KR20090028684A - 피크의 검출을 향상시키기 위한 여과용 장치 및 방법 - Google Patents

피크의 검출을 향상시키기 위한 여과용 장치 및 방법 Download PDF

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철수 문
아쯔시 다까노
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칸젠 바이오테크날러지즈, 인코포레이티드
다이니폰 인사츠 가부시키가이샤
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Abstract

질량 분광법 데이타에서 피크의 확인을 향상시키기 위한 필터 및 방법이 개시되어 있다. 특히, 본 발명은 질량 스펙트럼 데이타를 생성시키는데 사용되는, 생체액의 정제의 목적으로 하는 홀 어레이 필터를 사용하는 방법을 포함한다. 본 발명의 방법은 질환의 확인 및 진단, 또는 특정 질환 치료에 대한 반응의 예측에서 사용하기 위한 질량 스펙트럼 데이타에서 관련 피크를 향상시키는데 사용될 수 있다.
홀 어레이 필터, 질량 분광법, 질량 스펙트럼 데이타, 피크, 생체액

Description

피크의 검출을 향상시키기 위한 여과용 장치 및 방법 {APPARATUS AND METHOD FOR FILTRATION TO ENHANCE THE DETECTION OF PEAKS}
본 발명은 인간에서 질환의 초기 예측, 검출 및 질환의 치료에 대한 반응에서 사용하기 위한 질량 스펙트럼 데이타에서 피크의 확인을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
세포의 건강 및 유기체의 건강은 이에 함유된 단백질 및 다른 분자에 의해 반영된다. 단백질 및 다른 분자, 예컨대 지질 및 탄수화물의 검출, 확인 및 정량은 질환 메카니즘 설명, 질환의 초기 검출, 질환의 예측, 및 치료의 평가를 용이하게 할 수 있다.
게놈 연구에서 최근 진보에 의해 다양한 질환과 관련된 수많은 유전자가 확인되었다. 그러나, 게놈 연구는 질환에 대한 유전적 소질과 관련된 유전자를 확인할 수 있지만, 개별 환자에서 존재할 수 있는 단백질과 같은 마커의 특징화 및 확인에 대한 필요성이 여전히 존재한다. "마커"는 전형적으로 한 생물학적 상태를 다른 것과 구별하는 폴리펩티드 또는 몇몇 다른 분자를 지칭한다. 최근 개발된 분자 검출 방법은 이들 분자의 큰 분획을 측정하는 것을 가능하게 하여, 질환 검출, 예방 및 치료를 위한 새로운 표적 방법의 지평을 열었다. 이러한 방법을 효과적으 로 실시하기 위해서는 수백 또는 수천개의 상이한 화합물의 혼합물로부터 개별 분자 또는 마커 (종종 저농도로 존재함)를 확인하는 능력이 필요하다.
질량 분광측정 방법의 사용은 생물학적 검정법을 위한 선택 방법으로서 겔을 대체하고 있다. 예시적인 질량 분광측정 형식으로는 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화 질량 분광측정법 (MALDI) (예를 들어, 미국 특허 제5,118,937호 및 미국 특허 제5,045,694호 참조), 및 표면 향상된 레이저 탈착/이온화 질량 분광측정법 (SELDI) (예를 들어, 미국 특허 제5,719,060호 참조)을 들 수 있다. 세포 기능의 미묘한 변화의 총괄적 검출 및 모니터링을 위한 다른 기술을 뛰어넘는 질량 분광측정법의 우수한 장점은 수마이크로리터의 생체액에서 수천개의 요소를 빠르고 저렴하게 측정하는 능력이다. 예를 들어, 변경된 유전자로부터 기인하는 질환 프로세스, 예컨대 암은 다양한 크기의 폴리펩티드 및 다른 분자로서 혈액에서 순환하는 변경된 단백질 생성물을 생성한다. 질량 분광측정법은 이러한 생성물의 검출 및 질환의 후속적 진단 및 분석을 가능하게 한다.
복잡한 유체, 예컨대 혈청의 많은 질량 분광측정 패턴은 시각적 분석을 무시함에도 불구하고, 영향을 받지 않은 개체와 비교하여 영향을 받은 개체로부터 패턴의 미묘한 상이성을 식별하는데 컴퓨터 접근법이 사용되어 왔다. 검정법의 감수성을 개선시키려는 노력은 수많은 질량 분광측정 형식을 샘플의 생물학적 관련성 분석에 적용하는 결과를 가져왔다. 질량 분광측정 기술의 혁신 이외에, 분석 대상물을 흡착하는 기재 ("칩")가 또한 개발되었으며, 그 후 초기 고안은 개선되었다. 그러나, 이들 방법은 질량 분광측정 검정법의 감수성을 허용가능한 수준으로 개선 시키기에 매우 불충분하다고 증명되었다.
그러므로, 질량 분광측정 검정법이 초기 질환 진단, 질환 예측, 질환 진행 또는 치료에 대한 반응의 모니터링의 방법, 및 환자가 특정 치료로부터 이득을 얻기 가장 쉬운가를 확인하는 방법에서 사용되기 때문에, 질량 분광측정 검정법의 감수성을 개선시키는 방법에 대한 필요성이 존재한다.
