CN101495645B - 蛋白纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了纯化靶蛋白群的方法和试剂盒。该方法包括以下步骤：使包含至少95％靶蛋白群和至多5％污染蛋白的样品与具有不同结合部分的结合部分库接触，使污染蛋白和少量的靶蛋白群与结合部分库结合，使未结合的靶蛋白群与结合至结合部分库的蛋白分离，以及收集未结合的靶蛋白群。所收集的靶蛋白比样品中的靶蛋白更纯。

Description

蛋白纯化方法

相关申请的交叉参考

本申请要求2005年3月23日提交的临时申请Ser.No.60/664,794的权益，在此通过参考将公开内容以其整体并入。

发明领域

本发明涉及组合化学、蛋白质化学和生物化学领域。具体地，本发明描述了用在蛋白纯化领域的方法和试剂盒。

发明背景

对于生物技术行业来说，大规模和经济地纯化蛋白日益成为重要问题。通常，蛋白是通过细胞培养产生，采用通过插入含有蛋白编码基因的重组质粒而工程化为生产目的蛋白的哺乳动物或细菌细胞系。由于所使用的细胞系为活的生物体，它们必须用复杂的生长培养基喂养，其中含有糖、氨基酸、蛋白和生长因子，其通常由动物血清制剂来提供。在表达靶蛋白的同时也会表达很多其它的蛋白。将所需的蛋白与提供给细胞的化合物混合物以及细胞自身副产物分离，达到足以用作人治疗剂的纯度水平，提供了难以应对的挑战。

从细胞残骸分离蛋白的方法主要取决于蛋白的表达位置。可使一些蛋白直接从细胞分泌至周围的生长培养基中；其它的则在细胞内制造。对于后者，纯化方法的第一步涉及裂解细胞，这可通过多种方法来实现，包括机械剪切、渗透压休克或酶学处理。这种破碎将细胞的整个蛋白内容物释放进匀浆液，甚至进一步增加了分离靶蛋白的难度。由于细胞培养过程中细胞的自然死亡，对于直接释放的蛋白，尽管其规模较小，但是相同的问题也会出现。

一旦获得了含有目的蛋白的澄清溶液，其与细胞产生的其它蛋白的分离通常是企图采用不同层析技术的联合或相继应用。这些技术基于蛋白的电荷、疏水性程度、大小、或亲和性来分离蛋白的复杂混合物。对于这些技术中的每一种来说，可使用几种不同的层析树脂，使得能为所涉及的特定蛋白精确制定纯化方案。这些分离方法每一种的本质在于可以使得蛋白以不同的速率沿长柱向下移动，当它们进一步向下穿过柱时获得了增加的物理分离，或者有选择的吸附在分离柱上而被不同的溶剂差异洗脱。在一些情况下，当杂质特异地粘附于柱而目的蛋白不粘附于柱，即目的蛋白存在于“流出液”时，所需的蛋白与杂质分离。但是，通常经纯化的含有目的蛋白的蛋白溶液也含有多种污染蛋白和其它的不希望的杂质-尽管比用于纯化的起始材料中含量低。目前克服这个问题的努力通常涉及到所谓的精制步骤(polishing step)。这个步骤常常包括凝胶过滤(例如当污染蛋白具有不同于靶蛋白的分子量时)、免疫亲和层析或离子交换层析。

当存在于样品中的所有污染蛋白都是已知的并且可获得针对这些污染蛋白的抗体时，免疫亲和层析是最有用的。通常，随后将抗体固定至固体支持物并用作免疫吸附剂。但是，这种方法有很大的缺点。很多情况下，污染蛋白是未知的，这种抗体方法不可行。此外，免疫亲和柱昂贵并且很少能完全特异于它们的靶。

阴离子交换层析为一般方法，经常用于去除内毒素和外源DNA，二者都为相对酸性的分子。这种方法也结合其它的酸性分子，例如某些蛋白。但是，这种方法对于除去性质类似于目的靶蛋白(例如相同的净电荷)的污染蛋白是无效的。

因此，很经常地，性质未知的污染蛋白是非常不易除去的。对于治疗性蛋白溶液而言，甚至痕量的污染蛋白也可能对向其给予了该治疗性蛋白的患者具有灾难性影响。这种作用包括严重的过敏或免疫反应。通常这些作用由来自真核或原核细胞的污染蛋白所造成，这些细胞被用于重组表达治疗性蛋白。这些污染蛋白被称为HCP(宿主细胞蛋白，Host Cell Proteins)。就定义而言，HCP是多种多样的，采用现有技术的方法不能在单一过程中去除。因此，对它们的去除依赖于一系列的步骤，这也导致目的治疗性蛋白总产率的降低。因此，相对于现有技术的方法而言，所有的污染蛋白或杂质能在单一纯化步骤中至少部分地，优选完全地被去除的方法是优选的。

发明概述

本发明的目的是从已经高度纯化的样品中除去尽可能多的杂质。某些类型的结合部分库优选用于实现这个目的。具体地，可通过使用大量不同结合部分的库来最佳地实现这个目的，其中未就结合样品中特定分析物的能力对所述不同结合部分进行预选。这些库在本文中被称为“非选择性”库。(这种库中的一些结合部分的结合特异性可能在使用该库后变得明显，但这一事实并不赋予该库“选择性”。)使用这类库增加了不加区分地捕获整个群体中各种类的可能性。因此，例如每种抗体针对已知结合配偶体的抗体库将仅选择每种抗体所针对的种类；与此相反，相同规模的种系抗体库不含有结合预选分析物的抗体。这种库更可能选择未知存在于样品中的种类。可通过采用组合化学或通过随机组装化学部分来产生非选择性库。此外，通过增加库的大小，无论是选择性库还是非选择性库，人们可以增加在样品中捕获和检测的不同分析物种类(species)的数目。结合部分的非选择性库的实例包括种系抗体库、重组结合蛋白的噬菌体展示库、染料库、基于肽的组合库、寡核苷酸、寡糖以及成员的结合特异性未经预选的非组合库、不同种类的组合库及其部分。也应注意到纯化量取决于结合部分和样品中污染物的相对量。结合部分与污染物的相对量应足够大，以至于结合部分能够结合样品中大部分(即使不是全部)的污染物，但是不大到使大部分的靶蛋白也被结合至结合部分。

本发明的目的是提供纯化目的蛋白的方法。在本发明的一个实施方案中，提供了纯化靶蛋白群(target protein group)的方法。这种方法包括以下步骤：(a)使包含至少95％靶蛋白群和至多5％污染蛋白的样品与具有至少100种不同结合部分的库接触，其中所述结合部分的量足以结合污染蛋白和少量的(a minority of)靶蛋白群；(b)使污染蛋白和少量的靶蛋白群与结合部分库(library of binding moieties)结合；(c)使未结合的靶蛋白群与结合至结合部分库的污染蛋白和靶蛋白群分离；以及(d)从所述样品收集未结合的靶蛋白群。所收集的靶蛋白群比样品中的靶蛋白群更纯。在优选的实施方案中，结合部分库的量足以结合大部分的污染蛋白。

在本发明优选的实施方案中，样品包含至少98％靶蛋白群和至多2％污染蛋白。

在另一优选的实施方案中，样品包括发酵液。

在本发明优选的实施方案中，靶蛋白群由单一蛋白种类组成。

在本发明优选的实施方案中，靶蛋白包括天然产生的蛋白。在本发明另一实施方案中，靶蛋白群包括重组蛋白。在优选的实施方案中，重组蛋白选自酶、激素、生长因子、受体、疫苗、免疫球蛋白和任何前述蛋白的片段。在本发明另一优选的实施方案中，重组蛋白选自血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、促红细胞生成素(EPO)、骨形态发生蛋白(BMP)、骨衍生的神经营养因子(BDNF)、集落刺激因子(CSF)、神经生长因子(NGF)、人生长激素(hGH)、肿瘤坏死因子(TNF)、胰岛素、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)、干扰素、白介素(IL)和赫赛汀。

在本发明另外的实施方案中，所述库包括至少1,000、至少10,000、至少100,000、至少1,000,000、至少10,000,000或至少100,000,000种不同的结合部分。

在本发明优选的实施方案中，所述库为选自种系抗体库、重组多肽的噬菌体展示库、染料库、非组合库、组合库及任何前述库的部分的非选择性库。优选的库包括组合库的至少一部分。还优选的组合库包括选自多肽、多核苷酸、脂类、寡糖和小有机分子的结合部分。在另一实施方案中，组合库为六肽组合库。

优选的结合部分包括生物有机聚合物。结合部分选自染料、多肽、抗体、核酸、适体(aptamers)和小有机分子。

结合部分可结合至一个或多个固体支持物。优选的支持物或多种支持物为小珠或颗粒的集合。所述一个或多个固体支持物可选自离散颗粒(球形或不规则的)、小珠(beads)、纤维、滤器、膜和块状物(monolith)。每种结合部分可被连接至不同的固体支持物。在另一优选的实施方案中，多种不同的结合部分被连接至单一的固体支持物。

在另一实施方案中，本发明的方法在步骤(a)之前还包括培养产生靶蛋白群的细胞的步骤。所述细胞可为真核或原核细胞。靶蛋白群可从多种样品中纯化。在本发明的一个实施方案中，样品为细胞上清液。在另一实施方案中，样品为细胞提取物。

在本发明的一个实施方案中，所述方法在步骤(a)之前还包括步骤(i)使包含少于95％靶蛋白群和多于5％污染蛋白的在先样品经历至少一个纯化步骤；以及(ii)收集包含至少95％靶蛋白群和至多5％污染蛋白的样品。

在本发明的一个实施方案中，所述方法还包括步骤(e)通过使所收集的靶蛋白群与药物可接受的载体混合来制备药物组合物。

根据本发明的方法，可以多种方式来完成样品与结合部分库的接触。在优选的实施方案中，这个步骤在悬浮分批工艺中完成。在本发明另一优选的实施方案中，通过使所述样品穿过装填有连接至固体支持物的所述结合部分库的柱来完成样品与结合部分库的接触。在另一优选的实施方案中，使样品与结合部分库接触包括流化床工艺。

本发明的另一目的是提供药物组合物，其包含根据本发明的方法制备的靶蛋白群；以及药物可接受的载体。在优选的实施方案中，靶蛋白群选自酶、激素、生长因子、受体、疫苗、免疫球蛋白和任何前述蛋白的片段。在本发明另一优选的实施方案中，靶蛋白群选自血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、促红细胞生成素(EPO)、骨形态发生蛋白(BMP)、骨衍生的神经营养因子(BDNF)、集落刺激因子(CSF)、神经生长因子(NGF)、人生长激素(hGH)、肿瘤坏死因子(TNF)、胰岛素、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)、干扰素、白介素(IL)和赫赛汀。

本发明还提供了用于纯化靶蛋白群的试剂盒。在优选的实施方案中，该试剂盒包括(i)具有至少100种不同结合部分的结合部分库；以及(ii)通过使包含至少95％所述靶蛋白群和至多5％污染蛋白的样品与所述结合部分库接触来纯化靶蛋白群的使用说明。本发明的试剂盒还包括多个容纳用于使样品与结合部分库接触的孵育缓冲液的容器或分级分离柱。

本发明的其它试剂盒实施方案包括任选的功能性组分，其使得本领域普通技术人员能进行本文描述的任何方法变体。

定义

除非另有定义，本文使用的所有科技术语都具有本发明所属领域技术人员通常理解的含义。以下的参考文献就本发明中使用的很多术语为技术人员提供了一般定义：Singleton et al.，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology(2nd ed.1994)；The CambridgeDictionary of Science and Technology(Walker ed.，1988)；The Glossary ofGenetics，5th Ed.，R.Rieger et al.(eds.)，Springer Verlag(1991)；以及Hale & Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。当用在本文时，以下的术语具有归于其自身的含义，除非另有说明。

