TWI564016B - 龍眼籽萃取物的製備方法及其應用 - Google Patents

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龍眼籽萃取物的製備方法及其應用

本發明係關於一種龍眼籽萃取物的製備方法及其應用，所得之龍眼籽萃取物應用於生物體，可具有抗發炎、降低血液中尿酸的濃度、促進皮膚角質細胞的生長、增強傷口癒合機轉及抵制細菌活性等多種功效。

一、發炎(Inflammation)：

發炎在藥物治療上是一種不可忽視的現象，對人體而言，它是生成疾病前的警告訊息。當人體組織受傷時，不論是由細菌、外傷、化學物品還是其他原因導致的，受傷組織附近的巨噬細胞(Macrophage)會被活化而進行吞噬外來物質的任務，同時也會釋放一些因數來啟動更深一層的防禦反應；倘若發炎組織持續受外來物質刺激，其防禦機轉可達數月甚至數年，故處於發炎狀態時，所釋放的因數含量往往較多。經研究證實：所述因數包含有：一氧化氮(Nitric oxide,NO)、腫瘤壞死因數(Tumor necrosis factor,TNF)、細胞界白素(Interleukin,IL)、顆粒白血球群落刺激因數(Granulocyte colony stimulating factor,G-CSF)、單核球群落刺激因數(Monocyte colony stimulating factor,M-CSF)、顆粒白血球及單核球群落刺激因數(Granulocyte-monocyte colony stimulating factor,GM-CSF)，學者將由單核細胞與巨噬細胞產生的TNF命名為TNF-α，將T淋巴細胞產生的淋巴毒素(Lymphotoxin,LT)命名為TNF-β來加以區別。

脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)是內毒素的主要成份，經由動物實驗證明：LPS能夠延緩胃部排空，此作用與LPS誘導下前炎細胞因數及一氧化氮的升高有關。機體受到LPS的刺激後，會觸發單核吞噬細胞系統合成TNF-α、IL-1β、IL-6等多種細胞因數，參與機體防禦反應和修復。TNF-α、IL-1β、IL-6這三種細胞因數的合成是有序的級聯，即LPS誘導TNF-α的合成、TNF-α誘導IL-1β的合成、而IL-1β又誘導IL-6的合成。但過量的細胞因數也會對機體產生不良作用，例如過量的TNF-α會引起多種臟器功能衰竭、彌漫性血管內凝血及中毒性休克，甚至引起死亡，而應用TNF抗體的動物則能有效地阻止致死性內毒素休克的發生。

現今醫藥界所使用的抗發炎藥物種類繁多，例如抗生素(Antibiotics)、非類固醇抗發炎藥(Non-steroidal anti-inflammation drugs；NSAIDs)、抗組織氨藥(Anti-histamine drugs)等等，雖具有相當良好的消炎作用，卻有抗藥性及損傷腸胃等副作用。

二、痛風：

痛風是嘌呤代謝異常或尿酸排泄減少所引起的一種疾病，其臨床特點為高尿酸血症(Hyperuricemia)、反復發作的急性單一關節炎(Recurrent acute monoarthritis)、尿酸鈉鹽形成痛風石(Tophi)沉積、慢性痛風石關節炎等，若未經適當治療，通常最終會發展為痛風性腎病(Gouty nephropathy)。本病主要分為原發性和繼發性兩大類，原發性痛風患者中有近1%患者為酶缺陷所致，而大多數病因不明，臨床以痛風性關節炎為主要表現，且常伴有高血脂病、高血壓病、糖尿病、動脈硬化及冠心病等；繼發性痛風常由腎臟病、血液病及藥物等原因引起，痛風為其併發症。

高尿酸血症是痛風最重要的生化基礎，但並不是痛風的同義詞，研究指出：約有5~18.8%的高尿酸血症患者最終會發展為痛風， 但痛風患者在其病程中的某一階段必將有高尿酸血症的存在。

實驗室可利用尿酸酶法(Uricase differential spectrophotometric method)精確測定血尿酸值。高尿酸血症可分為絕對性和相對性兩大類。當血中尿酸濃度超過可溶性的上限時，稱為絕對性高尿酸血症，在37℃時血中尿酸飽和值是7mg/dl，超過這個飽和點，逐漸有針狀晶體析出。一般流行病學研究則以正常人血尿酸平均值加上二個標準差為上限，認為男性血中的尿酸值超過7mg/dl，女性超過6mg/dl時，稱為相對性高尿酸症。若血尿酸值超過7mg/dl，則痛風或腎結石的發生率將會增加。

