JP4547153B2 - タンパク質プロファイリングのための診断方法 - Google Patents
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Description
本発明に至る研究は、国立がん研究所からの公衆衛生局助成金CA−83875によって一部支援された。米国政府は、本発明において一部の権利を有し得る。
(発明の分野)
本発明は、重要な細胞タンパク質(指標タンパク質セットまたはサブセット)の重要なセットについての発現プロファイルを得るための方法および異常な状態または病的状態の存在を診断するために生成されたタンパク質プロファイルの使用に関する。本発明は、指標タンパク質セットの発現プロファイルを変化することが可能な治療的化合物をスクリーニングするための方法をさらに提供する。本発明はまた、目的のタンパクがユビキチン/プロテアソーム経路の標的であるか否かを特異的に決定するための手段も提供する。
生物のタンパク質相補体の研究は、プロテオミクスと呼ばれ、薬物標的および新規薬物を同定するための重要なアプローチとして出現している。プロテオミクスの分野は、以下の2つのアプローチを含む:タンパク質発現における全体的な変化を研究する、発現プロテオミクス、およびタンパク質−タンパク質相互作用の系統的研究である、細胞マッププロテオミクス(Blackstockら(1999)Trends in Biotechnology 17:121−127)。固定ゲノムと異なり、プロテオームは、遺伝子発現、安定性および翻訳後改変を反映する動的な実態である。プロテオームは、細胞特異的または組織特異的であり得、かつ生物の代謝状態、健康、および環境によって影響され得る。
本発明は、細胞における異常な状態または病的状態(例えば、発症した疾患の存在下で生じるかまたは正常な状態から形質転換された状態もしくは異常な状態への移行において生じる)の存在を決定するための新規の診断方法を提供する。本発明は、異なる生理学的状態または条件下で最も変化する可能性が高い、細胞タンパク質の重要なサブセットについての発現プロファイルを確立する方法を提供する。本発明の方法において、代表的に情報価値のない(uninformative)細胞タンパク質のバルクは削除され、そしてその分析は、細胞異常性の診断における高い予測値を有するタンパク質の小セットに限定される。本発明の方法は、「タンパク質プロファイリング」と呼ばれ、そして正常な発現からの変異について検査される重要な細胞タンパク質のサブセットは、「指標タンパク質セット」(「IPS」)と呼ばれる。このIPSは、ユビキチン化調節タンパク質および非ユビキチン化調節タンパク質の両方を含む。
を包含する。
本方法が記載される前に、本発明が、記載される特定のアッセイ法、試験化合物および実験条件に限定されないので、このような方法および化合物が変化し得ることが理解されるべきである。本明細書中で使用される技術が、特定の実施形態の記載のみの目的のみのためであり、限定することを意図されないこともまた、理解されるべきである。なぜなら、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみによって限定されるからである。
用語「タンパク質プロファイリング」は、細胞制御および細胞増殖に関連する重要なタンパク質の特定のセットの発現を定量化する方法を意味し、このタンパク質は、ユビキチン結合タンパク質(例えば、Rad23)に結合することによって本発明の方法において単離されたユビキチン化タンパク質および非ユビキチン化タンパク質を含む。
ユビキチン(Ub)は、真核生物において非常に保存された76アミノ酸タンパク質であり、プロテアソームとよばれるプロテアーゼによる分解に対する他のタンパク質を特徴付けるためにそれらに共有結合される。ヒトRad23タンパク質は、インビボでユビキチン化タンパク質に結合する。この結合相互作用は、高塩条件および変性条件に耐えるのに十分強い。ユビキチン化タンパク質を選択的に精製する方法を開発するために、この特徴を研究した。この特徴は、細胞増殖および細胞発生の最も重要な公知の調節因子を示す。これらの生理学的役割のために、ユビキチン化タンパク質の発現は、病的細胞に対して、健常細胞において、ユビキチン化タンパク質のタンパク質プロファイルフィンガープリントを比較することにより悪性疾患の存在または疾患状態の発生を決定するために診断的に使用され得る。実質的には、細胞増殖および発生のすべての重要な調節因子は、ユビキチン経路による分解に対して標的化される。