<발명의 요약>
본 발명은 인간에서 질환의 초기 예측, 검출, 및 질환의 치료에 대한 반응에서 사용하기 위한 질량 스펙트럼 데이타에서 피크의 확인을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 실시양태는 질환의 확률의 결정 방법을 포함한다. 상기 방법은 생체액을 홀 어레이 필터를 통해 여과하는 단계, 여과된 생체액으로부터 질량 스펙트럼 데이타를 생성하는 단계, 및 질량 스펙트럼 데이타를 데이타베이스와 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 실시양태는 질환 치료에 대한 반응의 예측 방법을 포함한다. 상기 방법은 질환 A의 치료에 반응하는 집단으로부터의 샘플의 제1 세트로부터, 홀 어레이 필터를 통한 샘플의 제1 세트의 여과후에 질량 스펙트럼 데이타의 제1 세트를 생성하는 단계, 및 질환 A의 동일한 치료에 반응하지 않는 집단으로부터의 샘플의 제2 세트로부터, 홀 어레이 필터를 통한 샘플의 제2 세트의 여과후에 질량 스펙트럼 데이타의 제2 세트를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 질량 스펙트럼 데이타의 제1 및 제2 세트에서 상응하는 피크를 비교하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 상응하는 피크에서의 상이성은 피크가 질환 A의 치료에 대한 반응의 우도(likelihood)를 표시하는 하나 이상의 마커를 나타낸다는 것을 표시한다. 하나 이상의 마커의 확인시, 하나 이상의 마커는 질환의 치료에 대한 반응의 우도를 예측하는데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플의 제1 세트를 여과하는 홀 어레이 필터의 구조와, 샘플의 제2 세트를 여과하는 홀 어레이 필터의 구조는 실질적으로 동일하다. 다른 실시양태에서, 샘플의 제1 세트를 여과하는 홀 어레이 필터 및 샘플의 제2 세트를 여과하는 홀 어레이 필터는 별개의 홀 어레이 필터이다. 다른 실시양태에서, 샘플은 각각 별개의 홀 어레이 필터를 통해 여과된다.
본 발명의 다른 실시양태는 질량 분광측정 방법에서 피크의 확인을 향상시키는 방법을 포함한다. 상기 방법은 샘플을 홀 어레이 필터를 통해 여과하는 단계, 및 샘플로부터 질량 스펙트럼 데이타를 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 실시양태는 질환 검출에서 감수성 및 특이성의 증가 방법을 포함할 수 있다. 상기 방법은 질환 A를 갖는 집단으로부터의 생체액 샘플의 제1 세트로부터, 홀 어레이 필터를 통한 생체액 샘플의 제1 세트의 여과후에 질량 스펙트럼 데이타의 제1 세트를 생성하는 단계, 및 질환 A를 갖지 않는 집단으로부터의 생체액 샘플의 제2 세트로부터, 홀 어레이 필터를 통한 생체액 샘플의 제2 세트의 여과후에 질량 스펙트럼 데이타의 제2 세트를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 질량 스펙트럼 데이타의 제1 및 제2 세트를 비교하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 질량 스펙트럼 데이타의 제1 및 제2 세트에서 상응하는 피 크 간의 상이성은 하나 이상의 질환 A 음성 마커를 표시한다. 한 실시양태에서, 샘플의 제1 세트를 여과하는 홀 어레이 필터의 구조와, 샘플의 제2 세트를 여과하는 홀 어레이 필터의 구조는 실질적으로 동일하다. 다른 실시양태에서, 샘플의 제1 세트를 여과하는 홀 어레이 필터 및 샘플의 제2 세트를 여과하는 홀 어레이 필터는 별개의 홀 어레이 필터이다. 다른 실시양태에서, 샘플은 각각 별개의 홀 어레이 필터를 통해 여과된다.
추가로, 본 발명의 한 실시양태는 하나 이상의 홀 어레이 필터를 포함하는, 질환 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 생체액 여과용 장치를 포함할 수 있다. 질환 A의 치료에 대해 반응하는 집단으로부터의 샘플의 제1 세트는 하나 이상의 홀 어레이 필터를 통해 여과될 수 있고, 질량 스펙트럼 데이타의 제1 세트는 하나 이상의 홀 어레이 필터를 통한 여과후 샘플의 제1 세트로부터 생성될 수 있다. 질환 A의 동일한 치료에 대해 반응하지 않는 집단으로부터의 샘플의 제2 세트는 하나 이상의 홀 어레이 필터를 통해 여과될 수 있고, 질량 스펙트럼 데이타의 제2 세트는 하나 이상의 홀 어레이 필터를 통한 여과후 샘플의 제2 세트로부터 생성될 수 있다. 또한, 질량 스펙트럼 데이타의 제1 및 제2 세트에서 상응하는 피크는 비교될 수 있으며, 여기서 상응하는 피크에서의 상이성은 피크가 질환 A의 치료에 대한 반응의 우도를 표시하는 하나 이상의 마커를 나타낸다는 것을 표시할 수 있다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 홀 어레이 필터는 하나 이상의 제1 홀 어레이 필터 및 하나 이상의 제2 홀 어레이 필터를 포함하며, 이들은 각각 실질적으로 동일한 구조를 갖는다. 하나 이상의 제1 홀 어레이 필터는 샘플의 제1 세트의 여과에 사용될 수 있고, 하나 이상의 제2 홀 어레이 필터는 샘플의 제2 세트의 여과에 사용될 수 있다. 샘플은 각각 별개의 홀 어레이 필터를 통해 여과될 수 있다.