“结合部分(binding moiety)”指结合分析物的化学部分。

“结合部分库”指不同结合部分的集合。

“抗体库”指成组的抗体，即能够结合抗原上特定表位并且在结构上被定义为包含特定氨基酸序列的分子，其中该特定氨基酸序列被技术人员认定为衍生自免疫球蛋白编码基因的框架区。就结构而言，最简单的天然产生的抗体(例如IgG)包含4个多肽链，两个拷贝的重(H)链和两个拷贝的轻(L)链，都通过二硫键共价连接。结合的特异性存在于H和L链的可变(V)决定区。抗体的主要结构区为恒定区(C)。术语“抗体”包括完整抗体，该抗体的功能性片段、修饰物或衍生物。其也可为经遗传处理的产物，或双特异性抗体或嵌合抗体，如人源化抗体。抗体可以以多种形式存在，例如包括Fv(由抗体单臂的V_L和V_H结构域组成)、Fd(由V_H和C_H1结构域组成)、dAB片段(由V_H结构域组成；Ward etal.，Nature，341：544-546，1989)、分离的互补决定区(CDR)、Fab(由V_L，V_H，C_L，和C_H1结构域组成)以及F(ab)₂(包含在铰链区通过二硫键桥连接的两个Fab片段的二价片段)，以及为单链形式。也可以使用单链抗体(SCA)，其中编码重链和轻链的基因被组合进单一编码序列。一些SCA为经遗传改造的分子，包含通过适合的多肽接头连接的轻链可变区，重链可变区。

“在先样品”指包含少于95％目的靶蛋白群的蛋白部分或混合物。优选的在先样品包括但不限于例如发酵液、细胞上清液、细胞提取物、动物提取物和植物提取物。

用在本文中时，术语“蛋白”、“多肽”和“肽”指氨基酸残基的聚合物。这些术语也指这样的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然产生的氨基酸的人工化学模拟物，还指天然产生的氨基酸聚合物，含有修饰的残基的氨基酸聚合物以及非天然产生的氨基酸聚合物。本发明的肽和蛋白包括具有各氨基酸残基D和L亚型以及其它氨基酸变体的氨基酸聚合物。通过组成分子一级结构的氨基酸残基数量区别肽。出于本发明的目的，通常肽为包含至多50氨基酸残基的那些分子，而蛋白包含多于50氨基酸残基。

从包含靶蛋白群和一种或多种污染蛋白或杂质的样品中“纯化”靶蛋白群指通过部分或完全地去除至少一种或多种污染蛋白或杂质而增加靶蛋白群的纯度。

“重组蛋白”指在宿主细胞中产生的蛋白，该宿主细胞经该蛋白编码核酸转化或转染或由于同源重组而产生该蛋白。

“样品”指任何组合物，优选水溶液，其包含目的靶蛋白群和污染蛋白，并且处于这样的物理状态，其使得存在于该样品中的任何目的靶蛋白群和污染蛋白能够与结合部分库接触。样品可以为任何来源，其包含至少95％的靶蛋白群和至多5％的污染蛋白。

“固体支持物”指任何不溶材料，包括颗粒(例如小珠)、纤维、块状物、膜、滤器、塑料条等等。

已公认蛋白能够以几种能够共纯化的(co-purified)形式存在于样品中。“靶蛋白群”指待纯化的单一蛋白或相关蛋白的群组。这些相关形式可起因于翻译前和翻译后修饰之一或二者。翻译前修饰形式包括等位变体、剪接变体和RNA编辑形式。翻译后修饰形式包括由蛋白水解切割(例如，母体蛋白的片段)、糖基化、磷酸化、脂化、氧化、甲基化、胱氨酸化、磺化和乙酰化导致的形式。包括特定蛋白和其所有修饰的形式的蛋白集合在本文中被称为“靶蛋白群”。因此，例如存在于血清中的白蛋白和修饰形式的白蛋白为靶蛋白群。另外，蛋白可表达为多聚体蛋白，例如二聚体蛋白。其实例为免疫球蛋白和胰岛素。术语“靶蛋白群”也包括这种。

附图简要说明

图1显示采用组合肽库和本发明的方法纯化靶群蛋白(肌红蛋白，以血清蛋白污染)。SDS-PAGE显示了以下的蛋白级分：道“a”：以血清蛋白污染的肌红蛋白；道“b”：在流出物中收集的经精制的肌红蛋白；道“c”：污染蛋白，包括少量的结合至组合肽库的肌红蛋白。

图2显示采用组合肽库和本发明的方法纯化用5％大肠杆菌(Escherichia coli)水提取物污染的肌红蛋白。A.显示MALDI质谱图。“a”：以E.coli提取物污染的肌红蛋白；“b”：在流出物中收集的经精制的肌红蛋白。单箭头指向肌红蛋白，双箭头指向双倍大小的带电荷的肌红蛋白。B.显示SDS-PAGE分析。SDS-PAGE显示以下的蛋白级分：道“a”：以E.coli提取物污染的肌红蛋白；道“b”：从流出物中收集的经精制的肌红蛋白；道“c”：E.coli污染蛋白，包括少量的结合至组合肽库的肌红蛋白；道“d”：E.coli标准提取物。

图3显示精制(除去污染物)在巴斯德毕氏酵母(Pichiapastoris)中表达的重组人白蛋白。通过在含有1mL组合肽的柱上前沿分析最初的提取物(96％纯度白蛋白)来完成杂质分离。收集级分，每种通过SDS-PAGE进行分析。如图所示，包括级分3的最初级分含有“精制”的重组白蛋白，而最后的级分逐渐含有越来越多的污染物，这是由于组合小珠被逐渐饱和。通过箭头指出蛋白杂质洗脱的开始和包含蛋白杂质的峰组分。

发明详细说明

本发明提供了方法和试剂盒，其使得本领域普通技术人员能够从包含靶蛋白群和未知污染蛋白的样品中纯化由不超过5种不同蛋白，优选单种蛋白组成的靶蛋白群。本发明还提供了药物组合物，其包含根据本发明方法制备的靶蛋白群。本发明还提供了试剂盒，其包含使得本领域普通技术人员能够实施本文描述的任何方法的组分。

I.纯化靶蛋白群

本发明方法的一般原理是基于这样的假设，即结合部分库如组合库包含各种结合部分，它们合起来能结合大批的分析物，尤其是样品中大批的蛋白污染物。

在本发明优选的实施方案中，结合部分库如组合库内各结合部分的数目足够大，以至于推定存在于样品中的每种蛋白对各结合部分中的至少一种具有亲和力。通常，结合部分被附着在固体支持物上，例如小珠。当包含进行纯化的目的靶蛋白群和多种污染蛋白的样品与这种组合库接触时，各结合部分结合到蛋白结合配偶体(partner)，包括靶蛋白群和污染蛋白。组合库的巨大多样性提供了特异于样品中每种蛋白，即目的靶蛋白群和污染蛋白，的结合部分。但是，由于用于单一蛋白种类的小珠的容量有限，将有极少量的靶蛋白群被结合并随后从样品中去除。理论上，如果结合到加入样品中的小珠的各种组合库的量被很好地计算，则几乎所有的污染蛋白应被去除，同时目的靶蛋白群的很少部分被去除。未结合的靶蛋白群将保持在上清中，可通过过滤、离心或其它手段与结合到结合部分库的蛋白分离。分离后，收集靶蛋白群。该收集的靶蛋白群比样品中的靶蛋白群更纯。

尽管从包含目的靶蛋白群和污染蛋白的样品纯化靶蛋白群是有利的，但是技术人员也应理解，本发明的方法也可被实施以从包含靶蛋白群和非多肽污染物或杂质的样品纯化目的靶蛋白群。

A.靶蛋白群和污染蛋白

本发明的方法和试剂盒尤其可用于从包含靶蛋白群和污染蛋白的样品纯化靶蛋白群。

在本发明优选的实施方案中，靶蛋白由单种蛋白组成。

1.靶蛋白群

在本发明的一个实施方案中，被纯化的靶蛋白群包括重组蛋白。在本发明优选的实施方案中，该重组蛋白选自酶、激素、生长因子、受体、疫苗、免疫球蛋白和任何上述蛋白的片段。

目的靶蛋白群也可以为通常存在于动物或人体内的细胞蛋白，其缺失或机能失调与疾病或感染状态，诸如癌症、病毒感染、寄生虫感染、细菌感染等相关。尤其关注的还有细胞应激标志物。表明动物或人处于应激状态的靶蛋白群为多种疾病状态的早期指示物，包括某些精神病、心肌梗塞和感染。

在本发明的另一实施方案中，靶蛋白群包括治疗性蛋白。“治疗性蛋白”是任何这样的蛋白，其被给予患有疾病的患者以引发应答，该应答至少部分地阻止或延缓该疾病的症状或并发症。通常，治疗性蛋白通过重组制备，即其为重组蛋白。

在本发明另一优选的实施方案中，该重组蛋白选自血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、促红细胞生成素(EPO)、骨形态发生蛋白(BMP)、骨衍生的神经营养因子(BDNF)、集落刺激因子(CSF)、神经生长因子(NGF)、人生长激素(hGH)、肿瘤坏死因子(TNF)、胰岛素、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)、干扰素、白介素(IL)和赫赛汀(herceptin)。