ウイルスによる細胞の形質転換または癌におけるそれらの変更された増殖特性は、増殖制御のパターンが変更されることを必要とする。ユビキチン経路により分解されるタンパク質の例としては、腫瘍サプレッサー(p53およびRb)、炎症性応答のインヒビター(I Bα)、シグナル伝達分子(c−Jun、c−MycおよびG−α)、細胞周期調節因子(サイクリン、CDKインヒビター、コヒージョンおよびPds1)、トポイソメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「2次元電気泳動」(2D−電気泳動)は、等電点電気泳動、その後の変性電気泳動を含む技術を意味し;これは、複数の分離したタンパク質を含む2次元ゲル(2D−ゲル)を生成する。好ましくは、変性電気泳動の工程は、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下でのポリアクリルアミド電気泳動(SDS−PAGE)を使用する。2D−ゲル電気泳動を実施するための高い精度および自動可能な方法および装置が、当該分野において公知であり、刊行物(例えば、WO98/23950および米国特許第6,064,754号)中に記載され、それらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。簡単には、2D−ゲル電気泳動は、生物学的サンプル中のタンパク質を同定し、選択し、そして特徴付けるための、効率的でコンピューター補助された、方法および装置を提供する。2次元アレイを、これらの電気泳動的移動度および等電点に従う2次元ゲル上で、生体分子を分離することによって生成する。アレイのコンピューター生成デジタルプロファイルを生成し、同一性、見かけの分子量、等電点および、2次元アレイにおいて検出される複数の生体分子の相対量を表し、それによって、複数の生物学的サンプルからのプロファイルのコンピュ−ターの媒介比較ならびに目的の分離されたタンパク質の切除を可能にする。
本発明によれば、IPSまたはサブセットタンパク質は、免疫原として使用されて、このような免疫原に免疫特異的に結合する抗体を生成し得る。このような免疫原は、上記の方法を含む任意の従来手段によって単離され得る。本発明の抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異的抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、FabフラグメントおよびF(ab’)フラグメント、Fab発現ライブラリーによって生成されるフラグメント、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分(すなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子)をいう。本発明の免疫グロブリン分子は、任意のクラス(例えば、IgG、IgE、IgM、IgDおよびIgA)、または免疫グロブリン分子のサブクラスであり得る。
本発明の方法は、ユビキチン結合タンパク質(例えば、Rad23、Ddil、Dsk2およびRpn10)を提供する。しかし、類似の特性を持つ他のタンパク質の使用は、本発明の一部と考えられる。ユビキチン結合タンパク質は、遺伝子が入手可能である任意の種から得られ得る。これらのタンパク質は、グルタチオン−セファロース、チオレドキシン、マルトース結合タンパク質、His−6エピトープ、Flag−エピトープ、または、親和試薬または抗体が入手可能である、多くの他のよく特徴付けられたエピトープのいずれかの1つとの融合体として発現され得る。ユビキチン結合タンパク質はまた、マトリックスと結合される特定の抗体に結合され得る。上述のユビキチン結合タンパク質の種々の誘導体と結合される、マトリックスの調製は、本発明の一部であると考えられる。加えて、(前述のエピトープおよびタグを欠失している)任意の上述のユビキチン結合タンパク質は、シアン活性化セファロースに直接結合し得、親和性マトリックスとして用いられ得る。さらに、タンパク質ユビキチン化の酵素学に関係するタンパク質は、ユビキチンとの一時的な相互作用を形成し、そしてまた、ユビキチン化タンパク質に結合するのに有用であることが分かり得る。