痛風的臨床表現分為四個階段：無症狀高尿酸血症(Asymptomatic hyperuricemia)、急性痛風關節炎(Acute gouty arthritis)、間歇期(Inter-critical gout)、慢性痛風石關節炎(Chronic tophaceous gout)。

診斷痛風較正確的方法為：在急性痛風關節炎發作時抽取關節液，如發現有被嗜中性白血球吞噬的針狀尿酸鹽結晶(Monosodium urate crystal)，在偏光顯微鏡下呈現負性雙折光(Negative birefringent)，即為痛風。其他常見的臨床表徵或實驗室檢查：突然發作第一大腳趾、足背、踝等單一關節紅腫劇痛、秋水仙鹼治療有特效者或高尿酸血症者，僅可作為診斷痛風的參考。

由於原發性痛風缺乏病因治療，因此不能根治。臨床治療的目的在於：1、及時控制痛風性關節炎的急性發作；2、長期治療高尿酸血症，以預防尿酸鈉鹽沉積造成的關節破壞及腎臟損害。

至於降尿酸藥物的選擇：在腎功能正常或輕度損害，24小時尿酸排出量低於600mg時，可使用促進尿酸排泄藥；在腎功能為中等損害(肌酐廓清率<35ml/分鐘)或24小時尿液尿酸明顯升高時，應使用抑制尿酸生成物。血尿酸明顯升高及痛風石大量沉積時，可合用以上兩 種藥物，以防止漸進性痛風性併發症。

前述的促進尿酸排泄藥(Uricosuric agent)主要通過抑制近端腎小管對尿酸的重吸收而促進尿酸排泄。為防止尿酸在腎臟大量排出時引起腎臟損害及腎結石的副作用，均應從小劑量開始，於7~10天內逐漸加量，並考慮鹹化尿液。此類藥品有丙磺殊(Probenecid)、苯溴馬隆(Benzbromarone)等。

前述的抑制尿酸生成藥(Xanthine oxidase inhibitor)，僅有別嘌呤醇(Allopurinol)，其結構類似次黃嘌呤(hypoxanthine)，有較強的抑制黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)的作用，可抑制痛風石和腎結石的形成，並促進痛風石的溶解。同時使用抗癌藥如巰嘌呤(Mercaptopurine)或硫唑嘌呤(Azathioprine)時，會提高抗癌藥的血中濃度，此時需酌量或留心臨床副作用。

三、傷口癒合(Wound healing)：

傷口癒合是一種動態的(Dynamic)、許多細胞交互作用(lnteractive)且為多重步驟的(Multiple steps)過程，包括細胞移動、細胞增生、細胞分化、細胞外基質的合成與組織再造(Tissue remodeling)等。這個過程與傷口處表皮的再生以及皮下結締組織的修復有關。在皮膚傷口癒合的過程中，傷口兩邊表皮邊緣的角質細胞會增生，並且向傷口中間移動而形成新的表皮層，這些過程需幾天甚至數星期才能完成。

與傷口癒合有密切關係的生長因數(Growth factors)，包括有成纖維細胞生長因數2(Fibroblast growth factor 2，FGF2)、血小板衍化生長因數(Platelet-derive growth factor，PDGF)、表皮生長因數(Epidermal growth factor，EGF)、角質細胞生長因數(Keratinocyte growth factor，KGF)、轉化生長因數-α(Transforming growth factor-α，TGF-α)、轉化生長因數-β(Transforming growth factor-β，TGF-β) 以及血管內皮生長因數(Vascular endothelial growth factor，VEGF)。這些生長因數(Growth factors)中，PDGF、EGF、TGF-β與VEGF由角質細胞分泌。其中，PDGF能夠吸引巨噬細胞(Macrophages)與成纖維細胞(Fibroblasts)，並促進基質蛋白(Matrix protein)的製造；EGF能夠以自分泌(Autocrine)的形式促進自身的移動與增生；TGF-β能夠促進成纖維細胞(Fibroblasts)的增生、細胞移動及血管新生，而且在傷口癒合的初期就會大量釋出；VEGF則能夠促進血管通透性、促血管再生基質(Proangiogenic matrix)的沉積及血管新生，並且能夠刺激單核細胞(Monocyte)的移動。由以上研究結果顯示：這些角質細胞所釋放的生長因數(Growth factors)均與傷口癒合過程密切相關。

