DE69635242T2

DE69635242T2 - Probengeber für massenspektrometrie

Info

Publication number: DE69635242T2
Application number: DE69635242T
Authority: DE
Inventors: W. Randall NELSON
Original assignee: ARIZONA BOARD OF REGENTS TEMPE; Arizona State University ASU
Current assignee: ARIZONA BOARD OF REGENTS TEMPE; Arizona State University ASU
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: AU729513B2; EP0832201B1; ATE305969T1; EP0832201A1; CA2221250A1; EP0832201A4; DE69635242D1; WO1996040888A1; CA2221250C; JP3879030B2; AU6254996A; JPH11507722A; AU729513C

Description

Diese Erfindung wurde ganz oder teilweise von der Regierung der Vereinigten Staaten gemäß einem Vertrag, der durch das US Department für Energie vergeben wurde, unterstützt. Die Regierung der Vereinigten Staaten hat gewisse Rechte an dieser Erfindung in Übereinstimmung mit den Bestimmungen dieses Vertrages.
Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen derivatisierte Vorrichtungen für die massenspektrometrische Probendarstellung und insbesondere Vorrichtungen für die massenspektrometrische Probendarstellung, die mit Komplexen derivatisiert sind, die mindestens ein Molekül, das ein Biomolekül modifiziert, enthalten.
Üblicherweise ist die Massenspektrometrie eine Technik, die zur Charakterisierung von Analyten durch Bestimmung von deren Molekulargewicht verwendet wird. Gewöhnlich weist die Massenspektrometrie die Schritte zur Beschichtung einer Probendarstellungsvorrichtung mit einem Analyten, die Einführung der Probendarstellungsvorrichtung in das Massenspektrometer, die Verdampfung und Ionisierung des Analyten, die Beschleunigung des ionisierten Analyten gegenüber einem Detektor, in dem die Ionen einem elektrischen und/oder magnetischen Feld ausgesetzt werden und die Analyse der Daten, um das Masse/Ladungs-Verhältnis von spezifischen Analyt-Ionen zu bestimmen, auf.
Wenn ein Analyt während dieses Prozesses intakt bleibt, können Daten erhalten werden, die dem Molekulargewicht eines gesamten intakten Analyt-Ions entsprechen. Dennoch ist es üblich, dass die zusätzliche Sammlung von Daten, die dem Molekulargewicht von verschiedenen Fragmenten des Analyten entsprechen, vorteilhaft ist. Es ist ebenso vorteilhaft, Daten zu erhalten, die nur dem reinen Analyten entsprechen, sogar wenn Verunreinigungen anwesend sind. Daher ist es vorteilhaft, in der Lage zu sein, die Analyten durch deren Reinigung und/oder deren Spaltung vor der Bestimmung ihres Molekulargewichts zu modifizieren.
In der herkömmlichen Massenspektrometrie wird der Analyt entweder vor der Beschichtung auf der Probendarstellungsvorrichtung oder während der Verdampfungs- und Ionisierungsschritte, die in dem Massenspektrometer ablaufen, modifiziert. Es ist bekannt, dass Biomoleküle (z.B. Polypeptide, Desoxyribonukleinsäure (DNA), Ribonukleinsäure (RNA) oder Kohlenhydrate) an spezifischen Stellen biologisch abgebaut werden können, indem sie immobilisierten Komplexen ausgesetzt werden. Dennoch bringt es Nachteile mit sich, den Analyten vor der Beschichtung auf der Probendarstellungsvorrichtung zu modifizieren, da dieser zusätzliche Schritt den Gesamtprozess verlangsamt, zu einem Verlust an Analyten führt und mögli cherweise Kontaminationen einführen kann. Darüberhinaus kann die Kinetik der Reaktion ziemlich langsam sein, wenn die Fragmente in Lösung durch eine Reaktion zwischen dem Analyten und einem. Reagenz erzeugt werden, was zu einer weiteren Verzögerung führt. Ein weiterer Nachteil ist es, Fragmente während der Verdampfungs- und Ionisierungsschritte herzustellen, weil solche Verfahren üblicherweise eine schlechte Kontrolle über die Spaltungsstelle des Analyten ermöglichen und zu einem übermäßigen Abbau des Analyten führen können.
Es ist weiterhin bekannt, die matrixunterstützte Laser-Desorptionsionisations-Technik (englisch: matrixassisted laser desorption/ionisation, MALDI) für die Verdampfung und Ionisierung von Biomolekülen in einem Massenspektrometer zu verwenden. Bei dieser Technik wird ein Biomolekül von einem speziellen Matrixmaterial umgeben. Ein Laserstrahl, der auf eine Frequenz abgestimmt ist, bei der die Matrix absorbiert, wird auf das Matrixmaterial gerichtet. Der Laser überträgt genügend Energie, um einen kleinen Anteil des Matrixmaterials zu verdampfen. Eine kleine Anzahl von Analytmolekülen wird so zusammen mit dem Matrixmaterial in die Gasphase im Massenspektrometer übertragen.
Vor der Entwicklung von MALDI war die Analyse von Biomolekülen mit der Massenspektrometrie ziemlich schwierig, wenn nicht unmöglich, weil keine Techniken zur Verfügung standen, die schonend genug sind, um intakte Biomoleküle ohne Abbau oder Fragmentierung zu verdampfen. Während die MALDI-Technik eine bevorzugte Technik für die Verdampfung von Biomolekülen darstellt, kann diese Technik nicht die Erzeugung von Analyt-Fragmenten oder die Aufreinigung eines Analyten vor Überführung des Analyten auf die Probendar stellungsvorrichtung ermöglichen. Insbesondere führt die Notwendigkeit zusätzlicher Fragmentierungs- oder Aufreinigungsschritte zu einer Verlangsamung des Gesamtprozesses, zu einer Vergeudung des wertvollen Analyten und kann Kontaminationen einbringen.
Aus der WO 94/28418 ist es bekannt, eine Probendarstellungsvorrichtung für die Laser-Desorptionsionisations-Massenspektrometrie zu verwenden, wobei die Probendarstellungsvorrichtung mit an der Oberfläche assoziierten Molekülen für eine verbesserte Desorption und Ionisation von Biomolekülen derivatisiert ist. In solchen oberflächengebundenen Biomolekül-Verfahren binden die an der Oberfläche assoziierten Moleküle Biomoleküle und verbessern später die Desorption der Biomoleküle, wenn diese Laser-Strahlung ausgesetzt sind. Die Biomolekül-Fragmente werden erzeugt, indem die an der Oberfläche gebundenen Biomoleküle Reagenzien in der Lösung ausgesetzt und später die Reagenzien ausgewaschen werden. Diese Prozedur ist problematisch, weil hierdurch Kontamination eingebracht werden können, die die Qualität der gesammelten Daten mindert. Insbesondere wenn irgendein Reagenz nach dem Auswaschen auf der Oberfläche verbleibt, wird es das erste Material sein, das durch den Laser-Strahl verdampft wird, und dies kann die Signale des interessierenden Materials sehr gut überlagern, wodurch die Daten nachteilig beeinflusst werden.
Außerdem ist solch ein Verfahren schwierig, da es auf neuen und unerprobten Systemen für die Verdampfung von Biomolekülen beruht. Im Gegensatz hierzu sind MALDI-Matrix-Systeme ausführlich erprobt und bekannt dafür, effektiv und schonend Biomoleküle zu verdampfen. MALDI-Matrizes können nicht mit dem Verfahren von an der Oberfläche assoziierten Molekülen verwendet werden, da die Matrix die an der Oberfläche gebundenen Biomoleküle überzieht, wodurch die Sammlung von nützlichen Daten vollständig verhindert würde.
Weiterhin ist es auch nachteilig, Biomoleküle direkt an einer Probendarstellungsoberfläche zu binden, weil dies die Möglichkeit der Übertragung eines modifizierten Biomoleküls auf einen zweiten Bereich der Darstellungsoberfläche oder eine zweite Darstellungsoberfläche, wo es anderen modifizierenden Reagenzien ausgesetzt werden könnte, ausschließen würde. Daher müssen sämtliche chemischen Reaktionen gemäß des Verfahrens des an der Oberfläche gebundenen Analyten sequentiell und nicht parallel durchgeführt werden. In solchen sequentiellen Verfahren muss der gebundene Analyt mit einem Reagenz reagieren, in das Massenspektrometer überführt werden, entfernt werden und anschließend mit einem zweiten Reagenz reagieren. Jeder dieser Schritte ist nachteilig, da er eine Möglichkeit der Kontamination der Probe darstellt und eine weitere zeitliche Verzögerung mit sich bringt.
Aufgrund der vorgenannten Gründe besteht ein Bedarf nach einer massenspektrometrischen Probendarstellungsvorrichtung, die ein schnelles und effizientes Verfahren für die Analyse von Biomolekülen unter Verwendung erprobter vorteilhafter MALDI-Matrizes bereitstellt.
Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Probendarstellungsvorrichtung, ein massenspektrometrisches Verfahren und ein Massenspektrometer bereitzustellen, die die Nachteile des Standes der Technik beseitigen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine verbesserte Probendarstellungs vorrichtung bereitzustellen, die einen Komplex enthält, der zur Modifizierung von Biomolekülen in der Lage ist, wobei es nicht notwendig ist, jegliche Reagenzien vom modifizierten Biomolekül zu trennen, um die Kontamination der von dem modifizierten Biomolekül erhaltenen Daten zu verhindern.
Weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine verbesserte derivatisierte massenspektrometrische Probendarstellungsvorrichtung bereitszustellen, die den Probenverlust minimiert und somit effektiv mit extrem geringen Mengen der Biomoleküle arbeiten kann.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine massenspektrometrische Probendarstellungsvorrichtung bereitzustellen, die einen Komplex bereitstellt, der ein Biomolekül in einer hohen effektiven Konzentration chemisch modifizieren kann und so die Geschwindigkeit von Biomolekül-Modifizierungsreaktionen erhöht.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine massenspektrometrische Probendarstellungsvorrichtung bereitzustellen, die Biomoleküle biologisch abbaut und/oder aufreinigt.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine derivatisierte massenspektrometrische Probendarstellungsvorrichtung bereitzustellen, die bestehende optimierte MALDI-Matrixsysteme verwenden kann.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein massenspektrometrisches Verfahren bereitzustellen, bei dem Biomoleküle mit einem Reagenz reagieren und dann ein Teil der reagierten Biomoleküle mit einem anderen Reagenz reagiert.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung einer massenspektrometrischen Probendarstellungsvorrichtung bereitzustellen, das die Nachteile des Standes der Technik beseitigt.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Analyse eines Biomoleküls bereitzustellen, wobei das Biomolekül der derivatisierten Oberfläche der Probendarstellungsvorrichtung ausgesetzt und dann in einer feuchten Atmosphäre inkubiert wird. Nachfolgend wird ein MALDI-Matrixmaterial zugesetzt und schließlich wird die Probendarstellungsvorrichtung in das Massenspektrometer überführt.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Analyse eines Polypeptids bereitzustellen, wobei die Molekulargewichtsdaten zur Bestimmung einer limitierten Aminosäurensequenz des Peptids verwendet werden. Die hierdurch erhaltene limitierte Aminosäurensequenz kann dann für die Herstellung entsprechender Nukleinsäuresequenzen verwendet werden.
Diese Nukleinsäuresequenzen können dann verwendet werden, um Computer-Datenbanken zu durchsuchen, die bekannte Nukleinsäuresequenzen enthalten. Ein Treffer kann eine bekannte Nukleinsäuresequenz identifizieren, die das Polypeptid codiert.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Massenspektrometer bereitzustellen, das eine verbesserte massenspektrometrische Probendarstellungsvorrichtung aufweist.
Diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden durch Bereitstellung einer Probendarstellungsvorrichtung erreicht, die folgendes aufweist:

(a) eine massenspektrometrische Probendarstellungsvorrichtung mit einer massenspektrometrischen Probendarstellungsoberfläche und
(b) ein auf der Oberfläche immobilisierter Komplex, wobei der Komplex mindestens ein Molekül enthält, das entweder ein Biomolekül durch selektive Spaltung des Biomoleküls an mindestens einer spezifischen Stelle chemisch modifiziert oder das ein Biomolekül durch Immobilisierung mindestens eines Fremdatoms aufbereitet, wobei das Biomolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden, DNA, Kohlenhydraten, RNA und Kombinationen hiervon.

