WO2011003236A1

WO2011003236A1 - 一种龙眼核萃取物的制备方法与应用

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Publication number: WO2011003236A1
Application number: PCT/CN2009/072687
Authority: WO
Inventors: 黄文田; 侯建维; 李英中; 曾焕中; 廖哲逸; 黄乔志; 黄介纬; 耿俊兰
Original assignee: 乔志亚生技股份有限公司
Priority date: 2009-07-08
Filing date: 2009-07-08
Publication date: 2011-01-13
Also published as: CN102481327A; CN102481327B; US20150079204A1; US20150079205A1; DE112009005041T5; JP2012532148A; US9999645B2; US20120177761A1

Description

一种龙眼核萃取物的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种龙眼核萃取物的制备方法，所得龙眼核萃取物应用于生物体具有抗发炎、降低血液中尿酸的浓度、促进皮肤角质细胞的生长、增强伤口愈合机转及抵制细菌活性等多种功效。

一、发炎 (Inflammation) ：

发炎在药物治疗上是一种不可忽视的现象，对人体而言，它是生成疾病前的警告讯息。当人体组织受伤时，不论是由细菌、外伤、化学物品还是其它原因导致的，受伤组织附近的巨噬细胞（Macrophage) 会被活化而进行吞噬外来物质的任务，同时也会释放一些因子来启动更深一层的防御反应；倘若发炎组织持续受外来物质剌激，其防御机转可达数月甚至数年，故处于发炎状态时，所释放的因子含量往往较多。经研究证实：所述因子包含有：一氧化氮（Nitric oxide, NO) 、肿瘤坏死因数（Tumor necrosis factor, TNF) 、细胞界白素 ( Interleukin, IL ) 、颗粒白血球群落束 lj激因子 ( Granulocyte colony stimulating factor, G-CSF) 、单核球群落剌激因子（Monocyte colony stimulating factor, M-CSF) 、颗粒白血球及单核球群落剌激因子（Granulocyte-monocyte colony stimulating factor, GM-CSF) ，学者将由单核细胞与巨噬细胞产生的 TNF命名为 TNF- α，将 T淋巴细胞产生的淋巴毒素 (Lymphotoxin, LT) 命名为 TNF- β来加以区别。

脂多糖（Lipopolysaccharides, LPS) 是内毒素的主要成份，经由动物实验证明： LPS 能够延缓胃部排空，此作用与 LPS诱导下前炎细胞因子以及一氧化氮的升高有关。机体受到 LPS的剌激后，会触发单核吞噬细胞系统合成 TNF- α、 IL-1 β、 IL-6等多种细胞因子，参与机体防御反应和修复。 TNF- a、 IL-1 β , IL-6这三种细胞因子的合成是有序的级联，即 LPS诱导 TNF- a的合成、 TNF- a诱导 IL-1 β的合成、而 IL-1 β又诱导 IL-6的合成。但过量的细胞因子也会对机体产生不良作用，例如过量的 TNF- a会引起多种脏器功能衰竭、弥漫性血管内凝血及中毒性休克，甚至引起死亡，而应用 TNF抗体的动物则能有效地阻止致死性内毒素休克的发生。

现今医药界所使用的抗发炎药物种类繁多，例如抗生素（Antibiotics)、非类固醇抗发炎药 (Non-steroidal anti-inflammation drugs; NSAIDs)、抗组织氨药 ( Anti-histamine drugs) 等，虽具有相当良好的消炎作用，却有抗药性及损伤肠胃等副作用。

二、痛风：

痛风是嘌吟代谢异常或尿酸排泄减少所引起的一种疾病，其临床特点为高尿酸血症 (Hyperuricemia) 、反复发作的急性单一关节炎 (Recurrent acute monoarthritis) 、尿酸钠盐形成痛风石（Tophi)沉积、慢性痛风石关节炎等，若未经适当治疗，通常最终会发展为痛风性肾病（Gouty nephropathy) 。本病主要分为原发性和继发性两大类，原发性痛风患者中有近 1 %患者为酶缺陷所致，而大多数病因不明，临床以痛风性关节炎为主要表现，且常伴有高血脂病、高血压病、糖尿病、动脉硬化及冠心病等；继发性痛风常由肾脏病、血液病及药物等原因引起，痛风为其并发症。

高尿酸血症是痛风最重要的生化基础，但并不是痛风的同义词，研究指出：约有 5〜

18.8 %的高尿酸血症患者最终会发展为痛风，但痛风患者在其病程中的某一阶段必将有高尿酸血症的存在。

实验室可利用尿酸酶法（Uricase differential spectrophotometric method) 精确测定血尿酸值。高尿酸血症可分为绝对性和相对性两大类。当血中尿酸浓度超过可溶性的上限时，称为绝对性高尿酸血症，在 37°C时血中尿酸饱和值是 7mg/dl，超过这个饱和点，逐渐有针状晶体析出。一般流行病学研究则以正常人血尿酸平均值加上二个标准差为上限，认为男性血中的尿酸值超过 7mg/dl，女性超过 6mg/dl时，称为相对性高尿酸症。若血尿酸值超过 7mg/dl，则痛风或肾结石的发生率将会增加。