另一方面，根據《全國中草藥彙編》記載：龍眼籽可用於治療胃痛、燒燙傷、刀傷出血、疳氣痛、外傷出血、疥癬、濕瘡等。古人將龍眼籽用於治療外傷，有良好的止血、定痛、生肌之效。《黃氏醫抄方》記載：「治刀斧傷，桂圓核不拘多少，用火燒枯存性，研末，摻患處即愈」。古文獻記載：「龍眼籽末，敷金刀傷，昔在西秦及巴理坤軍營救愈多人」。《殷紅趾傳方》亦雲：「治刀傷出血，以龍眼籽炒搗細磨，敷之」。由以上古書及藥典的記載可以知道：龍眼籽對皮膚刀傷及相關疾病具有治療效果，對促進傷口的癒合有效果，但是其作用機轉並不清楚。

本案發明人從事相關產業的研究與發展數載，據由前述試驗報告得知悉，治療痛風最重要地即是抑制體內的xanthine oxidase活性，從而減少尿酸生成，同時阻止或減低尿酸鹽的沉著；據此，本案發明人積極尋求解決之道，在經過長期努力之研究與測試之後，終於完成本發明。

緣此，本發明之主要目的，在於提供一種龍眼籽萃取物的製備 方法及其在生物體中的應用。

依據上述之目的，本發明首先提供一種龍眼籽萃取物的製備方法，包含下列步驟：一、配製特定濃度的萃取溶液；該萃取溶液可為水溶液或濃度為20%~95%的乙醇溶液；二、將萃取溶液溫度加熱至70℃~90℃；三、於萃取溶液中放入打碎的龍眼籽顆粒，進行萃取，萃取溫度為70℃~90℃，萃取時間為1~3小時；四、將萃取後的溶液過濾、濃縮；五、再將濃縮後的溶液進行冷凍及乾燥；六、製備出龍眼籽萃取物。

本發明進一步揭示，由上述製備方法制得的龍眼籽萃取物，主要可應用於生物體抗發炎；降低生物體的尿酸；促進生物體傷口癒合；抑制細菌活性。

據由前述，本發明提供的龍眼籽萃取物，可以應用於生物體，能夠產生抗發炎反應、降低尿酸生成、抑制細菌活性，並可促進皮膚角質細胞生長、增加傷口愈合速度，同時不會造成生物體內臟器受損或增加臟器負擔。

為期使對於本發明之目的、功效以及構造特徵能有更詳細明確的瞭解，茲舉出如下述之較佳實施例並配合圖式說明如後。

第一圖係為包含沒食子酸、鞣料雲實酸、鞣花酸之標準品溶液的質譜分析圖。

第二圖係為本發明龍眼籽萃取物的質譜分析圖。

第三圖係為表格三所建構之折線圖。

第四圖係為表格四所建構之折線圖。

第五圖係為表格七之平均值所建構的長條圖。

第六圖係為表格八之平均值所建構的長條圖。

第七圖係為表格九之平均值所建構的長條圖。

第八圖係為表格十所建構的折線圖。

第九圖係為表格十一所建構的折線圖。

本發明所述之龍眼籽萃取物，係透過以下步驟逐步進行製備：一、以親水性溶液(例如水)或親脂性溶液作為萃取溶液；本實施例係配製濃度為20~95%的乙醇溶液作為萃取溶液；二、將萃取溶液溫度加熱至70~90℃；三、將打碎後的龍眼籽放入萃取溶液中，使萃取溫度維持在70~90℃，萃取時間約為1~3小時，進行萃取；四、將萃取後的溶液經過濾、濃縮；五、再進行低溫低壓的冷凍乾燥；六、製備出龍眼籽萃取物。

利用高效液相層析儀(High Performance liquid Chromatography,HPLC)分析製備的龍眼籽萃取物，可得出其主要組成成份包含沒食子酸(Gallic acid)、鞣料雲實素(Corilagin)、鞣花酸(Ellagic acid)，結構式分別如下，高效液相層析儀的分析條件則如表格一所示：沒食子酸(Gallic acid)：