Weiterhin wird ein Verfahren zur Herstellung einer Probendarstellungsvorrichtung bereitgestellt mit folgenden Schritten:
Bereitstellung einer massenspektrometrischen Probendarstellungsvorrichtung mit einer massenspektrometrischen Probendarstellungsvorrichtung, Bindung eines Komplexes an die Oberfläche, wobei der Komplex mindestens ein Molekül enthält, das entweder ein Biomolekül durch selektive Spaltung des Biomoleküls an mindestens einer spezifischen Stelle chemisch modifiziert oder das ein Biomolekül durch Immobilisierung mindestens eines Fremdatoms aufbereitet, wobei das Biomolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden, DNA, Kohlenhydraten, RNA und Kombinationen hiervon.
Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden weiterhin durch ein Verfahren zur Analyse von Biomolekülen gelöst, das folgende Schritte aufweist:

(a) Bereitstellung einer massenspektrometrischen Probendarstellungsvorrichtung,
(b) Inkontaktbringen der Probendarstellungsoberfläche mit mindestens einem Molekül, das entweder (i) ein Biomolekül durch selektive Spaltung des Biomoleküls an mindestens einer spezifischen Stelle chemisch modifiziert oder (ii) ein Biomolekül durch Immobilisierung mindestens eines Fremdatoms aufbereitet, um einen an der Oberfläche gebundenen Komplex zu bilden,
(c) Entfernung von ungebundenem Komplex von der Probendarstellungsoberfläche,
(d) Inkontaktbringen des Biomoleküls mit dem an der Oberfläche gebundenen Komplex, wobei das Biomolekül chemisch modifiziert oder aufbereitet wird,
(e) Aufbringung einer MALDI-Matrix auf der Probendarstellungsoberfläche und
(f) Bestimmung des Molekulargewichts des chemisch modifizierten oder aufbereiteten Biomoleküls in einem Massenspektrometer.

Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden weiterhin durch ein Massenspektrometer gelöst, das eine massenspektrometrische Probendarstellungsvorrichtung aufweist, die folgendes enthält:

a) eine massenspektrometrische Probendarstellungsoberfläche und
b) einen an der Oberfläche immobilisierten Komplex, wobei der Komplex mindestens ein Molekül enthält, das entweder ein Biomolekül durch selektive Spaltung des Biomoleküls an mindestens einer spezifischen Stelle chemisch modifiziert oder das ein Biomolekül durch Immobilisierung mindestens eines Fremdatoms aufbereitet, wobei der Komplex nicht in eine MALDI-Matrix eingebaut ist und nicht in einem Massenspektrometer verdampft wird.

Das Massenspektrometer besitzt ein Vakuumverschlussmittel, um die Oberfläche in das Gerät zu überführen, eine Vorrichtung zur Verdampfung und Ionisierung des chemisch modifizierten Biomoleküls, ein Generator für das elektrische Feld, ein Detektor und Elektronik zur Bestimmung des Verhältnisses von Molekulargewicht zu Ladung der modifizierten Biomolekül-Ionen.
Die Probendarstellungsvorrichtung, das Verfahren zur Herstellung einer Probendarstellungsvorrichtung, das Verfahren zur Analyse von Biomolekülen und das Massenspektrometer gemäß der vorliegenden Erfindung stellen massenspektrometrische Informationen für Biomoleküle bereit, die sowohl einfacher zu erhalten als auch von höherer Qualität sind, im Vergleich zu dem, was bisher möglich war.
1 ist ein MALDI-Massenspektrum von 10 Picomol von Lysozym vom Hühnerei, das 10 Minuten lang mit an der Oberfläche gebundenem Trypsin verdaut wurde.
2 ist eine Zusammenfassung, die die Korrelation zwischen den berechneten und beobachteten Massen der Lysozym-Fragmente vom Hühnerei darstellt.
3 ist ein MALDI-Massenspektrum von 1 Picomol Lysozym vom Hühnerei, das 10 Minuten lang mit an der Oberfläche gebundenem Trypsin verdaut wurde.
4 ist ein MALDI-Massenspektrum von 1 Picomol von Lysozym vom Hühnerei, das 10 Minuten lang mit einer äquimolaren Menge von ungebundenem Trypsin verdaut wurde.
5 ist ein MALDI-Massenspektrum von 2 μl einer 500 μM Lösung von Lysozym vom Hühnerei, das mit einem gleichen Volumen von aufgeschlämmtem Trypsin, das an Agarose immobilisiert war, verdaut wurde.
6 ist eine Zusammenfassung der Reste von 1 Picomol und Lysozym vom Hühnerei, das nach 10-minütiger Verdauung mit freiem Trypsin und Agarose-immobilisiertem Trypsin erhalten wurde.
7 ist eine schematische Darstellung der Aminosäurensequenz von α-Cobratoxin.
8 ist ein MALDI-Massenspektrum von unverdautem α-Cobratoxin.
9 ist ein MALDI-Massenspektrum von etwa 10 Picomol von α-Cobratoxin, das 30 Minuten lang mit einer Probendarstellungsvorrichtung mit an der Oberfläche gebundenem Trypsin verdaut wurde.
10 ist ein MALDI-Massenspektrum von etwa 10 Picomol von α-Cobratoxin, das 30 Minuten lang mit einer Probendarstellungsvorrichtung mit an der Oberfläche gebundenem Trypsin in Gegenwart eines Reduktionsmittels verdaut wurde.
11 ist eine Explosionszeichnung des MALDI-Massenspektrums von 10, im m/z-Bereich von 1.000 bis 5.000 Pa.
12 ist ein MALDI-Massenspektrum der positiven Ionen von unverdauten menschlichen Parathyroid-Hormonen 1-34 (hPTH).
13 ist ein MALDI-Massenspektrum von hPTH, das 10 Minuten lang auf einer massenspektrometrischen Probendarstellungsvorrichtung mit an der Oberfläche gebundenem α-Chymotrypsin verdaut wurde.
14 ist ein MALDI-Massenspektrum von hPTH, das 10 Minuten lang mit einer Probendarstellungsvorrichtung mit an der Oberfläche gebundenem α-Chymotrypsin und nachfolgender pH-Einstellung auf ungefähr 5 und Zusatz von Carboxypeptidase P (cpp) verdaut wurde. Die Einfügung stellt den interessierenden Bereich für die abschließende Bestimmung des Restes dar.
15 stellt den Bereich der Peptidsequenz von hPTH dar, der durch Analyse der massenspektrometrischen Daten der α-Chymotrypsin- und α-Chymotrypsin/Carboxypeptidase P(cpp)-Fragmente erzeugt wurde.
16 ist ein MALDI-Massenspektrum von hPTH, das 5 Minuten lang auf einer Probendarstellungsvorrichtung mit an der Oberfläche gebundenem Trypsin verdaut und bei 45 °C, pH 8,1, gehalten wurde.
17 ist eine Protein-Leitersequenz, die durch Zusatz von cpp zu der verdauten Probe von 16 erzeugt wurde.
18 ist eine Zusammenfassung des Peptidsequenz-Bereiches, der durch Analyse der massenspektrometrischen Daten von Trypsin und Trypsin/cpp-Fragmenten erzeugt wurde.
19 ist eine Überlagerung der Massenspektren von Trypsin- und Trypsin/cpp-Fragmenten, die die Verwendung sowohl der Informationen aus dem großen Maßstab als auch der Leiter-Informationen verwendet, um die Sequenz-Bestimmung zu erweitern.
20 ist ein MALDI-Massenspektrum von hPTH, das 8 Minuten lang auf einer Probendarstellungsvorrichtung mit an der Oberfläche gebundenem Pepsin verdaut und bei 45 °C, pH 3,4, gehalten wurde.
21 ist ein MALDI-Massenspektrum von hPTH, das 10 Minuten lang auf einer massenspektrometrischen Probendarstellungsvorrichtung mit an der Oberfläche gebundenem α-Chymotrypsin verdaut und bei 45 °C, pH 3,4, gehalten wurde.
22 ist ein MALDI-Massenspektrum von hPTH, das 10 Minuten lang auf einer massenspektrometrischen Probendarstellungsvorrichtung mit an der Oberfläche gebundenem α-Chymotrypsin verdaut und bei 45 °C, pH 3,4, gehalten, gefolgt von einer 10-minütigen Verdauung durch an der Oberfläche gebundenem cpp gehalten bei 35 °C, pH 5.
Die vorliegende Erfindung stellt eine konventionelle massenspektrometrische Probendarstellungsvorrichtung bereit, die eine mit Biomolekül modifizierende, komplexe derivatisierte Oberfläche aufweist. Diese Vorrichtung wird üblicherweise einem Biomolekül ausgesetzt und inkubiert, um dem Komplex die Modifizierung des Biomoleküls zu ermöglichen. Nach der Inkubierung wird das modifizierte Biomolekül vorzugsweise von einem MALDI-Matrixmaterial umgeben und anschließend in ein Massenspektrometer überführt. Die Erfindung umfasst weitere Ausführungsformen, wie z.B. ein Massenspektrometer, das solch eine Probendarstellungsvorrichtung aufweist. Weitere Ausführungsformen stellen ein Verfahren zur Durchführung der Massenspektrometrie und zur Herstellung von Probendarstellungsvorrichtungen bereit.
Mit dem Begriff „derivatisiert", wie er hier verwendet wird, ist eine massenspektrometrische Probenvorbereitungsvorrichtung mit einem gebundenen Komplex gemeint. Eine derivatisierte Probenvorbereitungsvorrichtung gemäß der Erfindung kann aus jedem geeigneten Material zusammengesetzt sein. Das Material kann fest oder flüssig sein. Geeignete feste Materialien umfassen Isolatoren (z.B. Quarz), Halbleiter (z.B. dotiertes Silikon u.ä.), und Leiter einschließlich Metalle (z.B. Stahl, Gold u.ä.), worauf die festen Materialien aber nicht beschränkt sind. Verschiedene isolierende oder leitende Polymere können ebenso verwendet werden. Die Oberfläche der Probendarstellungsvorrichtung muss nicht aus dem gleichen Material wie der Rest der Vorrichtung hergestellt sein. Es ist bevorzugt, dass die Oberfläche sauber ist, sodass kein Komplex an der Oberfläche haften kann.
Der an der Darstellungsvorrichtungsoberfläche angebrachte Komplex hat zwei unterschiedliche Funktionalitäten. Der Begriff „Komplex", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine chemische Substanz, die mindestens ein Molekül umfasst, das ein Biomolekül chemisch modifiziert. Der Komplex hat eine „bindende" Funktion, wobei es in der Lage ist, selbst an mindes tens einem Ende der Oberfläche angebunden zu werden. Außerdem besitzt es eine „reaktive" Funktion, wobei es in der Lage ist, den Analyten chemisch zu modifizieren. Mit dem Begriff „chemisch modifizieren", wie er hier verwendet wird, ist die Aufreinigung und der Abbau bzw. die Verdauung eines Analyten, aber nicht die Bindung an einen Analyten gemeint. Der Komplex kann weiterhin ein Bindungsmolekül, das an die Oberfläche bindet, und ein reaktives Molekül, das an das Bindungsmolekül bindet und ein Biomolekül modifiziert, enthalten.