추가로, 본 발명의 한 실시양태는 하나 이상의 홀 어레이 필터를 포함하는, 여과된 생체액의 질량 스펙트럼 데이타의 측정에 의해 질환을 검출하기 위한, 생체액 여과용 장치를 포함할 수 있다. 질환 A를 갖는 집단으로부터의 생체액 샘플의 제1 세트는 하나 이상의 홀 어레이 필터를 통해 여과될 수 있고, 질량 스펙트럼 데이타의 제1 세트는 하나 이상의 홀 어레이 필터를 통한 여과후 생체액 샘플의 제1 세트로부터 생성될 수 있다. 질환 A를 갖지 않는 집단으로부터의 생체액 샘플의 제2 세트는 또한 하나 이상의 홀 어레이 필터를 통해 여과될 수 있고, 질량 스펙트럼 데이타의 제2 세트는 하나 이상의 홀 어레이 필터를 통한 여과후 생체액 샘플의 제2 세트로부터 생성될 수 있다. 또한, 질량 스펙트럼 데이타의 제1 및 제2 세트는 비교될 수 있으며, 여기서 질량 스펙트럼 데이타의 제1 및 제2 세트에서 상응하는 피크 간의 상이성은 하나 이상의 질환 A 음성 마커를 표시할 수 있다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 홀 어레이 필터는 하나 이상의 제1 홀 어레이 필터 및 하나 이상의 제2 홀 어레이 필터를 포함하며, 이들은 각각 실질적으로 동일한 구조를 갖는다. 하나 이상의 제1 홀 어레이 필터는 샘플의 제1 세트의 여과에 사용될 수 있고, 하나 이상의 제2 홀 어레이 필터는 샘플의 제2 세트의 여과에 사용될 수 있다. 샘플은 각각 별개의 홀 어레이 필터를 통해 여과될 수 있다.
추가로, 본 발명의 한 실시양태는 홀 어레이 필터를 포함하는, 질량 분광측정 방법에서 피크의 확인을 향상시키기 위한, 생체액 여과용 장치를 포함할 수 있 다. 생체액 샘플은 홀 어레이 필터를 통해 여과될 수 있고, 질량 스펙트럼 데이타는 여과된 생체액 샘플로부터 생성될 수 있다.
추가로, 본 발명의 한 실시양태는 하나 이상의 질환 검출용 음성 마커의 검출 방법을 포함할 수 있다. 상기 방법은 홀 어레이 필터를 통한 생체액 샘플의 제1 세트의 여과후 질환을 갖는 집단으로부터의 생체액 샘플의 제1 세트로부터 질량 스펙트럼 데이타의 제1 세트를 생성하는 단계, 및 홀 어레이 필터를 통한 생체액 샘플의 제2 세트의 여과후 질환을 갖지 않는 집단으로부터의 생체액 샘플의 제2 세트로부터 질량 스펙트럼 데이타의 제2 세트를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 질량 스펙트럼 데이타의 제1 및 제2 세트를 비교하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 질량 스펙트럼 데이타의 제1 및 제2 세트에서 상응하는 피크 간의 상이성은 하나 이상의 질환 검출용 음성 마커를 표시한다. 한 실시양태에서, 샘플의 제1 세트를 여과하는 홀 어레이 필터의 구조와, 샘플의 제2 세트를 여과하는 홀 어레이 필터의 구조는 실질적으로 동일하다. 다른 실시양태에서, 샘플의 제1 세트를 여과하는 홀 어레이 필터 및 샘플의 제2 세트를 여과하는 홀 어레이 필터는 별개의 홀 어레이 필터이다. 다른 실시양태에서, 샘플은 각각 별개의 홀 어레이 필터를 통해 여과된다.
추가로, 본 발명의 한 실시양태는 시험 대상체에서 질환의 검출 방법을 포함할 수 있다. 상기 방법은 시험 대상체에서 질환을 검출하기 위한 진단 마커로서, 상기 단락에서 설명된 바와 같은 방법에 의해 검출된 하나 이상의 음성 마커를 사용하는 단계를 포함할 수 있다. 한 특정 실시양태에서, 상기 방법은 홀 어레이 필 터를 통해 시험 대상체로부터의 생체액 샘플을 여과하는 단계; 및 하나 이상의 음성 마커의 양(들)을 평가하기 위해 여과된 생체액으로부터 질량 스펙트럼 데이타를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 실시양태에서, 상기 방법은 또한 양(들)을 기초로 하여 시험 대상체에서 질환을 진단하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 이들 및 다른 목적 및 장점은 하기 설명, 첨부된 도면 및 청구의 범위로부터 명백할 것이다.
본 명세서는 본 발명을 구체적으로 지적하고 명백하게 청구하는 청구의 범위로 완결되지만, 본 명세서는 비제한적 방식으로 본 발명의 실행을 위해 현재 고려되는 최선의 방식을 예시하는, 첨부된 도면과 함께 하기 설명으로부터 더 잘 이해될 것이라고 여겨지며, 여기서 동일한 참고 숫자는 도면에 걸쳐 동일한 부분을 나타낸다.
도 1은 본 발명의 한 실시양태에 따른 방법을 예시하는 흐름도이다.
도 2a 내지 2k는 정상적인 여과전 및 여과후 혈청 샘플의 크로마토그램이다.
도 2l 내지 2s는 폐암을 가진 것으로 공지된, 여과전 및 여과후 혈청 샘플의 크로마토그램이다.
도 3a는 본 발명에서 사용하기 위한 필터의 단면도를 나타낸다.
도 3b는 필터의 홀 어레이의 상면도를 나타낸다.
도 4a 내지 4g는 본 발명에 따른 필터의 제조에 사용될 수 있는 단계를 나타낸다.
도 5a1 내지 5a34는 화학감수성 스크리닝 검정에서 피크의 향상을 나타내는 여과전 혈청 대 여과후 혈청의 크로마토그램을 나타낸다.
도 6a1 내지 6a32는 폐암 환자의 여과전 혈청 대 여과후 혈청의 크로마토그램을 나타낸다.