痛风的临床表现分为四个阶段：无症状高尿酸血症（Asymptomatic hyperuricemia) 、急性痛风关节炎（Acute gouty arthritis) 、间歇期（Inter-critical gout) 、慢性痛风石关节炎 ( Chronic tophaceous gout) 。

诊断痛风较正确的方法为：在急性痛风关节炎发作时抽取关节液，如发现有被嗜中性白血球吞噬的针状尿酸盐结晶（Monosodium urate crystal) ，在偏光显微镜下呈现负性双折光（Negative birefringent) ，即为痛风。其它常见的临床表征或实验室检查：突然发作第一大脚趾、足背、踝等单一关节红肿剧痛、秋水仙碱治疗有特效者或高尿酸血症者，仅可作为诊断痛风的参考。

由于原发性痛风缺乏病因治疗，因此不能根治。临床治疗的目的在于： 1、及时控制痛风性关节炎的急性发作； 2、长期治疗高尿酸血症，以预防尿酸钠盐沉积造成的关节破坏及肾脏损害。

至于降尿酸药物的选择：在肾功能正常或轻度损害， 24 小时尿酸排出量低于 600mg 时，可使用促进尿酸排泄药；在肾功能为中等损害（肌酐廓清率 <35ml/分钟）或 24小时尿液尿酸明显升高时，应使用抑制尿酸生成物。血尿酸明显升高及痛风石大量沉积时，可合用以上两种药物，以防止渐进性痛风性并发症。

前述的促进尿酸排泄药（Uricosuric agent) 主要通过抑制近端肾小管对尿酸的重吸收而促进尿酸排泄。为防止尿酸在肾脏大量排出时引起肾脏损害及肾结石的副作用，均应从小剂量开始，于 7〜10天内逐渐加量，并考虑咸化尿液。此类药品有丙磺殊（Probenecid) 苯溴马隆（Benzbromarone) 等。

前述的抑制尿酸生成药（Xanthine oxidase inhibitor) ，仅有别嘌吟醇（ Allopurinol) ，其结构类似次黄嘌吟（hypoxanthine) ，有较强的抑制黄嘌吟氧化酶（xanthine oxidase) 的作用，可抑制痛风石和肾结石的形成，并促进痛风石的溶解。同时使用抗癌药如巯嘌吟 ( Mercaptopurine ) 或硫唑嘌吟（ Azathioprine ) 时，会提高抗癌药的血中浓度，此时需酌量或留心临床副作用。

三、伤口愈合（Wound healing):

伤口愈合是一种动态的（Dynamic) 许多细胞交互作用（Interactive) 且为多重步骤的 ( Multiple steps ) 过程，包括细胞移动、细胞增生、细胞分化、细胞外基质的合成与组织再造（Tissue remodeling)等。这个过程与伤口处表皮的再生以及皮下结缔组织的修复有关。在皮肤伤口愈合的过程中，伤口两边表皮边缘的角质细胞会增生，并且向伤口中间移动而形成新的表皮层，这些过程需几天甚至数星期才能完成。

与伤口愈合有密切关系的生长因子（Growth factors) ，包括有成纤维细胞生长因子 2 ( Fibroblast growth factor 2, FGF2 ) 、血小板衍化生长因子（Platelet-derive growth factor, PDGF )、表皮生长因子（Epidermal growth factor, EGF)、角质细胞生长因子（Keratinocyte growth factor, KGF ) 、转化生长因子 - a ( Transforming growth factor- a , TGF- a ) 、转化生长因子 - β ( Transforming growth factor- β , TGF- β ) 以及血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF)。这些生长因子（ Growth factors )中， PDGF、 EGF、 TGF- β与 VEGF由角质细胞分泌。其中， PDGF能够吸引巨噬细胞（Macrophages)与成纤维细胞（Fibroblasts) , 并促进基质蛋白（Matrix protein)的制造； EGF能够以自分泌（Autocrine) 的形式促进自身的移动与增生； TGF- β能够促进成纤维细胞（Fibroblasts ) 的增生、细胞移动及血管新生，而且在伤口愈合的初期就会大量释出； VEGF则能够促进血管通透性、促血管再生基质（Proangiogenic matrix ) 的沉积及血管新生，并且能够剌激单核细胞 ( Monocyte ) 的移动。由以上研究结果显示：这些角质细胞所释放的生长因子（Growth factors ) 均与伤口愈合过程密切相关。