Üblicherweise ist die „bindende" Funktion mit einer Gruppe von Atomen (d.i. das Bindungsmolekül) assoziiert, während die „reaktive" Funktion mit einer anderen Gruppe von Atomen (d.i. das reaktive Molekül) assoziiert ist. Der Komplex kann sowohl ein Bindungsmolekül, das an die Probendarstellungsoberfläche bindet, als auch ein reaktives Molekül, das das Bindungsmolekül bindet und ein Biomolekül modifiziert, enthalten. Dennoch ist diese Trennung der Funktion nicht erforderlich. Das Biomolekül ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe von Molekülen, die sich als immobilisierter Ligand als effektiv erwiesen haben. Viele spezifische Beispiele solcher Moleküle sind auf den Seiten T-156 bis T-200 des 1995 Pierce Corporation Katalog (Pierce Corp., P.O. Box 117, Rockford Il. 61105) aufgeführt. Geeignete Bindungsmoleküle schließen ein:
Dithiothreitol, Dimethyladipimidat-2·HCl, Dimethylpimelimidat·HCl, Dimethylsuberimidat·2HCl, Dimethyl-3,3'-dithiobispropionimidat·2HCl, Dibernsteinsäureimidylglutarat, Dibernsteinsäureimidylsuberat, Bis-(Sulfobernsteinsäureimidyl)-suberat, Dithiobis-(bernsteinsäureimidylpropio nat), Dithiobis-(sulfobernsteinsäureimidylpropionat), Ethylenglycobis-(bernsteinsäureimidylsuccinat), Ethylenglycobis-(sulfobernsteinsäuresuccinat), Dibernsteinsäureimidyltartrat, Disulfobernsteinsäureimidyltartrat, Bis-[2-(bernsteinsäureimidyloxycarbonyloxy)ethyl]sulfon, Bis-[2-(sulfobernsteinsäureimidooxycarbonyloxy)ethyl]sulfon, Bernsteinsäureimidyl 4-(N-maleimido-methyl)cyclohexan-1-carboxylat, Sulfobernsteinsäureimidyl-4-(N-maleimido-methyl)cyclohexan-1-carboxylat, m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxybernsteinsäureimidester, m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfobernsteinsäureimidester, Bernsteinsäureimidyl 4-(p-Maleimidophenyl)-butyrat, Sulfobernsteinsäureimidyl 4-(p-Maleimidophenyl)-butyrat, Bismaleimidohexan, N-(γ-Maleimidobutyryloxy)bernsteinsäureimidester, N-(γ-Maleimidobutyryloxy)sulfobernsteinsäureimidester, N-Bernsteinsäureimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoat, Sulfobernsteinsäureimidyl(4-iodoacetyl)-aminobenzoat, 1,4-Di-[3'-2'-pyridyldithio(propionamido)butan], 4-Bernsteinsäureimidyloxycarbonyl-α-(2-pyridyldithio)toluol, Sulfobernsteinsäureimidyl-6-[α-methyl-α(2-pyridyldithio)-toluamido]hexanoat, N-Bernsteinsäureimidyl-3(2-pyridyldithio)-propionat, Bernsteinsäureimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)-propionamido]hexanoat, Sulfobernsteinsäureimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)-propionamido]hexanoat, 3-(2-Pyridyldithio)-propionylhydrazid, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid, N,N-Dicyclohexylcarbodiimid, 4-(p-Azidosalicylamido)-butylamin, Azidobenzoylhydrazid, N-5-Azido-2-nitrobenzoyloxybernstinsäureimid, N-[4-(p-Azidosalicylamido)butyl]-3'-(2'-pyridyldithio)propionamid, p-azidophenylglyoxal-monohydrat, 4-(p-Azidosalicylamido)butylamin, 1-(p-Azidosalicylamido)-4-(iodoacetamido)butan, Bis-[β-4-Azidosalicylamido)ethyl]disulfid, N-Hydroxybernsteinsäureimidyl-4-azidobenzoat, n-Hydroxysulfobernsteinsäureimidyl-4-azidobenzoat, N-Hydroxybernsteinsäureimidyl-4-azidosalicylsäure, N-Hydroxysulfobernsteinsäureimidyl-4-azidosalicylsäure, Sulfobernsteinsäureimidyl-(4-azidosalicylamido)hexanoat, p-Nitrophenol-2-diazo-3,3,3-trifluoropropionat, 2-Diazo-3,3,3,-trifluoropropionylchlorid, N-Bernsteinsäureimidyl-(4-azidophenyl)-1,3'-dithiopropionat, Sulfobernsteinsäureimidyl-(4-azidophenyldi-thio)propionat, Sulfobernsteinsäureimidyl-2-(7-azido-4-methylcoumarin-3-acetamid)ethyl-1,3'-dithiopropionat, Sulfobernsteinsäureimidyl-7-azido-4-methylcoumarin-3-acetat, Sulfobernsteinsäureimidyl 2-(m-azido-o-nitrobenzamido)-ethyl-1,3'-dithiopropionat, N-Bernsteinsäureimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoat, Sulfobernsteinsäureimidyl-6-(4'-azido-2'-nitro-phenylamino)hexanoat, Sulfobernsteinsäureimidyl-2-(p-azidosalicylamido)ethyl-1,3'-Dithiopropionat, Sulfobernsteinsäureimidyl-4-(p-azidophenyl)-butyrat.
Verschiedene Protokolle für die Verwendung solcher Liganden sind in der Druckschrift „Immobilized Affinity Ligand Techniques" von Greg T. Hemanson et al. (1992), deren Inhalt in diese Anmeldung per Querverweis mit aufgenommen wird, erklärt.
Der Komplex kann einen Biomolekül-Analyten auf mehreren unterschiedlichen Wegen chemisch modifizieren.
Der Begriff „Biomolekül", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf DNA, RNA, Polypeptide, Kohlenhydrate und Kombinationen hiervon. Beispielsweise kann der Komplex das Biomolekül abbauen bzw. verdauen oder aufreinigen. Mit dem Begriff „verdauen", wie er hier verwendet wird, ist die chemische oder enzymatische Spaltung eines Biomoleküls in Fragmente gemeint. Mit dem Begriff „aufreinigen", wie er hier verwendet wird, ist die Entfernung unerwünschter Materialien aus der das Biomolekül enthaltenden Lösung gemeint. Der Begriff „Fragment", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf einen Teil eines Biomoleküls, der von dem Rest des Biomoleküls unter Verwendung eines chemischen oder enzymatischen Reagenzes gespalten wurde. Mehrere unterschiedliche reaktive Moleküle sind für die Verdauung von Biomolekülen verfügbar. Wenn das Biomolekül ein Polypeptid ist, enthält der Komplex vorzugsweise ein chemisches Spaltmittel oder eine enzymatische Protease.
Enzymatische Proteasen sind spezifische Polypeptide, die Polypeptide spalten. Proteasen können sich selbst durch einen als Autolyse bezeichneten Prozess spalten. Mehrere enzymatische Proteasen spalten Polypeptide zwischen spezifischen Aminosäureresten. Beispiele von Proteasen, die nicht spezifisch spalten, umfassen Subtilisin, Papain und Thermolysin. Beispiele von Proteasen, die zumindest etwas spezifisch spalten, umfassen: Aminopeptidase-M, Carboxypeptidase-A, Carboxypeptidase-P, Carboxypeptidase-B, Carboxypeptidase-Y, Chymotrypsin, Clostripain, Trypsin, Elastase, Endoproteinase Arg-C, Endoproteinase Glu-C, Endoproteinase Lys-C, Faktor Xa, Ficin, Pepsin, Plasmin, Staphylococcus aureus V8-Protease, Proteinkinase K und Thrombin.
Chemische Spaltungsmittel, die Polypeptide zwischen spezifischen Aminosäureresten spalten, umfassen Cyanogenbromid, O-Iodosobenzoat oder O-Iodosobenzoesäure, verdünnte Salzsäure, N-Bromsuccinimid, Natriumhydrazin, Lithiumaluminiumhydrid, Hydroxylamin und 2-Nitro-5-thiocyanobenzoat. Geeignete chemische Spaltungsmittel schließen auch Sangers's Reagenz (2,4-Dinitrofluorobenzol), Edmund's Reagenz (Phenylisothiocyanat), und immobilisierte Derivate dieser Reagenzien ein. Außerdem können koordinierte Übergangsmetall-Komplexe, wie der Tetradentat-Kobalt(III)-Komplex, β-[Co(triethylentetramin)-OH(H₂O)], als effektive Spaltungsmittel verwendet werden (siehe Buckingham et al. 89 J.A.C.S. 1082 (1967)).
Wenn das zu analysierende Biomolekül ein Polypeptid ist, kann es vorteilhaft sein, ein Reduktionsmittel zur Trennung sämtlicher Disulfid-Bindungen zwischen den Aminosäuren zuzusetzen. Das Trennen dieser Bindung führt zu einer weiteren Fragmentierung des Peptids, wodurch mehr Informationen über die Peptidstruktur erhalten werden. Disulfid-reduzierende Mittel können an die Probendarstellungsoberfläche gebunden oder in Lösung verwendet werden. Geeignete Disulfid-reduzierende Mittel umfassen β-Mercaptoethanol, Cystein und Dithiothreitol (DTT). Carboxypeptidase-P, Dithioerythritol-(DTE)-lipomid und N-Acetylhomocystein können als an der Oberfläche gebundene Disulfid-reduzierende Mittel verwendet werden.
Für Biomoleküle wie DNA oder RNA kann es vorteilhaft sein, eine Restriktions-Endonuklease oder -Exonuklease der Probendarstellungsvorrichtungsoberfläche zuzusetzen. Diese Enzyme können DNA und RNA zwischen spezifischen Nukleasen spalten, wodurch Fragmente von DNA oder RNA erzeugt werden. Spezifische Restriktions-Endonukleasen oder -Exonukleasen sind dem Fachmann bekannt. Beispiele von Enzymen, die sowohl DNA als auch RNA spalten, schließen Phosphodiesterase aus Schlangengift und Phosphodiesterase der Milz ein, worauf die Beispiele aber nicht beschränkt sind. Enzyme, die nur DNA spalten, schließen Desoxyribonuklease I und II ein. Ribonuklease I (Pankreas) und T. (Schimmelpilz) spalten RNA.
Wenn ein Kohlenhydrat-haltiges Biomolekül analysiert wird, kann es vorteilhaft sein, Fucase, O- oder N-Glycanase, Mannase, Neuraminidase, Galactosidase oder Glucosidase an der Oberfläche zuzusetzen. Diese Enzyme erzeugen Kohlenhydratfragmente oder ein spezifisches Molekulargewicht, das im Massenspektrometer bestimmt werden kann.
Der an der Probendarstellungsoberfläche gebundene Komplex kann ebenso das Biomolekül aufreinigen. Zum Beispiel kann der Komplex ein reaktives Molekül enthalten, das unsichtbar übliche Fremdstoffe wie Detergenzien, Lipide, Endotoxine oder Proteasen binden kann.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Herstellung der zuvor beschriebenen derivatisierten massenspektrometrischen Probendarstellungsvorrichtung bereit. Bei diesem Verfahren ist es wesentlich, dass ein Komplex, der Biomoleküle modifiziert, an der Oberfläche der Probendarstellungsvorrichtung gebunden wird. In einer Ausführungsform wird der gesamte Komplex zuerst synthetisiert oder auf gereinigt, anschließend erfolgt die Reaktion mit der Oberfläche. In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform wird der Komplex zuerst durch Reaktion der Probendar stellungsoberfläche mit einem Bindungsmolekül gebildet und später erfolgt eine Reaktion des gebundenen Moleküls mit einem reaktiven Molekül.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Analyse eines Biomoleküls bereit. Insbesondere umfasst das Verfahren: (1) Bereitstellung einer massenspektrometrischen Probendarstellungsoberfläche, (2) Bindung von mindestens einem Komplex an die Oberfläche, wobei der Komplex mindestens ein Molekül enthält, das ein Biomolekül chemisch modifiziert, (3) Inkontaktbringen des Biomoleküls mit der Oberfläche, wobei das Biomolekül chemisch modifiziert wird, (4) Aufbringen einer MALDI-Matrix auf die Oberfläche und (5) Bestimmung des Molekulargewichts des Biomoleküls in einem Massenspektrometer. Das Biomolekül kann mit der Oberfläche in Kontakt gebracht werden, während es sich in Lösung oder in der Gasphase befindet.
Der Schritt des Inkontaktbringens wird vorzugsweise oberhalb von Raumtemperatur, besonders bevorzugt bei bis zu 55°C durchgeführt, um die Reaktionsgeschwindigkeit zu erhöhen. Dennoch sollte er nicht bei einer Temperatur durchgeführt werden, die hoch genug ist, um zum Abbau des Analyts oder des Komplexes zu führen. Für gewisse Komplexe kann es vorteilhaft sein, den Schritt des Inkontaktbringens unterhalb von Raumtemperatur, besonders bevorzugt oberhalb von –10°C durchzuführen. Dieser Schritt des Inkontaktbringens wird über einen ausreichenden Zeitraum durchgeführt, üblicherweise 5 bis 30 Minuten. Die aktuelle Reaktionszeit hängt von dem speziellen Komplex und Biomolekül ab. Wenn Proteasen für die Verdauung des Polypeptid-Biomoleküls verwendet werden, wird der Schritt des Inkontaktbringens vorzugsweise in einer feuchten Atmosphäre durchgeführt. Solch eine Atmosphäre kann z.B. durch Bereitstellung eines Wasserreservoirs und dessen Einbindung zusammen mit der Probendarstellungsoberfläche und dem Biomolekül in einem geschlossenen System erzeugt werden.