鞣花酸(Ellagic acid)：

鞣料雲實素(Corilagin)：

以包含沒食子酸、鞣料雲實素、鞣花酸的標準溶液為參考溶液，利用上述高效液相層析儀的分析條件進行分析，得到第一圖所示結果，該結果表明：沒食子酸(42.42μg/ml)、鞣料雲實素 (52.72μg/ml)、鞣花酸(22.4μg/ml)的保留時間(Retention Time)分別為14.409、43.304、63.489分鐘；將龍眼籽萃取物利用高效液相層析儀分析後，得到第二圖所示結果，顯示龍眼籽萃取物中峰值成分的保留時間分別為14.461、43.302、63.476分鐘，因此，該龍眼籽萃取物的主要成分與標準溶液相同，即該龍眼籽萃取物包含有沒食子酸、鞣料雲實素和鞣花酸。

再者，為了揭示前述製備的龍眼籽萃取物的療效，茲利用前述製備之龍眼籽萃取物進行各類體內試驗與體外試驗：

一、抗發炎的體內試驗：

(一)準備材料：

龍眼籽萃取物(萃取溶液為50%乙醇溶液)、龍眼籽萃取物A(萃取溶液為純水)、龍眼籽萃取物B(萃取溶液為20%乙醇溶液)。

(二)體內試驗(餵食試驗)：

1、取雄性SD鼠(Sprague-dawley rats)24隻，每隻體重約為200g~250g，控制飼養室室內溫度23℃，光線明、暗各12小時，使用SD鼠專用飼料，飲用水經過逆滲透處理。

2、隨機分成九組，每組6隻，分別餵食：(1)控制組，僅口投逆滲透水；(2)口投龍眼籽萃取物(0.5g/Kg，每Kg鼠重口投0.5g龍眼籽萃取物)一星期後，腹腔注射大腸桿菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS，2.5mg/Kg，每Kg鼠重注射2.5mg大腸桿菌脂多糖)後，待24小時；(3)口投龍眼籽萃取物(0.5g/Kg)一星期後，腹腔注射LPS(2.5mg/Kg)待48小時；(4)腹腔注射LPS(2.5mg/Kg)後待24小時，口投龍眼籽萃取物A(0.5g/Kg)；(5)腹腔注射LPS(2.5mg/Kg)後待24小時，口投龍眼籽萃取物 B(0.5g/Kg)；(6)腹腔注射LPS(2.5mg/Kg)後待24小時，口投龍眼籽萃取物(0.5g/Kg)；(7)腹腔注射LPS(2.5mg/Kg)後待48小時，口投龍眼籽萃取物(0.5g/Kg)；(8)單獨腹腔注射LPS(2.5mg/Kg)後待24小時；(9)單獨口投龍眼籽萃取物(0.5g/Kg)；投藥結束，經過一晚絕食後，在乙醚麻醉下，由SD鼠腹腔動脈採血，提供血清免疫學檢查。

3、血清免疫學檢查：使用酶聯免疫分析法(ELISA)檢測腫瘤壞死因數(TNF-α)、細胞白介素(IL-1β)。

4、統計方法：本實驗所得資料，均以單因數變異數分析(One-way analysis of variance,ANOVA)。

5、實驗結果：由表格二可以看出：在IL-1β的部分，口投龍眼籽萃取物與腹腔注射LPS均可對SD鼠造成免疫反應；由表格三與第三圖可看出：在TNF-α的部分，預先口投龍眼籽萃取物再腹腔注射LPS及單獨口投龍眼籽萃取物均有抗發炎的作用，而LPS逆境處理後再口投龍眼籽萃取物，則對SD鼠不具有抗發炎的作用。

二、抗痛風的體內試驗與體外試驗：

(一)準備材料：龍眼籽萃取物(萃取溶液為50%乙醇溶液)。

(二)體內試驗(餵食試驗)：

1、取雄性SD鼠(Sprague-Dawley rats)24隻，每隻體重約為200g~250g，控制飼養室室內溫度約23℃，光線明、暗各12小時，使用SD鼠專用飼料，飲用水經過逆滲透處理。

