JP4015992B2 - Maldi質量分析機用サンプル濃縮maldiプレート - Google Patents
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Description
マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)によるイオン化質量分析(MS)は、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、DNA、RNA等の大きな分子の分析に有用なツールである。分析の感度と自動分析の速度が、MALDIプレート上へのサンプル調製に大きく依存することが広く知られている。MALDI質量分析用のサンプル調製に関する問題は、英国特許出願公開第GB2332273A号明細書にまとめられている。
(発明の概要)
本発明は、MALDI−MS分析用サンプル支持プレート、およびMALDI−MS分析用に1以上の別個の位置にサンプルを濃縮する方法に関する。また、本発明によって、この支持プレートの簡便な作成法および使用法も提供される。さらに、本発明によって、サンプルの調製法および分析法も提供される。さらにまた、本発明のサンプルの調製法と分析法によって、様々な分析対象を小さなスポットに正確に濃縮・配置し、塩や他の望ましくない分子を分析対象やマトリックスから分離することが可能になる。本発明のサンプル調製法と分析法は、現実的にあらゆる種類のMALDI−MS分析に使用できる。
(発明の詳細な説明)
本発明は、MALDI−MS用の流入型(flow-through)サンプル濃縮支持プレートに関する。本発明は、また、本発明の支持プレートの簡便な作製法および使用法、ならびにサンプル調製法およびサンプルの分析法に関する。本発明のサンプル支持プレートおよびそれに関する方法により、以下の多くの利点が提供される。
穴に充填される多孔性材料は、分析対象分子を捕捉・濃縮することができる。そのため、(効率的で精度の高い質量分析用に)かなり希釈された大容量のサンプル溶液を穴に添加して、多孔性材料上に十分な濃度の分析対象分子を集積させることができる。
(定義)
本発明をさらに詳細に説明する前に、本明細書、実施例、および添付された請求項において用いられる一定の用語を、便宜上、ここにまとめる。
本明細書で用いられる「浸透」という用語は、吸収、吸着、および/または単純ろ過によって、選択された分子が、多孔性材料の中へまたは多孔性材料を通って、移動することを指す。この用語は、多孔性材料に浸透しないため、多孔性材料の表面に残留・「保持」された選択された分子に対して用いられる、「保持」という用語とは異なる。
本明細書で用いられる「マトリックス材料」という用語は、MALDI−MSでの使用に適したすべての材料(例えば、1以上の小さな、酸性の、光を吸収する分子(例えば、ニコチン酸、シナピン酸)が挙げられる)をいい、これは分析対象と溶液中で混合され、ターゲットスポット上において乾燥され、マトリックス結晶に包含された分析対象の分子を(レーザー照射によって)固相結晶から気体層または蒸気層へ十分に脱着・イオン化させ、分子イオンとして飛び出させるものである。何倍もの過剰量のマトリックス材料によって、結晶形成と分析対象の捕捉とが促進される。
(発明の実施態様の説明)
1つの観点からは、本発明は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析(MALDI−MS)において使用するサンプル支持プレートに関する。本発明のMALDIプレートには、サンプル提示用上面と下面とがあり、サンプル提示用上面には、サンプル受け入れ用の1以上の穴がある。この穴は、サンプル提示用上面と下面とを通って、サンプル提示用上面と下面との間にある。この穴には、サンプル中に含まれる分析対象の分子とマトリックス分子とを穴の表面に保持・濃縮する多孔性材料が充填されている。他の観点からは、本発明は、サンプル支持プレートの作製方法、サンプルの調製方法、およびサンプルの分析方法に関する。
(実施例)
以下の実施例によって、本発明をさらに説明するが、本発明を限定するものと解釈すべきではない。
(実施例1:本発明のサンプル支持プレートの作成)
図2に示すようなサンプル支持プレートを、以下のように作成する。通常のスチール製MALDIプレートに、ターゲットスポットと同数の(複数の)穴を開ける。次いで、この穴に高分子多孔性吸着剤を充填する。この高分子多孔性吸着剤は、モノマー、ポロゲン(porogen)、および開始剤を含有する溶液を混合することにより、作製する。続いて、重合反応を開始させ、高分子多孔性吸着剤プラグを製造する。真空マニホールド上にサンプル支持プレートを置き、真空マニホールドによってこのMALDIプレートを減圧状態にする。次いで、高分子多孔性吸着剤プラグを適当な溶媒で処理し、未反応のモノマー、ポロゲン、および開始剤を除去する。
(実施例2:本発明のサンプル調製方法)
方法1
a)実施例1に記載したように作製したMALDI−MS用サンプル支持プレートを、真空マニホールドにセットする。