另一方面，根据《全国中草药汇编》记载：龙眼核可用于治疗胃痛、烧烫伤、刀伤出血、疳气痛、外伤出血、疥癣、湿疮等。古人将龙眼核用于治疗外伤，有良好的止血、定痛、生肌之效。《黄氏医抄方》记载：「治刀斧伤，桂圆核不拘多少，用火烧枯存性，研末，掺患处即愈」。古文献记载：「龙眼核末，敷金刀伤，昔在西秦及巴理坤军营救愈多人」。《殷红趾传方》亦云：「治刀伤出血，以龙眼核炒捣细磨，敷之」。由以上古书及药典的记载可以知道：龙眼核对皮肤刀伤及相关疾病具有治疗效果，对促进伤口的愈合有效果，但是其作用机转并不清楚。发明内容

本发明的主要目的在于提供一种龙眼核萃取物的制备方法及其在生物体中的应用。本发明首先提供了一种龙眼核萃取物的制备方法，包含下列步骤：

( 1 ) 配制特定浓度的萃取溶液；

(2) 将萃取溶液温度加热至特定温度；

(3 ) 于萃取溶液中放入打碎的龙眼核颗粒，进行萃取；

(4) 将萃取后的溶液过滤、浓缩；

(5 ) 再将浓缩后的溶液进行冷冻及干燥；

(6) 制备出龙眼核萃取物。

本发明还提供了上述制备方法的优选方案：

萃取溶液为水溶液或醇溶液；

醇溶液为乙醇溶液；

乙醇溶液的浓度为 20%〜95 % _;

步骤（2) 中，所述萃取溶液加热至 70 X〜 90 °C ;

步骤（3 ) 中，所述萃取的萃取温度为 70X〜 90°C ;

步骤（3 ) 中，所述萃取的萃取时间为 1〜3小时。

本发明还提供了由述方法制备出的龙眼核萃取物，其成分包含有鞣料云实素

( Corilagin) 、鞣花酸（Ellagic acid) 、没食子酸（Gallic acid) 。

本发明还进一步提供了上述龙眼核萃取物的主要应用：

该龙眼核萃取物应用于生物体抗发炎；

该龙眼核萃取物应用于降低生物体的尿酸者；

该龙眼核萃取物应用于促进生物体伤口愈合；该龙眼核萃取物应用于抑制细菌活性。

由本发明提供的制备方法制得的龙眼核萃取物具有以下优点：

可以应用于生物体，能够产生抗发炎反应、降低尿酸生成、抑制细菌活性，并可促进皮肤角质细胞生长、增加伤口愈合速度，同时不会造成生物体内脏器受损或增加脏器负担。附图说明

图 1 : 包含没食子酸、鞣料云实酸、鞣花酸的标准品溶液的高效液相层析仪分析图 (HPLC图）。

图 2: 本发明提供的龙眼核萃取物的高效液相层析仪分析图（HPLC图）。

图 3 : 表 3所建构的折线图。

图 4: 表 4所建构的折线图。

图 5 : 表 7的平均值所建构的长条图。

图 6: 表 8的平均值所建构的长条图。

图 7: 表 9的平均值所建构的长条图。

图 8: 表 10所建构的折线图。

图 9: 表 11所建构的折线图。具体实施方式下面通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案，本发明包括但不限于以下实施方式。根据现有技术对本发明所进行的不脱离本发明实质内容的改变，仍属于本发明的保护范围。

实施例 1

( 1 ) 以亲水性溶液（例如水）或亲脂性溶液作为萃取溶液；本实施例是配制浓度为

20〜95 %的乙醇溶液作为萃取溶液；

(2) 将萃取溶液温度加热至 70〜90°C _;

(3 ) 将打碎后的龙眼核放入萃取溶液中，使萃取温度维持在 70〜90°C，萃取时间约为 1〜3小时，进行萃取；

(4) 将萃取后的溶液经过滤、浓缩；

(5 ) 再进行低温低压的冷冻干燥；

(6) 制备出龙眼核萃取物。利用高效液相层析仪（High Performance liquid Chromatography, HPLC) 分析制备的龙眼核萃取物，可得出其主要组成成份包含有没食子酸（Gallic acid)鞣料云实素（Corilagin) 鞣花酸（Ellagic acid) ，结构式分别如下：

