	ruppe	gruppe	ruppe
1. Mal	232	152	218	149
2. Mal	121	82	239	134
3. Mal	169	94	153	99
Durchschnit ± Toleranz	174 ± 38	109 ± 28	203 ± 45	127 ± 26

(III) Die Teststämme: Akne-Bakterien (Propionibacterium acne):

1. Akne-Bakterien werden mit der Hilfe vom flüssigen Medium anBAP Brühe bei 37°C für 16 Stunden hintereinander gezüchtet. Die gezüchtete Kulturbrühe wird mit isotonischer Phosphat-Lösung (1 × PBS) in doppelter Menge 3mal gewaschen. Nach jedem Waschgang wird sie mit 3000 rpm in Zentrifugen 10 Minuten lang geschleudert, um den Überstand zu entfernen. Die Extinktion (OD-Value) der gereinigten Kulturbrühe wird mit einer Absorption-Spektroskopie getestet. Schließlich wird sie mit einfacher isotonischer Phosphat-Lösung verdünnt, um eine Kulturbrühe mit einer OD = 0.3 für Untersuchung herzustellen.
2. In die zubereitete einfache isotonische Phosphat-Lösung (1 × PBS) werden jeweils die 10-fach kontinuierlich verdünnte Bakterienlösung von Akne-Bakterien zugegeben und dann unter der Temperatur von 37°C 1 Stunde lang andauernd behandelt.
3. Aus der 1 Stund lang behandelten Kulturbrühe werden jeweils 5, 10, 20, 50, 100 μl herausgenommen und auf dem LB-Medium aufgebracht. Nach 48 ständig bei 30°C andauernder Züchtung wird die Anzahl der Bakterien pro Medium-Platte gezählt. Die Kulturbrühe, die in isotonischer Phosphat-Lösung mit P-Bohnengel behandelt wird, ist die Versuchsgruppe und die in isotonischer Phosphat-Lösung mit dem Umkehrosmose Wasser aufgebreitet wird, ist die Vergleichsgruppe.
4. Die oben genannten Schritte wurden dreimal gemacht und die endgültigen Ergebnisse berechnet.
5. Die Ergebnisse der Untersuchung

Tabelle 8 und zeigen, dass die Anzahl von Propionibacterium acne in der Versuchsgruppe ist deutlich gesunken als die in der Vergleichsgruppe. Das beweist, dass das P-Bohnengel, die mit dem Longankernenextrakt als wesentlicher Inhaltstoff hergestellt wird, die Hemmwirkung gegen Propionibacterium acne hat und kann zum Hemmen bei der Bildung der Akne verwendet werden. Tabelle 8. antibakterielle (Akne-Bakterien) Testergebnisse

Akne-Bakterien Kolonie/Platte

Testreihenfolge Vergleichsgruppe Versuchsgruppe

1. Mal 76 44

2. Mal 47 19

3. Mal 65 22

Durchschnittswert ± Toleranz 63 ± 15 28 ± 14
(IV) Teststämme: Trichophyton rubrum (Trichophyton rubrum):

1. Trichophyton rubrum wird mit der Hilfe vom IMA-Platte (Inhibit Form Agar)-Medium bei 30°C für 96 Stunden hintereinander gezüchtet. Die gezüchtete Kulturbrühe wird mit isotonischer Phosphat-Lösung (1 × PBS) in doppelter Menge 3mal gewaschen. Nach jedem Waschgang wird sie mit 3000 rpm in Zentrifugen 10 Minuten lang geschleudert, um den Überstand zu entfernen. Die Extinktion (CD-Value) der gereinigten Kulturbrühe wird mit einer Absorption-Spektroskopie getestet. Schließlich wird sie mit einfacher isotonischer Phosphat-Lösung verdünnt, um eine Kulturbrühe mit einer OD 0.1 für Untersuchung herzustellen.
2. In die zubereitete einfache isotonische Phosphat-Lösung (1 × PBS) wird die 10-fach kontinuierlich verdünnte Bakterienlösung von Trichophyton rubrum zugegeben und dann unter der Temperatur von 30°C 1 Stunde lang andauernd behandelt.
3. Aus der 1 Stund lang behandelten Kulturbrühe werden jeweils 5, 10, 20, 50, 100 μl herausgenommen und auf dem LB-Medium aufgebracht. Nach 96 ständig bei 130°C andauernder Züchtung wird die Anzahl der Bakterien pro Medium-Platte gezählt. Die Kulturbrühe, die in isotonischer Phosphat-Lösung mit P-Bohnengel behandelt wird, ist die Versuchsgruppe und die in isotonischer Phosphat-Lösung mit dem Umkehrosmose Wasser aufgebreitet wird, ist die Vergleichsgruppe.
4. Die oben genannten Schritte wurden dreimal gemacht und die endgültigen Ergebnisse berechnet.
5. Die Ergebnisse der Untersuchung