治疗性蛋白可以为抗体，例如IgA，IgD，IgE，IgG或IgM。该抗体可以为单克隆或多克隆的。本发明的方法适合鼠、嵌合和人源化抗体的纯化。

本发明的方法适合于纯化多种靶蛋白群，包括但不限于，例如，(i)凝血因子，例如抗纤维蛋白酶III、凝血因子VIIa、凝血因子VIII和凝血因子IX；(ii)抗凝剂，例如组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶；(iii)罕见先天性疾病的酶，例如β葡萄糖脑苷脂酶、α-D-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、αL-艾杜糖苷酸酶、α-1，4-糖苷酶、芳香基硫酸酯酶B、艾杜糖酸-2-硫酸酯酶、腺苷脱氨酶、人脱氧核糖核酸酶I(hDNase-I)以及人活化蛋白；(iv)胰岛素和遗传修饰的胰岛素；(v)生殖激素，如人卵泡刺激素、绒毛膜促性腺激素和促黄体激素；(vi)其它激素，如人生长激素(Somatotropin)、人骨形态发生蛋白2、奈西立肽(nesiritide)和甲状旁腺激素；(vii)生长因子，例如促红细胞生成素(包括促红细胞生成素α、促红细胞生成素β、Darbepoetinα)、角质化细胞生长因子、角质化细胞生长因子-2、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Gm-CSF)；(iix)干扰素，例如α干扰素(包括聚乙二醇化的α干扰素和利巴韦林、聚乙二醇化的干扰素α-2a和copegus)、β干扰素(例如干扰素β-1a、干扰素β-1b)以及γ干扰素；(ix)白介素，例如IL-1拮抗剂、IL-2、白介素-10、白介素-11和白介素-12；(x)靶向白细胞受体的单克隆抗体，例如α4整合素拮抗剂、抗胸腺细胞球蛋白、CD2拮抗剂、CD3拮抗剂、CD4拮抗剂、CD11a拮抗剂(例如依法利珠单抗(efalizumab))、CD20拮抗剂、(Rituxan，Tiuxetan，Zeevalin，Bexxar)、CD22拮抗剂、CD33拮抗剂(吉姆单抗奥佐米星(gemtuzumabozogamicin))、以及CD52拮抗剂(阿仑单抗(alemtuzumab))；(xi)靶向细胞因子的单克隆抗体，例如趋化因子拮抗剂、IL-2拮抗剂、IL-4拮抗剂、IL-5拮抗剂、IL-6拮抗剂、IL-12拮抗剂、选择素拮抗剂、TNF-α拮抗剂；(xii)靶向癌细胞上受体的单克隆抗体，例如EGFR拮抗剂、HER-2拮抗剂(例如赫赛汀)、MUC-1拮抗剂、VEGF拮抗剂；(xiiv)其它抗体，例如rituximab(人源化的MAb)、补体抗体(例如C5抑制剂)、糖蛋白(GP)IIb/IIIa拮抗剂、IgE拮抗剂(例如omalizumab)、以及呼吸道合胞体病毒F-蛋白拮抗剂、英夫利昔单抗(嵌合MAb)、阿达木单抗(Adalimumab)、以及依那西普(etanercept)(抗体-Fc和p75-TNF受体蛋白的融合蛋白)；(xiv)用于治疗非何杰金淋巴瘤的基于蛋白的药物，例如CD20拮抗剂、CD22拮抗剂、以及IL-2拮抗剂；(xv)用于治疗白血病的基于蛋白的药物，例如CD33拮抗剂、CD52拮抗剂和α干扰素；(xvi)用于治疗实体肿瘤的基于蛋白的药物，例如单克隆抗体曲妥单抗(trastuzumab)(赫赛汀；人源化抗HER-2 MAb；乳腺癌)、西妥昔单抗(cetuximab)、以及贝伐单抗(bevacizumab)(EGFR和VEGR抑制剂)、pemtumomab和oregovomab(MUC-1抑制剂)；(xvii)用于治疗贫血的蛋白治疗剂，例如促红细胞生成素；(xiix)用于治疗充血性心力衰竭的蛋白，例如奈西立肽；(xix)用于治疗心脏病发作和中风的蛋白，例如阿替普酶、链激酶、尿激酶、GPIIb/IIIa受体抑制剂和补体抑制剂；(xx)用于治疗血友病和vonWillebrand病的蛋白，例如凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子VII、以及van Willebrand’s因子；(xxi)用于治疗中性粒细胞减少症的蛋白，例如G-CSF、G-CSF-PEG偶联物和Gm-CSF；(xxii)用于治疗血小板减少症的蛋白，例如血小板生成素；以及(xxiiv)用于治疗肺病(例如囊性纤维化、肺气肿、特发性肺纤维化)、传染性疾病(例如乙型肝炎(包括乙型肝炎病毒的包膜蛋白)、丙型肝炎、败血症和RSV)、免疫疾病(例如哮喘、类风湿性关节炎、多发性硬化症、急性移植排斥、克罗恩病和溃疡性结肠炎、牛皮癣(例如alefacept)、牛皮癣性关节炎和SCID)、皮肤和骨病(骨折、骨质疏松症和创伤)、以及其它疾病(例如，溶酶体贮存病、不育(例如促滤泡素α)以及糖尿病)的蛋白，以及以上列出的任何蛋白的片段、嵌合蛋白或融合蛋白。

根据本发明方法可被纯化的其它生物学相关靶蛋白群包括肾素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；前胰岛素；促卵胞激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；抗凝血因子如蛋白质C；心房利钠因子；肺表面活性物质；纤维蛋白溶酶原激活剂，如人尿或组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-alpha)；血清白蛋白如人血清白蛋白；Muellerian抑制性物质；松弛素A链；松弛素B链；前松弛素；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，例如β内酰胺酶；DNase；IgE；细胞毒性T细胞相关抗原(CTLA)，例如CTLA-4；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子如骨衍生的神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、-4、-5、或-6(NT-3，NT-4，NT-5，或NT-6)、或神经生长因子如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白如CD3，CD4，CD8，CD19和CD20；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；超氧化物岐化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如AIDS被膜的一部分；运输蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整合素，如CD11a，CD11b，CD11c，CD18，ICAM，VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，如EGFR，HER2，HER3或HER4受体；和任何以上列出的蛋白的片段、嵌合蛋白或融合蛋白。

此外，特定的目的靶蛋白群包括抗体。优选抗体的列表可见于美国专利申请2003/0036095(Tchaga)，通过参考将其整体并入本文。

2.污染蛋白

通常，样品含有目的靶蛋白群和污染蛋白，污染蛋白不同于靶蛋白群，人们希望将其从样品中除去。污染蛋白可以为任意数目的不同蛋白。但是，在本发明优选的实施方案中，污染蛋白在样品中的浓度至多为5％。在本发明另一优选的实施方案中，污染蛋白在样品中的浓度为至多2％。

由于本发明的方法和试剂盒提供了结合部分库，因而人们不需要污染蛋白身份或来源的任何信息。在靶蛋白群在宿主细胞中通过重组产生的情况下，污染蛋白通常来自产生该靶蛋白群的宿主细胞或来自用于培养该宿主细胞的细胞培养基。它们可为不同种类，例如胞质溶胶蛋白、结构蛋白、核蛋白、膜蛋白、酶，尤其是蛋白酶。用于产生重组靶蛋白群的合适的宿主细胞包括动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母和原核细胞。也可使用无细胞系统。

优选的用于产生重组靶蛋白群或靶蛋白群的各种蛋白的真核宿主细胞包括，但不限于，例如脊椎动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾CV1细胞(例如COS7细胞)、骨髓瘤细胞、人胚肾细胞(293细胞或用于悬浮培养的293细胞亚克隆)、人宫颈癌细胞(HELA)、人肺细胞(例如W138)、人肝细胞(例如Hep G2)、3T3细胞、小鼠Sertoli细胞(例如TM4)、非洲绿猴肾细胞(例如VERO-76)、犬肾细胞(例如MDCK)、水牛大鼠肝细胞(例如BRL 3A)。优选的为CHO和BHK细胞。因此，存在于来自CHO或BHK细胞的样品中的污染蛋白包含CHO细胞蛋白或BHK细胞蛋白。

可用于表达重组靶蛋白群或靶蛋白群各蛋白的其它真核宿主细胞为以重组酵母表达载体转化的酵母细胞(e.g.，Saccharomycescerevisiae，Schizosacharomyces pombe，Kluyveromyces lactis，Kluyveromyces fragiles，Kluyveromyces bulgaricus，Kluyveromyceswickeramii，Kluyveromyces waltii，Kluyveromyces drsophilarum，Kluyveromyces thermotolerans，Kluyveromyces marxianus，Pichiapastoris，Neurospora crassa)。根据本发明的方法还适合的纯化为在用重组病毒表达载体转染的昆虫(例如Spodoptera frugiperda，Aedes aegypti，Aedes albopictus，Drosophila melanogaster，以及Bombyx mori)细胞中表达的靶蛋白群。在植物细胞中表达的靶蛋白群也可通过使用本发明的方法来纯化。

用于产生靶蛋白群或靶蛋白群各蛋白的优选的原核宿主细胞包括，但不限于，例如E.coli(例如E.coli 294，E.coli B，E.coli X1776E.coli W3110)，Enterobacter，Erwinia，克雷白杆菌属(Klebsiella)，变形菌属(Proteus)，沙门氏菌属(例如Salmonella typhimurium)，沙雷氏菌属(例如Serratia marcescans)，志贺氏菌属，杆菌(例如B.subtilis，B.licheniformis)，假单胞菌属(例如P.aeruginosa)，和链霉菌属。优选的原核细胞为E.coli和B.subtilis。因此，存在于来自E.coli或B.subtilis的样品中的污染蛋白包括E.coli细胞蛋白或B.subtilis细胞蛋白。

B.适合的样品

样品包含至少95％靶蛋白群和至多5％污染蛋白，其在本文中也被称为分析物。在靶蛋白群包括多种不同蛋白的样品中，存在于样品中的靶蛋白群的合并总量至少为95％。例如，当三种不同的目的蛋白(即靶蛋白群)存在于样品中时，第一种蛋白可以以至少25％存在，第二种蛋白可以以至少30％存在，并且第三种蛋白可以以至少40％存在。在本发明另一优选的实施方案中，样品包含至少98％靶蛋白群和至多2％污染蛋白。

适用于本发明的样品包括气体、粉末、液体、悬浮液、乳液、可渗透的或可粉碎的固体，等等。样品优选为液体。最优选的样品为水溶液。样品可以直接从来源取得并用在本发明的方法中，无需任何预备处理。优选的样品包括但不限于例如细胞悬浮液和细胞提取物。

当表达的靶蛋白群被分泌时，其可以从生长培养基或细胞上清液中纯化。因此，在本发明优选的实施方案中，根据本发明的方法从中分离靶蛋白的样品为细胞上清液。

本发明的方法也可应用于不被分泌的靶蛋白群，即靶蛋白群一旦在宿主细胞中被表达，其就保留在宿主细胞中，从这里纯化。当被表达的靶蛋白群不从宿主细胞分泌时，优选破碎宿主细胞并让靶细胞群被释放进水提取物中。在本发明另一优选的实施方案中，根据本发明方法从中纯化靶蛋白的样品为细胞提取物。

或者，将包含少于95％目的靶蛋白群的在先样品以下文描述的各种方式进行处理，以改善其性能并获得包含至少95％靶蛋白群的样品。

在先样品可以为取自生物源的生物样品，包括生物液体，例如全血和血衍生物、血清、血浆、尿、前列腺液、眼泪、口腔液、唾液、精液(semen)、精液(seminal fluid)、粘液、粪便、痰、脑脊液、骨髓、淋巴液、胎儿液、羊水、乳和汗液。在先样品还包括生物组织样本、细胞提取物、发酵液和细胞上清液。生物样品也可通过擦、刮、手术或通过皮下针抽取，等等。在各种情况下，收集方法很大程度上取决于生物源和情形，很多备选的合适收集技术对本领域技术人员来说是公知的。通常，来自发酵液或来自生物液的靶蛋白可通过常规的分级分离和纯化方法被纯化至至少大约95％，这些方法例如为过滤、沉淀、层析或电动方法。

通常，一旦靶蛋白群在宿主细胞中被表达，其就被分泌进细胞培养基，其可以从这里被纯化。因而，在先样品可为发酵液。通常，发酵液包含表达靶蛋白群的宿主细胞、细胞碎片和颗粒物。在先样品可以为已经经过例如pH调整、离子强度调整、温度调整、水稀释和/或一种或多种固体/液体分离技术(例如絮凝、离心、过滤或微滤)处理的发酵液。因此，发酵液可以进一步通过除去表达靶蛋白群的宿主细胞、细胞碎片和颗粒物而澄清。存在于发酵液或澄清发酵液中的靶蛋白群可以在应用本发明的方法前进一步浓缩。但是，澄清和/或浓缩并非必须步骤。

C.适合的结合部分

纯化靶蛋白群的方法包括使包含至少95％靶蛋白群和至多5％污染蛋白的样品与结合部分库接触的步骤，其中该结合部分库具有至少100种不同的结合部分，其量足以结合污染蛋白和少量的靶蛋白群。

用在本发明中的结合部分库包括至少100种不同的结合部分。优选地，结合部分库包括至少与样品中分析物一样多的不同结合部分。因此，理想地，结合部分库包括至少10，50，100，1,000，10,000，100,000，1,000,000，3,000,000，10,000,000，1,000,000,000结合部分。优选地，每种结合部分识别不同的分析物。

结合部分也可以为可溶组合分子。可溶组合分子优选包含接头部分。“接头部分”使得结合部分偶合(coupled to)到包含互补接头部分的互补固体支持物。通常使可溶的组合分子与样品接触并让其与目的分析物结合，然后通过使组合分子经由它们的接头部分结合或偶合到固体支持物来分离得到的复合物。或者，组合分子可在与样品接触之前被偶合至固体支持物。