b)減圧状態にする。
c)分析対象とマトリックスとを含んだサンプル溶液を、ターゲットスポットの穴に充填された高分子多孔性吸着剤プラグの上部に加える。
d)サンプル溶液を高分子多孔性吸着剤プラグへ徐々に通し、分析対象の分子やマトリックス分子を高分子多孔性吸着剤プラグの上部に濃縮・捕捉する。
e)乾燥後、サンプル支持プレートをMALDI質量分析機にかける準備が整う。
方法2
a)実施例1に記載したように作製されたMALDI−MS用のサンプル支持プレートを真空マニホールドにセットする。
b)減圧状態にする。
c)マトリックス溶液を、ターゲットスポットの穴に充填された高分子多孔性吸着剤プラグの上部に加える。
d)この溶液を高分子多孔性吸着剤プラグへ徐々に通し、マトリックス分子を高分子多孔性吸着剤プラグの上部に保持・濃縮させ、高分子多孔性吸着剤プラグの上部に小さな結晶を形成させる。
e)分析対象を含んだ溶液を高分子多孔性吸着剤プラグの上部に加える。
f)分析対象を含んだ溶液を高分子多孔性吸着剤プラグへ徐々に通し、分析対象分子を高分子多孔性吸着剤の上部で濃縮し、マトリックス分子の結晶に包含させる。
g)乾燥後、サンプル支持プレートをMALDI質量分析機にかける準備が整う。
方法3
a)実施例1に記載したように作製されたMALDI−MS用サンプル支持プレートを真空マニホールドにセットする。
b)減圧状態にする。
c)分析対象を含む溶液を、ターゲットスポットの穴に充填された高分子多孔性吸着剤プラグの上部に加える。
d)この溶液を、高分子多孔性吸着剤プラグへ徐々に通し、分析対象分子を高分子多孔性吸着剤プラグの上部に保持・濃縮する。
e)マトリックスを含む溶液を高分子多孔性吸着剤の上部に加える。
f)マトリックスを含む溶液を高分子多孔性吸着剤へ徐々に通し、マトリックス分子が高分子多孔性吸着剤プラグの上部に保持・濃縮され、分析対象分子が包含された小結晶を生成させる。
g)乾燥後、サンプル支持プレートをMALDI 質量分析機にかける準備が整う。
方法4
マトリックス溶液を加える前に、高分子多孔性吸着剤の上部に水を加え、高分子多孔性吸着剤へ水を通すこと以外は、方法3と同じである。
(参照による本明細書への導入)
すべての特許、公開された特許出願、および本明細書で引用された他の文献の全内容は、ここに参照により本明細書に含まれるものとする。
(均等物)
当業者は、本明細書に具体的に記載されている本発明の具体的な実施態様に対する多くの均等物を、通常の実験(routine experimentation)以上のことをすることなく、認識し、確認できるだろう。このような均等物も、本特許請求の範囲に含まれると考える。
Claims (46)
- サンプル提示用上面と下面とを備えたマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析(MALDI−MS)用サンプル支持プレートであって、前記サンプル提示用上面には1以上のサンプル受け入れ穴があり、前記穴はサンプル提示用上面と下面とを通って、サンプル提示用上面と下面との間にあり、前記穴には、サンプル中に含まれる分析対象とマトリックス分子とを前記穴の表面で保持・濃縮するための多孔性材料が充填されている、前記サンプル支持プレート。
- 前記多孔性材料が、選択された分子を多孔性材料中へあるいは多孔性材料を通って浸透させ、または選択された分子を多孔性材料上に保持することができるほど、十分に多孔性である、請求項1に記載のサンプル支持プレート。
- 前記多孔性材料が、多孔性モノリス(monolith)および粒子層からなる群より選択される、請求項2に記載のサンプル支持プレート。
- 前記多孔性材料を浸透する分子が、塩、溶媒、およびこれらの混合物から選択され、前記多孔性材料の表面に保持される分子が分析対象およびマトリックスである、請求項2に記載のサンプル支持プレート。
- 前記多孔性材料が多孔性モノリスである、請求項3に記載のサンプル支持プレート。
- 前記多孔性モノリスが、モノマー、ポロゲン(porogen)、および開始剤を混合することにより作製される、請求項5に記載のサンプル支持プレート。
- 前記モノマーが、モノビニルモノマー、ポリビニルモノマー、およびモノビニルモノマーとポリビニルモノマーとの混合物からなる群より選択される、請求項6に記載のサンプル支持プレート。
- 前記モノビニルモノマーが、スチレン、N−ビニルピロリドン、メタクリレート、ビニルアセテート、グリシジル・メタクリレート、およびこれらのいかなる混合物からなる群より選択される、請求項7に記載のサンプル支持プレート。
- 前記ポリビニルモノマーが、ジビニルベンゼン、エチレンジメタクリレート、ビス−アクリルアミド、ジビニルピリジン、エチレンジメタクリレート、ヒドロキシアルキレンジメタクリレート、およびこれらのいかなる混合物からなる群より選択される、請求項7に記載のサンプル支持プレート。