其中，高效液相层析仪的分析条件如表 1所示。

表 1、高效液相层析仪的分析条件仪器设备 Agilent 1100

层析管 Atlantis®T35μηι 4.6 X 10 mm, Waters

前置管柱 Cosmosil 5C18-A -II 4.6 X 10 mm, Nacalai Tesque 管柱温度 25 °C

流速 1.0 ml/min

检测波长 UV 270 nm

注射体积 10 μΐ

时间（分） 0 5 15 30 45 60 75 85

0.1% H₃P0₄ (%) 98 97 97 87 86 81 79 0 乙腈 (Acetonitrile, %) 2 3 3 13 14 19 21 100 以包含没食子酸、鞣料云实素、鞣花酸的标准溶液为参考溶液，利用上述高效液相层析仪的分析条件进行分析，得到图 1所示结果，该结果表明：没食子酸（42.42 g/ml) 、鞣料云实素（ 52.72 g/ml) 和鞣花酸（22.4 g/ml) 的保留时间（ Retention Time ) 分别为 14.409、 43.304、 63.489分钟；将前述龙眼核萃取物利用高效液相层析仪分析后，得到图 2 所示结果，表明：龙眼核萃取物中峰值成分的保留时间分别为 14.461、 43.302、 63.476分钟，因此，该龙眼核萃取物的主要成分与标准溶液相同，即该龙眼核萃取物包含有没食子酸、鞣料云实素和鞣花酸。

为了揭示前述制备的龙眼核萃取物的疗效，进行各类体内试验与体外试验：一、抗发炎的体内试验：

(一）准备材料：

龙眼核萃取物（萃取溶液为 50%乙醇溶液）、龙眼核萃取物 A (萃取溶液为纯水）和龙眼核萃取物 B (萃取溶液为 20%乙醇溶液）。

(二）体内试验（喂食试验）：

1、取雄性 S D鼠（Sprague-dawley rats) 24只，每只体重约为 200g〜250g，控制词养室室内温度 23°C，光线明、暗各 12小时，使用 S D鼠专用词料，饮用水经过逆渗透处理。

2、随机分成九组，每组 6只，分别喂食：

( 1 ) 控制组，仅口投逆渗透水；

(2) 口投龙眼核萃取物（0.5g/Kg，每 Kg鼠重口投 0.5g龙眼核萃取物）一星期后，腹腔注射大肠杆菌脂多糖（Lipopolysaccharides, LPS， 2.5mg/Kg, 每 Kg鼠重注射 2.5mg大肠杆菌脂多糖）后，待 24小时；

(3 ) 口投龙眼核萃取物（0.5g/Kg)—星期后，腹腔注射 LPS (2.5mg/Kg)待 48小时；

(4) 腹腔注射 LPS (2.5mg/Kg) 后待 24小时，口投龙眼核萃取物 A (0.5g/Kg) ；

(5 ) 腹腔注射 LPS (2.5mg/Kg) 后待 24小时，口投龙眼核萃取物 B (0.5g/Kg) ；

(6) 腹腔注射 LPS (2.5mg/Kg) 后待 24小时，口投龙眼核萃取物（0.5g/Kg) ； (7) 腹腔注射 LPS (2.5mg/Kg) 后待 48小时，口投龙眼核萃取物（0.5g/Kg) ；

(8) 单独腹腔注射 LPS (2.5mg/Kg) 后待 24小时；

(9) 单独口投龙眼核萃取物（0.5g/Kg) 。

投药结束，经过一晚绝食后，在乙醚麻醉下，由 S D鼠腹腔动脉采血，提供血清免疫学检查。

3、血清免疫学检查：

使用酶联免疫分析法（ELISA)检测肿瘤坏死因数（TNF- α )细胞白介素（IL- 1 β ) 。 4、统计方法：

本实验所得资料，均以单因子变异数分析（One-way analysis of variance, ANOVA) 。

5、实验结果：

由表 2可以看出：在 IL-Ι β的部分，口投龙眼核萃取物与腹腔注射 LPS均可对 S D鼠造成免疫反应；由表 3与图 3可看出：在 TNF-ct的部分，预先口投龙眼核萃取物再腹腔注射 LPS及单独口投龙眼核萃取物均有抗发炎的作用，而 LPS逆境处理后再口投龙眼核萃取物，则对 S D鼠不具有抗发炎的作用。

表 2、抗发炎体内实验的 IL-1 β值对比

IL-1 β (ng/L) IL-1 β (ng/L) 给药前 (original) 给药后 ( after stress ) 控制组 119±12 117±22 龙眼核萃取物（7d) +LPS (24h) 131±20 212±15 龙眼核萃取物 (7d) +LPS (48h) 102±16 213±19