结合部分库可以存在并与使用本发明可检测的分析物相互作用，该分析物可为任何与形成分子相互作用相容的物理状态，包括气态的、水悬浮液和有机悬浮液以及乳液，最优选为液体状态。

通常并如以下详细描述的，结合部分库被偶合至不溶固体支持物或颗粒材料。每种固体支持物或不溶颗粒优选带有几个拷贝的相同结合部分，每种颗粒类型偶合不同的结合部分。

本发明的结合部分库可以通过本领域技术人员已知的任何技术来产生。例如，结合部分库可以化学合成，从天然来源收集，或者在结合部分库是生物有机聚合物的情况下，采用重组技术产生。

结合部分可以在购买时已预先偶合到固体支持物，或者可以采用标准方法间接附着或直接固定到固体支持物之上(参见，例如Harlow and Lane，Antibodies，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY(1988)；Biancala et al.，Letters in Peptide Science 2000，7(291)：297；MacBeath et al.，Science 2000，289：1760-1763；Cass et al.，ed.，Proceedings of the Thirteenth American Peptide Symposium；Leiden，Escom，975-979(1994)；美国专利5,576,220；Cook et al.，TetrahedronLetters 1994，35：6777-6780；以及Fodor et al.，Science 1991，251(4995)：767-773)。

1.组合库

在本发明的一个实施方案中，结合部分库为组合库或其部分。组合化学库为通过化学合成或生物合成，通过使多种化学“建筑块(building blocks)”以所有可能的组合进行组合而产生的化合物的集合。例如，对于指定的化合物长度(即多肽化合物中的氨基酸数目)来说，完全的线性组合化学库如多肽库是通过使一套化学建筑块(氨基酸)以所有可能的方式组合来形成。举例而言，如果建筑块的数目是5，并且构建体由5个成员组成，则可能的线性组合数目为5⁵或3,125个成员。这种情况下，建筑块(A，B，C，D和E)被线性组合，例如A-A-A-A-A；A-A-A-A-B；A-A-A-A-C；A-A-A-B-A；A-A-A-B-B；A-A-A-B-C；......；A-A-B-A-A；A-A-B-A-B；A-A-B-A-C；......；E-E-E-E-C；E-E-E-E-D；E-E-E-E-E。

另一种形式的组合库为基于骨架的。这些构建体基于单一中心分子或核心，包含可被建筑块选择性取代的位置。可举出的实例为三氯-三嗪(三个可取代的位置)，在其上可附着几个取代基。如果取代基的数目为3，则可能的组合数为10。也可以考虑每个取代基的相对位置；这种情况下，组合的数目更大。

作为第三水平，还可能将线性组合库与基于骨架的库组合，其中后者的取代基为组合线性序列。

成百万的化合物可通过化学建筑块的这种组合混合而合成。对于肽结合部分，长度优选限于15，10，8，6或4氨基酸。本发明的核酸结合部分具有至少4个，更优选6，8，10，15或至少20核苷酸的优选长度。寡糖优选为至少5个单糖单位长度，更优选8，10，15，20，25或更多的单糖单位。

组合库可以是完全或不完全的。生物聚合物的完全组合库为这样的库，其对于给定的聚合物长度和组成含有单体的每种可能的排列的代表。不完全库则对于给定的聚合物长度来说缺少一种或多种可能的单体排列。

肽结合部分为要求保护的发明的优选实施方案。产生适用于本发明的肽结合部分库的方法对本领域技术人员是公知的，例如“分开、偶合和再结合”方法(参见，例如Furka et al.，Int.J.Peptide ProteinRes.，37：487-493(1991)；Houghton et al.，Nature 354：84-88(1991)；Lam et al.，Nature，354：82-84(1991)；国际专利申请WO 92/00091；以及美国专利5,010,175，5,133,866，和5,498,538)或者现有技术中已知的其它方法。肽库的表达在Devlin et al.，Science，249：404-406(1990)中也有描述。

现有技术中公知的组合和合成化学技术可生成含有数百万成员的库(Lam et al.，Nature 354：82-84(1991)和国际(PCT)专利申请WO92/00091)，每种都具有独特的结构。例如，以18种天然氨基酸制备的线性六聚体配体库含有34×10⁶种不同的结构。当还包括进氨基酸类似物和异构体时，潜在结构的数目实际上是无限的。此外，这种库的每个成员可能具有结合不同分子的能力。组合库的成员可在固体支持物上合成或被偶合到固体支持物，如小珠，每个小珠在其表面基本上具有数百万拷贝的库成员。由于不同的小珠可以被偶合到不同的库成员并且用于偶合库成员的小珠的总数巨大，所以能够结合至小珠偶合的库成员的不同分子的可能数目是庞大的。

Hammond et al.，US 2003/0212253(2003年11月13日)沿以下的线路描述了组合库。肽结合部分库可以由相对于天然氨基酸提供了增加的稳定性的氨基酸合成。例如，半胱氨酸、甲硫氨酸和色氨酸可以从库中剔除，并包括进非天然氨基酸，例如2-naphylalanine和正亮氨酸。N末端氨基酸可以为D-异构体或可以被乙酰化以在氨基-肽酶存在下提供更大的生化稳定性。结合部分密度必须足以为靶分子提供足够的结合，但是不能过高以至于结合部分自身相互作用而不是与靶分子相互作用。结合部分密度为0.1μmole-500μmole每克支持物干重是令人期望的，并且优选结合部分密度为10μmole-100μmole每克支持物。6-mer肽库被合成在Toyopearl-AF Amino 650M树脂上(Tosohaas，Montgomeryville，Pa.)。树脂小珠的大小为每小珠60-130 mm的范围。通过偶合Fmoc-Ala-OH和Boc-Ala-OH(1∶3.8摩尔比)的混合物实现起始树脂的最初取代。偶合后，Boc保护集团被纯TFA全部去除。然后，得到的脱保护的氨基基团被乙酰化。肽链经由树脂小珠上保留的Fmoc-Ala-OH位点组装。采用了标准的Fmoc合成策略。在一个典型实验的实施方案中，6克的Fmoc-Ala-(Ac-Ala-)Toyopearl Resin用20％哌啶/DMF(2×20min)脱保护，然后用DMF洗涤(8次)并等分至18个单独的反应容器。在每个单独的容器中，使单一的Fmoc-氨基酸偶合至树脂(BOP/NMM，5-10倍过量)，进行4-7小时。洗涤各树脂，并采用“分开/混合”库技术组合(Furka et al.，Int.J.Peptide Protein Res.，37，487-493(1991)；Lam et al.，Nature，354，82-84(1991)；国际专利申请WO92/00091(1992)；美国专利5,010,175；美国专利5,133,866；以及美国专利5,498,538)。重复脱保护和偶合循环，直至完成氨基酸序列(对于六聚体库是6个循环)。采用20％哌啶/DMF在独立的反应容器在最后的偶合循环中从肽树脂去除最后的Fmoc。用TFA处理(TFA：H.sub.20：Phenol，90∶5∶5)2小时除去侧链保护基团。充分洗涤树脂并在真空下干燥。所获得的肽密度通常在0.06-0.12mmol/g树脂的范围。

确认肽配体-树脂小珠复合物的序列和肽组成，通过在Commonwealth Biotechnologies，Inc.，Richmond，Va.的定量氨基酸分析计算树脂的取代程度。测序在Protein Technologies Laboratories，TexasA&M University采用Hewlett PackardG1005A通过Edman降解进行。

用于制备组合库的装置为可购得的(参见，例如357 MPS，390 MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433A Applied Biosystems，Foster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。此外，多种组合库本身就是可购得的(参见，例如ComGenex，Princeton，N.J.，Tripos，Inc.，St.Louis，MO，3DPharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Columbia，MD，etc.)。

2.小有机分子

在本发明优选的实施方案中，所述方法包括使样品与结合部分库结合的步骤，其中该库为小有机分子的组合库。

因此，可考虑将小分子作为结合部分库用于在本发明的方法和试剂盒中使用。通常，小分子有机分子具有这样的性质，它们使得能与分析物有离子、疏水或亲和相互作用。小有机分子库包括通常用在层析过程中的化学基团，例如单-、二-和三-甲基氨基乙基基团，单-、二-和三-乙基氨基乙基基团，磺酰基，磷酰基，苯基，羧甲基基团，等等。例如，库可以使用苯并二氮

(参见，例如Bunin et al.，Proc Natl Acad SciUSA 1994，91：4708-4712)和peptoids(例如Simon et al.，Proc Natl AcadSci USA 1992，89：9367-9371)。在另一实施方案中，结合部分为染料或三嗪衍生物。这种列举绝非是穷尽的，因为本领域技术人员会很容易地识别出数千种化学功能基团，其离子、疏水或亲和性质与用作本发明方法中的结合部分库相符。

在本发明优选的实施方案中，小有机分子的组合库被共价附着至固体支持物，优选多个小珠。如下文进一步说明的，将小有机分子的组合库附着于固体支持物可以是直接的或者经由接头。

3.生物聚合物

在本发明优选的实施方案中，所述方法包括使样品与结合部分库接触，其中该库为生物聚合物的组合库。

在本发明的一个实施方案中，生物聚合物选自多肽、多核苷酸、脂类和寡核苷酸。

对于本发明的结合部分的生物聚合物库来说，线性长度优选为4至50单体单元，特别是不超过15，不超过10，理想地8，7，6，5，4或3个单体单元。对于肽库来说，长度优选限于不超过15，10，8，6或4个氨基酸。核酸库优选具有至少4，更优选至少6，8，10，15或至少20核苷酸的长度。寡糖优选具有至少5个单糖单位长度，更优选至少8，10，15，20，25或更多的单糖单位。

在本发明的一个实施方案中，生物聚合物被共价附着到固体支持物上，优选多个小珠。如下文进一步描述的，将生物聚合物的组合库附着于固体支持物可以是直接的或者经由接头。

a)肽

在本发明优选的实施方案中，生物聚合物是肽。尤其优选的结合部分库包含具有不超过50，40，30，25，20，15，10，8，6或4个氨基酸的肽，由于它们易于通过重组或固相化学技术产生。此外，结合部分的肽库可以通过使它们容易用于本发明方法的方式产生。例如，肽可以作为噬菌体展示库重组产生，其中该肽作为噬菌体外壳的一部分提呈(参见，例如Tang et al.，J Biochem 1997，122(4)：686-690)。就此而言，肽会被附着到固体支持物，噬菌体。其它的用于产生适用于本发明的肽结合部分库的方法也是本领域技术人员熟知的，例如“分开、偶合和再组合”方法(参见，例如Furka et al.，Int J Peptide Protein Res 1991，37：487-493；Fodor et al.，Science 1991，251：767-773；Houghton et al.，Nature 1991，354：84-88；Lam et al.，Nature 1991，354：82-84；国际专利申请WO 92/00091；以及美国专利Nos 5,010,175，5,133,866，和5,498,538，通过参考将它们的整体都并入本文)或现有技术中已知的其它技术。肽库的表达在Devlin et al.，Science 1990，249：404-406中也有描述。

肽结合部分库可以从相对于天然氨基酸提供了增强的稳定性的氨基酸合成。例如，半胱氨酸、甲硫氨酸和色氨酸可以从库中剔除，并包括进非天然氨基酸，例如2-naphylalanine和正亮氨酸。N末端氨基酸可以为D-异构体或可以被乙酰化以在氨基-肽酶存在下提供更大的生化稳定性。库密度必须足以为分析物提供足够的结合，但是不能过高以至于结合部分自身相互作用而不是与靶分子相互作用。库密度为0.1μmole-500μmole每克固体支持物干重是合适的，并且更优选库密度为10μmole-100μmole每克固体支持物。其它优选的范围为10μmole至100μmole每毫升固体支持物。