- 前記ポロゲンが、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、エステル、アルコール、ケトン、エーテル、およびこれらのいかなる混合物からなる群より選択される、請求項6に記載のサンプル支持プレート。
- 前記開始剤が、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、過酸化二硫酸、バゾ(Vazo)52、バゾ64、バゾ67、バゾ88、V70、およびこれらのいかなる混合物からなる群より選択される、請求項6に記載のサンプル支持プレート。
- 前記穴が、正確に定められた位置にある、請求項1に記載のサンプル支持プレート。
- 前記穴の正確に定められた位置が、自動分析を容易にするものである、請求項7に記載のサンプル支持プレート。
- 前記穴が、前記プレートを垂直方向に通り、プレート表面に対し垂直方向を向いている、請求項1に記載のサンプル支持プレート。
- 選択された分子を多孔性材料中へまたは多孔性材料を通って浸透させやすくするために、前記穴を減圧状態にする、請求項2に記載のサンプル支持プレート。
- 前記減圧状態が、真空マニホールドによってかけられる、請求項15に記載のサンプル支持プレート。
- 請求項1に記載の前記サンプル支持プレートを準備し;
サンプルを前記穴に添加し;
サンプル中の選択された分子を前記穴にある多孔性材料へ浸透または通過させ、サンプル中の他の選択された分子を前記多孔性材料の上部に保持させることによって、前記他の選択された分子を前記穴の表面に濃縮し;
それによって、MALDI−MS用のサンプルを調製することを有するマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析機(MALDI−MS)用のサンプル調製方法。 - 前記穴にサンプルを添加する前に、前記サンプル支持プレートを減圧状態にすることをさらに含む、請求項17に記載の方法。
- 前記減圧状態が、前記サンプル支持プレートを真空マニホールドに置くことによってかけられる、請求項18に記載の方法。
- 前記サンプルが、分析対象、マトリックス材料、1以上の塩、または1以上の溶媒を含んでなる、請求項18に記載の方法。
- 前記サンプルが前記吸着剤中へまたは前記吸着剤を通って徐々に通過するような速度で減圧状態にすることによって、1以上の塩および1以上の溶媒を前記多孔性材料中へまたは前記多孔性材料を通って通過させ、前記分析対象および前記マトリックス材料を前記多孔性材料の上部に保持させ、それによって、前記分析対象を前記穴の表面に濃縮させる、請求項20に記載の方法。
- 前記サンプルが、マトリックス材料の溶液を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記サンプルが前記吸着剤中へまたは前記吸着剤を通って徐々に通過するような速度で減圧状態にすることによって、前記多孔性材料の上部に前記マトリックス材料を保持させ、前記多孔性材料の上部に前記マトリックス材料の結晶を形成させ、それによって、前記穴の表面に前記マトリックス材料の結晶を濃縮させる、請求項22に記載の方法。
- 分析対象の溶液を含む第2のサンプルを前記穴に添加し、前記第2のサンプルが前記多孔性材料中へまたは前記多孔性材料を通って徐々に通過するような速度で減圧状態にすることによって、前記分析対象を前記多孔性材料の上部に保持させ、それによって、前記多孔性材料の上部に前記分析対象を濃縮させ、前記穴の表面でマトリックス材料の結晶に前記分析対象を含ませることをさらに含んでなる、請求項23に記載の方法。
- 前記サンプルが分析対象の溶液を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記サンプルが前記多孔性材料中へまたは前記多孔性材料を通って徐々に通過するような速度で減圧状態にすることによって、前記分析対象を前記多孔性材料の上部に保持させ、それによって、前記穴の表面に分析対象を濃縮させる、請求項25に記載の方法。
- マトリックス材料の溶液を含む第2のサンプルを前記穴に添加し、前記第2のサンプルが前記多孔性材料中へまたは前記多孔性材料を通って徐々に通過するような速度で減圧状態にすることによって、前記マトリックス材料が前記多孔性材料の上部に保持され、前記多孔性材料の上部に前記マトリックス材料の結晶を形成させ、それによって、前記マトリックス材料の結晶を濃縮させ、前記穴の表面で前記分析対象に前記マトリックス材料を含ませることをさらに含んでなる、請求項26に記載の方法。
- 前記マトリックス材料の溶液を含有する第2のサンプルを添加する前に、水を前記穴に添加し、水が前記多孔性材料を通って通過するよう減圧状態にすることをさらに含む、請求項27に記載の方法。
- サンプル提示用上面と下面とを備えたサンプル支持プレートを準備し;
サンプル提示用上面にサンプル受け入れ用の1以上の穴を形成させ、この穴は、サンプル提示用上面と下面とを通って、サンプル提示用上面と下面との間にあり;および
多孔性材料を前記穴に加えることをさらに含んでなる、請求項1に記載の前記サンプル支持プレートの作製方法。 - サンプル提示用上面と下面とを備えたサンプル支持プレート上に1以上の穴を形成させ、この穴は、サンプル提示用上面と下面とを通って、サンプル提示用上面と下面との間にあり;および