LPS (24h) + 龙眼核萃取物 A 116±14 212±18

LPS (24h) + 龙眼核萃取物 B 104±17 190±20

LPS (24h) + 龙眼核萃取物 125±11 207±13

LPS (48h) + 龙眼核萃取物 110±16 211±10

LPS (24h) 111±20 209 ±9 龙眼核萃取物 124 ±8 198±9 表 3、抗发炎体内实验的 TNF-α值对比

二、抗痛风的体内试验与体外试验：

(一）准备材料：龙眼核萃取物（萃取溶液为 50%乙醇溶液）。

(二）体内试验（喂食试验）：

1、取雄性 S D鼠（Sprague-Dawley rats) 24只，每只体重约为 200g〜250g，控制词养室室内温度约 23 °C，光线明、暗各 12小时，使用 S D鼠专用词料，饮用水经过逆渗透处理。

2、随机分成三组，每组各 8只，其中一组为对照组，该组经口投逆渗透水；一组为实验组，该组投 300 mg/Kg鼠重的 6-羟基嘌吟（Hypoxathine)加上 250 mg/Kg鼠重的氧嗉酸（Oxonic acid, —种尿酸酶抑制剂）；另一组为龙眼核实验组，该组口投 300 mg/Kg鼠重的 6-羟基嘌吟（Hypoxathine)250 mg/Kg鼠重的氧嗉酸（Oxonic acid)及龙眼核 0.1% (wt%); 添加氧嗉酸（Oxonic acid) 的主要目的，在于诱导 SD老鼠体内形成高度尿酸者； S D鼠可任意饮水，投药期间，每天观察动物两次，每天称体重一次。投药结束，经过一晚绝食后，在乙醚麻醉下，由 S D鼠尾部采血，提供血清生化学检查。

( 1 ) 对照组：口投逆渗透水。

(2) 实验组：口投 300 mg/Kg鼠重的 6-羟基嘌吟（Hypoxathine) ，加上 250 mg /Kg 鼠重的氧嗉酸（Oxonic acid) 。

(3 )龙眼核组：投予 300mg/Kg鼠重的 6-羟基嘌吟（Hypoxanthine)，加上 250mg/Kg 鼠重的氧嗉酸（Oxonic acid) ，再加上 0.1 % (Wt%) 龙眼核。

3、血清生化学检查：

使用生化自动分析仪（ Ciba-cornint 550) 测定，检测 S D鼠血清尿酸浓度。

4、统计方法：

5、实验结果：

由表格 4以及图 4可以看出：龙眼核萃取物（萃取溶液为 50%乙醇溶液）能有效降低 S D鼠血清尿酸，降低效果高达 32 %。

表 4、抗痛风体内实验的尿酸浓度对比

(三）体外实验（黄嘌吟氧化酶 (Xanthine oxidase)抑制实验）：

1、以磷酸缓冲溶液（PBS) 配制出 50mmol/L的黄嘌吟（Xanthine) 。

2、将黄嘌吟氧化酶 (Xanthine oxidase)以磷酸缓冲溶液（PBS)配制成 0.1〜0.2 unit/ml。

3、配制各式龙眼核萃取物的样本：

( 1 ) 配制纯水，萃取龙眼核。

(2) 配制 20 %乙醇溶液，萃取龙眼核。

( 3 ) 配制 50 %乙醇溶液，萃取龙眼核。

(4) 配制 95 %乙醇溶液，萃取龙眼核。

4、取一阳性对照组——临床用药别嘌吟醇（Allopurinol) ，于阳性对照组中加入黄嘌吟氧化酶 (Xanthine oxidase), 反应 5分钟后，加入黄嘌吟（Xanthine) 。

5、取一空白对照组，该组仅添加纯水。

6、于各种龙眼核萃取物样本中，加入黄嘌吟氧化酶 (Xanthine oxidase), 反应 5分钟，再加入黄嘌吟（Xanthine) 。

7、利用分光光度仪，选取波长 290nm，侦测各种龙眼核萃取物样本及对照组的吸光值变化，每 20秒侦测一次，共侦测 5分钟，再经仪器计算其酵素活性。

8、活性抑制率 = 1 实验组活性，

对照组活性

9、实验结果：

由表格 5可以看出：各种龙眼核萃取物均能抑制黄嘌吟氧化酶 (Xanthine oxidase)的活性，活性抑制率最高可达 60 %。

表 5、抗痛风体外实验（黄嘌吟氧化酶抑制实验）的结果对比

三、抗痛风毒性试验：

(一）准备材料：龙眼核萃取物。

(二）急性毒性试验： S D鼠分成 2组，每组 8〜10只，实验前绝食一晚，但不绝水，经口投龙眼核萃取物（450mg/ml) ，观察中毒症状并记录 14天内体重变化和死亡情形；一半致死剂量（ LD₅。 ) 和 95 %可信赖限依照 Litctchfield及 Wilcoxon二氏的方法计算。