在一些组合肽库的实施方案中，所述肽被表达在重组噬菌体的表面以产生大库。采用“噬菌体方法”(Scott and Smith，Science 249：386-390，1990；Cwirla，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci，87：6378-6382，1990；Devlin et al.，Science，49：404-406，1990)，可构建非常大的库(10⁶-10⁸化学实体)。第二种手段是主要使用化学方法，其中的实例为Geysen方法(Geysen et al.，Molecular Immunology 23：709-715，1986；Geysen et al.，J.Immunologic Method 102：259-274，1987；和Fodor et al.方法(Science 251：767-773，1991)。Furka et al.(14th International Congressof Biochemistry，Volume #5，Abstract FR：013，1988；Furka，Int.J.PeptideProtein Res.37：487-493，1991)，Houghton(美国专利4,631,211，1986年12月授权)和Rutter et al.(美国专利5,010,175，1991年4月23日授权)描述了产生可被试验为激动剂或拮抗剂的肽混合物的方法。

在本发明优选的实施方案中，所述方法包括使样品与结合部分库接触的步骤，其中该结合部分库包括抗体库(参见，例如Vaughn etal.，Nature Biotechnology 1996，14(3)：309-314；PCT/US96/10287)。在本发明优选的实施方案中，所述方法包括使样品与展示在噬菌体颗粒上的抗体库接触。

b)多核苷酸

核酸为另一优选的结合部分的生物聚合物库。如同肽一样，核酸可以采用本领域技术人员公知的合成或重组技术产生。术语“多核苷酸”、“核酸”以及“核酸分子”在本文中可互换使用，指脱氧核糖核苷酸、核酸核苷酸和/或它们的类似物的聚合物形式，不论是单链形式还是双链螺旋。核酸分子也可以包含修饰的核酸分子，例如甲基化的核酸分子和核酸分子类似物。现有技术中已知嘌呤和嘧啶的类似物。核酸可以是天然产生的，例如DNA或RNA，或者可以是合成的类似物，如现有技术中所已知的。由于其良好的稳定性，这些类似物可以优选用作结合部分。天然结构中的修饰，包括骨架、糖或杂环碱基中的改变，已被证实增加细胞内稳定性和结合亲和性。骨架化学中有用的变化为硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯，其中全部两个非桥接氧都被硫替代；phosphoroamidites；烷基磷酸三酯和硼酸磷酸酯(boranophosphate)。无手性的磷酸衍生物包括3′-O′-5′-S-硫代磷酸酯、3′-S-5′-O-硫代磷酸酯、3′-CH₂-5′-O-磷酸酯和3′-NH-5′-O-磷酰胺。肽核酸以肽键置换了整个核糖磷酸二酯骨架。

优选的核酸结合部分为至少4，更优选至少6，8，10，15，或20核苷酸长度。核酸结合部分包括双链DNA或单链RNA分子(例如适体(aptamer))，它们结合特异的分子靶，例如蛋白或代谢物。

(1)寡糖

生物聚合物可为寡糖。由此，寡糖结合部分也被考虑用在本发明的方法和试剂盒中。寡糖结合部分优选为至少5个单糖单位的长度，更优选至少8，10，15，20，25或更多单糖单位的长度。

(2)脂类

生物聚合物可为脂类。用在本文中时，术语“脂类(lipid)”指疏水或双亲部分。因此，脂类结合部分也被考虑用在本发明的方法和试剂盒中。适合的脂类包括C14至C50的脂族、芳基、芳烷基、芳基烯基或芳基炔基部分，其可以包括至少一个选自氮、硫、氧和磷的杂原子。其它适合的脂类包括磷酸甘油酯、糖基甘油酯、鞘磷脂、固醇、磷脂酰乙醇胺或磷脂酰丙醇胺。脂结合部分优选为至少5单元的长度，更优选至少8，10，15，20，25，50或更多单元的长度。

D.结合部分向固体支持物的附着

在本发明优选的实施方案中，所述方法包括使样品与结合部分库接触的步骤，其中，结合部分库被附着到固体支持物。

1.固体支持物

可接受的用在本发明中的固体支持物可以有很多种。固体支持物可为多孔或非多孔的，但优选多孔的。其可为连续的或不连续的，柔性的或非柔性的。固体支持物可由多种材料制成，包括陶瓷、玻璃、金属、有机聚合物材料或其组合。

优选的固体支持物包括有机聚合物支持物，例如颗粒或小珠支持物、纺织或无纺织网(例如纤维网)、微孔纤维、微孔膜、空纤维或管。也可使用聚丙烯酰胺和矿物支持物，例如硅酸盐和金属氧化物。纺织和无纺织网可以是规则的或不规则的表面物理配置。尤其优选的实施方案包括球形或不规则形状的小珠或颗粒形式的固体支持物。

由于多孔材料提供了大的表面积，也是可用的。多孔支持物可以是合成的或天然的，有机的或无机的。具有孔结构的适合的固体支持物具有至少约1.0纳米(nm)的直径和至少约0.1立方厘米/克(cm³/g)的孔体积。优选地，孔直径为至少约30nm，由于更大的孔对扩散限制更少。优选地，对于更大的潜在容量而言，孔体积为至少约0.5cm³/g，由于其更大的表面积围绕着孔。优选的多孔支持物包括颗粒或小珠支持物，例如琼脂糖、亲水聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、矿物氧化物和Sepharose，包括球形和不规则形状的小珠和颗粒。

为了显著的优势，用于结合部分的固体支持物优选为亲水的。优选地，亲水聚合物为水可溶胀的，以使得分析物更好地渗透。这类支持物的实例包括天然多糖，例如纤维素、改性纤维素、琼脂糖、交联葡聚糖、氨基改性的交联葡聚糖、瓜儿胶、改性瓜儿胶、黄原胶、豆角胶和水凝胶。其它的实例包括交联的合成亲水聚合物，例如聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚乙烯醇(PVA)和改性聚乙二醇。

另一种形式的固体支持物为噬菌体，如用在噬菌体库中的一样。噬菌体展示库从噬菌体形成，该噬菌体经重组处理以表达作为噬菌体蛋白外壳一部分的结合部分。采用噬菌体展示，可容易地构建结合部分库并用于本发明的方法。

2.微颗粒固体支持物

本发明的优选实施方案使用小的、小珠形的微粒固体支持物，它们直径小于1000μm，优选小于100，10，1或0.1μm。微粒固体支持物是适合的，因为它们与更大的小珠相比具有较大的表面积体积比。微粒固体支持物也降低了容纳组合库所必需的支持物的体积，由此能使用更复杂和有效的支持物。但是，采用现有的设备，不容易在非常小(＜10μm)的小珠上合成组合库，这是由于所使用的滤器系统在釉料尺寸(frit size)方面的限制。为了克服这个问题，组合库可以在小珠上成批合成，它们随后可以通过机械研磨、挤压或声波降解片断化来形成粉末或微粒集合。采用这些技术，可以产生偶合至不同结合部分的微粒固体支持物。继而这些又可被充分混合以形成相对于混合更大的或不同大小的不同小珠而言更均一的组合物。

表面上未反应的交联基团可以与小化合物如巯基乙醇反应以防止进一步的反应性。此外，表面可以被进一步处理以防止蛋白的非特异性附着。

微粒固体支持物也可以为磁性小珠，使得易于一步分离未结合的靶蛋白群和结合到偶合至磁性小珠的结合部分的蛋白。

通过包括质谱、SDS-PAGE、毛细管电泳在内的几种方法或通过等电聚焦，可对被洗脱的分析物(例如，少量的靶蛋白群和污染蛋白)根据分子量分析蛋白组成。

或者，微粒固体支持物可以与填充剂复合并被压成小片形式。为这种形式时，其可被直接加至样品溶液，或者先在缓冲液中悬浮。

微粒固体支持物可以被置于溶液如琼脂糖或丙烯酰胺中，并被交联进凝胶自身或者通过交联剂在纤维上彼此交联以形成大块材料。

或者，微粒固体支持物可以被固定到粘性物的薄膜上。************

另一种方式是将微粒固体支持物俘获进多孔基质中。这些基质可以包括无纺纤维或织物，颗粒可能在喷熔阶段并入。

微粒可被并入单层或层叠膜中，如为了获得合适的所需结合容量所需的，其中微粒固体支持物通过压延(calendaring)或水缠结(hydroentanglement)被俘获在各层之间。

膜组合物可选自天然或合成来源，包括聚酯和聚丙烯纤维和丝网。当然，本领域技术人员会意识到在这部分中描述的很多技术一般也适用于本发明的其它实施方案。

3.将结合部分偶合至固体支持物

在本发明优选的实施方案中，结合部分被偶合至一种或多种固体支持物。将结合部分偶合至固体支持物可以通过多种机制来完成。

通过使之前制备好的结合部分库结合到固体支持物，固体支持物可被完全制备的结合部分库衍生化。或者，通过将前体分子结合至固体支持物并随后向通过第一前体分子结合至固体支持物的生长链添加另外的前体分子，结合部分库可以在固体支持物上形成。当结合部分是聚合物，尤其是诸如多肽、多核苷酸或多糖分子的生物聚合物时，这种在固体支持物上构建吸附物的机制尤其有用。采用本领域已知的方法，可通过连续向结合至固体支持物的第一单体组分(monomericcomponent)添加单体组分(例如氨基酸、核苷酸或单糖)来提供生物聚合物结合部分。参见，例如美国专利5,445,934(Fodor et al.)，在此通过参考将其整体并入。

少至1个，多至10,100，1,000，10,000，1,000,000，3,000,000，10,000,000，1,000,000,000或更多的结合部分可以被偶合至单个固体支持物。在优选的实施方案中，固体支持物为小珠形式，每个小珠结合有单一的、不同的结合部分类型。例如，在肽结合部分库中，代表一种可能的氨基酸排列的肽被结合至一种小珠，而代表另一种可能的排列的肽被结合至另一种小珠，以此类推。

结合部分可以采用可逆或不可逆反应被偶合至固体支持物。例如，可以采用包括至少一种任选地通过间隔基团化学结合至结合部分的反应官能团(如羟基、羧基、巯基、或氨基)的支持物进行不可逆反应。适合的官能团包括N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺酰酯、碘乙酰基、醛、环氧、咪唑基氨基甲酸酯、以及溴化氰和其它卤活化的支持物。可通过多种已知的技术来提供这些官能团。例如，玻璃表面可用氨基丙基三乙氧基甲硅烷以已知的方式衍生化。在一些实施方案中，结合部分在合成过程中就被偶合至固体支持物，这是本领域技术人员所已知的(例如固相肽和核酸合成、)。

或者，固体支持物和结合部分之间的可逆相互作用可以采用与固体支持物和/或结合部分结合的接头部分来进行。多种适用于本发明的接头部分为已知的，其中的一些在本文中讨论。采用接头部分偶合不同的试剂对于本领域技术人员来说是已知的，只需常规实验，他们就可采用这种公知常识来形成适用于本发明的固体支持物/结合部分偶合。

在某些实施方案中，每种不同的结合部分被偶合至不同的固体支持物。例如，当采用分开池和重组方法(split-pool-and-recombinemethod)在小珠上构建组合库时，就是如此。或者，结合部分的集合可以被偶合至小珠池，以至于每个小珠附着有多种不同的结合部分。这例如可通过在第一套支持物上创建组合库、从支持物切下结合部分并将它们重新偶合至第二支持物集合来完成。

a)接头部分

将结合部分偶合至固体支持物也可以例如通过采用接头部分来完成。在本发明的这种实施方案中，使样品与结合部分接触，该结合部分包括接头部分，其使得能使结合部分靶向和/或可逆偶合至固体支持物，优选微粒固体支持物。“接头部分”使得结合部分能被偶合至包含互补接头部分的互补固体支持物。