2、隨機分成三組，每組各8隻，其中一組為對照組，該組經口投逆滲透水；一組為實驗組，該組投300mg/Kg鼠重的6-羥基嘌呤(Hypoxathine)加上250mg/Kg鼠重的氧嗪酸(Oxonic acid，一種尿酸酶抑制劑)；另一組為龍眼籽實驗組，該組口投300mg/Kg鼠重的6-羥基嘌呤(Hypoxathine)、250mg/Kg鼠重的氧嗪酸(Oxonic acid)及龍眼籽0.1%(wt%)；添加氧嗪酸(Oxonic acid)的主要目的，在於誘導SD老鼠體內形成高度尿酸者；SD鼠可任意飲水，投藥期間，每天觀察動物兩次，每天稱體重一次。投藥結束，經過一晚絕食後，在乙醚麻醉下，由SD鼠尾部採血，提供血清生化學檢查。

(1)對照組：口投逆滲透水。

(2)實驗組：口投300mg/Kg鼠重的6-羥基嘌呤(Hypoxathine)，加 上250mg/Kg鼠重的氧嗪酸(Oxonic acid)。

(3)龍眼籽組：投予300mg/Kg鼠重的6-羥基嘌呤(Hypoxanthine)，加上250mg/Kg鼠重的氧嗪酸(Oxonic acid)，再加上0.1%(Wt%)龍眼籽。

3、血清生化學檢查：使用生化自動分析儀(Ciba-cornint 550)測定，檢測SD鼠血清尿酸濃度。

4、統計方法：本實驗所得資料，均以單因數變異數分析(One-way analysis of variance,ANOVA)。

5、實驗結果：由表格四以及第四圖可以看出：龍眼籽萃取物(萃取溶液為50%乙醇溶液)能有效降低SD鼠血清尿酸，降低效果高達32%。

(三)體外實驗(黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase)抑制實驗)：

1、以磷酸緩衝溶液(PBS)配製出50mmol/L的黃嘌呤(Xanthine)。

2、將黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase)以磷酸緩衝溶液(PBS)配製成0.1~0.2unit/ml。

3、配製各式龍眼籽萃取物的樣本：

(1)配製純水，萃取龍眼籽。

(2)配製20%乙醇溶液，萃取龍眼籽。

(3)配製50%乙醇溶液，萃取龍眼籽。

(4)配製95%乙醇溶液，萃取龍眼籽。

4、取一陽性對照組--臨床用藥別嘌呤醇(Allopurinol)，於陽性對照組中加入黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase)，反應5分鐘後，加入黃嘌呤(Xanthine)。

5、取一空白對照組，該組僅添加純水。

6、於各種龍眼籽萃取物樣本中，加入黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase)，反應5分鐘，再加入黃嘌呤(Xanthine)。

7、利用分光光度儀，選取波長290nm，偵測各種龍眼籽萃取物樣本及對照組的吸光值變化，每20秒偵測一次，共偵測5分鐘，再經儀器計算其酵素活性。

8、活性抑制率=[1-(試驗組活性/對照組活性)]

9、實驗結果：由表格五可看出：各種龍眼籽萃取物均能抑制黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase)活性，活性抑制率最高可達60%。

三、抗痛風毒性試驗：

(一)準備材料：龍眼籽萃取物。

(二)急性毒性試驗：SD鼠分成2組，每組8~10隻，實驗前絕食一晚，但不絕水，經口投龍眼籽萃取物(450mg/ml)，觀察中毒症狀並記錄14天內體重變化和死亡情形；一半致死劑量(LD50)和95%可信賴限依照Litctchfield及Wilcoxon二氏的方法計算。

(三)28日餵食急性毒性試驗：分成2組，每組各10隻，分別口投龍眼籽萃取物1g/kg、3g/kg及去離子水(1ml/100g)，連續28天。投藥期間，每天觀察動物兩次，每週稱重一次。投藥結束，經過一晚絕食，再乙醚麻醉下由SD鼠腹腔動脈採血，提供血液學及血清生化學檢查。

(四)血清生化學檢查：用生化自動分析儀(Ciba-cornint 550)測定，檢測項目包含麩氨酸草乙酸轉氨酶(GOT)、麩氨酸丙氨基轉氨酶(GPT)、白蛋白(Albumin)、球蛋白(Globulin)、肌酸酐(Greatinine)。

(五)統計方法：本實驗所得資料，均以單因數變異數分析(One-way analysis of variance,ANOVA)，並進行Dunnett檢驗，以P值小於0.01認為有顯著差異。