도 6b1 내지 6b34는 정상적인 환자의 여과전 혈청 대 여과후 혈청의 크로마토그램을 나타낸다.
도 7a1 내지 7a42는 췌장암 환자의 여과전 혈청 대 여과후 혈청의 크로마토그램을 나타낸다.
도 8a 내지 8l은 정상적인 환자 및 방광암 환자 둘 모두의 여과전 뇨 대 여과후 뇨의 크로마토그램을 나타낸다.
도 9는 본 발명에 따른 필터의 제조에 사용될 수 있는 단계를 나타낸다.
도 10a 내지 10e는 본 발명의 한 실시양태에 따른 홀 어레이 필터를 통한 혈청의 여과 결과를 예시한다.
본원은 이제 본 발명의 다양한 실시양태를 나타낸 도면을 참고로 하여 보다 상세하게 기술될 것이다. 그러나, 본원의 대상은 많은 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 본원에 기재된 실시양태로 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다.
질량 스펙트럼 데이타를 향상시키는 방법이 기재되어 있다. 단순하게 예시하기 위해, 본 발명의 원리는 그의 다양한 예시적인 실시양태를 참고로 하여 기술된다. 본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 구체적으로 개시되어 있으나, 당업자는 동일한 원리가 다른 조성물 및 방법에 균등하게 적용될 수 있고, 다른 조성물 및 방법으로 실행될 수 있으며, 임의의 이러한 변화물이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 이러한 변형 내에 있을 것이라는 것을 쉽게 인식할 것이다. 개시된 본 발명의 실시양태를 상세하게 설명하기 전에, 물론 본 발명이 다른 실시양태일 수 있기 때문에, 본 발명이 그의 적용에서 나타낸 임의의 특정 실시양태의 상세사항으로 제한되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 본원에서 사용된 용어는 제한을 위한 것이 아니라 기술을 위한 것이다. 추가로, 특정 방법이 많은 예에서 특정 순서로 본원에 제공된 특정 단계에 관하여 기재되어 있으나, 이들 단계는 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이 임의의 순서로 수행될 수 있으며, 방법은 본원에 개시된 단계의 특정 배열로 제한되지 않는다.
상기 배경기술에서 확인된 필요성, 및 하기 설명으로부터 명백하게 될 다른 필요성 및 목적이 본 발명에서 성취되며, 이는 질환의 예측 및 검출 방법, 및 질환의 치료에 대한 반응의 예측 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명은 폐암, 췌장암 및 방광암 (상기 질환으로 제한하려는 것은 아님)과 같은 질환의 예측, 검출 및 질환의 치료에 대한 반응의 예측에 특히 효과적이다. 이는 발명에 의해 포함된 원리 중 하나가 우수한 피크 생성 및 더 명백한 데이타를 야기하는, 샘플에서의 원치않는 물질의 제거에 관한 것이기 때문이다. 이와 같이, 본 발명의 필터 및 방법은 특정 질환에 관한 것이 아니다.
질량 분광 크로마토그램을 먼저 비교하여, 본원에서 질환 A로서 확인된 특정 질환을 갖는 인간의 유체와 정상적인 유체 간의 상이성을 발견하였다. 크로마토그램이 본원에서 예시되지만, 당업자는 빈도 대 시간의 임의의 플롯의 용도 및 분석이 본 발명의 범위 및 취지를 벗어나지 않고 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이는 분광도를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 비교된 크로마토그램은 상이성이 소분자가 아닌 단백질에 존재하는 것으로 여겨지기 때문에 고분자 범위에 초점을 맞추었다. 그러나, 고분자 범위에서의 특별한 피크 상이성은 확인할 수 없었다. 따라서, 저분자 범위에서 2개의 유체 간의 상이성을 발견하는 시도를 수행하였다. 실질적인 상이성은 정상적인 유체 크로마토그램 및 질환 A 유체 크로마토그램 간에 도 2a 내지 2s 피크 A 및 B로서 표지된 스폿에서 확인하였다. 정상적인 혈청 크로마토그램은 A 및 B에 상응하는 스폿에서 높은 피크를 나타내었으나, 질환 A 유체 크로마토그램은 상기 스폿에서 어떠한 피크도 나타내지 않거나 또는 오직 작은 피크만을 나타내었다.
본 발명의 다른 측면에서, 질량 분광 크로마토그램은 특정 화학요법 치료에 반응하지 않았던 군과 특정 화학요법 치료에 반응하는 군을 비교하였다. 피크는 상당한 다수의 무반응자에서 확인되었다. 이들 결과는 도 5a1 내지 5a34에서 볼 수 있다.
상기 검정에 의해 생성된 데이타는 유용한 것으로 입증되었으나, 데이타가 개선될 수 있었다고 결정되었다. 놀랍게도, 생체액의 정제 단계가 바이오마커를 표시하는 피크의 존재 또는 부재를 검출하는 능력을 향상시킨다고 결정되었다. 홀 어레이 필터를 혈청의 정제에 사용하였다. 여과의 결과로서, 및 본원에서 논의된 바와 같이, 본 발명에 따른 필터의 사용후 감수성은 10%만큼 증가하였고, 특이성은 25%만큼 증가하였다.