示例性的接头部分包括表位和his标签，它们被连接至结合部分如肽以形成融合蛋白。在这些情况下，可切割的接头序列，如特异于因子XA或肠激酶(Invitrogen，San Diego，Calif.)的那些可以任选地被包括在肽和接头之间，以帮助分离和/或分开融合分子的各组分。被设计的配体特异识别的蛋白结构域也可以被用作结合部分(参见，例如Deisenhofer，Biochemistry 20(1981)2361-2370)。很多其它的类似接头部分在现有技术中是已知的。参见，例如Hochuli，Chemische Industrie，12：69-70(1989)；Hochuli，Genetic Engineering，Principle and Methods，12：87-98(1990)，Plenum Press，N.Y.；以及Crowe，etal.(1992)OLAexpress：The High Level Expression & Protein PurificationSystem，QIAGEN，Inc.Chatsworth，Calif.；将它们的整体通过参考并入本文。

被偶合至固体支持物的结合部分的抗原决定簇和其它特性也可用作接头部分标签。示例性的标签部分包括多组氨酸(多-his)或多-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；流感HA标签多肽和其抗体12CA5(Field et al.，Mol Cell Biol 1988，8：2159-2165)；c-myc标签和其8F9，3C7，6E10，G4，B7和9E10抗体(Evan et al.，Mol Cell Biol 1985，5：3610-3616)；以及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签和其抗体(Paborskyet al.，Protein Engineering 1990，3(6)：547-553)。其它的标签抗体包括Flag肽(Hopp et al.，BioTechnology 1988，6：1204-1210)；KT3表位肽(Martin et al.，Science 1992，255：192-194)；α-微管素表位肽(Skinner etal.，J Biol Chem 1991，266：15163-15166)；以及T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1990，87：6393-6397)。

E.使样品与结合部分库接触并使样品与其结合

本发明提供了纯化靶蛋白群的方法。这些方法包括(a)使包含至少95％靶蛋白群和至多5％污染蛋白的样品与具有至少100种不同结合部分的结合部分库接触，其中结合部分的量足以结合污染蛋白和少部分的靶蛋白群，和(b)使污染蛋白和少部分的靶蛋白群与结合部分库结合。

当引入含有多种分析物的样品时，结合部分将结合样品中的各种污染物，例如污染蛋白。大量的分析物，例如目的靶蛋白群以远远超出饱和它们各自的结合部分的量存在。因此，这些大量的分析物总量的大部分将保持为未结合，仅少部分被结合至结合部分。与此相反，较少量的微量分析物，例如污染蛋白，则意味着不会饱和所以它们可用的结合部分。因此，起始量的绝大部分污染蛋白将结合至它们各自的结合部分。

在每种结合部分结合样品中其对应的分析物条件下，使存在于样品中的分析物，靶蛋白群和污染蛋白，与具有至少100种不同结合部分的结合部分库接触。通常，在使污染蛋白和少部分的靶蛋白群能够结合至结合部分的条件下使样品与结合部分库接触。纯化靶蛋白群的条件将随多种参数变化，包括靶蛋白群的固有性质、污染蛋白的性质，等等。

使样品与结合部分库接触可通过多种方法来实现。例如，使结合部分库与样品接触可以通过混合二者、将样品抹入结合部分库、使样品流过在其上附着有结合部分库的固体支持物以及其它对本领域普通技术人员来说显而易见的方法来完成。在本发明优选的实施方案中，使样品与结合部分库接触是在悬浮分批法中完成，在本发明另一优选的实施方案中，使样品与结合部分库接触是通过使样品穿过柱来完成，其中柱中填充有连接至固体支持物的结合部分库。在本发明另一优选的实施方案中，使样品与结合部分库接触包括流化床过程。

如上所推断的，结合部分可以与样品直接接触，或者结合部分可以首先结合至固体支持物。举例而言，在一个优选的实施方案中，结合部分包括接头部分。在这个实施方案中，在使得存在于样品中的分析物(即靶蛋白群和污染蛋白)能结合至结合部分的情况下，使结合部分直接与样品接触。经过足够长的时间后，使包括互补接头部分(互补于结合部分的接头部分)的固体支持物与样品接触。这使得结合部分与固体支持物通过接头部分偶合，同时保留有捕获的分析物。例如，具有生物素接头部分的结合部分会与包含有偶合至其表面的抗生物素蛋白或链霉亲和素的固体支持物偶合。

在本发明的一个实施方案中，结合部分库在与样品接触前被偶合至固体支持物。在该备选的实施方案中，让固体支持物(带有偶合的结合部分)简单地与样品接触足够的时间以使得结合部分能结合分析物，然后使固体支持物与经由在分析物和结合部分之间形成复合物而与其结合的分析物一起从样品中取出。

结合部分可以直接添加至包含靶蛋白群和污染蛋白的样品中。或者，为此可以添加任何适合的结合缓冲液。示例性的结合缓冲液包括极低或极高离子强度的盐水溶液、去垢剂溶液和有机溶剂，如下文进一步讨论的。竞争结合结合部分的试剂的溶液和悬浮液也可以用在结合缓冲液中，只要这些竞争结合试剂不干扰随后结合污染蛋白和少部分的靶蛋白群。所选择的结合缓冲液为应用-特异的并且可以容易地由本领域普通技术人员通过在公共领域中通常可获得的材料或者通过常规实验进行鉴别(参见，例如Buffers.A Guide for the Preparation and Use ofBuffers in Biological Systems，Gueffroy，D.，Ed.CalbiochemCorporation(1975)；Scopes，Protein Purification ：Principles andPractice(1982)；以及Deutscher(1990)“Guide to Protein Purification”inMethods in Enzymology vol.182，和该系列中的其它卷)。

典型地，在结合缓冲液中存在有样品和结合部分。适合的结合缓冲液的非限定性实例包括含有50mM磷酸钠和0.15M NaCl的溶液，pH7；含有50mM磷酸钠和0.15M NaCl的溶液，pH8；等等。适合的结合缓冲液包括例如基于Tris的缓冲液，基于硼酸的缓冲液、基于磷酸的缓冲液、咪唑、HEPES、PIPES、MOPS、MOPSO、MES、TES、醋酸、柠檬酸、琥珀酸等等。

适合的结合缓冲液的实例包括改变分析物和/或结合部分表面电荷的那些，例如pH缓冲溶液。pH缓冲溶液优选为强缓冲溶液，足以维持溶液的pH在酸性范围，例如在小于7，优选小于6.8，6.5，6.0，5.5，5.0，4.0或3.0的pH，或者在高于7，优选高于7.5，8.0，8.3，8.5，9.0，9.3，10.0或11.0的pH。

适于从包含靶蛋白群和污染蛋白的样品纯化靶蛋白群的pH条件是约3.5至约1、约3.5至约11、约4.0至约10.0、约5.0至约9.0、约5.5至约8.5、约6.0至约8.0或者约6.5至约7.5。在本发明备选的实施方案中，结合缓冲液具有约6.5至约8.5的pH范围。

或者，可以使用不同盐浓度的结合缓冲液。适合于从包含靶蛋白群和污染蛋白的样品纯化靶蛋白群的示例性NaCl盐浓度在约0.01M NaCl至约3M NaCl的范围，约0.05M NaCl至约1.5M NaCl的范围，约0.1M NaCl至约1.0M NaCl的范围，或者约0.2M NaCl至约0.5MNaCl的范围。优选的结合缓冲液具有约0M至约0.25M的范围。在结合缓冲液中其它适合的盐为KCl或NaHOAc。

其它的适合于本发明的结合缓冲液包括以上提及的缓冲液组分的组合。由两种或多种上述结合缓冲液组分制备的结合缓冲液能够改变污染蛋白和结合部分之间分子相互作用的选择性。

本领域普通技术人员应理解的是，用于蛋白纯化的温度条件可以随待纯化的目的靶蛋白群的性质而变化。通常，适合于从包含靶蛋白群和污染蛋白的样品纯化靶蛋白群的温度条件在约4℃至约40℃的范围，约15℃至约40℃的范围，约20℃至约37℃的范围，或者约22℃至约25℃的范围。典型的温度条件在约4℃至约25℃的范围。一个优选的温度是约4℃。

使样品和结合部分库接触并使分析物与结合部分结合进行一段足够长的时间，以便污染蛋白和小部分的靶蛋白结合至结合部分库。典型地，结合部分库和包含靶蛋白群和污染蛋白的样品一起孵育至少约10分钟，经常是至少约20分钟，更经常是至少约30分钟，更经常是至少约60分钟。孵育时间也可以是几个小时，例如多至12小时，但通常不超过1小时。当例如采用柱实施本发明的方法时，样品与结合部分库接触的时间被称为保留时间。典型的保留时间在约1分钟至约20分钟的范围。

一旦分析物已被结合至结合部分，可能希望洗脱分析物用于其它分析。有效的洗脱缓冲液中包括描述在表1中的那些。它们可以单独使用或按照预订的顺序使用(例如，首先是起离子交换作用的洗脱剂，然后是能够解除亲和相互作用的洗脱剂，等等)。

表1：针对吸附至固相肽库的蛋白的不同洗脱方案列表

洗脱剂	组分	解离的键
			盐	1M氯化钠	离子相互作用
乙二醇	50％乙二醇水溶液	中等的疏水结合
			酸性pH	200mM甘氨酸-HClpH2.5	氢键，构象变化
解离-去垢剂	2M硫脲-7M脲-4％CHAPS	混合模式，疏水结合，氢键
			变性剂	6M胍-HCl pH6	所有类型的相互作用
水-有机的	乙腈(6.6)-异丙醇-(33.3)-三氟乙酸(0.5)-水(49.5)	强的疏水结合
			酸解离剂	9M脲，2％CHAPS，加柠檬酸至pH 3.0-3.5	氢键、离子相互作用
碱解离剂	9M脲，2％CHAPS，加氨至pH 11	离子相互作用、氢键

本发明优选的洗脱缓冲液包括适用于质谱仪的基质材料。在缓冲液中包括基质材料，本发明的一些实施方案可以任选地包括将分析物从结合部分直接洗脱至质谱探测器，例如蛋白或生物芯片。在本发明的其它实施方案中，可以在从结合部分洗脱后使该基质与分析物混合。其它的实施方案包括将分析物直接洗脱至SEND或SEAC/SEND蛋白芯片，其包括预置在蛋白芯片上的能量吸收基质。在后面的这些实施方案中，不需要在稀释缓冲液中存在额外的基质材料。

F.分离和收集靶蛋白群

本发明提供了从样品纯化靶蛋白群的方法。这些方法包括将样品中未结合的靶蛋白群与结合至结合部分的污染蛋白和靶蛋白群分开的步骤。收集的靶蛋白群比样品中的靶蛋白群更纯。

如之前所描述的，捕获剂(capture agent)可在其与样品接触之前或之后被偶合至固体支持物。因此，通常，本发明的方法包括将未结合的靶蛋白群与结合至已偶合至固体支持物的结合部分结合的污染蛋白和靶蛋白群分开。这种分离可以以多种方式完成，包括但不限于例如离心、柱层析、使用接头部分或使用磁性小珠。

在一个实施方案中，将未结合的靶蛋白群与结合至已偶合至固体支持物的结合部分的污染蛋白和靶蛋白群分开是通过离心来完成。在离心包含靶蛋白群和结合至固体支持物的结合部分的样品后，结合至结合部分的蛋白被沉淀。未结合的靶蛋白群将存在于上清液中，由此可被收集。