(六)實驗結果：

1、急性毒性：

急性毒性試驗主要目的是尋求一次投予高劑量的藥物造成試驗動物一半死亡的劑量，SD鼠空腹最大量每100g重量可投予1.0ml的劑量，藥物濃度為450mg/ml的濃度，因此急性毒性試驗的劑量以15g/kg為基準，若SD鼠完全沒有死亡，則不再進行。

SD鼠10隻，經口一次投予龍眼籽萃取物15g/kg為基準，觀察14天，沒有死亡情形，即SD鼠的一半致死劑量(LD50)大於15g/kg。投予龍眼籽萃取物後至第14天SD鼠體重與控制組比較沒有差異。

2、28日連續餵食毒性試驗：

使用最高劑量以一半致死劑量的1/5為原則，因此選用最高劑量為3g/kg，和1g/kg。

(1)每組SD鼠8~10隻，連續28天口投龍眼籽萃取物1g/kg和3g/kg，無死亡情形，與控制組比較體重也沒有明顯變化。

(2)血清生化學檢查：如表格六所示，連續28天經口投龍眼籽萃 取物，SD鼠1g/kg和3g/kg萃取物組和正常對照組的血清生化指標沒有差異。

(3)主要臟器重量：連續28天經口投龍眼籽萃取物，SD鼠1g/kg和3g/kg組的肝臟及腎臟的重量和控制組的沒有差異，表明：龍眼籽萃取物對主要臟器重量沒有影響。

(4)病理檢驗：連續28日經口投龍眼籽萃取物1g/kg和3g/kg組進行病理切片檢查，SD鼠的心臟、肝臟、腎臟、脾臟、腎上腺、精囊、睾丸等皆無變化。

3、實驗結果：龍眼籽萃取物不會造成生物體內臟器受損或增加臟器負擔。

四、抑菌試驗：

(一)準備材料：

取以龍眼籽萃取物為核心成分2.5mg/ml(每ml”P豆凝膠”中含有 2.5mg龍眼籽萃取物)的”P豆凝膠(含龍眼籽萃取物之產品名)”，以逆滲透水配製出一倍的等張磷酸液(1×PBS，等張溶液是指不引起紅細胞膜變形的溶液)，再將配製的等張磷酸液利用無菌濾膜(Mini pore)過濾，製備出無菌狀態的”P豆凝膠”等張磷酸液。

(二)試驗菌種：

大腸桿菌(Escherichia coli)與金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)：

1、將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等細菌，分別用LB broth液體培養基、37℃連續培養16小時，將培養好的菌液以一倍的等張磷酸液(1×PBS)清洗三次，每次清洗後以3000rpm離心10分鐘，去除上清液。將清洗後的菌液利用光譜儀測試其吸光度(OD value)，最後再以一倍的等張磷酸液稀釋，製備出吸光度為0.3(OD=0.3)的菌液，以進行實驗。

2、將配製好的一倍的等張磷酸液(1×PBS)分別加入10倍連續稀釋的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等菌液，以37℃下連續處理1小時。

3、將處理1小時後的菌液取5、10、20、50、100μl塗於LB培養基上，37℃下連續培養18小時後，計數每盤培養基的菌數，菌液以P豆凝膠等張磷酸液處理者為實驗組，菌液以逆滲透水等張磷酸液處理者為對照組。

4、以上步驟分別進行三次，最後統計結果。

5、實驗結果：如表格七與第五圖所示，與對照組相比，實驗組明顯降低了大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的細菌數目，從而證實：以龍眼籽萃取物為核心成分的”P豆凝膠”確實具有抑制大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的功能，可以應用於抑制青春痘的生成。

(三)試驗菌種：痤瘡桿菌(Propionibacterium acne)：

1、將痤瘡桿菌利用anBAP broth液體培養基、37℃下連續培養48小時，將培養好的菌液以一倍的等張磷酸液(1×PBS)清洗三次，每次清洗後以3000rpm離心10分鐘，去除上清液。將清洗後的菌液利用光譜儀測試其吸光度(OD value)，最後再以一倍的等張磷酸液稀釋，制得吸光度為0.3(OD=0.3)的菌液，以進行實驗。