본 발명에서 사용하기 위한 필터는 두께 약 3 내지 20 ㎛의 규소 막에 형성된 홀의 어레이를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 막 두께는 약 6 내지 10 ㎛이다. 두께가 6 ㎛ 미만인 경우, 홀 어레이 구역은 매우 취약하게 될 수 있다. 두께가 10 ㎛ 초과인 경우, 홀 표면 구역 A의 레지스트으로 인해 여과 시간이 증가할 수 있다. 10 ㎛ 초과의 두께는 또한 평활 홀의 제조의 곤란함을 증가시킬 수 있다. 홀 어레이의 크기는 1 mm × 1 mm 내지 10 mm × 10 mm일 수 있다. 구역이 1 mm × 1 mm보다 작은 경우, 여과된 생체액의 양이 적절한 데이타를 생성시키기에 충분하지 않을 수 있다. 구역이 10 mm × 10 mm보다 큰 경우, 생체액의 양이 너무 많게 될 수 있으며, 필터에 보다 더 많은 비용이 소모될 수 있다. 어레이에서 홀의 크기는 약 1 ㎛ 내지 20 ㎛, 및 바람직하게는 약 1 내지 10 ㎛일 수 있다. 이 경우, 용어 "크기"는 원형 홀에 대한 직경, 및 정사각형 홀에 대한 대각선을 지칭한다. 크기가 1 ㎛보다 작은 경우, 음압이 가해지면 필터 홀 어레이 구역이 파괴될 수 있다. 크기가 10 ㎛보다 큰 경우, 생체액의 원치않는 화합물이 필터 홀을 통과하기 쉬울 수 있으며, 여과 공정이 불충분하게 될 수 있다. 홀 피치, 또는 홀 간의 거리는 홀의 크기의 약 3배일 수 있으나 (바람직하게는 3 내지 30 ㎛), 특정 적용에 의존적으로 홀 크기의 3배 초과 또는 3배 미만일 수 있다 (도 3a 및 3b 참조).
본 발명에 따른 홀 어레이 필터는 주로 2개의 구역, 홀 어레이를 갖는 얇은 구역, 및 필터 강성의 개선을 위한 두꺼운 외부 구역으로 구성될 수 있다. 필터의 물질은 강성일 수 있고, 당업자가 인식하는 바와 같이, 정밀한 고안 패턴으로 용이하게 가공될 수 있다. 필터 물질로는 금속 또는 반도체 물질과 같은 물질을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 한 예는 Si(두꺼운 층)/SiO2/Si(홀 어레이를 갖는 얇은 층)이다. Si(두꺼운 층)이 Si(홀 어레이를 갖는 얇은 층)을 향해 점점 얇아지는 경우, 홀 어레이 필터를 통한 생체액의 흐름은 더 평활하게 된다. 홀 어레이 필터를 위해 사용될 수 있는 다른 물질은 Ni/Cu이다. 홀 어레이 필터 물질은 강성이어야 하며, 고르게 제조된 홀은 고안된 크기에 매칭되야 한다.
본 발명에서 사용되는 필터는 리소그래피 또는 필터 제조의 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 한 예시적인 방법에서, 약 575 ㎛ 두께의 규소 기판을 출발 물질로서 사용할 수 있다. 그 후, 화학적 증기 침착법 (CVD)과 같은 임의의 통상적인 방법을 사용하여, 또는 산소를 함유하는 플라즈마로의 노출에 의한 기판의 표면 부분의 추가 산화를 통해 이산화규소의 얇은 층을 기판의 한면 상에 형성할 수 있다. 이산화규소 층은 약 2 ㎛의 두께일 수 있다. 규소의 얇은 층을 CVD 또는 박막 결정화와 같은 임의의 방법에 의해 산화물 층 상에 형성할 수 있다 (도 4A 참조). 그 후, 얇은 결정질 규소 필름이 기판의 바닥 또는 이면 상에 있도록 기판을 뒤집을 수 있다. 이 규소는 자연적으로 대략 수 Å의 두께의 이산화규소의 매우 얇은 층을 생성한다. 이 기판은 전형적으로 SOI (silicon on isolator) 기판이라고 지칭된다.
레지스트 물질을 SOI 표면 상에 코팅할 수 있다. 레지스트 물질은 자외선광과 같은 광 노출에 대해 포토레지스트이고, 하기 공정에서 전자 빔 노출에 대해 전자 빔 레지스트일 수 있다. 그 후, 패턴화된 마스크를 레지스트 상에 또는 레지스트에 인접하여 적용할 수 있다. 다음, 자외선광 또는 전자 빔과 같은 전리 방사선을 패턴화된 마스크를 통해 레지스트에 적용할 수 있다. 마스크를 제거한 후, 용매와 같은 물질의 제거에 의해 레지스트의 불필요한 패턴 부분을 제거할 수 있다. 최종적으로, 전체 레지스트의 제거후, 도 4B에 나타낸 바와 같이, 특정 형상의 홀 어레이의 건식 제조 방법 또는 습식 제조 방법을 사용하여, Si 층을 에칭할 수 있다. 이 경우, 이산화규소 층이 에칭 중지 층으로서 작용한다.
그 후, 홀 어레이 위를 포함하여 전체 기판 위에 보호층을 적용할 수 있다 (도 4C). 그 후, 밑에 있는 홀 어레이와 비교하여 대칭적으로 배열되었으나 홀보다 더 넓은, 기판의 상단부 상의 보호층의 일부를, 마스크 및 레지스트 에칭 공정을 통해 제거할 수 있다 (도 4D). 그 후, 도 4E에 나타낸 바와 같이, 산화물 층이 도달될 때까지 노출된 기판의 습식 에칭을 수행하여, 노출된 규소 기판의 측부의 테이퍼형 벽 및 밑에 있는 홀 어레이를 둘러싸는 산화물 층의 노출을 야기할 수 있다. 그 후, 도 4F에 나타낸 바와 같이, 습식 또는 건식 에칭 공정에 의해 보호층의 나머지를 제거할 수 있다. 그 후, 도 4G에 나타낸 바와 같이, 습식 또는 건식 에칭 공정에 의해 산화물 층의 노출된 부분을 제거하여, 완성된 필터를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 필터는 또한 Ni/Cu를 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 물질로 제조될 수 있다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 이러한 필터의 형성에 사용되는 단계는 상기 단계 및 도 9에 나타낸 단계와 유사할 것이다.