在另一实施方案中，将未结合的靶蛋白群与结合至已偶合至固体支持物的结合部分的污染蛋白和靶蛋白群分开通过使用磁力来进行。结合至结合部分/磁性小珠的蛋白将被牵引离开未结合的靶蛋白群。未结合的靶蛋白群将存在于上清液中，由此可被收集。通常磁性小珠包含铁磁性氧化物颗粒，例如铁磁性铁氧化物、磁赤铁矿、磁铁矿或锰锌铁氧体(参见，例如美国专利6,844,426)。

在另一实施方案中，将未结合的靶蛋白群与结合至已偶合至固体支持物的结合部分的污染蛋白和靶蛋白群分开通过柱层析完成。在结合污染蛋白和少部分的靶蛋白群之后，将混合物上柱，该柱保留固体支持物和与其结合的蛋白。未结合的靶蛋白群将存在于流出物中，由此可被收集。

G.评估纯化的靶蛋白群的纯度

采用本文描述的发明方法，靶蛋白被纯化至所需的纯度。应用本发明的方法，通常导致收集的靶蛋白群比样品中的靶蛋白群更纯。因此，靶蛋白群被进一步纯化，至少96％纯，至少97％、更优选至少98％，更优选至少99％纯。

评估采用本文描述的技术纯化的靶蛋白群的纯度或者以其它方式对其进行检测、定量或表征可以采用本领域技术人员已知的任何适合方法来进行(也参见实施例)。例如，采用染料的比色测定是广泛使用的。或者，可以通过光谱方法完成检测。光谱检测器依赖于折射率的变化；紫外和/或可见光吸收或以合适波长激发后的荧光来检测组分。示例性的检测方法包括荧光比色法、吸收、反射和透光光谱法。检测的其它实例基于使用抗体(例如ELISA和Western印迹)。双折射、折光率或衍射的变化也可以被用于监测复合物形成或反应进展。尤其有用的监测分子相互作用的技术包括表面等离子共振、椭圆偏光术(ellipsometry)、共振镜像技术(resonant mirror technique)、光栅偶合的波导技术以及多极共振光谱法。这些以及其它技术是公知的，本领域技术人员无需过多的实验就可将其应用于本发明。这些方法中的很多和其它方法可以在例如“Spectrochemical Analysis”Ingle，J.D.and Crouch，S.R.，Prentice HallPubl.(1988)and“Analytical Chemistry”Vol.72，No.17中找到。

另一优选的用于表征纯化的靶蛋白群的方法为质谱法。质谱技术包括，但不限于，离子化(I)技术，如基质辅助激光解吸(MALDI)、连续或脉冲电喷雾(ESI)和相关技术(例如，IONSPRAY或THERMOSPRAY)，或块状团簇冲击(MCI)；这些离子源可与检测形式匹配，包括线性或非线性反射飞行时间(TOF)、单或多四极杆、单或多扇形磁场、傅里叶变换离子回旋加速器(FTICR)、离子陷阱以及组合(例如，离子陷阱/飞行时间)。对于离子化，可以采用多种基质/波长组合(MALDI)或溶剂组合(ESI)。例如，采用ESI(Valaskovic，G.A.et al.，(1996)Science273：1199-1202)或MALDI(Li，L.et al.，(1996)J.Am.Chem.Soc.118：1662-1663)质谱法，Subattomole水平的分析物已被检测。ES质谱法已由Fenn等人引入(J.Phys.Chem.88，4451-59(1984)；PCT申请WO90/14148)，当前的应用总结在最近的综述文章中(R.D.Smith et al.，Anal.Chem.62，882-89(1990)和B.Ardrey，Electrospray Mass Spectrometry，Spectroscopy Europe，4，10-18(1992))。MALDI-TOF质谱法已由Hillenkamp等人引入(“Matrix Assisted UV-Laser Desorption/Ionization：A New Approach to Mass Spectrometry of Large Biomolecules，”BiologicalMass Spectrometry(Burlingame and McCloskey，编辑)，Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，pp.49-60，1990)。采用ESI，在飞摩尔量的样品中确定分子量是非常精确的，由于多离子峰的存在可以被用于质谱计算。优选的分析方法采用表面增强激光解吸附/离子化(SELDI)，例如在美国专利6,020,208中所讨论的。在本发明的一些实施方案中质谱法是尤其优选的检测方法，这些实施方案中使分析物直接捕获进质谱探测器或生物芯片，或者捕获缓冲液含有基质材料或在从结合部分洗脱分析物之后与基质材料混合。

另一种广泛使用的检测和靶蛋白群表征的方法为基于目的分析物的一种或多种物理性质的电泳分离。尤其优选的分析多肽和蛋白分析物的实施方案为二维电泳。优选的应用在第一维度通过等电点分离分析物，而在第二维度通过大小分离分析物。此外，纯化的靶蛋白群和结合至结合部分的蛋白可例如通过SDS-PAGE和随后的染色来分析(参见实施例)。分析物的电泳分析方法随所研究的分析物而有相当大的变化，但是鉴别适合于给定的分析物的特定电泳方法对本领域技术人员是公知的。

质谱分析通常在质荷比(m/z)的特定值处显示蛋白峰。当用在本文时，峰为相对于一个或多个m/z、层析保留时间或其它合适的变量信号密度的局部最大值。通常，密度值或峰密度(高度、曲线下面积或其它适合的密度衡量)为任意单位，其绝对值取决于多种因素，例如检测器设置。对样品(即，包含至少95％靶蛋白群和至多5％污染蛋白)峰和包含根据本发明纯化收集的靶蛋白的溶液峰的测量和比较，提供了对所收集的靶蛋白群的纯度的评估。也可能例如使用Polaroid 665正/负即显胶片拍摄负片(negative photograph)并对负片进行光密度测量来对所收集的靶蛋白群定量。从通过光密度评估每个蛋白带而获得的每个曲线下面积开始，可计算所收集的靶蛋白群的纯度。

H.纯化靶蛋白群的其它步骤

通常，本发明的方法可与用在靶蛋白群下游处理中的常规分离方法联合使用。

1.培养宿主细胞

在本发明优选的实施方案中，所述方法包括在使包含靶蛋白群的样品与结合部分库接触之前培养产生靶蛋白群的细胞的步骤。在优选的实施方案中，所述细胞为如上所述的宿主细胞。对于给定的宿主细胞，优选的培养条件可以在科技文献中找到和/或从宿主细胞来源如美国典型微生物收藏所得到。

培养的宿主细胞可为真核细胞或原核细胞。培养宿主细胞的方法在现有技术中是已知的。用于产生靶蛋白群的真核宿主细胞可以在多种培养基中培养。可购得的培养基如Ham′s F10(Sigma)、最小必须培养基((MEM)，(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)以及Dulbecco′s ModifiedEagle′s Medium((DMEM)，Sigma)适于培养真核宿主细胞。此外，在Hamet al.，Meth.Enz.58：44(1979)，Barnes et al.，Anal.Biochem.102：255(1980)，美国专利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985中描述的任何培养基都可以用作宿主细胞的培养基。需要时，这些培养基中的任何培养基都可以补充激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(如Gentamycin

)、痕量元素(被定义为通常以微摩尔范围最终浓度存在的无机化合物)以及葡萄糖或等价能源。任何其它必须的补充物也可以本领域技术人员已知的合适浓度包括进来。培养条件，例如温度、pH等为针对表达所选的用于宿主细胞的先前使用的条件，这对普通技术人员来说是已知的。

培养原核细胞、表达重组蛋白和产生肽的方法在现有技术中是已知的(参见，例如Sambrook et al.，Molecular Cloning， A LaboratoryManual(2nd ed.1989)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：ALaboratory Manual(1990)；以及Ausubel et al.，eds.，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley interscience，N.Y.(1994))。

2.纯化在先样品

在本发明的一个实施方案中，所述方法进一步包括在使样品与结合部分库接触之前使包含靶蛋白群和污染蛋白的在先样品经过至少一种纯化步骤并收集包含靶蛋白群和污染蛋白的样品的步骤，由此样品中的靶蛋白群比在先样品中的靶蛋白群更纯。

包含少于95％目的靶蛋白群的在先样品可以以多种方式进行处理，以改善其性能并获得包含至少95％靶蛋白群的样品，其可被用在本发明的方法中。对在先样品的这种操作包括纯化、除去某些分析物、浓缩、磨碎、提取、浸滤、稀释、过滤、筛滤，等等，它们提高目的靶蛋白群的纯度使其适用于本发明的方法。例如，固体样品可以被微粉化成粉末，然后使用水性或有机溶剂提取。来自粉末的提取物然后可以用于本发明的方法。气体样品可以被鼓泡或滤过溶液以在液体中溶解和/或浓缩气体的组分，随后将该液体用于本发明的方法。

其它的纯化步骤包括但不限于过滤、透析、沉淀(例如硫酸铵沉淀、乙醇沉淀)；制备电动方法(例如电泳，等电聚焦)、液体层析(例如阴离子或阳离子交换层析、羟基磷灰石层析、采用抗体的亲和层析、疏水相互作用层析(HIC)、反相HPLC、硅胶柱层析、色谱聚焦以及凝胶过滤)。

3.制备药物组合物

根据本发明方法纯化的靶蛋白群可以被用于制备药物组合物，该药物组合物可被用于该靶蛋白群的已知的各种治疗或其它用途。因此，在本发明的一个实施方案中，所述方法还包括使所收集的靶蛋白群与药物可接受的载体混合制备药物组合物的步骤。

这种载体可为无菌液体，例如水和油，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油，例如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等等。当药物组合物通过静脉给药时，优选的载体为水。盐溶液和含水葡萄糖以及甘油溶液也可以用作液体载体，尤其是用于可注射溶液。适合的药物载体包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、淀粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、干燥脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇，等等。

口服制剂可包括标准载体，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁，等等。适合的药物载体的实例描述在E.W.Martin的“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中。这类药物组合物将含有治疗有效量的根据本发明纯化的靶蛋白群，连同适合量的载体，以便为向宿主给药提供适当的形式。

II.药物组合物

本发明还提供了药物组合物。在优选的实施方案中，该药物组合物包含根据本发明方法制备的靶蛋白群以及药物可接受的载体。

药物组合物的靶蛋白群可以是本文描述的任何蛋白或现有技术中已知的蛋白。根据本发明的方法制备的靶蛋白与现有技术中已知的靶蛋白群的区别在于包含所纯化的靶蛋白群的最终溶液的纯度和不存在污染蛋白。如本文所述，通常即使是高度纯化的蛋白制剂(参见实施例1)也包含采用标准技术不能与目的靶蛋白群分离的污染蛋白。但是，采用本发明的方法纯化靶蛋白群，则污染蛋白能够几乎完全被去除。因此，采用本发明方法纯化的靶蛋白群特征在于其更好的纯度，因而是更令人期望的并且不同于通过其它技术纯化的靶蛋白群。

如果需要，本发明的药物组合物还可含有小量的增湿或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、粉末、缓释制剂等等的形式。组合物可被制备为栓剂，含有传统的粘合剂和载体，如甘油三酯。

III.试剂盒

本发明还提供了用于纯化靶蛋白群的试剂盒。该试剂盒含有使得本领域普通技术人员能进行本文描述的方法的组分。在优选的实施方案中，该试剂盒包括具有至少100种不同结合部分的结合部分库和通过使包含至少95％靶蛋白群和至多5％污染蛋白的样品与结合部分库接触来纯化靶蛋白群的使用说明。