Anschließend wird eine MALDI-Matrix zu dem reagierten Biomolekül zugesetzt. Die MALDI-Matrix kann jedes Material sein, das Biomoleküle löst, Lichtenergie bei einer durch einen Laser leicht erreichbaren Frequenz absorbiert, wobei die Matrix im Hinblick auf die Biomoleküle nicht reaktiv ist. Geeignete Matrizes schließen Nicotinsäure, Pyrazinsäure, Vanillinsäure, Bernsteinsäure, Kaffeesäure, Glycerol, Harnstoff oder Tris-Puffer (pH 7,3) ein. Bevorzugte Matrizes schließen α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure, Ferulasäure, 2,5-Dihydroxybenzoesäure, Sinapinsäure, 3,5-Dimethoxy-4-hydroxy-trans-zimtsäure, andere Zimtsäurederivate, Gentisinsäure und Kombinationen hiervon ein.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Massenspektrometer, das die zuvor beschriebene Probendarstellungsvorrichtung aufweist. Das Massenspektrometer gemäß der vorliegenden Erfindung enthält weiter eine Vakuum-Verschlussvorrichtung zur Einführung der Probendarstellungsvorrichtung in die Verdampfungskammer, eine Vorrichtung zur Verdampfung und Ionisierung des Analyten, einen optionalen Generator für das elektrische Feld, der so angeordnet ist, dass die Biomolekül-Ionen auf den Detektor zuwandern können, und Elektronik für die Bestimmung des Verhältnisses von Molekulargewicht zu Ladung für ein spezielles Ion, basierend auf dessen Flugbahn.
Dieses Massenspektrometer ist mit allen Techniken, die normalerweise für die Verdampfung und Ionisierung von Analyten verwendet werden, kompatibel. Solche Techniken schließen die Elektrospray-Ionisation, die Californium²⁵²-Plasma-Desorption, die Felddesorption, den schnellen Atombeschuss, die Flüssig-Sekundärionen-MS, die Laser-Desorption und die Thermospray-Ionisation ein. Vorzugsweise wird die MALDI-Technik für die Verdampfung und Analyse der Biomoleküle verwendet. Die erforderlichen mechanischen Strukturen oder die Ausstattung bei diesen Techniken sind dem Fachmann bekannt.
Das Spektrometer enthält üblicherweise einen Generator für das elektrische Feld, der elektrisch geladenen Metallstrukturen zwischen dem Bereich im Spektrometer, wo die Ionen erzeugt werden, und dem Detektor aufweist. Diese Strukturen müssen so ausgestaltet sein, dass sie Ionen anziehen, aber dass die Ionen vorbeiziehen können, um den Detektor zu erreichen. Vorzugsweise sind die Strukturen geladene Metallgitter mit Aperturen, die es einigen der Ionen erlauben zu passieren, um auf den Detektor zu zu driften. Die Strukturen müssen zwischen dem Bereich für die Ionenerzeugung und dem Detektor angeordnet sein. Sie müssen ebenso eine Potentialdifferenz aufweisen, die die Beschleunigung der Ionen auf dem Detektor bewirkt.
Einige Massenspektrometer nutzen ebenso magnetische Felder um Ionen abzulenken, wenn sie sich auf den Detektor zu bewegen. Solche Instrumente bestimmen die Masse eines Ions basierend auf dessen Ablenkung im magnetischen Feld. Dennoch ist es bevorzugt, ein Flugzeit-Massenspektrometer für die Bestimmung der Biomolekülmasse zu verwenden.
Die Elektronik für die Bestimmung des Verhältnisses von Molekulargewicht zu Ladung eines Ions basierend auf dessen Flugbahn schließt üblicherweise einen Ionen-Aufprall-Detektor, eine Datensammlungs-Elektronik und eine Daten-Analyse-Elektronik, wie z.B. einen Computer, ein.
Viele Detektortypen sind mit der vorliegenden Erfindung kompatibel. Einige spezifische Beispiele von Detektoren schließen die Faraday-Tasse, Elektronenvervielfältiger, elektrooptische Ionen-Detektoren und fotografische Emulsionen ein.
Spezifische Ausführungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung werden nun im Detail beschrieben. Diese Beispiele sind als Illustrationen gedacht, und die Erfindung ist nicht auf die Materialien, Verfahren oder die Vorrichtung, die in diesen Ausführungsformen beschrieben ist, beschränkt.
Beispiel 1
Herstellung der Probendarstellungsvorrichtung
Goldfolienkreise (Au, 99,9 %), erhältlich von Johnson Matthey, mit 2,5 mm Durchmesser und 0,01 mm Dicke, wurden ausgestanzt und in einem Polyethylen-Mikrozentrifugenröhrchen platziert. Es wurde sorgsam darauf geachtet, jegliche Kontamination der Goldfolienkreise zu vermeiden. Die Goldfolie wurde gemäß dem Verfahren von Katz aktiviert (siehe E.Y. Katz, J. Electroanal. Chem., Band 291, S. 257 (1990). Die Kreise wurden mit einem quervernetzenden oder bindenden Molekül, einer Lösung von Dithiobis[bernsteinsäureimidylpropionat] (DSP), erhältlich von Pierce, gelöst in Isopropanol auf etwa 0,1 M, behandelt. Die DSP/Isopropanol-Lösung war im wesentlichen bei dieser Konzentration gesättigt. Die Kreise wurden mit der DSP/Isopropanol-Lösung 15 Minuten lang mit gelegentlichem Rühren unter Verwendung eines Vortex-Rührers behandelt. Diese Bindungsmolekül-Lösung wurde abgegossen und die Goldkreise wurden wiederholt mit reinem Isopropanol gespült, gefolgt von drei Spülungen mit reinem Ethanol. Die Goldkreise wurden im Vakuum getrocknet und vor der Behandlung mit einem reaktiven Molekül oder Biomolekül in neue Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
Beispiel 2
Herstellung einer Probendarstellungsvorrichtung mit an der Oberfläche gebundenem Trypsin
Eine massenspektrometrische Probendarstellungsvorrichtung wurde durch Bindung von Trypsin an der Oberfläche der Vorrichtung wie folgt hergestellt. Trypsin Typ XIII: Behandeltes Tosyl-L-phenylalaninchlormethylketon (TPCK), von bovinem Pankreas, erhältlich von Sigma, wurde in 20 mM Phosphat-Puffer, pH 7,8, bis auf eine Konzentration von 1 mg/mL für die Verwendung bei der Herstellung der derivatisierten Probendarstellungsvorrichtung aufgelöst. Um das Enzym an dem quervernetzenden oder bindenden Molekül auf den Goldfolienkreisen, die in Beispiel 1 hergestellt wurden, anzubinden, wurden die Kreise mit einer 1 mg/mL-Lösung des Enzyms in 20 mM Phosphat-Puffer (pH 7,8) über Nacht in einem Kühlschrank mit gelegentlichem Rühren inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Goldfolienkreise mit dem Phosphat-Puffer kräftig gespült und nachfolgend mit einer 0,1%igen wässrigen Lösung von Triton-X100 gerührt, wobei ein Vortex-Rührer für beide Spülungen verwendet wurde. Die Gold folienkreise wurden dann im Vakuum getrocknet und in Polyethylen-Mikrozentrifugenröhrchen aufbewahrt. Die physikalische Befestigung der Oberflächen der Goldfolienkreise an den Probendarstellungsvorrichtungen aus Edelstahl, die für die Routine-MALDI-Analyse konventionell verwendet werden, erfolgte durch Verwendung einer kleinen Menge eines Adhäsionsmittelsprays an der konventionellen Probendarstellungsoberfläche oder Sondenspitze, die dann auf die Goldfolienkreise gepresst wurde. Vor der Befestigung wurden die konventionellen massenspektrometrischen Probendarstellungsvorrichtungen aus Edelstahl (304) elektrolytisch poliert und sorgfältig in entionisiertem Wasser gespült, gefolgt von einer Ultraschallreinigung in Methanol. Während man das Adhäsionsmittel binden ließ, wurde ein gleichmäßiger Druck auf die Sondenspitze und die Goldfolie aufrechterhalten. Die Probendarstellungsvorrichtung mit gebundenem Trypsin wurde dann für die Protein-Verdauung wie nachfolgend beschrieben verwendet. In der Praxis wurden mehrere Spitzen hergestellt und in Polyethylen-Röhrchen bei Raumtemperatur aufbewahrt, bis sie benötigt wurden.
Beispiel 3
Au/Trypsin-Probendarstellungsoberfläche, in Kontakt mit Lysozym
Abbaureaktionen wurden mit Au/Trypsin-aktiven Oberflächen, hergestellt in Beispiel 2, durch die Anwendung von Aliquots (entweder 4 μL oder 400 nL) von 250 nM Lysozym-Lösung vom Hühnerei (aufgelöst in 20 mM Phosphat; 10 mM Dithiothreitol (DTT); Puffer pH 8,1) direkt mit den Oberflächen der Probendarstellungsvorrichtung durchgeführt. Man ließ die Oberflächen in einer feuchten Umgebung, die bei 40°C gehal ten wurde, stehen. Das Lösungsvolumen auf der Oberfläche wurde beobachtet und es wurden zusätzliche Aliquots von 1 bis 2 μL Phosphat-Puffer zugesetzt, als das Volumen der Flüssigkeit scheinbar weniger als 2 μL betrug. Nach 10 Minuten wurde die Vorrichtung aus der feuchten Umgebung entfernt, 2 μL der MALDI-Matrix, α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (hergestellt als eine gesättigte Lösung in einer Lösungsmittelmischung von 2:1, 1,3%ige wässrige Trifluoressigsäure:Aceto.nitril (ACCA)), wurden zugesetzt, und man ließ die Oberfläche an der Luft trocknen.
Vergleichsbeispiel 4
Proteinabbau/Probenvorbereitung mit freiem Trypsin
Ein molares Verhältnis von Trypsin zu Lysozym von 1:1 wurde durch Zusatz von 2 μL von 500 nM Lysozym mit 2 μL von 500 nM Trypsin (beide hergestellt in einem 20 mM Phosphat, 10 mM DTT, pH 8,1 Puffer) hergestellt. Die vereinigten Volumina wurden in ein 600 μL-Mikrozentrifugen-Röhrchen gegeben und bei 40°C 10 Minuten lang inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 2 μL der MALDI-Matrix ACCA gestoppt, und das Gesamtvolumen der Abbau/Matrix-Mischung wurde in eine inerte massenspektrometrische Probenvorbereitungsvorrichtung gegeben, die man an der Luft trocknen ließ.
Vergleichsbeispiel 5
An Agarose immobilisiertes Trypsin
Ein molares Verhältnis von Lysozym zu Agarose/Trypsin von 1:1 wurde durch Zusatz von 2 μL von 500 nM Lysozym mit 2 μL aufgeschlämmter Agarose/Trypsin (beide hergestellt in einem 20 mM Phosphat, 10 mM DTT, Puffer, pH 8,1) hergestellt. Die aufgeschlämmte Agarose enthielt ungefähr 1 μL von aneinandergereihtem Reagens. Die vereinten Volumina wurden in ein 600 μL Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und bei 40°C 10 Minuten lang inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 2 μL der ACCA-Matrix gestoppt, und das Gesamtvolumen (mit perlschnurförmig angeordneten Reagenzien) der Abbau/Matrix-Mischung wurde auf eine inerte konventionelle massenspektrometrische Probendarstellungsvorrichtung oder Sondenspitze aufgebracht, die man an der Luft trocknen ließ.
Beispiel 6
Flugzeit-Massenspektrometrie
Die Massenspektrometrie wurde unter Verwendung der Probendarstellungsvorrichtung hergestellt in Beispiel 3, Vergleichsbeispiel 4 und Vergleichsbeispiel 5 und einem linearen Flugzeit-Massenspektrometer durchgeführt. Die Desorption und Ionisation wurden unter Verwendung der dritten harmonischen Ausgangsleistung (355 nm) des Nd:YAG-Lasers (Continuum Surelite I) durchgeführt. Der Strahlengang des Lasers enthielt einen variablen Dämpfer (Newport 935), ein rechtwinkliges, den Strahl steuerndes Prisma und eine Quarzlinse mit einer Brennweite von 250 mm, die ungefähr 300 mm vom Probenziel angeordnet wurde. Die von der Matrix/Analyt-Probe erzeugten Ionen wurden unter Verwendung einer zweistufigen Beschleunigungsquelle (Gesamtdistanz = 1,5 cm) auf ein Potential von 30 kV beschleunigt. Ein elektrostatischer Partikel-Lenker wurde zur Unterstützung der Transmission der Ionen über den Flugweg verwendet. Die Detektion wurde unter Verwendung eines hybriden Elektronenvervielfältigers mit Mikrokanalplatte/diskreter Dynode ausgeführt. Die Grenzwerte der Ionisation wurden empirisch durch Erhöhung der Intensität des Laserlichts an der Probenoberfläche bei gleichzeitigem Beobachten des Ionen-Signals in Echtzeit mit einem 50 MHz-Oszilloskop (Tektronix TDS 310) bestimmt. Nach Beobachtung des stabilen Ionen-Signals von 50 Laser-Schüssen wurde über das Signal gemittelt, wobei ein 500 MS/s-Digitalspeicher-Oszilloskop (Tektronix TDS 520A) verwendet wurde, und diese wurden an einen IBM-kompatiblen 486-Computer übermittelt. Die Daten wurden unter Verwendung der PC-kompatiblen Software Lab-Calc (Galactic Industries) analysiert. Alle Massenspektren wurden im Positiv-Ionen-Modus erhalten. Eine externe Massen-Kalibration wurde mit den einfach und doppelt geladenen Peaks von bovinem Insulin (MW = 5.733,5 Da) durchgeführt. Die Massen von Abbau-Fragmenten wurden unter Verwendung der bekannten Lysozym-Aminosäurensequenz von Hühnerei und der Peptid-Datenmanipulationsroutine PROCOMP berechnet. Dieses Programm ist öffentlich zugänglich über Dr. Philip C. Andrews, University of Michigan Medical Center, Ann Arbor, Michigan 48104.