本発明に従って、疾患あるいは病理を有すると疑われる、またはこれらを有することが知られる非験体より得られた脳脊髄液(CSF)、血清、血漿または尿の試験生物学的サンプルが、診断またはモニタリングに使用され得る。一つの実施形態において、コントロールサンプル(既知の健常なコントロールサンプル/被験体由来)または対応するIPSまたはサブセットの以前に決定されたコントロール参照範囲タンパク質プロファイルに対して、試験生物学的サンプル中の異常状態の存在に典型的なIPSまたはサブセットのタンパク質発現プロファイルは、異常状態の存在を示す。別の実施形態において、1つ以上の主要な指標タンパク質が異常状態を示すと同定された場合、対応するコントロールに対して、1つ以上の主要な指標タンパク質の発現の増加あるいは減少は、異常状態の存在を示す。加えて、IPS中の1つ以上の主要指標タンパク質の改変(リン酸化、アセチル化、メチル化、ADPリボシル化、ニトロシル化、脂肪酸付加および糖付加、タンパク分解性プロセシングまたはユビキチン様修飾因子との結合が挙げられるが、これらに限定されない)は、正常範囲と異なることを示し、そして異常状態を予想する。
本発明は、異常な発現パターンを改善するように(例えば、正常なフィンガープリントにより類似する)、IPSまたはサブセットのタンパク質の発現パターンを変化させ得るような薬剤(例えば、候補組成物または試験組成物)を同定するための方法を提供する。薬剤、候補組成物または試験組成物の例としては、核酸(例えば、DNAおよびRNA)、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物(peptidomimetic)、小分子ならびに他の薬物が挙げられるが、これらに限定されない。薬剤は、以下を含む当該分野で公知であるコンビナトリアルライブラリー法において、多くのアプローチのうちいくつかを用いて得られ得る;生物学的ライブラリー;空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリー;逆重畳積分を必要とする合成ライブラリー法;「1ビーズ−1化合物(one−bead one− compound)」ライブラリー法;ならびにアフィニティークロマトグラフィー抽出を用いる合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定され、一方他の4つのアプローチは、化合物のペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリーまたは小分子ライブラリーに適用可能である(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12:145;米国特許第5,738,996号;および同5,807,683号、このそれぞれが、その全体が参考として本明細書中に援用される)。
酵母からヒトまでRad23タンパク質は、プロテアソームサブユニットRpn10/S5aに結合するUbLR23ドメイン、およびユビキチンおよびユビキチン化細胞タンパク質に結合するUBAドメインを含む。以下の実施例1は、Rad23が、ユビキチン化細胞タンパク質に結合し得ることを示す。かなり、この相互作用は、UBAドメインを必要とした。なぜなら、特定の変異体は、ユビキチン化細胞タンパク質に結合しないか、またはインビボで基質を試験しないからである。UbLR23ドメインまたは機能的UBAドメインのいずれかを欠くRad23変異体は、rad23Δrpn10Δの欠点を抑圧しないので、ユビキチン化タンパク質とプロテアソームとの相互作用はともに、Rad23機能を必要とする。Rad23の高レベルの発現は、プロテアソームにおけるユビキチン化タンパク質のレベルの劇的な増加を生じたこともまた、決定された。この興味深い知見は、ユビキチン化タンパク質とプロテアソームとのインビボでの相互作用を明らかにすることの第1の証拠である。さらに、これらの知見は、Rad23が、ユビキチン化タンパク質の、プロテアソームに存在するRpn10へのトランスロケーションを媒介することを示唆する。まとめると、これらの結果は、「シャトル因子仮説」についての反論し得ない支持を提供し、ここで、UbLドメインおよびUBAドメインを含むRad23および他のタンパク質(例えば、Dsk2(Bigginsら(1996)J.Cell Biol.133:1331−1346)およびDdil(Clarkeら(2001)Mol.Cell.Biol.21:1997−2007))は、プロテアソームに対してタンパク質分解基質を転座させる新規な調節因子である。