该使用说明可以以多种形式存在于所述试剂盒中，试剂盒中可存在有一种或多种形式。使用说明可以作为适合的介质或基底上的印刷信息而存在，例如一页纸，在其上印刷有如何通过使包含至少95％靶蛋白群和至多5％污染蛋白的样品与结合部分库接触来纯化靶蛋白群的信息。另一形式可能是计算机可读形式的介质，例如CD或软盘，在其上记录了如何通过使包含至少95％靶蛋白群和至多5％污染蛋白的样品与结合部分库接触来纯化靶蛋白群的信息。另一形式可能是网址，其可被试剂盒的使用者使用，经由因特网访问关于如何通过使包含至少95％靶蛋白群和至多5％污染蛋白的样品与结合部分库接触来纯化靶蛋白群的信息。

在本发明的另一实施方案中，本发明的试剂盒还包括多个容纳有用于使样品与结合部分库接触的孵育缓冲液的容器，或一个或多个柱，例如分级分离柱。

在本发明的一些试剂盒中，结合部分库以结合至固体支持物、优选不溶性小珠的形式被提供。在其它实施方案中，固体支持物和结合部分库被分开提供。当分开提供时，结合部分库和/或固体支持物包括结合部分和/互补接头部分，它们使得本发明的实施者能够在进行本文描述的发明过程中将结合部分偶合至固体支持物。提供分开的结合部分库和固体支持物的试剂盒可以任选地包括其它的为进行结合部分库向固体支持物的偶合所需的其它试剂。

此外，本发明的试剂盒可包括用于从在先样品纯化靶蛋白的层析介质，便于随后采用本发明的结合部分库的精制。

本发明的其它试剂盒实施方案包括任选的功能性组分，其使得本领域普通技术人员能进行本文描述的任何方法变体。

尽管前述的发明已经通过解释说明和实例的方式出于清楚和理解目的而进行了一定程度的详细描述，但是对本领域普通技术人员而言显而易见的是，借助于本发明的指导可在不脱离本发明的精神和范围的情况下对其进行某些变动、修改、修饰和等价替换。结果，本文描述的实施方案可经受各种修饰、变化等，而本发明的范围仅通过参照所附的权利要求来确定。本领域技术人员可容易地意识到多种非关键性的参数可以改变、变动或修饰以得到基本上类似的结果。

尽管本发明的每个要素在本文中都被描述为含有多个实施方案，但是除非另有说明，应理解的是本发明给定要素的每个实施方案能够与本发明其它要素的每个实施方案一起使用，而每种这类使用旨在形成本发明的不同实施方案。

从以上的公开内容可知的是，本发明具有多种多样的应用。本发明进一步通过以下的实施例来举例说明，它们仅仅是说明性的而无意以任何方式限制本发明的定义和范围。

IV.实施例

实施例1：从纯化的肌红蛋白分离血清蛋白

首先将纯的肌肉肌红蛋白(Sigma)用人血清蛋白污染，所得到的混合物(包含95％的肌红蛋白(即目的靶蛋白群)和至多5％的污染血清蛋白)随后采用连接到小珠的组合肽库精制。该组合肽库包含约30,000,000结合部分。

将肌红蛋白以10mg/ml的浓度溶解在25mM磷酸缓冲液(pH 7.4)中。向该溶液中加入5％去除了白蛋白的人血清蛋白(即污染蛋白)。这对应于在溶液中存在至多5％的肌红蛋白。随后将400μL蛋白溶液与80μL的连接至固相的组合肽库混合。在室温下将悬浮液轻轻晃动60分钟。然后，通过过滤将上清液(未结合的精制的肌红蛋白)与结合至连接到固相的组合肽库的蛋白质分开。用磷酸缓冲液洗涤固相。结合到组合小珠库的蛋白(蛋白杂质)随后被完全解吸附并收集用于分析。

所得到的组分通过SDS-PAGE分析，并与起初的被污染的肌红蛋白进行比较(图1)。在污染的肌红蛋白中可清楚地看到几种蛋白杂质(道a)。它们为不同的分子量并代表约5％的总蛋白；它们中的大部分来自所添加的血清，极少的其它蛋白为最初纯的肌红蛋白的一部分。道b显示精制的血红蛋白。在采用组合肽库精制之后，肌红蛋白的最终纯度高于精制处理前(比较道“a”和“b”)。总的回收率估计为约95％。结合到组合肽库并在精制后完全解吸附的蛋白显示在道c。很多不同的血清蛋白被组合肽库捕获，包括少量的肌红蛋白。

采用96.3％肌红蛋白和3.7％污染血清蛋白重复这个实验，得到类似的结果。

实施例2：分离E.coli蛋白和纯化的肌红蛋白

首先将纯的肌肉肌红蛋白(Sigma)用可溶的E.coli蛋白污染，所得到的混合物(包含95％的肌红蛋白(即目的靶蛋白群)和至多5％的污染血清蛋白)随后采用连接到小珠的组合六肽库精制。

将100mg的肌红蛋白溶解在400μL的25mM磷酸缓冲液(pH 7.4)中。向该溶液中加入5％可溶E.coli蛋白(即污染蛋白)。随后将得到的溶液与80μL的连接至固相的组合六肽库混合。在室温下将悬浮液轻轻晃动20分钟。然后，通过离心将上清液(未结合的精制的肌红蛋白)与结合至连接到固相的组合六肽库的蛋白质分开。用磷酸缓冲液洗涤固相并分析收集的未结合的蛋白。

通过SELDI MS(图2A)和SDS-PAGE(图2B)进行分析，并与起初被污染的肌红蛋白比较(图2)。在包含被污染的肌红蛋白的样品中几种蛋白杂质清晰可见(道“a”)。它们为不同的分子量并且代表约5％的总蛋白。大部分的这些污染蛋白来自E.coli提取物，少数其它的为最初纯肌红蛋白的一部分。图2A和2B的道“b”显示了精制的肌红蛋白。采用组合肽库精制后的肌红蛋白最终纯度＞99％，因而显著高于精制处理前(比较来自SDS-PAGE和SELDI MS分析的道“a”和“b”；图2)。总回收率估计为约95％。结合到组合肽库并在精制后完全解吸附的蛋白显示在图2B道“c”(SDS-PAGE)中。图2B道“d”显示最初的来自E.coli的提取物，用于与解吸附的杂质进行比较。

实施例3：分离P.pastoris蛋白和纯化的重组人白蛋白

将纯化的重组人白蛋白(96％)和P.pastoris蛋白(4％)的溶液以10mg/mL的浓度制备在磷酸缓冲盐水(PBS)中。另外，填充1mL的固相组合六肽库柱，用PBS平衡，并被连接至层析设备，该层析设备包括泵系统和UV/pH检测单元，用于在柱的出口记录这两种事件。

将柱用重组人白蛋白/P.pastoris蛋白溶液连续上样，以50cm/小时的线性流速精制。以几个mL每级分收集流出物来分析固相支持物除去蛋白杂质的能力，类似于前沿分析(frontal analysis)。一旦上样结束，PBS溶液被引入以洗涤过量的蛋白。然后通过SDS-PAGE和质谱分析法来分析收集的级分。结果表明最初的三个级分含有纯的白蛋白而剩余级分逐渐含有越来越多的污染蛋白，这是由于组合小珠柱被饱和。图3显示整个层析图，以及某些级分的电泳分析。

实施例4：靶蛋白群的纯化

本发明的方法适合于从例如包含至少95％靶蛋白群和至多5％污染蛋白的25升样品纯化靶蛋白群，其中该溶液中污染蛋白以10^-6M至约10^-12M的浓度存在并且包含约40可检测但未确定的各污染蛋白。向该样品中加入0.5升包括约30,000,000种肽结合部分的组合肽库的小珠，浓度为每ml小珠50μMol分析物。

通过参考并入

通过参考将本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请以其整体并入本文，如同每一所有出版物、专利或专利申请被明确和分别地指出通过参考而并入一样。

Claims (25)

1.一种纯化靶蛋白群的方法，包括以下步骤：

(a)使包含至少95％靶蛋白群和至多5％污染蛋白的样品与包括至少100种不同结合部分的库接触，其中所述结合部分的量足以结合污染蛋白和少量的所述靶蛋白群；

(b)使所述污染蛋白和所述少量的靶蛋白群与所述结合部分库结合；

(c)使未结合的靶蛋白群与结合至所述结合部分库的所述污染蛋白和靶蛋白群分离；以及

(d)从所述样品收集所述未结合的靶蛋白群；

由此所收集的靶蛋白群比所述样品中的所述靶蛋白群更纯，

其中所述库为组合肽库，并且所述结合部分为多肽。

2.权利要求1的方法，其中所述样品包含至少98％的所述靶蛋白群和至多2％的污染蛋白。

3.权利要求1的方法，其中所述样品包括发酵液。

4.权利要求1的方法，其中所述靶蛋白群由单一蛋白种类组成。

5.权利要求1的方法，其中所述靶蛋白群包括重组蛋白。

6.权利要求5的方法，其中所述重组蛋白选自酶、激素、生长因子、受体、疫苗、免疫球蛋白和任何前述蛋白的片段。

7.权利要求5的方法，其中所述重组蛋白选自血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、促红细胞生成素(EPO)、骨形态发生蛋白(BMP)、骨衍生的神经营养因子(BDNF)、集落刺激因子(CSF)、神经生长因子(NGF)、人生长激素(hGH)、肿瘤坏死因子(TNF)、胰岛素、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)、干扰素、白介素(IL)和赫赛汀。

8.权利要求1的方法，其中所述靶蛋白群包括天然产生的蛋白。

9.权利要求1的方法，其中所述库包括至少1,000、至少10,000、至少100,000、至少1,000,000、至少10,000,000或至少100,000,000种不同的结合部分。

10.权利要求1的方法，其中所述组合肽库为六肽组合库。

11.权利要求1的方法，其中所述结合部分被结合至一个或多个固体支持物。

12.权利要求11的方法，其中所述一个或多个固体支持物为小珠或颗粒的集合。

13.权利要求11的方法，其中所述一个或多个固体支持物选自小珠、纤维、滤器、膜和块状物。

14.权利要求11的方法，其中每个结合部分被连接至不同的固体支持物。

15.权利要求11的方法，其中多个不同的结合部分被连接至单个固体支持物。

16.权利要求1的方法，在步骤(a)之前还包括培养产生所述靶蛋白群的细胞的步骤。

17.权利要求16的方法，其中所述细胞为真核细胞。

18.权利要求16的方法，其中所述细胞为原核细胞。

19.权利要求16的方法，其中所述样品为细胞上清液。

20.权利要求16的方法，其中所述样品为细胞提取物。

21.权利要求1的方法，在步骤(a)之前还包括以下步骤：

(i)使包含少于95％所述靶蛋白群和多于5％所述污染蛋白的在先样品经历至少一个纯化步骤；以及

(ii)收集包含至少95％所述靶蛋白群和至多5％所述污染蛋白的样品。

22.制备药物组合物的方法，包括以下步骤：

(a)使包含至少95％靶蛋白群和至多5％污染蛋白的样品与包括至少100种不同结合部分的库接触，其中所述结合部分的量足以结合污染蛋白和少量的所述靶蛋白群；

(b)使所述污染蛋白和所述少量的靶蛋白群与所述结合部分库结合；

(c)使未结合的靶蛋白群与结合至所述结合部分库的所述污染蛋白和靶蛋白群分离；

(d)从所述样品收集所述未结合的靶蛋白群；

由此所收集的靶蛋白群比所述样品中的所述靶蛋白群更纯；以及

(e)通过使所收集的靶蛋白群与药物可接受的载体混合来制备药物组合物，

其中所述库为组合肽库，并且所述结合部分为多肽。

23.权利要求1的方法，其中步骤(a)在悬浮分批工艺中完成。

24.权利要求1的方法，其中步骤(a)通过使所述样品穿过装填有连接至固体支持物的所述结合部分库的柱来完成。

25.权利要求1的方法，其中步骤(a)包括流化床工艺。

Images