2、將配製好的一倍的等張磷酸液(1×PBS)分別加入10倍連續稀釋的痤瘡桿菌，30℃下連續處理1小時。

3、將處理1小時後的菌液取5、10、20、50、100μl塗於LB培養基上，30℃下連續培養48小時後，計數每盤培養基的菌數，菌液以”P豆凝膠”等張磷酸液處理者為實驗組，菌液以逆滲透水等張磷酸液處理者為對照組。

4、以上步驟分別進行三次，最後統計結果。

5、實驗結果：如表格八與第六圖所示，與對照組相較，實驗組明顯降低了痤瘡桿菌的數目，從而證實：以龍眼籽萃取物為核心成分的”P豆凝膠”確實具有抑制痤瘡桿菌的功能，可以應用于抑制青春痘的生成。

(四)試驗菌種：紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)：

1、將紅色毛癬菌利用IMA plate(Inhibit mold Agar)培養基、30℃下連續培養96小時，將培養好的菌液以一倍的等張磷酸液(1×PBS)清洗三次，每次清洗後以3000rpm離心10分鐘，去除上清液。將清洗後的菌液利用光譜儀測試其吸光度(OD value)，最後以一倍的等張磷酸液稀釋製備出吸光度為0.1(OD=0.1)的菌液，以進行實驗。

2、將配製好的一倍的等張磷酸液(1×PBS)分別加入10倍連續稀釋的紅色毛癬菌，30℃下連續處理1小時。

3、處理1小時後的菌液取5、10、20、50、100μl塗於LB培養基，130℃下連續培養96小時後，計數每盤培養基的菌數，菌液以”P豆凝膠”等張磷酸液處理者為實驗組，菌液以逆滲透水等張磷酸液處理者為對照組。

4、以上步驟分別進行三次，最後統計結果。

5、實驗結果：如表格九與第七圖所示，與對照組相較，實驗組明顯降低了紅色毛癬菌的細菌數目(約30%)，表明：以龍眼籽萃取物為核心成分的”P豆凝膠”確實具有抑制紅色毛癬菌等黴菌的功能，可以應用於抑制香港腳的生成。

五、促進傷口癒合機轉試驗：

(一)準備材料：

1、取龍眼籽萃取物5g溶解於250ml二次水中，以2號濾紙過濾，再以0.45μm、0.22um過濾膜過濾後備用。

2、配製0%、0.25%、2.5%、5.0%與10.0%(Wt%)龍眼籽萃取物，作為角質細胞培養液。

3、人類角質細胞(Human epidermal keratinocytes；HEKa-C005-5C)。

(二)細胞培養：取1×104cells/ml人類角質細胞(HEKa-C005-5C)，用添加有角質細胞生長因數(KC supplements)及青黴素一鏈黴素(Penicillin-Streptomycin)的角質細胞培養基(Cascade biologics，USA)，於37℃、含5%CO₂的培養箱中進行培養，此批細胞為第一代；每隔兩天換一次培養基，直到第一代細胞八分滿後，再作繼代培養。加人0.25%的胰酶細胞消化液(Trypsin-EDTA solution，含0.25%的胰酶和0.02%的EDTA)，於37℃作用5分鐘後，將懸浮的角質細胞以10%上清液沖洗中和後，置入離心管中，1500rpm離心10分鐘，去除上清液，再以角質細胞培養基重新懸浮細胞，以1：3稀釋，並繼續於含濃度5%CO₂的培養箱中培養；取其第三代進行實驗。

(三)細胞增生能力測試：以結晶紫(Crystal violet)染色法進行； 人類角質細胞(HEKa-C005-5C)經24、48、72小時培養後，先以倒立式顯微鏡觀察細胞生長的實際狀況，用200μl上清液清洗細胞兩次，以細胞固定液固定細胞20分鐘，再用200μl PBST清洗細胞兩次，以100μl結晶紫(Crystal violet)溶液於室溫下染色30分鐘，再用200μl上清液清洗細胞三次，以1%SDS溶解細胞，於室溫下迴旋震盪培養1小時，將染上細胞核的結晶紫染料溶出，測定波長595nm下的吸光度(OD值)，同時以650nm的參考波長修正吸光度(OD值)。