(酵母株およびプラスミド)bar1Δ変異体は、一倍体の酵母株JD47−13C(Dr.J.Dohmenにより提供)(JD47−13C:MATa his3−Δ200trp1−Δ63 lys2−801 ura3−52 leu2−112)中で、プラスミドpJGSST1を用いて構築された。酵母RAD23遺伝子は、プラスミドpDG28(Dr.R.D.Gietzにより享受)を用いて、JD47−13C中で欠失された。KMY1188はこのrad23Δ株のFOA抵抗性誘導体である。Flag−Rad23をコードするプラスミド、およびGSTセットのRad23融合タンパク質は以前に前述している(例えば、Arakiら(2001)J.Biol.Chem.276:18665−18672を参照のこと)。
(Rad23は、ユビキチン化タンパク質に結合する) Rad23の高レベル発現は、酵母細胞におけるユビキチン化されたタンパク質の蓄積を導く。類似の条件において増殖したコントロール株、または過剰発現したRpn10は、この効果を示さなかった。以前の研究は、Rad23が、フリーのユビキチン(Ub)に結合し得たことを示した(Bertolaetら(2001)Nat.Struct.Biol.8:417〜422;Chenら(2001)EMBO Rep 2)が、その天然の標的がユビキチン化タンパク質を示すことが予想された。高分子量のユビキチン化タンパク質の蓄積により、本発明者は、それらがRad23に結合されたか否かを決定した。
(Rad23は、インビボでユビキチン化タンパク質を結合し得る) ヒトhHR23−Bを、グルタチオンS−トランスフェラーゼへの融合体として発現させた。タンパク質抽出物を、グルタチオンセファロースに適用し、そしてGST−hHR23−Bに結合するタンパク質を、免疫ブロット法において試験した。約20kDaから200kDaより多くまでにわたる有意な反応が、抗Ub抗体に対して検出された(結果は示さない)。これらのタンパク質は、非常に堅くhHR23−Bに結合され、かつ、SDSでの処理によってのみ、解離され得た。抗Ub交差反応物質は、GSTのみを含有する第二レーンにおいて、検出されなかった。これらのデータは、ヒトRad23が、次の単一の親和性工程において回収され得るユビキチン化タンパク質を結合することを、証明した。
Claims (21)
- 生物学的サンプルのタンパク質発現プロファイルを確立するための方法であって、
(a)生物学的サンプルをユビキチン結合タンパク質と接触させることにより、IPSタンパク質(指標タンパク質セット)が該ユビキチン結合タンパク質と結合する、工程;
(b)該IPSタンパク質を単離する工程;および
(c)該単離されたIPSタンパク質を分析する工程であって、組織または細胞についてのユビキチン化タンパク質の発現プロファイルが確立される、工程、
を包含し、
該ユビキチン結合タンパク質は、Rad23、Ddil1、Dsk2、アタキシン−3、p62、Rpn10、ならびに直列に結合されたユビキチン結合(UBA)ドメインを含む天然または人工のペプチド構築物からなる群より選択される、
方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記生物学的サンプルが、末梢血、体液、組織生検、培養細胞、タンパク質抽出物、または糞便サンプルである、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記ユビキチン結合タンパク質が、直列に結合されたユビキチン結合(UBA)ドメインを含む天然または人工のペプチド構築物である、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記ユビキチン結合タンパク質が、Rad23、Ddil1、Dsk2、アタキシン−3、p62、Rpn10、およびUBA含有タンパク質からなる群より選択される、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記単離する工程(b)が、前記ユビキチン結合タンパク質(IPS)をUBAドメイン親和性マトリックスに付着することによって実施される、方法。
- 請求項5に記載の方法であって、
脱ユビキチン化反応による前記結合したタンパク質(指標タンパク質セット)の放出をさらに包含する、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記分析する工程(c)が、前記単離された脱ユビキチン化タンパク質(指標タンパク質セット)を高解像度二次元(2D)ゲル電気泳動に供することによって実施される、方法。