(三） 28 日喂食急性毒性试验：分成 2组，每组各 10只，分别口投龙眼核萃取物 lg/kg、 3g/kg及去离子水（l ml/lOOg) ，连续 28天。投药期间，每天观察动物两次，每周称重一次。投药结束，经过一晚绝食后，在乙醚麻醉下由 S D鼠腹腔动脉采血，提供血液学及血清生化学检查。

(四）血清生化学检查：

用生化自动分析仪（ Ciba-comint 550 )测定，检测项目包含麸氨酸草乙酸转氨酶（ GOT)、麸氨酸丙氨基转氨酶（GPT)、白蛋白（Albumin)、球蛋白（Globulin)、肌酸酐（Greatinine)。

(五）统计方法：

本实验所得数据，均以单因子变异数分析（One-way analysis of variance, ANOVA) ，并进行 Dunnett检验，以 P值小于 0.01认为有显著差异。

(六）实验结果：

1、急性毒性：

急性毒性试验主要目的是寻求一次投予高剂量的药物造成试验动物一半死亡的剂量，

S D鼠空腹最大量每 100g重量可投予 1.0ml的剂量，药物浓度为 450mg/ml的浓度，因此急性毒性试验的剂量以 15g/kg为基准，若 S D鼠完全没有死亡，则不再进行。

S D鼠 10只，经口一次投予龙眼核萃取物 15g/kg为基准，观察 14天，没有死亡情形，即 S D鼠的一半致死剂量（LD_5Q) 大于 15g/kg。投予龙眼核萃取物后至第 14天 S D鼠体重与控制组比较没有差异。

2、 28日连续喂食毒性试验：

使用最高剂量以一半致死剂量的 1/5为原则，因此选用最高剂量为 3g/kg，和 lg/kg。 ( 1 )每组 S D鼠 8〜10只，连续 28天口投龙眼核萃取物 lg/kg和 3g/kg，无死亡情形，与控制组比较体重也没有明显变化。

(2) 血清生化学检查：

如表 6所示，连续 28天经口投龙眼核萃取物， S D鼠 lg/kg和 3g/kg萃取物组和正常对照组的血清生化指标没有差异。

(3 ) 主要脏器重量：

连续 28天经口投龙眼核萃取物， S D鼠 lg/kg和 3g/kg组的肝脏及肾脏的重量和控制组的没有差异，表明：龙眼核萃取物对主要脏器重量没有影响。

(4) 病理检验：

连续 28日经口投龙眼核萃取物 lg/kg和 3g/kg组进行病理切片检查， S D鼠的心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肾上腺、精囊、睾丸等皆无变化。 3、实验结果：

龙眼核萃取物不会造成生物体内脏器受损或增加脏器负担。

表 6、连续喂食毒性试验结果

四、抑菌试验：

(一）准备材料：

取以龙眼核萃取物为核心成分 2.5mg/ml (每 ml "P豆凝胶"中含有 2.5mg龙眼核萃取物）的" P豆凝胶 (含龙眼核萃取物之产品名） "，以逆渗透水配制出一倍的等张磷酸液（1 X PBS, 等张溶液是指不引起红细胞膜变形的溶液），再将所配制的等张磷酸液利用无菌滤膜（Mini pore) 过滤，制备出无菌状态的 " P豆凝胶"等张磷酸液。

(二）试验菌种：

大肠杆菌 (Escherichia coli) 与金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) ：

1、将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等细菌，分别用 LB broth液体培养基、 37°C连续培养 16小时，将培养好的菌液以一倍的等张磷酸液（1 X PBS)清洗三次，每次清洗后以 3000 rpm离心 10分钟，去除上清液。将清洗后的菌液利用光谱仪测试其吸光度（OD value) ，最后再以一倍的等张磷酸液稀释，制备出吸光度为 0.3 (OD = 0.3 ) 的菌液，以进行实验。

2、将配制好的一倍的等张磷酸液（1 X PBS) 分别加入 10倍连续稀释的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等菌液，以 37°C下连续处理 1小时。

3、将处理 1小时后的菌液取 5、 10、 20、 50、 ΙΟΟμΙ涂于 LB培养基上， 37°C下连续培养 18 小时后，计数每盘培养基的菌数，菌液以 P豆凝胶等张磷酸液处理者为实验组，菌液以逆渗透水等张磷酸液处理者为对照组。 4、以上步骤分别进行三次，最后统计结果。

5、实验结果：

如表 7与图 5所示，与对照组相比，实验组明显降低了大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的细菌数目，从而证实：以龙眼核萃取物为核心成分的 " P豆凝胶 "确实具有抑制大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的功能，可以应用于抑制青春痘的生成。