특정 단계 및 공정이 본 발명에서 사용되는 필터의 제조를 기술하는데 사용되었으나, 이들 단계 및 공정은 오직 예시적인 것이다. 당분야에 익히 공지된 바와 같이, 규소의 얇은 층에 홀 어레이를 형성시키는데 임의의 공정이 사용될 수 있다. 또한, 상이한 층의 두께, 및 홀의 크기, 및 홀 간의 거리는 예시로서만 제공되며, 어떠한 방식으로도 제한하는 것을 의미하지 않는다. 또한, 단어 "홀"은 임의의 특정 형상의 공간으로 제한되는 것을 의미하지 않으나, 원형, 정사각형, 삼각형 또는 임의의 다른 형상일 수 있다. 이와 같이, 홀의 단면이 원통형 형상일 필요는 없다. 추가로, 필터가 임의의 통상적인 필터 물질을 포함할 수 있기 때문에 필터 물질은 규소로 제한되지 않는다.
또한, 임의의 적합한 생물학적 샘플이 본 발명의 실시양태에서 사용될 수 있다는 것을 주목해야 한다. 생물학적 샘플로는 조직 (예를 들어, 생검으로부터), 혈액, 혈청, 혈장, 유두 흡인액, 뇨, 눈물, 침, 세포, 연부 및 경부 조직, 기관, 정액, 분변 등을 들 수 있다. 생물학적 샘플은 진핵, 원핵 또는 바이러스 유기체를 비롯한 임의의 적합한 유기체로부터 얻을 수 있다.
생물학적 샘플로는 생물학적 분자, 예를 들어 거대분자, 예컨대 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 효소, DNA, RNA, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 탄수화물, 올리고사카라이드, 다당류; 상기 기재된 생물학적 거대분자의 단편, 예컨대 핵산 단편, 펩티드 단편 및 단백질 단편; 상기 나열된 생물학적 거대분자의 복합체, 예컨대 핵산 복합체, 단백질-DNA 복합체, 수용체-리간드 복합체, 효소-기질, 효소 억제제, 펩티드 복합체, 단백질 복합체, 탄수화물 복합체, 및 다당류 복합체; 작은 생물학적 분자, 예컨대 아미노산, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 당, 스테로이드, 지질, 금속 이온, 약물, 호르몬, 아미드, 아민, 카르복실산, 비타민 및 조효소, 알콜, 알데히드, 케톤, 지방산, 포르피린, 카로테노이드, 식물 성장 조절인자, 포스페이트 에스테르 및 뉴클레오시드 디포스포-당, 합성 소분자, 예컨대 제약상 또는 치료상 효과적인 작용제, 단량체, 펩티드 유사체, 스테로이드 유사체, 억제제, 돌연변이원, 발암물질, 항유사분열 약물, 항생제, 이온운반체, 항대사물질, 아미노산 유사체, 항박테리아제, 수송 억제제, 표면-활성제 (계면활성제), 미토콘드리아 및 엽록체 기능 억제제, 전자 공여체, 담체 및 수령체, 프로테아제에 대한 합성 기질, 포스파타제에 대한 기질, 에스테라제 및 리파제에 대한 기질, 및 단백질 변형 시약; 및 합성 중합체, 올리고머, 및 공중합체를 들 수 있다. 상기 구체적으로 인용된 물질들의 임의의 적합한 혼합물 또는 조합물이 또한 생물학적 샘플에 포함될 수 있다.
본 여과 방법을 보다 충분히 최적화하고 특징화하기 위해, 샘플을 세정하고 이에 의해 본 방법의 감수성 및 특이성을 개선시키는 능력에 대해 하기 표에서 확인된 홀 어레이 필터를 평가하였다.
Figure 112008074652488-PCT00001
혈청 샘플을 상기 필터 각각으로 여과하였다. MALDI-TOF-MS에 의한 평가는 세정 효과에서 하기 경향을 밝혀내었다: 1-11P > 5-10P > 5-20P > 5-55P > 10-40P > 10-110P. 즉, 필터 1-11P는 시험된 샘플에 대한 가장 우수한 세정 효과를 가졌다. 그러나, 여과의 진행적인 수준은 각각 여과의 전 수준과 비교하여 질량 이온 종을 나타내는 특정 피크를 확인하는 능력을 증가시켰다. 그러므로, 필터로 여과된 샘플에 대한 질량 스펙트럼 데이타는 비여과된 샘플과 비교하여, 잠재적인 관심 피크에 대한 개선된 해상도 또는 향상된 신호 대 잡음 비율 (예를 들어, 상이한 분자의 질량 대 전하 비율에 상응하는 스펙트럼 피크)을 가졌다.