- 請求項7に記載の方法であって、前記2Dゲル電気泳動の後に、前記タンパク質の可視化が行われる、方法。
- 請求項8に記載の方法であって、前記可視化が、硝酸銀染色を用いて達成される、方法。
- 請求項4に記載の方法であって、前記Rad23が、グルタチオンS−トランスフェラーゼに融合された組換えヒト融合タンパク質であり、親和性マトリックスが、グルタチオン−セファロースから構成される、方法。
- 請求項6に記載の方法であって、前記指標タンパク質セットの放出が、高塩条件、界面活性剤、または酵素反応への曝露による、方法。
- 請求項9に記載の方法であって、前記指標タンパク質セットの酵素的放出が、ユビキチン−イソペプチダーゼへの曝露による、方法。
- 生物学的サンプル中の疾患または病理の存在を決定するための検査方法であって、
(a)試験生物学的サンプルをユビキチン結合タンパク質と接触させることにより、IPSタンパク質(指標タンパク質セット)が該ユビキチン結合タンパク質と結合する、工程;
(b)該IPSタンパク質を単離する工程;
(c)該単離されたIPSタンパク質を分析する工程であって、発現プロファイルが生成される、工程;および
(d)該試験発現プロファイルをコントロール発現プロファイルと比較して、該試験プロファイルが該コントロールプロファイルと異なるか否かを決定する工程であって、該コントロールプロファイルとの差異は、疾患または病理の存在を示す、工程、
を包含し、
該ユビキチン結合タンパク質は、Rad23、Ddil1、Dsk2、アタキシン−3、p62、Rpn10、ならびに直列に結合されたユビキチン結合(UBA)ドメインを含む天然または人工のペプチド構築物からなる群より選択される、
方法。 - 請求項13に記載の方法であって、
(e)前記単離されたIPSタンパク質(指標タンパク質セット)をタンデム型質量分析法に供する工程、
をさらに包含する、方法。 - (f)前記IPSに対する抗体またはそのサブセットに対する抗体を生成する工程;および
(g)工程(f)において生成された抗体の選択されたセットを使用して、タンパク質チップを構築する工程、
をさらに包含する、請求項13または14に記載の方法。 - 目的のサンプルについてのタンパク質プロファイルを生成するためのキットであって、
(a)診断、予後判定、治療的モニタリングまたはこれらの適用の任意の組み合わせのためにユビキチン結合タンパク質を使用する指示、
(b)ユビキチン結合タンパク質であって、該ユビキチン結合タンパク質は、Rad23、Ddil1、Dsk2、アタキシン−3、p62、Rpn10、ならびに直列に結合されたユビキチン結合(UBA)ドメインを含む天然または人工のペプチド構築物からなる群より選択される、ユビキチン結合タンパク質;
(c)該結合タンパク質が固定され得る固相;および
(d)診断用途、予後判定用途、もしくは治療用途、またはこれらの任意の組み合わせについての規制機関の認可を示す、標識または挿入物、
を備える、キット。 - 前記固相が試薬片である、請求項16に記載のキット。
- 目的の指標タンパク質セットのタンパク質プロファイルを調節可能である化合物を同定するための方法であって、
(a)試験化合物に曝露された生物学的サンプルをユビキチン結合タンパク質に接触させることによって、IPSタンパク質(指標タンパク質セット)が該ユビキチン結合タンパク質に結合する、工程;
(b)該IPSタンパク質(指標タンパク質セット)を単離する工程;および
(c)該単離された指標タンパク質セットを分析する工程であって、該指標タンパク質セットの発現プロファイルに対する該試験化合物の影響が決定される、工程、
を包含し、
該ユビキチン結合タンパク質は、Rad23、Ddil1、Dsk2、アタキシン−3、p62、Rpn10、ならびに直列に結合されたユビキチン結合(UBA)ドメインを含む天然または人工のペプチド構築物からなる群より選択される、
方法。 - 請求項18に記載の方法であって、前記化合物が、前記タンパク質プロファイルを異常から正常へと調節する、方法。
- 請求項16に記載のキットであって、
前記結合タンパク質に対する標識された結合パートナー
をさらに含み、
該標識は放射性標識または化学発光標識である、
キット。 - 請求項16に記載のキットであって、
前記ユビキチン結合タンパク質は放射性標識または化学発光標識で標識された、
キット。
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