表 7、抑菌（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）试验结果

(三) 试验菌禾中：痤疫杆菌 (Propionibacterium acne) ：

1、将痤疮杆菌利用 anBAP broth液体培养基、 37 °C下连续培养 48小时，将培养好的菌液以一倍的等张磷酸液（1 X PBS)清洗三次，每次清洗后以 3000 rpm离心 10分钟，去除上清液。将清洗后的菌液利用光谱仪测试其吸光度（OD value) ，最后再以一倍的等张磷酸液稀释，制得吸光度为 0.3 (OD = 0.3 ) 的菌液，以进行实验。

2、将配制好的一倍的等张磷酸液（1 X PBS) 分别加入 10倍连续稀释的痤疮杆菌， 30 °C下连续处理 1小时。

3、将处理 1小时后的菌液取 5、 10、 20、 50、 ΙΟΟμΙ涂于 LB培养基上， 30°C下连续培养 48 小时后，计数每盘培养基的菌数，菌液以 " P豆凝胶"等张磷酸液处理者为实验组，菌液以逆渗透水等张磷酸液处理者为对照组。

4、以上步骤分别进行三次，最后统计结果。

5、实验结果：

如表 8与图 6所示，与对照组相较，实验组明显降低了痤疮杆菌的数目，从而证实：以龙眼核萃取物为核心成分的 " P豆凝胶"确实具有抑制痤疮杆菌的功能，可以应用于抑制青春痘的生成。表 8、抑菌（痤疮杆菌）试验结果

(四）试验菌种：红色毛癣菌（Trichophyton rubrum) ：

1、将红色毛癣菌利用 IMA plate (Inhibit mold Agar) 培养基、 30°C下连续培养 96小时，将培养好的菌液以一倍的等张磷酸液（1 X PBS ) 清洗三次，每次清洗后以 3000 rpm 离心 10分钟，去除上清液。将清洗后的菌液利用光谱仪测试其吸光度（OD value) ，最后以一倍的等张磷酸液稀释制备出吸光度为 0.1 ( OD = 0.1 ) 的菌液，以进行实验。

2、将配制好的一倍的等张磷酸液（1 X PBS )分别加入 10倍连续稀释的红色毛癣菌， 30 °C下连续处理 1小时。

3、处理 1小时后的菌液取 5、 10、 20、 50、 ΙΟΟμΙ涂于 LB培养基， 13CTC下连续培养 96小时后，计数每盘培养基的菌数，菌液以 " Ρ豆凝胶 "等张磷酸液处理者为实验组，菌液以逆渗透水等张磷酸液处理者为对照组。

4、以上步骤分别进行三次，最后统计结果。

5、实验结果：如表 9与图 7所示，与对照组相较，实验组明显降低了红色毛癣菌的细菌数目（约 30 % ) ，表明：以龙眼核萃取物为核心成分的 " Ρ豆凝胶 "确实具有抑制红色毛癣菌等霉菌的功能，可以应用于抑制香港脚的生成。

表 9、抑菌（红色毛癣菌）试验结果

五、促进伤口愈合机转试验：

(一）准备材料：

1、取龙眼核萃取物 5 g溶解于 250 ml二次水中，以 2号滤纸过滤，再经由 0.45 μιη、

0.22 μιη过滤膜过滤后备用。

2、配制 0%、 0.25 %、 2.5 %、 5.0%与 10.0% (Wt%) 龙眼核萃取物，作为角质细胞培养液。

3、人类角质细胞（Human epidermal keratinocytes; HEKa-C005-5C) 。

(二）细胞培养：取 I X 104 cells/ml人类角质细胞（HEKa-C005-5C) ，用添加有角质细胞生长因子（KC supplements) 及青霉素一链霉素（Penicillin— Streptomycin) 的角质细胞培养基（Cascade biologies, USA) ，于 37°C、含 5 %C0₂的培养箱中进行培养，此批细胞为第一代；每隔两天换一次培养基，直到第一代细胞八分满后，再作继代培养。加入 0.25 %的胰酶细胞消化液（Trypsin-EDTA solution, 含 0.25%的胰酶和 0.02%的 EDTA) ，于 37 °C作用 5分钟后，将悬浮的角质细胞以 10%上清液冲洗中和后，置入离心管中， 1500rpm 离心 10分钟，去除上清液，再以角质细胞培养基重新悬浮细胞，以 1 : 3稀释，并继续于含浓度 5 %C0₂的培养箱中培养；取其第三代进行实验。

(三）细胞增生能力测试：以结晶紫（Crystal violet) 染色法进行；人类角质细胞 (HEKa-C005-5C) 经 24、 48、 72小时培养后，先以倒立式显微镜观察细胞生长的实际状况，用 200μ1上清液清洗细胞两次，以细胞固定液固定细胞 20分钟，再用 200μ1 ΡΒ8Τ清洗细胞两次，以 ΙΟΟμΙ结晶紫（Crystal violet) 溶液于室温下染色 30分钟，再用 200μ1上清液清洗细胞三次，以 1 %SDS溶解细胞，于室温下回旋震荡培养 1小时，将染上细胞核的结晶紫染料溶出，测定波长 595 nm下的吸光度（OD值），同时以 650 nm的参考波长修正吸光度（OD值）。