2 ㎛, 3 ㎛, 4 ㎛, 5 ㎛, 6 ㎛, 7 ㎛, 8 ㎛ 및 9 ㎛의 홀 직경을 갖는 홀 어레이 필터를 또한 세정 효과에 대해 평가하였다. 이들 실험의 결과는 도 10a 내지 10e에 나타낸다. 도 10a는 2 ㎛의 직경을 갖는 홀 어레이 필터를 통해 여과된 암 혈청의 샘플로부터의 크로마토그램이다. 도 10b는 5 ㎛의 직경을 갖는 홀 어레이 필터를 통해 여과된 암 혈청의 샘플로부터의 크로마토그램이다. 도 10c는 9 ㎛의 직경을 갖는 홀 어레이 필터를 통해 여과된 암 혈청의 샘플로부터의 크로마토그램이다. 도 10d는 3 ㎛, 4 ㎛, 5 ㎛, 6 ㎛, 7 ㎛ 및 8 ㎛의 직경을 갖는 홀 어레이 필터를 통해 여과된 암 혈청의 샘플로부터의 크로마토그램이다. 도 10e는 3 ㎛, 4 ㎛, 5 ㎛, 6 ㎛, 7 ㎛ 및 8 ㎛의 직경을 갖는 홀 어레이 필터를 통해 여과된 정상적인 혈청의 샘플로부터의 크로마토그램이다. 2 ㎛ 필터 중 몇몇은 여과 공정 중에 음압이 가해지는 경우 파괴되었다. 이는 필터 층이 생체액에 의해 덮히는 경우 필터 층에 보다 큰 압력을 유발하는 작은 홀로 인해 일어나기 쉽다. 그러나, 2 ㎛ 필터의 나머지는 샘플의 신호 대 잡음 비율을 개선시켰다.
9 ㎛ 홀 필터로부터의 결과는 더 작은 홀 필터보다 덜 여과되는 효과를 야기하는 경향이 있다. 몇몇 경우에, 이는 더 큰 홀이 신호 대 잡음 비율을 감소시키는 생체액 중 상기 물질 (예를 들어, 분자)의 증가된 양을 필터를 통해 통과하게 하기 때문일 수 있다. 그러나, 다른 경우에, 더 큰 홀 필터는 잡음-유발 물질의 충분한 양을 여과시키기에 충분하여 잠재적인 관심 피크의 해상도를 증가시킬 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이 평가는 잡음-유발 물질의 충분한 양이 여과되어, 최종 데이타에서 관련 피크를 증가시키기 때문에, 2 내지 9 ㎛의 필터 홀 크기가 잘 작동한다고 나타내었다.
하기 실시예 1 내지 4는 본 발명의 방법 및 장치를 사용하는, 혈청의 특정 시험 및 분석을 예시한다. 실시예는 각각 도 1에 예시된 방법을 사용한다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 생체액 (1)을 필터 (2)를 통해 여과할 수 있으며, 질량 분광 (3)을 위해 얻어진 샘플을 수집하고 가공할 수 있다. 그 후, 샘플을 질량 분광 플레이트 (4) 상에 로딩할 수 있으며, 샘플을 질량 분광계 (5)를 통해 실행시킬 수 있다. 그 후, 하기 실시예에서 논의된 바와 같이 질량 분광측정법 데이타를 분석할 수 있다. 당업자는 이들 실시예가 각각 특정 질환 및 상황의 시험에 특정되어 있으나, 이들은 오직 예시적인 목적으로 제공된 것이며, 본 발명의 범위 및 적용을 제한하는 것을 의미하지 않는다는 것을 인식할 것이다.
실시예 1
하기 논의는 상기 논의된 본 발명에 따른 장치 및 방법을 사용하여 수행된 특정 폐암 스크리닝에 대해 논의한다. 혈청에서 상이한 단백질/펩티드 패턴을 나타내는 스펙트럼 샘플 데이타 세트를 생성하는데 MALDI-TOF-MS를 사용하였다. 한 임상 연구에서, 폐암이 있는 환자 또는 건강한 대조군으로부터 혈청을 수술 과정 전에 얻었다. 모든 최종 진단은 조직병리학에 의해 확인하였으며, 모든 대조군은 폐암에 대해 높은 위험이 있었으나, 임상적 제시 및 CT 스캔 시험을 기초로 하는 폐암의 증거는 없었다.
혈청 샘플의 매트릭스의 제조에 의해 질량 분광계에 의한 평가를 위해 혈청을 제조하였다. 질량 분광계 매트릭스는 50% 아세토니트릴-0.05% 트리플루오로아세트산 (TFA)에 포화 알파-시아노-4-히드록시신남산을 함유하였다. 혈청을 0.1% n-옥틸 β-D-글루코피라노시드에 1:1000으로 희석하였다. 384 정의된 구역을 갖는 샘플 플레이트의 정의된 구역 각각에 매트릭스 0.5 ㎕를 위치시키고, 개체 각각으로부터의 혈청 0.5 ㎕를 정의된 구역에 첨가한 후, 공기에 의해 건조시켰다. 샘플 및 샘플 플레이트 상의 그의 위치를 정확한 데이타 해석을 위해 기록하였다. 크라토스 어낼리티컬 인크.(Kratos Analytical Inc.)에 의해 제조된 액시마(Axima)-CFR MALDI-TOF 질량 분광계를 사용하였다. 하기 세부사항에 따라 기기를 셋팅하였다: 튜너 모드, 선형; 질량 범위, 0 내지 약 5,000; 레이저 힘, 90; 프로파일, 100; 1스폿당 화소수(shots per spot), 5. 질량 분광계의 출력을 샘플 데이타 세트의 형태로 컴퓨터 저장소에 저장하였다.