Vor der enzymatischen Spaltung wurde die Unversehrtheit der Lysozym-Proben durch MALDI-Analysen unter Verwendung der Probendarstellungsvorrichtung ohne gebundenem Komplex verifiziert. Während dieser Analysen konnten keine Signale außer denen, die auf Lysozym-Ionen oder einfach und mehrfach geladene Signale zurückzuführen sind, beobachtet werden. 1 zeigt die Ergebnisse einer 10-minütigen Verdauung (40°C) von 10 pmol von Lysozym unter Verwendung der Probendarstellungsvorrichtung mit an der Goldoberfläche gebundenem Trypsin, wie in Beispiel 3 beschrieben. Es wurden keine Signale über m/z = 6.000 beobachtet, was eine hohe Trypsin-Aktivität anzeigt. Ionen-Signale wurden für 33 von 67 möglichen Abbauprodukten (im Massenbereich bis zu 6.000 Da) beobachtet. Signale unterhalb m/z = 1.000 Da wurden aufgrund möglicher Interferenzen der Matrix grundsätzlich nicht berücksichtigt. Die Signalintensität und -qualität lag in einem Bereich, die Laserdesorptions-Bedingungen zulässt, die die Auflösung von Trypsin-Fragmenten bei m/z = 1.424,8, 1.429,6 und 1.435,5 Da (Inset) ermöglichen. 2 zeigt die Korrelation zwischen den berechneten Massen der enzymatisch gewaschenen Fragmente und denen, die im Massenspektrum beobachtet werden.
3 zeigt das Massenspektrum, das unter Verwendung des gleichen Verfahrens mit nur 1 pmol von an der Oberfläche angewandtem Lysozym durchgeführt wurde. Nahezu das gleiche Fragmentierungsmuster wurde beobachtet, wobei der erwartete Verlust im Signal-Rausch-Verhältnis der Daten auftrat.
Zum Vergleich wurde 1 pmol Lysozym unter Verwendung von entweder dem gleichen Molverhältnis von freiem Trypsin oder einem gleichen Volumen von an Agarose immobilisiertem Trypsin, wie in den Vergleichsbeispielen 4 und 5 beschrieben, verdaut. Die Ergebnisse des Abbaus unter Verwendung von freiem Trypsin sind in 4 gezeigt. Viele der Signale geringer Masse, die mit den mit Trypsin erzeugten Fragmenten konform sind, werden beobachtet, was in 6 gezeigt ist. Starke Signale bei m/z 1177, 1459, 1498, 2166, 2191 und 2275 sind auf Autolyse-Produkte des Trypsins zurückzuführen, weil diese Fragmente ebenso während der MALDI-Massenanalyse von Trypsin wie in 6 gezeigt beobachtet werden.
Zusätzlich erscheinen Signale des gesamten Trypsin-Moleküls (einfach und mehrfach geladene Signale) ebenso in dem Spektrum. Die Autolyse- und Ausgangs-Signale kontaminieren die Daten, weil diese Fragmente in die Matrix eingebaut sind. Das bei der Verdauung verwendete Trypsin ist nicht an die Oberfläche gebunden, weshalb keine Möglichkeit besteht, das Molekül-Ion von Trypsin und Autolyse-Produkte vor dem Einbau in die Matrix-Kristalle zu bewahren. Zusätzlich wird auch eine Verringerung des Signal-Rausch-Verhältnisses in Relation zu 3 beobachtet, was auf einen Verlust der Probe während des Transfers und der Handhabung zurückzuführen ist.
Auf Agarose immobilisiertes Trypsin wurde für den Versuch verwendet, den Beitrag der Autolyseprodukte von Trypsin zum Untergrund zu reduzieren. Die Ergebnisse, die von der 10-minütigen Verdauung bei 40°C von 1 pmol von Lysozym unter Verwendung von ungefähr 1 μL perlschnurförmiger Agarose, wie in Vergleichsbeispiel 5 beschrieben, erhalten wurden, sind in 5 gezeigt. Signale wurden für neun Verdauungs-Fragmente von Lysozym beobachtet, während nur zwei Autolyse-Produktpeaks bei m/z 2164 und 3371 gefunden wurden. Im Gegensatz zu beiden konnten bei der derivatisierten Probendarstellungsvorrichtung und der freien Trypsin-Verdauung einige Peaks beobachtet werden, die mit Verdauungs-Fragmenten korrespondieren. Dennoch wird eine merkbare Verringerung der Gesamtsignal-Intensität beobachtet. Da die Agarose ein poröses Medium darstellt, wird vermutet, dass Verdauungs-Fragmente durch eine Kombination des Einbaus in das Medium, langsame Verdauung aufgrund der schlechten Lokalisierung des Analyts in der Umgebung des immobilisierten Enzyms und eine ineffiziente Elution unter Verwendung eines kleinen Volumens der Matrix verloren gehen.
Bei dem Vergleich des Spektrums, das unter Verwendung der mit Au/Trypsin derivatisierten Probendarstellungsvorrichtung erhalten wurde, mit denen der immobilisierten und freien Trypsin-Verdauung, wird es klar, dass die unter Verwendung der derivatisierten Probendarstellungsvorrichtungen durchgeführten Verdauungen zusehend frei von Untergrundsignalen aufgrund von Enzym-Autolyse-Produkten sind und einen hohen Grad an Aktivität behalten. Von dem Verdauungsmuster, das den Grad der gesamten Verdauung anzeigt, wird abgeschätzt, dass die Aktivität der derivatisierten Oberflächen gemäß der vorliegenden Erfindung in den Bereich zwischen den von an Agarose immobilisiertem Trypsin und freiem Trypsin (ungefähr 0,05 bzw. 0,15 TAME-Einheiten) fällt. Es hat sich herausgestellt, dass dieses Niveau der Aktivität der derivatisierten Oberflächen von Ansatz zu Ansatz einigermaßen konstant bleibt, wenn gleiche Herstellungsbedingungen, z.B. Inkubationszeit, Temperatur und Puffer, verwendet werden. Dennoch hat sich gezeigt, dass die Aktivität ernsthaft beeinträchtigt wird, wenn die Oberflächen unbeabsichtigt berührt werden, was zur Ablagerung von Ölen führt, oder während der Fixierung der Au/Trypsin-Folie an der konventionellen Probendarstellungsvorrichtung mit Klebstoff kontaminiert wird. Bei den abschließenden Schritten der Oberflächenherstellung muss Sorgfalt herrschen. Andernfalls konnte das Risiko der Kontamination vollständig durch Sputtern der Oberflächen mit Gold und Kupplung des Trypsins direkt an diese Gold-Schicht eliminiert werden. Es stellte sich heraus, dass die Aktivität von Trypsin unter Verwendung dieses Verfahrens in etwa gleich zu dem Verfahren mit der Goldfolie war.
Beispiel 7
Au/Trypsin-Probendarstellungsoberfläche in Kontakt mit α-Cobratoxin
α-Cobratoxin wurde unter Verwendung einer immobilisierten Trypsin-Probendarstellungsvorrichtung wie in Beispiel 2 beschrieben analysiert.
Zuerst wurde das unfragmentierte α-Cobratoxin unter Verwendung des MALDI-Verfahrens analysiert. Es wurden Signale erhalten, die mit den einfach und mehrfach geladenen Ionen des intakten Peptids korrespondieren. Wie aus 7 und 8 zu entnehmen, werden einfach und doppelt geladene Ionen, korrespondierend mit den Resten 1-71, bei 7.823 bzw. 3.912 Da, beobachtet. Signale mit einem m/z von weniger als etwa 1.000 Da sind auf die ACCA-Matrix zurückzuführen.
Als Nächstes wurden 10 pmol von α-Cobratoxin 30 Minuten lang mit einer Trypsin-Oberfläche, hergestellt gemäß Beispiel 2, verdaut. Das α-Cobratoxin wurde auf der Oberfläche in einem 3 μL-Volumen von 10 mM Phosphat-Puffer (pH 7,8) aufgetragen. Man ließ die Reaktion in einer sehr feuchten Umgebung bei Raumtemperatur 30 Minuten lang fortschreiten, bevor diese durch Zusatz von einem gleichen Volumen der ACCA-Matrix gestoppt wurde. Die Mischung ließ man trocknen, bevor diese in das Massenspektrometer eingesetzt wurde. Das in 9 gezeigte Massenspektrum zeigt einfach und doppelt geladene Ionen-Signale für Peptide mit Molekulargewichten von 7.445, 7.575 und 7.823 Da. Diese Gewichte korrespondieren mit den Peptidsequenzen 1-68, 1-69 bzw. 1-71, wie in 7 zu sehen. Dies sind die primären Fragmente, die von der Trypsin-Behandlung des nicht-reduzierten Peptids erwartet werden. Fünf andere Spaltungsstellen sind möglich, die jeweils Fragmente mit unterschiedlichem Molekulargewicht erzeugen. Dennoch sind diese Stellen sterisch gehindert und für Trypsin nicht zugänglich. Daher wurden diese fünf anderen möglichen Peaks nicht beobachtet.
α-Cobratoxin wurde weiter durch Wiederholung der zuvor beschriebenen 10 pmol α-Cobratoxin-Verdauung durch an der Oberfläche gebundenes Trypsin in Gegenwart eines Reduktionsmittel (10 pmol α-Cobratoxin in 3 μL–10 mM Phosphat, 10 mM DTT) analysiert. Wie aus 7 zu erkennen, wurden durch das Reduktionsmittel die Disulfidbindungen gebrochen, was die Erzeugung von mehr Fragmenten ermöglicht. Das resultierende Spektrum in den 10 und 11 zeigt einen Satz von Peptid-Fragmenten, die reduziertes Cobratoxin zeigen.
Beispiel 8
Herstellung einer Probendarstellungsvorrichtung mit an der Oberfläche gebundenem α-Chymotrypsin
Eine massenspektrometrische Probendarstellungsvorrichtung wurde durch Bindung von α-Chymotrypsin an der Oberfläche der Vorrichtung wie folgt gebunden. α-Chymotrypsin oder mit TPCK-behandeltes α-Chrymotrypsin wurde in 20 mM Phosphat-Puffer (pH 7,8) bis auf eine Konzentration von 1 mg/mL für die Verwendung bei der Herstellung einer derivatisierten Probendarstellungsvorrichtung wie in Beispiel 2 beschrieben aufgelöst.
Beispiel 9
Sequenzbestimmung für das Design von Nukleinsäuresonden und Gen-Identifizierung
Die Kombination von an der Oberfläche immobilisierten und freien Peptidasen wurde zur Herstellung heterogener Fragment-Mischungen von einem ursprünglichen Peptid wie folgt verwendet.
Enzymatisch aktive massenspektrometrische Trypsin- und α-Chymotrypsinprobendarstellungsoberflächen wurden wie in den Beispielen 2 und 8 beschrieben hergestellt.
Das synthetische Peptid des menschlichen Nebenschilddrüsenhormons 1-34 (hPTH) wurde als Versuchspeptid für die Analysen ausgewählt. Die Sequenz des Peptids ist.