以未添加龙眼核萃取物的组别作为控制组，求得生长促进率。

(四）以 ELISA测定人类角质细胞所分泌生长因子（growth factors) 的释出量： 1、人类角质细胞经剌激后收集其上清液，以 Commercial kits测定培养液中生长因子

( growth factors ) 的量。

2、首先取 96孔板 (96 well plates) 的微量滴定板 (Microtitration plate) ，以牛血清蛋白（Bovine serum albumin)阻抑未结合位置，再以 PBS-Tween洗净，加入经剌激作用后的上清液各 100μ1，于 37°C反应 2小时后，以 PBS— Tween洗净，然后加入兔抗生长因子 (Rabbit-anti-growth factor Ab-H P Chemicon, Temecula, CA)，于 37°C反应 2小时后洗净，加入呈色的底物（Substrate, 内含邻苯二胺 0-phenyldiamine)，呈色后加入 50μ1的 2NH₂S0₄ 终止反应，并测定波长 450nm下的吸光度，从而测出生长因子（growth factors) 中的血管内皮细胞生长因子（VEGF) 的浓度。

(五）实验结果：

1、如表 10与图 8所示，以结晶紫（Crystal violet) 染色法测定增生能力与显微镜下的结果相符，显示 2.5 %、 5.0%与 10%的组别其促进角质细胞生长的倍数分别为控制组的 1.25、 1.26与 1.50倍，其中仅 10%组别具有统计上的显著意义（其 p值小于 0.05 )，表明：仅须 10%龙眼核萃取物，即可有效促进人类角质细胞的生长。

2、如表 11与图 9所示，经由酶联免疫吸附（ELISA)测定得到的结果，在涂覆胶原

I (Collagen I, CI)和纤维连接蛋白 (Fibronectin, FN) 的组别，加入 5 %及 10%龙眼核萃取物培养后，上清液中血管内皮细胞生长因子（VEGF)随剂量增加而显著上升（p<0.05 )，表明：龙眼核萃取物在促进伤口愈合过程中包含有促进血管增生的机制，能够促进生物体伤口愈合。

表 10、结晶紫染色法测定增生能力结果

表 11、酶联免疫吸附测定结果

由以上列举的体内试验、体外试验与毒性试验可知：本发明提供的龙眼核萃取物，可用于生物体并产生抗发炎反应、降低尿酸生成、抑制细菌活性，还可促进皮肤角质细胞的生长，增加伤口愈合的速度，同时该龙眼核萃取物并不会造成生物体内的脏器受损或增加其负担，故能安心使用。

Claims

权利要求书

1、一种龙眼核萃取物的制备方法，其特征在于：所述制备方法包含下列步骤：

( 1 ) 配制特定浓度的萃取溶液；

(2) 将萃取溶液温度加热至特定温度；

(3 ) 于萃取溶液中放入打碎的龙眼核颗粒，进行萃取；

(4) 将萃取后的溶液过滤、浓缩；

(5 ) 再将浓缩后的溶液进行冷冻及干燥；

(6) 制备出龙眼核萃取物。

2、依据权利要求 1 所述的龙眼核萃取物的制备方法，其特征在于：该萃取溶液为亲水性溶液或亲脂性溶液。

3、依据权利要求 2 所述的龙眼核萃取物的制备方法，其特征在于：所述亲脂性溶液为乙醇水溶液。

4、依据权利要求 3 所述的龙眼核萃取物的制备方法，其特征在于：所述乙醇溶液的浓度为 20%〜95 %。

5、依据权利要求 1所述的龙眼核萃取物的制备方法，其特征在于：步骤（2) 所述萃取溶液加热至 70X〜 90°C。

6、依据权利要求 1所述的龙眼核萃取物的制备方法，其特征在于：步骤（3 ) 所述萃取的萃取温度为 70X〜 90°C。

7、依据权利要求 1所述的龙眼核萃取物的制备方法，其特征在于：步骤（3 ) 所述萃取的萃取时间为 1〜3小时。

8、依据权利要求 1~7任一项所述方法制备出的龙眼核萃取物，其成分包含有鞣料云实素、鞣花酸和没食子酸。

9、依据权利要求 8所述的龙眼核萃取物应用于生物体抗发炎。

10、依据权利要求 8所述的龙眼核萃取物应用于降低生物体的尿酸。

11、依据权利要求 8所述的龙眼核萃取物应用于促进生物体伤口愈合。

12、依据权利要求 8所述的龙眼核萃取物应用于抑制细菌活性。