Tabelle 9 und zeigen, dass die Anzahl von Trichophyton rubrum in der Versuchsgruppe ist deutlich gesunken (30%) als die in der Vergleichsgruppe. Das beweist, dass das P-Bohnengel, die mit dem Longankernenextrakt als wesentlicher Inhaltstoff hergestellt wird, die Hemmwirkung gegen Propionibacterium acne hat und kann zum Hemmen bei der Bildung der Fußpilzen verwendet werden. Tabelle 9. die antibakterielle (Trichophyton rubrum) Testergebnisse

Trichophyton rubrum i Kolonie/Platte

Testreihenfolge Vergleichsgruppe Versuchsgruppe

1. Mal 176 128

2. Mal 136 93

3. Mal 182 133

Durchschnittswert ± Toleranz 165 ± 25 118 ± 22
V. Test der Förderung des Heilungsmechanismus der Wunde

(I) Materialvorbereitung
1. 5 g des Longankernenextraktes wird in 250 ml Wasser gelöst und dann mit Filterpapier Nr. 2 gefiltert. Danach wird die Lösung noch mit Membranfilter von 0,45 μm, 0,22 μm gefiltert.
2. Als Zellkulturmedien für epidermale Keratinozyten wird Lösung von jeweils 0%, 0.25%, 2.5%, 5.0% und 10.0% (Gewicht%) mit Longankernenextrakt vorbereitet.
3. Humane Keratinozyten (Human epidermal keratinocytes; HEKA-C005-5C)
(II) Zellkultur: IX 104 Zellen/ml von humanen Keratinozyten (HEKA-C005-5C) wird ins Zellkulturmedum für epidermale Keratinozyten (Cascade biologies, USA) zugegeben, in dem Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KC supplements) und Penicillin-Streptomycin hinzugefügt werden, und bei 37°C in einem mit 5% CO2 ausgefüllten Kulturinkubator gezüchtet. Diese Charge von Zellen ist die erste Generation. An jeden zweiten Tag wird das Medium ausgewechselt, bis die Zellen der ersten Generation 80% vom Inkubator ausgefüllt ist und dann werden Zellen der weiteren Generation gezüchtet. Weitere 0,25%-ge Trypsin-Verdau (Trypsin-EDTA-Lösung, die 0,25% Trypsin und 0,02% EDTA enthält) wird zugefügt. Nachdem es 5 Minuten lang bei 37°C zusammengewirkt hat, werden die Aussetzung der Keratinozyten im 10%-gen Überstand gewaschen und neutralisiert. Danach wird sie in einer Zentrifuge mit 1500 rpm 10 Minuten lang schleudern, um den Überstand zu entfernen. Mit Zellenkultur-Medium werden der Überstand mit 1:3 verdünnt und dann weiter in einem mit 5% CO2 ausgefüllten Kulturinkubator weiter züchten. Die Zellen der dritten Generation werden zum Test verwendet.
(III) Test der Fähigkeit der Zell-Proliferation: gemacht wird mit der Kristallviolett-(Kristallviolett)Färbemethode. Die humanen Keratinozyten (HEKA-C005-5C) werden in 24, 48, 72 Stunden gezüchtet und danach werden die Ist-Zustand des Zellenwachstums mit inversem Mikroskop beobachtet und dann mit 200 μl Überstand zwei mals gewaschen. Die Zellen werden mit der Zellenfixierungslösung für 20 Minuten fixiert. Weiter werden sie nochmal mit 200 μl PB8T zweimal gewschen und dann mit mit 100 μl Kristallviolett (Kristallviolett) Färbelösung bei