Verdauungen wurden in der folgenden Weise durchgeführt. Es wurden 3 μL-Aliquots von einer 0,01 mg/mL-Lösung hPTH (in einem Puffer von 20 mM NaHPO₄, pH 8,1) auf einer massenspektrometrischen Probendarstellungsvorrichtung, hergestellt gemäß Beispiel 2 oder Beispiel 8, aufgetragen. Man ließ die Abbaureaktionen 5 bis 10 Minuten laufen, bevor 0,5 bis 1,0 μL-Aliquots der Reaktionsmischungen von den Oberflächen entfernt wurden. Diese Aliquots wurden für das Endopeptidase-Mapping mit MALDI analysiert. Der pH-Wert wurde durch Zusatz eines Aliquots von 20 mM NH₄COOCH₃, an Volumen, das identisch zu dem der verbleibenden Reaktionsmischung war, auf ungefähr 5 reduziert. Anschließend wurden 500 nL-Aliquots von 0,001 mg/mL Carboxypeptidase P (CPP), in Acetatpuffer, zu den Reaktionsmischungen zugesetzt. Abbaureaktion der Proteinleiter ließ man zwischen 1 bis 3 Minuten laufen, bevor die Oberflächen von der erhitzten sehr feuchten Umgebung entfernt wurden und die Reaktion durch Zusatz einer gleichen Menge der MALDI-Matrix gestoppt wurden. Die Matrix/Reaktions-Mischung ließ man an der Luft trocknen und die enzymatisch aktivierten Oberflächen wurden direkt in das Massenspektrometer überführt.
12 ist ein ACCA-MALDI-Massenspektrum von 2,5 pmol von hPTH, dem Referenz-Startpunkt für die folgenden enzymatischen Analysen. Ein starkes einzeln protoniertes Signal ist bei einem Verhältnis von Masse zu Ladung (m/z) von 4.119,0 Da, ein doppelt geladenes bei m/z = 2.019,7 Da und wenig andere als Matrix-Ionen-Signale bei m/z < 500 Da zu beobachten.
Das hPTH wurde nach einer 10-minüten Verdauung mit einer Au/α-Chymotrypsin-Oberfläche, die bei 40°C und pH 8,1 gehalten wurde, weiter analysiert. Die Ergebnisse dieser Verdauung zeigt 13. Vier hauptsächliche Signale bei 1.398,5, 1.706,2, 1.850,0 und 2.738,7 Da sind zu beobachten, wie aus 13 zu entnehmen.
Vor Zusatz der MALDI-Matrix für den Erhalt des Massenspektrums, wie es in 13 gezeigt ist, wurde ein Teil des verdauten Peptids auf eine zweite konventionelle Probendarstellungsvorrichtungsoberfläche übertragen. Der Bereich des verdauten Peptids auf der zweiten konventionellen Probendarstellungsoberfläche wurde auf einen pH-Wert von ungefähr 5 eingestellt und weiter cpp ausgesetzt. 14 zeigt das MALDI- Massenspektrum, das von dieser zweiten Probe erhalten wurde. Eine Serie von Ionen-Signalen aufgrund der cpp-Verdauung wird im m/z-Bereich von 1.800 bis 2.800 Da beobachtet, was vermutlich von dem Au/α-Chymotrypsin-Verdauungssignal bei m/z = 2.738,7 stammt. Der erste Rest ist eine bevorzugte Spaltungsstelle für α-Chymotrypsin. 15 fasst die Massen der in 14 beobachteten Signale zusammen sowie die Differenzen der Massen zwischen benachbarten Signalen und die aus den Differenzen bestimmten Reste. Die Teilsequenz (zu lesen wie in 15 gezeigt vom N- zum C-Ende) ist durch sequenzielle Massendifferenz bestimmt und ergibt (pep) – MERVEW – COOH.
Eine zweite ähnliche Analyse des hPTH wurde unter Verwendung einer Au/Trypsin-Probendarstellungsoberfläche gefolgt von cpp-Verdauung durchgeführt. 16 zeigt die Ergebnisse der Au/Trypsin-Verdauung nach 5 Minuten bei einer Temperatur von 45°C (pH 8,1). 18 fasst die für die Verdauung beobachteten Massen zusammen. Die Trypsin-Verdauung, wie in 16 gezeigt, resultiert in der Herstellung von verschiedenen Start-Fragmenten und deutet auf die Anwesenheit der kurzen Sequenz (Arg/Lys) – Lys – Lys hin.
Vor Zusatz der MALDI-Matrix, um das in 16 gezeigte Massenspektrum zu erhalten, wurde ein Teil des verdauten Peptids auf eine zweite konventionelle Probendarstellungsvorrichtungsoberfläche übertragen. Das cpp wurde dann diesem zweiten Bereich zugesetzt. Nach Einstellung des pH-Wertes auf etwa 5, ließ man die Leiter-Verdauung 3 Minuten laufen, bevor diese durch Zusatz von ACCA zu der Probendarstellungsoberfläche abgebrochen wurde. 17 zeigt den resultierenden Sequenz-Leiter. Aus den beobachten Massendifferenzen, die in 18 zusammengefasst sind, wurde die Sequenz (pep) – NSMERVEW(L/I)RK – COOH bestimmt. Der erste durch cpp gespaltene Rest ist der von Arg. Arg ist eine bevorzugte Spaltungsstelle für Trypsin. Dies ist offensichtlich eine Erweiterung der Teilsequenz, die unter Verwendung von Au/α-Chymotrypsin/cpp bestimmt wurde.
Die Sequenz im großen Maßstab, (Arg/Lys) – Lys – Lys, überlappt mit der Leiter-Sequenz bei der korrekten Masse. Dies ermöglicht die Kombination beider Spektren für die Sequenzerweiterung bei einem zusätzlichen Lys. Der erste beobachtete Rest in der Au/α-Chymotrypsin/cpp-Serie, vom C-Ende, wurde als Tryptophan bestimmt. Dies ist erwartungsgemäß, weil Tryptophan eine der bevorzugten Stellen der α-Chymotrypsin-Spaltung ist.
Es existieren zwei Ionen-Signale, die in dem Bereich der letzten Spaltung der Au/α-Chymotrypsin/cpp-Verdauung, wie aus 15 zu sehen, auswählbar sind, was zur Möglichkeit einer Zweideutigkeit führt. Die zwei Massendifferenzen stellen die Möglichkeit von einem Serin oder einem Prolin als letzten Rest dar. Auf der Basis der Massenzuweisungsfehler, die in der gesamten Serie beobachtet werden (Mittel ungefähr 0,15 Da), wurde die letztliche Bestimmung von Serin mit einem Fehler von –0,1 Da gegenüber Prolin (mit einem Fehler von –2,2 Da) festgestellt. Die resultierende Sequenz wurde als (pep) – SMERVEW – COOH bestimmt.
Eine nominale Massendifferenz von 128 Da wurde an verschiedenen Punkten in dem Spektrum, das von der erstmaligen Trypsin-Spaltung in der Au/Trypsin/cpp-Analyse stand, beobachtet. Angesichts der Tatsache, das Trypsin nur am Lysin oder Arginin gespalten wird, ist es sehr wahrscheinlich, dass die 128 Da Massendifferenz von einem Lysin-C-Ende zu entweder einem anderen Lysin oder einem Arginin stammt. Ebenso zeigen zwei benachbarte Massendifferenzen von 128 Da, wie im Bereich zwischen 3.000 bis 3,300 Da, die Anwesenheit von Lys-Lys in der Sequenz, wobei der dritte Rest entweder ein Lysin oder ein Arginin ist. Diese Information, in Kombination mit erkennbaren Überlappungen in den Endo- und Exopeptidase-Spektren, erlaubt es, die beiden Spektren in Kombination zu verwenden, um die Sequenzbestimmung zu erweitern.
19 stellt eine Leiter-Sequenz dar, die durch ein zusätzliches Lysin erweitert wurde, das aus dem in dem Trypsin-Spektrum beobachteten (Arg/Lys) – Lys-Lys, das mit dem Arg-Lys der Leiter-Sequenz überlappt, bestimmt wurde. Die in dieser Weise bestimmte Massendifferenz von 128 Da kann unzweifelhaft dem Lys zugeordnet werden, das zum Gln, das das gleiche Molekulargewicht hat, entgegensteht. Ergebnis ist, dass 12 Reste der Sequenz als (pep) – NSMERVEW(L/I)RKK – COOH bestimmt wurden.
Für die Sammlung dieser Daten wurden vier Massenspektren mit 50 bis 100 Laser-Schüssen, die eine Qualität und ein Signal-Rausch-Verhältnis aufweisen, das für die Bestimmung relativer Molekularmassen im Bereich von ungefähr 0,2 Da groß genug sind, unter Verwendung einer Gesamtmenge von etwa 15 pmol der Probe erzeugt. Die Probenzubereitungen waren, typisch für den MALDI-Prozess, dazu in der Lage, Tausende von Einzellaserschuss-Massenspektren gleicher Qualität zu liefern. Da keine besonderen Anstrengungen unternommen wurden, die verwendete Menge der Probe bei der Probendarstellungsvorrichtung zu minimieren, und der Oberflächenbereich der Vorrichtung ziemlich groß war, ist es möglich, die Probenmenge des Analyten ohne Abstriche hinsichtlich der Qualität, durch ein einfaches niedrigeres Skalieren des gesamten Prozesses durch Reduzierung des Oberflächenbereiches und Anwendung von weniger Analytprobe zu reduzieren.
Es war wichtig, die derivatisierten Probendarstellungsoberflächen bei erhöhter Temperatur zu halten, um diese Abbaureaktionen schnell durchzuführen. Die sowohl für die Endo- als auch Exopeptidase-Abbaureaktionen verwendeten Temperaturen, d.h. durchgeführt bei erhöhten Temperaturen von bis zu ungefähr 55°C, sind etwas höher als üblicherweise in proteolytischen Verdauungen verwendet, nämlich 37°C. Dies, in Kombination mit der hohen relativen Energie der enzymatisch aktivierten Probendarstellungsoberflächen, wird als Grund für die schnellen Analysenzeiten angesehen. Obwohl es nicht in jedem Fall garantiert ist, zeigte es sich, dass eine Analysenzeit von 15 Minuten für das hPTH-Beispiel eine Analysengeschwindigkeit gerade unterhalb von einem Rest pro Minute darstellt.
Nachdem eine Peptidsequenz durch das zuvor beschriebene Verfahren bestimmt wurde, können die Regeln der Degeneration verwendet werden, um viele Nukleinsäuresequenzen zu bestimmten, die die Peptidsequenz codieren (siehe z.B. Biochemistry, Stryer, S. 91–115 (1988). Weil viele verschiedene Nukleinsäuresequenzen für ein einzelnes Peptid codieren, können mehrere Nukleinsäuresequenzen aus den Peptidsequenzen hergestellt werden. Die Nukleinsäuresequenzen können für die Suche in einer Datenbank für Nukleinsäuresequenzen, z.B. Genbank, verwendet werden, um Gene zu identifizieren, die ein spezielles Polypeptid codieren.
Beispiel 10
Herstellung einer Probendarstellungsvorrichtung mit an der Oberfläche gebundenem Pepsin
Eine massenspektrometrische Probendarstellungsvorrichtung wurde durch Bindung von Pepsin an der Oberfläche der Vorrichtung wie folgt hergestellt. Eine Goldfolie wurde zunächst mit DSP gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren aktiviert. Das mit DSP aktivierte Gold wurde dann mit Ethylendiamin (20 % V/V in Isopropanol) bei Raumtemperatur 30 Minuten lang umgesetzt. Nach der Inkubation wurde die Goldfolie sorgfältig mit Isopropanol gespült und dann mit 0,1 M [1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid] in 20 mM Phosphat-Puffer bei pH 4,5 30 Minuten lang bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Folie wurde dann sorgfältig mit dem Phosphat-Puffer gespült. Anschließend wurde eine Lösung von 10 mg/mL Pepsin in Phosphat-Puffer der Oberfläche zugesetzt, und man ließ bei 4 Stunden lang bei 4°C inkubieren. Nach der Inkubation wurde die Folie wiederholt mit Phosphat-Puffer gespült und schließlich im Vakuum getrocknet.
Beispiel 11
Au/Pepsin-Probenvorbereitungsoberfläche kontaktiert mit Pepsin
Eine Verdauung wurde mit den Au/Pepsin-aktiven Oberflächen, hergestellt in Beispiel 10, durch Anwendung von etwa 5 pmol von hPTH 1-34 in 10 mM Ammoniumacetat-Puffer (pH 3,4) durchgeführt. Das hPTH wurde 8 Minuten lang bei 45°C verdaut, bevor die Reaktion durch Zusatz der ACCA-Matrix gestoppt wurde. An schließend wurde die Flugzeit-Massenspektrometrie durchgeführt. Das in 20 dargestellte resultierende Spektrum enthält Ionen-Signale für die mit Pepsin hergestellten Peptide gemäß den Aminosäuren 4-18, 9-24, 8-24 und 18-34.