以未添加龍眼籽萃取物的組別作為控制組，求得生長促進率。

(四)以ELISA測定人類角質細胞所分泌生長因數(growth factors)的釋出量：

1、人類角質細胞經刺激後收集其上清液，以Commercial kits測定培養液中生長因數(growth factors)的量。

2、首先取96孔板(96 well plates)的微量滴定板(Microtitration plate)，以牛血清蛋白(Bovine serum albumin)阻抑未結合位置，再以PBS-Tween洗淨，加入經刺激作用後的上清液各100μl，於37℃反應2小時後，以PBS-Tween洗淨，然後加入兔抗生長因數(Rabbit-anti-growth factor Ab-HRP Chemicon，Temecula，CA)，於37℃反應2小時後洗淨，加入呈色的底物(Substrate，內含鄰苯二胺O-phenyldiamine)，呈色後加入50μl的2NH₂SO₄終止反應，並測定波長450nm下的吸光度，從而測出生長因數(growth factors)中的血管內皮細胞生長因數(VEGF)的濃度。

(五)實驗結果：

1、如表格十與第八圖所示，以結晶紫(Crystal violet)染色法測定增生能力與顯微鏡下的結果相符，顯示2.5%、5.0%與10%的組別其促進角質細胞生長的倍數分別為控制組的1.25、1.26與1.50倍，其中僅10%組別具有統計上的顯著意義(其p值小於0.05)，表明：僅須10%龍 眼籽萃取物，即可有效促進人類角質細胞的生長。

2、如表格十一與第九圖所示，經由酶聯免疫吸附(ELISA)測定得到的結果，在塗覆膠原I(Collagen I，CI)和纖維連接蛋白(Fibronectin，FN)的組別，加入5%及10%龍眼籽萃取物培養後，上清液中血管內皮細胞生長因數(VEGF)隨劑量增加而顯著上升(p<0.05)，表明：龍眼籽萃取物在促進傷口癒合過程中包含有促進血管增生的機制，能夠促進生物體傷口癒合。

由以上列舉的體內試驗、體外試驗與毒性試驗可知：本發明提供的龍眼籽萃取物，可用於生物體並產生抗發炎反應、降低尿酸生成、抑制細菌活性，還可促進皮膚角質細胞的生長，增加傷口癒合的速度，同時該龍眼籽萃取物並不會造成生物體內的臟器受損或增加其負擔，故能安心使用。

本發明在同類領域中，具有極佳之進步性及實用性，同時查遍 國內外關於此類架構之技術資訊文獻，亦未發現有相同近似之構造存在於先，應已符合『創作性』、『合於產業利用性』、『新穎性』以及『進步性』的專利要件，爰依法提出申請。

惟，以上所述者僅係本發明之較佳實施例而已，故舉凡應用本專利說明書以及申請專利範圍所為之其他等效方法結構變化者，均屬可行，理應包含在本發明之申請專利範圍內。

Claims (8)

1. 一種龍眼籽萃取物的用途，該用途是作為製備抑制細菌活性之藥物，其中該龍眼籽萃取物係經乙醇溶液萃取龍眼籽而得，其中該細菌係選自由大腸桿菌、痤瘡桿菌及紅色毛癬菌所組成之群。
2. 依據請求項第1項之用途，其中該龍眼籽萃取物係由一製備方法所製備，其方法包含下列步驟：一、配製特定濃度的萃取溶液，該萃取溶液為乙醇溶液；二、將萃取溶液溫度加熱；三、於萃取溶液中放入打碎的龍眼籽顆粒，進行萃取；四、將萃取後的溶液過濾、濃縮；五、將濃縮後的溶液進行冷凍及乾燥；及六、製備出龍眼籽萃取物。
3. 依據請求項1所述之用途，其中，該乙醇溶液的濃度為20%~95%。
4. 依據請求項2所述之用途，其中，步驟二所述萃取溶液係加熱至70℃~90℃。
5. 依據請求項2所述之用途，其中，步驟三加入打碎的龍眼籽後之萃取溶液的溫度係維持在70℃~90℃。
6. 依據請求項2所述之用途，其中，步驟三所述萃取的時間係為1~3小時。
7. 依據請求項1至6項任何一項所述之用途，其中龍眼籽萃取物之成分包含有鞣料雲實素(Corilagin)、鞣花酸(Ellagic acid)、沒食子酸(Gallic acid)。
8. 依據請求項1至6任何一項所述之用途，其中該用途是作為製備 治療青春痘及/或香港腳的藥物。