Raumtemperatur für 30 Minuten färben, dann mit 200 μl Überstand 3mal waschen. Die Zellen werden dann mit 1%-gem SDS gelöst und dann in der Raumtemperatur für 1 Stunde geschüttelt und dann wird der Kristallviolett-Farbstoff aus den Zellen gelöst und der OD-Wert bei Wellenlänge von 595 nm überprüft, wobei der OD-Wert mit der Referenz-Wellenlänge von 650 nm korrigiert wird. Bei der Kontrollgruppe ohne Zusatz des Longankernenextrakts wird der Förderungsrat des Wachstums ermittelt.
(IV) Mit ELISA wird die freigegebene Menge von humanen Keratinozyten-Wachstumsfaktor (growth factors) ermittelt: 1. Der Überstand wird nach der Stimulierung der humanen Keratinozyten gesammelt und dann wird die Wachstumsfaktoren mit Commercial kits im Kulturmedium gemessen.
(2) Eine Mikrotiterplatten (Mikrotiterplatte) mit den 96-well-Platten wird genommen. Mit Rinderserumalbumin (Bovine Serum Albumin) werden die noch nicht verbundenen Stellen gehemmt und dann mit PBS-Tween gewaschen und danach wird der stimmulierten 100 μl Überstand zugesetzt und bei 37°C für 2 Stunden zusammenwirken. Danach noch nochmal mit PBS-Tween waschen und dann Kaninchen-Anti-Wachstumsfaktor (Rabbit-anti-growth factor Ab-H P Chemicon, Temecula, CA) zugeben. Nochmals bei 37°C für 2 Stunden zusammenwirken lassen. Nachdem sie gewaschen wird. Kolorimetrischer Substrat (Untergrund, mit o-Phenylendiamin) wird zugefügt. Nachdem die Farbe sich erscheinen, dann wird 50 μl 2NH₂SO₄ zugegeben, um die Reaktion zu beenden. Der OD-Wert wird bei der Wellenlänge vom 450 nm gemessen, und somit wird auch die Konzentration des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) in Wachstumsfaktor gemessen.
(V) Die Ergebnisse der Untersuchung
1. Die Tabelle 10 und zeigen, dass die Ergenisse der Bestimmung der proliferativen Kapazität mit Kristallviolett-Färbungsmethode in Einklang mit den Ergebnissen unter dem Mikroskop stehen. Es zeigt, dass die Förderung der Keratinozyten-Wachstumsfaktor der Gruppen mit 2.5%, 5.0% und 10% jeweils 1.25, 1.26 und 1.50 fach im Vergleichen mit der Kontrollgruppe zeigt. Darunter hat nur die Gruppe mit 10% signifikante Bedeutung bezüglich der Statistik (P < 0,05). Das bedeutet: mit nur 10% von Longankernenextrakt kann das Wachstum der humanen Keratinozyten effektiv zu fördern.
2. Tabelle 11 und zeigen die Ergebnisse, die durch enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ermittelt werden. Wenn in den Gruppen mit der Besichtung von Kollagen I (Collagen I, CI) und Fibronektin (Fibronectin, FN) 5%- und 10%-ger Longankernenextrakt zugesetzt werden, dann steigt der überstand des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) erheblich mit der erhöhten Dosis (p < 0,05). Das bedeutet: der Longankernenextrakt wirkt bei beim Prozess der Wundheilung den Mechanismus der Angiogenese und die Wundhleilung selbst fördernd.