Beispiel 12
Sequentielle Behandlung eines Biomoleküls mit zwei verschiedenen Komplexen
Die Kombination von zwei verschiedenen an der Oberfläche gebundenen Komplexen wurde für die Modifizierung eines Biomoleküls in Sequenz wie folgt verwendet. Zunächst wurde hPTH 10 Minuten lang bei 35°C, pH 8,1, unter Verwendung einer immobilisierten Au/α-Chymotrypsin-Probendarstellungsvorrichtung, wie in Beispiel 2 beschrieben verdaut. Ein Teil der Verdauungsmischung wurde dann auf eine mit cpp aktivierte Vorrichtung, hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben, übertragen und der pH-Wert der Lösung wurde auf etwa 5 eingestellt. Die cpp-Verdauung ließ man 10 Minuten bei 35°C laufen, bevor diese durch Zusatz der ACCA-Matrix beendet wurde.
Das Massenspektrum der Ergebnisse der ersten Au/α-Chymotrypsin-Verdauung ist in 21 dargestellt. Es wurden Ionen-Signale beobachtet, die von der α-Chymotrypsin-Spaltung des hPTH resultieren. Das Massenspektrum der Ergebnisse der AU/cpp-Verdauung der α-Chymotrypsin-Verdauungsmischung ist in 22 gezeigt. Neue Ionen-Signale, gekennzeichnet durch einen Zusatz "*", wurden beobachtet. Diese neue Signale korrespondieren mit der C-Ende-Verdauung der ursprünglichen Peptid-Spezies.
Beispiel 13
Aufreinigung der Biomoleküle
Die Erfindung kann für die Aufreinigung von Biomolekülen wie folgt verwendet werden. Für viele biologische Studien ist es wesentlich, ungewünschte Proteasen aus den biologischen Lösungen zu entfernen. Aprotinin ist ein einzelkettiges basisches Polypeptid mit 58 Aminosäuren mit einer Molekularmasse von 6.512 Daltons, das eine polyvalente inhibierende Wirkung auf Proteasen besitzt. Insbesondere inhibiert es eine Vielzahl von Enzymen, die zu der Familie von Serin-Proteasen gehören, indem sie an die aktive Stelle des Enzyms binden und stabile Komplexe bilden. Eine massenspektrometrische Probendarstellungsvorrichtung wird durch Bindung von Aprotinin an der Oberfläche in gleicher Weise wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. Eine Lösung eines Polypeptids und einer Protease wird an der Oberfläche zugesetzt. Die Protease wird aus der Lösung durch das Aprotinin entfernt. Die Massenspektrometrie wird durchgeführt und nur das gereinigte Polypeptid sollte beobachtet werden.
Beispiel 14
Herstellung eines Probendarstellungsvorrichtung A, die Biomoleküle durch Ionenaustausch auf reinigt
Eine Ionenaustausch-Funktionalität, wie z.B. ein Diethylaminoethyl-Derivat, ein t-Butylamino-Derivat (für einen Anionenaustauscher), ein Sulfit-Derivat, ein Carbonsäure-Derivat (für den Kationenaustausch) oder eine Kombination hiervon wird auf einer Probendarstellungsoberfläche, hergestellt gemäß Beispiel 1, immobilisiert.
Beispiel 15
Aufreinigung von Biomolekülen durch Ionenaustausch
Eine Biomoleküle enthaltende Lösung wird zu einer gemäß Beispiel 14 hergestellten Oberfläche zugegeben. Die Ionenaustausch-Funktionalität, die an die Probendarstellungsoberfläche gebunden ist, tauscht Ionen mit störenden ionischen Spezies, die als Fremdstoffe in der Biomoleküle enthaltenden Lösung anwesend sind.
Beispiel 16
Analyse von DNA unter Verwendung der Probendarstellungsvorrichtung
Zuerst wird die Nuklease, Phosphodiesterase aus Schlangengift, an der Probendarstellungsvorrichtungsoberfläche befestigt. Diese Befestigung kann unter Verwendung eines Bindungsmoleküls in einer gleichen Weise, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist, durchgeführt werden. Als Zweites wird die DNA der Oberfläche zugesetzt. Nachdem die Phosphodiesterase DNA-Fragmente erzeugt hat, wird eine MALDI-Matrix zugesetzt und die MALDI-Flugzeit-Massenspektrometrie durchgeführt.
Beispiel 17
Analyse von Kohlenhydraten unter Verwendung der Probendarstellungsvorrichtung
Ein Enzym wie Mannase, das Kohlenhydrate verdaut, wird an der Probendarstellungsvorrichtungsoberfläche befestigt. Diese Befestigung kann unter Verwendung eines Bindungsmoleküls in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise durchgeführt werden. Als Nächstes wird ein Kohlenhydrat der Oberfläche zugesetzt. Nachdem die Mannase Kohlenhydrat-Fragmente erzeugt hat, wird eine MALDI-Matrix zugesetzt und die MALDI-Flugzeit-Massenspektrometrie durchgeführt.
Viele andere Variationen und Modifikationen der Erfindung sind für den Fachmann offensichtlich, ohne von dem Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen. Die zuvor beschriebenen Ausführungsformen sind daher hauptsächlich als beispielhaft beabsichtigt und alle solche Variationen und Modifikationen sind als innerhalb des Schutzumfangs der Ansprüche liegend beabsichtigt.

Claims

Probendarstellungsvorrichtung enthaltend: (a) eine massenspektrometrische Probendarstellungsvorrichtung mit einer massenspektrometrischen Probendarstellungsoberfläche und (b) ein auf der Oberfläche immobilisierter Komplex, wobei der Komplex mindestens ein Molekül enthält, das entweder ein Biomolekül durch selektive Spaltung des Biomoleküls an mindestens einer spezifischen Stelle chemisch modifiziert oder das ein Biomolekül durch Immobilisierung mindestens eines Fremdatoms aufbereitet, wobei das Biomolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden, DNA, Kohlenwasserstoffen, RNA und Kombinationen hiervon.
Probendarstellungsvorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Komplex folgendes enthält: (a) Bindungsmolekül, das über mindestens ein Ende des Bindungsmoleküls an die Probendarstellungsoberfläche gebunden ist, und (b) ein reaktives Molekül, das ein Biomolekül chemisch modifiziert, wobei das Bindungsmolekül an das reaktive Molekül gebunden ist.
Probendarstellungsvorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Biomolekül ein Polypeptid und das reaktive Molekül ein proteolytisches Enzym ist.
Probendarstellungsvorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das proteolytische Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Trypsin, α-Chymotrypsin, Pepsin und Carboxypeptidase-P.
Verfahren zur Herstellung einer Probendarstellungsvorrichtung, mit folgenden Schritten: Bereitstellung einer massenspektrometrischen Probendarstellungsvorrichtung mit einer massenspektrometrischen Probendarstellungsoberfläche, Bindung eines Komplexes an die Oberfläche, wobei der Komplex mindestens ein Molekül enthält, das entweder ein Biomolekül durch selektive Spaltung des Biomoleküls an mindestens einer spezifischen Stelle chemisch modifiziert oder das ein Biomolekül durch Immobilisierung mindestens eines Fremdatoms aufbereitet, wobei das Biomolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden, DNA, Kohlenwasserstoffen, RNA und Kombinationen hiervon.
Verfahren zur Herstellung einer Probendarstellungsvorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt der Bindung eines Komplexes an die Probendarstellungsoberfläche folgendes aufweist: (a) Bindung mindestens eines Endes eines Bindungsmoleküls an die massenspektrometrische Probendarstellungsoberfläche und (b) Bindung eines reaktiven Moleküls an das Bin dungsmolekül, wobei das reaktive Molekül ein Biomolekül chemisch modifiziert, wobei das Biomolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden, DNA, Kohlenwasserstoffen, RNA und Kombinationen hiervon.
Verfahren zur Analyse eines Biomoleküls mit folgenden Schritten: (a) Bereitstellung einer massenspektrometrischen Probendarstellungsoberfläche, (b) Inkontaktbringen der Probendarstellungsoberfläche mit mindestens einem Molekül, das entweder (i) ein Biomolekül durch selektive Spaltung des Biomoleküls an mindestens einer spezifischen Stelle chemisch modifiziert oder (ii) ein Biomolekül durch Immobilisierung mindestens eines Fremdatoms aufbereitet, um einen an der Oberfläche gebundenen Komplex zu bilden, (c) Entfernung von ungebundenem Komplex von der Probendarstellungsoberfläche, (d) Inkontaktbringen des Biomoleküls mit dem an der Oberfläche gebundenen Komplex, wodurch das Biomolekül chemisch modifiziert oder aufbereitet wird, (e) Anwendung einer MALDI-Matrix für die Probendarstellungsoberfläche und (f) Bestimmung des Molekulargewichts des che misch modifizierten oder aufbereiteten Biomoleküls in einem Massenspektrometer.
Verfahren zur Analyse eines Biomoleküls nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Biomolekül mindestens eine Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden, DNA, Kohlenwasserstoffen, RNA und Kombinationen hiervon enthält.
Verfahren zur Analyse nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplex folgendes enthält: (a) ein Bindungsmolekül, das über mindestens ein Ende des Bindungsmoleküls an die Probendarstellungsoberfläche gebunden ist und (b) ein reaktives Molekül, das ein Biomolekül chemisch modifiziert, wobei das Bindungsmolekül ebenfalls an das reaktive Molekül gebunden ist.
Verfahren zur Analyse eines Biomoleküls nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Biomolekül ein Polypeptid ist und der Komplex ein proteolytisches Enzym enthält.
Verfahren zur Analyse eines Polypeptids nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das proteolytische Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Trypsin, α-Chymotrypsin, Pepsin und Carboxypeptidase-P.
Verfahren zur Analyse eines Polypeptids nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein Reduktionsmittel, das die Disulfidbrücken spaltet, an der Oberfläche zugesetzt wird.
Verfahren zur Analyse eines Polypeptids nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein Reduktionsmittel, das die Disulfidbrücken spaltet, an der Oberfläche zugesetzt wird.
Verfahren zur Analyse eines Biomoleküls nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Schritt des Inkontaktbringens des Biomoleküls mit dem an der Oberfläche gebundenen Komplex der an der Oberfläche gebundene Komplex und das Biomolekül in einer feuchten Atmosphäre inkubiert werden.
Verfahren zur Analyse eines Biomoleküls nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der an der Oberfläche gebundene Komplex das Biomolekül chemisch modifiziert und nachdem das Biomolekül durch den Komplex modifiziert wurde, das Biomolekül einem zweiten reaktiven Molekül ausgesetzt wird, dass das Biomolekül ein zweites Mal chemisch modifiziert.
Verfahren zur Analyse eines Biomoleküls nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite reaktive Molekül sich vom reaktiven Molekül unterscheidet.
Verfahren zur Analyse eines Biomoleküls nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite reaktive Molekül ein Komplex ist, der an die Oberfläche gebunden wird.
Verfahren zur Analyse eines Biomoleküls nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekulargewichtsdaten, die von der Analyse des durch den Komplex modifizierten oder aufbereiteten Biomoleküls erhalten wurden und die Molekulargewichtsdaten, die von den Biomolekülen stammen, die sowohl durch den Komplex als auch das zweite reaktive Molekül modifiziert oder aufbereitet wurden, miteinander verglichen werden, um die partielle Struktur des Biomoleküls zu bestimmen.
Verfahren zur Analyse eines Biomoleküls nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekulargewichtsdaten verwendet werden, um eine beschränkte Aminosäurensequenz eines Peptids zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich mindestens eine zu der limitierenden Aminosäurensequenz korrespondierende Nukleinsäurensequenz bestimmt und eine Datenbank, die Nukleinsäurensequenzen für die Nukleinsäurensequenz enthält, gesucht wird.
Verfahren zur Analyse eines Biomoleküls nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Massenspektrometer folgende Merkmale aufweist: (a) eine massenspektrometrische Probendarstellungsvorrichtung, die die besagte massenspektro metrische Darstellungsoberfläche aufweist, (b) Mittel zur Einführung der Probendarstellungsoberfläche in eine Vakuumkammer, (c) Mittel zur Verdampfung und Ionisierung des chemisch modifizierten oder aufbereiteten Biomoleküls und (d) Mittel zur Bestimmung des Verhältnisses von Molekulargewicht zur Ladung des chemisch modifizierten oder aufbereiteten Biomolekül-Ions, basierend auf der Flugbahn im Massenspektrometer.