多孔性材料を前記穴に加えることを含んでなる、請求項1のサンプル支持プレートの作製方法。 - 前記多孔性材料が、多孔性モノリスを含んでなる、請求項29または30に記載の方法。
- モノマー、ポロゲン、および開始剤を混合し;
前記穴を前記混合物で充填し;
重合反応を開始させ、多孔性モノリスプラグ(plug)を形成させ;および
前記多孔性高分子吸着剤プラグを洗浄して、未反応のモノマー、ポロゲン、および開始剤を除去することをさらに含んでなる、請求項31に記載の方法。 - 前記モノマーが、モノビニルモノマー、ポリビニルモノマー、およびモノビニルモノマーとポリビニルモノマーとの混合物からなる群より選択される、請求項32に記載の方法。
- 前記モノビニルモノマーが、スチレン、N−ビニルピロリドン、メタクリレート、ビニルアセテート、グリシジルメタクリレート、およびこれらのいかなる混合物からなる群より選択される、請求項33に記載の方法。
- 前記ポリビニルモノマーが、ジビニルベンゼン、エチレンジメタクリレート、ビス−アクリルアミド、ジビニルピリジン、エチレンジメタクリレート、ヒドロキシアルキレンジメタクリレート、およびこれらのいかなる混合物からなる群より選択される、請求項33に記載の方法。
- 前記ポロゲンが、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、エステル、アルコール、ケトン、エーテル、およびこれらのいかなる混合物からなる群より選択される、請求項32に記載の方法。
- 前記開始剤が、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、過酸化二硫酸、バゾ(Vazo)52、バゾ64、バゾ67、バゾ88、V70、およびこれらのいかなる混合物からなる群より選択される、請求項36に記載の方法。
- 前記穴が、選択された分子の浸透と、他の選択された分子の保持とを可能にするいかなる形状であってよい、請求項1に記載の支持プレート。
- サンプル支持プレートを準備し、前記サンプル支持プレートにはサンプル提示用上面と下面とがあり、前記サンプル提示用上面には1つ以上のサンプル受け入れ用の穴があり、前記穴は、サンプル提示用上面と下面とを通って、サンプル提示用上面と下面との間にあり、前記穴には、サンプルに含まれる分析対象とマトリックス分子とを前記穴の表面に保持・濃縮する多孔性材料が充填されており;
分析対象を含むサンプルを前記穴に添加し;
前記サンプル中の選択された分子を前記穴にある前記多孔性材料へ浸透または通過させ、および、前記サンプル中の分析対象を前記多孔性材料の上部に保持させ、それによって、前記穴の表面の分析対象を濃縮させ;および
前記分析対象にMALDI−MSを行うことを含んでなる、分析対象にマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析(MALDI−MS)を行う方法。 - 前記サンプル提示用上面に1以上のサンプル受け入れ用の穴があり、前記穴は、サンプル提示用上面と下面とを通って、サンプル提示用上面と下面との間にあり、前記穴には、サンプル中に含まれる分析対象とマトリックス分子とを前記穴の表面に保持・濃縮するための多孔性モノリスが充填されている、サンプル提示用上面と下面とを備えたマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析(MALDI−MS)において使用するサンプル支持プレート。
- 前記多孔性モノリスが、マクロ多孔性高分子プラグである、請求項5または40に記載のサンプルプレート。
- 前記サンプル提示用上面に1以上のサンプルターゲットスポットがあり、前記ターゲットスポットの中に前記穴が位置している、請求項1、17、29、30、39、または40のいずれか1項に記載の方法またはサンプルプレート。
- 前記サンプル提示用上面に1以上のサンプル受け入れ用の穴があり、前記穴は、サンプル提示用上面と下面とを通って、サンプル提示用上面と下面との間にあり、さらに、前記穴には、サンプル中に含まれる分析対象またはマトリックス分子を前記穴の表面に保持・濃縮するための多孔性モノリスが充填されている、サンプル提示用上面と下面とを有するモノリス支持プレートを備えたマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析機(MALDI−MS)用サンプル支持プレート。
- ターゲットスポットのグリッドが、サンプル提示用上面に形成される、複数の穴を備えた請求項12または13に記載のサンプル支持プレート。
- 前記グリッドが、96の穴を有する、請求項44に記載のサンプル支持プレート。
- 前記複数の穴が、ハイスループット分析を容易にするものである、請求項44に記載のサンプル支持プレート。
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