Tabelle 10 Ergebnisse der Messung von proliferative Kapazität mit der Methode von Kristallviolettfärbung

Dosis (v/v%) Waschstumsrat

0 1 ± 0.060

1.25 0.98 ± 0.075394

2.5 1.26 ± 0.059782

5 1.27 ± 0.090245

10 1.50 ± 0.119184*

Tabelle 11 Die Messungsergebnisse mit der Methode von der enzyme-linked immunosorbent assay

Dosis (v/v ) CI (pg/ml) CVI (pg/ml) FN (pg/ml)

0 144.8 ± 14.61 150.1 ± 33.47 53.5 ± 8.96

5 84.9 ± 7.54 73.6 ± 23.57 80.9 ± 11.31

10 269.8 ± 36.77* 171.1 ± 3.77 141.1 ± 1.89*
Es ist durch oben beschrieben in vivo- und in vitro- sowie Toxizität-Test gut zu erkennen, dass der von der vorliegende Erfindung hervorgebrachte Longankernenextrakt ruhig verwendet werden kann. Er reagiert hemmende Reaktion auf Entzündung; er reduziert die Bildung der Harnsäue; er hemmt die bakterillen Aktivität. Er fördert auch noch das Wachstum von Haut-Keratinozyten, erhöht die Geschwindigkeit der Wundheilung, während der Longankernenextrakt die inneren Organe des Lebwesens nicht schaden und auch zu keiner zusätzlichen Belastung fürht.

Claims

Das charakteristische Merkmal der Zubereitungsmethode des Longankernenextrakts ist dadurch gekennzeichnet, dass die Methode die folgenden Schritte enthält: (1) Herstellung einer Extrahierlösung mit bestimmter Konzentration. (2) Die Extrahierlösung wird auf bestimmter Temperatur erhitzt. (3) Gehackte Longankerne werden zur Extrahierlösung zugegeben, um die Stoffe in Langankernen zu extrahieren. (4) Die Extrahierlösung mit dem extrahierten Stoff aus Langankernen wird gefiltert und angereichert. (5) Der angereicherte Extrakt wird gefroren und getrocknet. (6) Herstellung der Extrakt aus Longankernen.
Das charakteristische Merkmal der Zubereitungsmethode des Longankernenextrakts nach dem Anspruch 1 ist dadurch gekennzeichnet, dass die Extrahierlösung eine hydrophileoder lipophile Lösung ist.
Das charakteristische Merkmal der Zubereitungsmethode des Longankernenextrakts nach dem Anspruch 2 ist dadurch gekennzeichnet, dass die lipophile Lösung Ethanol ist.
Das charakteristische Merkmal der Zubereitungsmethode des Longankernenextrakts nach dem Anspruch 3 ist dadurch gekennzeichnet, dass die Ethanol-Konzentration von 20% bis 95% beträgt;
Das charakteristische Merkmal der Zubereitungsmethode des Longankernenextrakts nach dem Anspruch 1 ist dadurch gekennzeichnet, dass die Extrahierlösung im Schritt (2) bis 70X~90°C erhitzt wird.
Das charakteristische Merkmal der Zubereitungsmethode des Longankernenextrakts nach dem Anspruch 1 ist dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur zum Extrahieren im Schritt (3) von 70X~90°C ist.
Das charakteristische Merkmal der Zubereitungsmethode des Longankernenextrakts nach dem Anspruch 1 ist dadurch gekennzeichnet, dass die Extrahierzeit im Schritt (3) von 1–3 Stunden beträgt.
Der nach einer beliebigen der von Anspruch 1–7 erklärten Methode hergestellten Longankernenextrakts enthält den Inhaltstoff Corilagin, Ellagsäure und Gallussäure.
Der Longankernenextrakt nach dem Anspruch 8 wird für die Hemmung der Entzündung des Lebwesens verwendet.
Der Longankernenextrakt nach dem Anspruch 8 wird für die Reduzierung der Harnsäurebildung des Lebwesens verwendet.
Der Longankernenextrakt nach dem Anspruch 8 wird für die Förderung der Wundheilung des Lebwesens verwendet. 12. Der Longankernenextrakt nach dem Anspruch 8 wird für die Hemmung der bakteriellen Aktivität verwendet.