Verfahren zur Analyse eines Biomoleküls nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Massenspektrometer zusätzlich Mittel zur Herstellung eines elektrischen Feldes aufweist, wobei das Feld so ausgerichtet ist, dass die chemisch modifizierten oder aufbereiteten Biomolekül-Ionen eine Ablenkung von der Probendarstellungsoberfläche hin zu einem Detektionsmittel bewirkt.
Verfahren zur Analyse eines Biomoleküls nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Verdampfung und Ionisierung des chemisch modifizierten Biomoleküls ein Laser ist.
Verfahren zur Analyse eines Biomoleküls nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Bestimmung des Molekulargewichts des chemisch modifizierten oder aufbereiteten Bindungsmoleküls die Flugzeit für das chemisch modifizierte oder aufbereitete Bindungsmolekül messen.
Verfahren zur Analyse eines Polypeptids nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass, nachdem das Molekulargewicht eines Polypeptid-Fragmentes bestimmt wurde, das Molekulargewicht von dem Gewicht eines Polypeptid-Fragmentes mit einem nächstniedrigeren Molekulargewicht abgezogen wird, um zu bestimmen, welche Aminosäure von dem Polypeptid-Fragment mit dem geringeren Molekulargewicht fehlt.
Verfahren zur Analyse eines Polypeptids nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass eine limitierte Sequenz eines Aminosäuren enthaltenden Polypeptids, durch Sequenz-Analyse der Polypeptid-Fragmente mit geringerem Molekulargewicht bestimmt wird, um die fehlenden Aminosäuren zu erhalten, sowie zusätzlich mindestens eine Nukleinsäurensequenz, die mit der limitierten Aminosäurensequenz korrespondiert, bestimmt und eine Datenbank, die die Nukleinsäurensequenzen für die Nukleinsäurensequenz enthält, gesucht wird.
Massenspektrometer, das eine massenspektrometrische Probendarstellungsvorrichtung enthält, umfassend: (a) eine massenspektrometrische Probendarstellungsvorrichtung und (b) einen an der Oberfläche immobilisierten Komplex, wobei der Komplex mindestens ein Molekül enthält, das entweder ein Biomolekül durch selektive Spaltung des Biomoleküls an mindestens einer spezifischen Stelle chemisch modifiziert oder das ein Biomolekül durch Immobilisierung mindestens eines Fremdatoms aufbereitet, wobei der Komplex nicht in eine MALDI-Matrix eingebaut ist und nicht in einem Massenspektrometer verdampft wird.
Massenspektrometer nach Anspruch 27, zusätzlich enthaltend: (a) Mittel zur Einführung einer Probendarstellungsvorrichtung in eine Vakuumkammer, (b) Mittel zur Verdampfung und Ionisierung eines chemisch modifizierten oder aufbereiteten Biomoleküls, wobei ein chemisch modifiziertes oder aufbereitetes Biomolekül-Ion gebildet wird, und wobei die besagten Mittel zur Verdampfung folgendes enthalten: (i) ein Matrix-Material, das das chemisch modifizierte oder aufbereitete Biomolekül in Lösung bringt und Strahlungsenergie bei einer Frequenz absorbiert, die für Laser leicht zu erreichen ist, wobei das Matrix-Material über dem Komplex aufgebracht wird und (ii) Mittel zur Verdampfung des Matrix-Materials und (c) Mittel zur Bestimmung eines Verhältnisses von Molekulargewicht zur Ladung des chemisch modifizierten oder aufbereiteten Biomolekül-Ions basierend auf dessen Flugbahn.
Probendarstellungsvorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probendarstellungsoberfläche ein Metall ist und das Bindungs mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dithiothreitol, Dimethyladipimidat-2·HCl, Dimethylpimelimidat·HCl, Dimethylsuberimidat·2HCl, Dimethyl-3,3'-dithiobispropionimidat·2HCl, Dibernsteinsäureimidylglutarat, Dibernsteinsäureimidylsuberat, Bis-(Sulfobernsteinsäureimidyl)-suberat, Dithiobis-(bernsteinsäureimidylpropionat), Dithiobis-(sulfobernsteinsäureimidylpropionat), Ethylenglycobis-(bernsteinsäureimidylsuccinat), Ethylenglycobis-(sulfobernsteinsäuresuccinat), Dibernsteinsäureimidyltartrat, Disulfobernsteinsäureimidyltartrat, Bis-[2-(bern-steinsäureimidyloxycarbonyloxy)ethyl]sulfon, Bis-[2-(sulfobernsteinsäureimidooxycarbonyloxy)ethyl]sulfon, Bernsteinsäureimidyl 4-(N-maleimido-methyl)cyclohexan-1-carboxylat, Sulfobernsteinsäureimidyl-4-(N-maleimido-methyl)cyclohexan-1-carboxylat, m-Maleimido-benzoyl-N-hydroxybernsteinsäureimidester, m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfobernsteinsäureimidester, Bernsteinsäureimidyl 4-(p-Maleimidophenyl)-butyrat, Sulfobernsteinsäureimidyl 4-(p-Maleimidophenyl)-butyrat, Bismaleimidohexan, N-(γ-Maleimidobutyryloxy)bernsteinsäureimidester, N-(γ-Maleimidobutyryloxy)sulfobernsteinsäureimidester, N-Bernsteinsäureimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoat, Sulfobernsteinsäureimidyl(4-iodoacetyl)-amino-benzoat, 1,4-Di-[3'-2'-pyridyldithio(propionamido)butan], 4-Bernsteinsäureimidyloxycarbonyl-α-(2-pyridyldithio)toluol, Sulfobernsteinsäureimidyl-6-[α-methyl-α(2-pyridyldithio)-toluamido]hexanoat, N-Bernsteinsäureimidyl-3(2-pyridyldithio)-propionat, Bernsteinsäureimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)-propionamido]hexanoat, Sulfobernsteinsäureimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)-propion amido]hexanoat, 3-(2-Pyridyldithio)-propionylhydrazid, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid, N,N-Dicyclohexylcarbodiimid, 4-(p-Azidosalicylamido)-butylamin, Azidobenzoylhydrazid, N-5-Azido-2-nitrobenzoyloxybernstinsäureimid, N-[4-(p-Azidosalicylamido)butyl]-3'-(2'-pyridyldithio)propionamid, p-azidophenylglyoxal-monohydrat, 4-(p-Azidosalicylamido)butylamin, 1-(p-Azidosalicylamido)-4-(iodoacetamido)butan, Bis-[β-4-Azidosalicylamido)ethyl]disulfid, N-Hydroxybernsteinsäureimidyl-4-azidobenzoat, n-Hydroxysulfobernsteinsäureimidyl-4-azidobenzo-at, N-Hydroxybernsteinsäureimidyl-4-azidosalicylsäure, N-Hydroxysulfobernsteinsäureimidyl-4-azidosalicylsäure, Sulfobernsteinsäureimidyl-(4-azidosalicylamido)hexanoat, p-Nitrophenol-2-diazo-3,3,3-trifluoropropionat, 2-Diazo-3,3,3,-trifluoropropionylchlorid, N-Bernsteinsäureimidyl-(4-azidophenyl)-1,3'-dithiopropionat, Sulfobernsteinsäureimidyl-(4-azidophenyldi-thio)propionat, Sulfobernsteinsäureimidyl-2-(7-azido-4-methylcoumarin-3-acetamid)ethyl-1,3'-dithiopropionat, Sulfobernsteinsäureimidyl-7-azido-4-methylcoumarin-3-acetat, Sulfobernsteinsäureimidyl 2-(m-azido-o-nitrobenzamido)-ethyl-1,3'-dithiopropionat, N-Bernsteinsäureimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoat, Sulfobernsteinsäureimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoat, Sulfobernsteinsäureimidyl-2-(p-azidosalicylamido)ethyl-1,3'-Dithiopropionat, Sulfobernsteinsäureimidyl-4-(p-azidophenyl)-butyrat.
Probendarstellungsvorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probendarstel lungsoberfläche Gold und das Bindungsmolekül Dithiobis(bernsteinsäureimidylpropionat) oder Dithiobis(sulfobernsteinsäureimidylpropionat) ist.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Probendarstellungsoberfläche Metall ist und das Bindungsmolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dithiothreitol, Dimethyladipimidat-2·HCl, Dimethylpimelimidat·HCl, Dimethylsuberimidat·2HCl, Dimethyl-3,3'-dithiobispropionimidat·2HCl, Dibernsteinsäureimidylglutarat, Dibernsteinsäureimidylsuberat, Bis-(Sulfobernsteinsäureimidyl)-suberat, Dithiobis-(bernsteinsäureimidylpropionat), Dithiobis-(sulfobernsteinsäureimidylpropionat), Ethylenglycobis-(bernsteinsäureimidylsuccinat), Ethylenglycobis-(sulfobernsteinsäuresuccinat), Dibernsteinsäureimidyltartrat, Disulfobernsteinsäureimidyltartrat, Bis-[2-(bernsteinsäureimidyloxycarbonyloxy)ethyl]sulfon, Bis-[2-(sulfobernsteinsäureimidooxycarbonyloxy)ethyl]sulfon, Bernsteinsäureimidyl 4-(N-maleimido-methyl)cyclohexan-1-carboxylat, Sulfobernsteinsäureimidyl-4-(N-maleimido-methyl)cyclohexan-1-carboxylat, m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxybernsteinsäureimidester, m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfobernsteinsäureimidester, Bernsteinsäureimidyl 4-(p-Maleimidophenyl)-butyrat, Sulfobernsteinsäureimidyl 4-(p-Maleimidophenyl)-butyrat, Bismaleimidohexan, N-(γ-Maleimidobutyryloxy)bernsteinsäureimidester, N-(γ-Maleimidobutyryloxy)sulfobernsteinsäureimidester, N-Bernsteinsäureimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoat, Sulfobernsteinsäureimidyl(4-iodoacetyl)-amino benzoat, 1,4-Di-[3'-2'-pyridyldithio(propionamido)butan], 4-Bernsteinsäureimidyloxycarbonyl-α-(2-pyridyldithio)toluol, Sulfobernsteinsäureimidyl-6-[α-methyl-α(2-pyridyldithio)-toluamido]hexanoat, N-Bernsteinsäureimidyl-3(2-pyridyldithio)-propionat, Bernsteinsäureimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)-propionamido]hexanoat, Sulfobernsteinsäureimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)-propionamido]hexanoat, 3-(2-Pyridyldithio)-propionylhydrazid, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid, N,N-Dicyclohexylcarbodiimid, 4-(p-Azidosalicylamido)-butylamin, Azidobenzoylhydrazid, N-5-Azido-2-nitrobenzoyloxybernstinsäureimid, N-[4-(p-Azidosalicylamido)butyl]-3'-(2'-pyridyldithio)propionamid, p-azidophenylglyoxal-monohydrat, 4-(p-Azidosalicylamido)butylamin, 1-(p-Azidosalicylamido)-4-(iodoacetamido)butan, Bis-[β-4-Azidosalicylamido)ethyl]disulfid, N-Hydroxybernsteinsäureimidyl-4-azidobenzoat, n-Hydroxysulfobernsteinsäureimidyl-4-azidobenzoat, N-Hydroxybernsteinsäureimidyl-4-azidosalicylsäure, N-Hydroxysulfobernsteinsäureimidyl-4-azidosalicylsäure, Sulfobernsteinsäureimidyl-(4-azidosalicylamido)hexanoat, p-Nitrophenol-2-diazo-3,3,3-trifluoropropionat, 2-Diazo-3,3,3,-trifluoropropionylchlorid, N-Bernsteinsäureimidyl-(4-azidophenyl)-1,3'-dithiopropionat, Sulfobernsteinsäureimidyl-(4-azidophenyldi-thio)propionat, Sulfobernsteinsäureimidyl-2-(7-azido-4-methylcoumarin-3-acetamid)ethyl-1,3'-dithiopropionat, Sulfobernsteinsäureimidyl-7-azido-4-methylcoumarin-3-acetat, Sulfobernsteinsäureimidyl 2-(m-azido-o-nitrobenzamido)-ethyl-1,3'-dithiopropionat, N-Bernsteinsäureimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoat, Sulfobern steinsäureimidyl-6-(4'-azido-2'-nitro-phenylamino)hexanoat, Sulfobernsteinsäureimidyl-2-(p-azidosalicylamido)ethyl-1,3'-Dithiopropionat, Sulfobernsteinsäureimidyl-4-(p-azidophenyl)-butyrat.