필터를 적용하기 전에, 혈청을 0.1% n-옥틸 β-D-글루코피라노시드에서 1:10 으로 희석하였다. 마이크로 튜브를 마이크로 Amp 8 스트립 튜브로부터 개별적으로 절단하였다. 0.9 mm 이하의 직경을 갖는 바늘 (벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson) 20G1)을 사용하여, 마이크로 튜브의 하단부에 홀을 제조하였다. 홀을 갖는 마이크로 튜브를 겔-팩 흡입 장치 (에어 펌프)의 금속 플레이트에 위치시키고, 홀을 공기 펌프의 동일한 공기-흐름 방향으로 조절하였다. 필터를 마이크로 튜브의 상단 상에 위치시켰다. 혈청 20 ㎕를 필터의 상부 상에 로딩하였다. 혈청 용액을 산포하여, 필터의 내부 정사각형을 충전하였다. 수동으로 공기 펌프를 펌프질함으로써 음성 공기 흐름을 적용하였다. 필터로부터 마이크로 튜브로 적가된 혈청 용액을 수집하고, 새로운 튜브로 이동시켰다. 여과된 혈청을 추가로 0.1% n-옥틸 β-D-글루코피라노시드에 1:100으로 희석하였다. 384 정의된 구역을 갖는 샘플 플레이트의 정의된 구역 각각에 매트릭스 0.5 ㎕를 위치시키고, 개체 각각으로부터의 혈청 0.5 ㎕를 정의된 구역에 첨가한 후, 공기에 의해 건조시켰다. 샘플 및 샘플 플레이트 상의 그의 위치를 정확한 데이타 해석을 위해 기록하였다. 크라토스 어낼리티컬 인크.에 의해 제조된 액시마-CFR MALDI-TOF 질량 분광계를 사용하였다. 하기 세부사항에 따라 기기를 셋팅하였다: 튜너 모드, 선형; 질량 범위, 0 내지 약 5,000; 레이저 힘, 90; 프로파일, 100; 1스폿당 화소수, 5. 질량 분광계의 출력을 샘플 데이타 세트의 형태로 컴퓨터 저장소에 저장하였다.
정상적인 혈청 데이타 및 폐암 혈청 데이타 간의 비교는 도 2a 내지 2s에 예시하고, 정상적인 여과전 및 여과후 샘플은 도 2a 내지 2k에 나타내고, 폐암 ("질환 A") 여과전 및 여과후 샘플은 도 2l 내지 2s에 나타낸다. 추가로, 도 6a1 내지 6a32는 폐암 환자의 여과전 혈청 대 여과후 혈청의 크로마토그램을 나타내고, 도 6b1 내지 6b34는 정상적인 환자의 여과전 및 여과후 혈청의 크로마토그램을 나타낸다.
먼저, 정상적인 혈청 및 폐암 혈청을 여과전 조건에서 시험하였다. 11개의 정상적인 혈청 및 8개의 폐암 혈청을 상기 기재된 바와 동일한 방법에 의해 처리하고, 도면에 나타낸 크로마토그램 프로파일을 생성하였다. 크로마토그램 프로파일을 고정된 범위에서 비교한 경우, 도 2a 내지 2s에서 점 A 및 B에 상응하는 스폿에서 정상적인 혈청 및 폐암 혈청 간의 실질적인 상이성을 발견하였다. 도면에 예시된 바와 같이, 점 A는 456의 질량 대 전하 비율에 상응하고, 점 B는 472의 질량 대 전하 비율에 상응한다. 도면에 나타낸 바와 같이, 정상적인 혈청의 크로마토그램은 스폿 A 및 B에서 피크를 나타내었다. 그러나, 폐암 혈청의 크로마토그램은 스폿 A 및 B에서 실질적으로 피크를 갖지 않았다.
도 2a 내지 2k에 나타낸 바와 같이 정상적인 혈청의 경우, 11개의 샘플 중 10개의 샘플이 스폿 A에서 피크를 나타내었다. 11개의 샘플 중 6개의 샘플은 스폿 B에서 피크를 나타내었다. 그러나, 도 2l 내지 2s에 나타낸 바와 같이 폐암 혈청의 경우, 8개의 샘플 모두 스폿 A 및 B에서 피크를 나타내지 않았다. 하기 표에 이들 결과를 요약한다.
혈청 군 스폿
A B
정상적인 혈청에서 피크를 갖는 샘플의 수 10/11 6/11
폐암 혈청에서 피크를 갖는 샘플의 수 0/8 0/8
다음, 정상적인 혈청 데이타 및 폐암 혈청 데이타는 여과후 시험하였다. 정상적인 혈청 및 폐암 혈청을 상기 기재된 바와 동일한 여과 방법에 의해 처리하였다. 여과된 혈청으로부터 크로마토그램 프로파일을 생성하였다. 크로마토그램 프로파일을 정상적인 혈청과 고정된 범위에서 비교한 경우, 11개의 샘플 모두 스폿 A에서 피크를 나타내었고, 11개의 샘플 중 7개의 샘플은 스폿 B에서 피크를 나타내었다. 그러나, 폐암 혈청의 경우, 결과는 여과전 데이타와 동일하였다. 도 2l 내지 2s에 예시된 바와 같이, 8개의 샘플 모두 스폿 A 및 B에서 피크를 나타내지 않았다. 하기 표에 이들 결과를 요약한다.
혈청 군 스폿
A B
정상적인 혈청에서 피크를 갖는 샘플의 수 11/11 7/11
질환 A 혈청에서 피크를 갖는 샘플의 수 0/8 0/8
폐암 혈청의 경우, 혈청의 여과후 스폿 A 및 B에서 낮은 피크가 감소하거나 또는 제거되었음을 주목해야 한다. 바꾸어 말하면, 필터의 사용은 폐암을 앓지 않는 인간으로부터의 혈청과 비교하여, 폐암에 걸린 인간으로부터의 혈청의 질량 분광그래프에서 상이성을 두드러지게 하였다. 이는 피크의 검출을 향상시켰다.
도 2a 내지 2s 및 6a1 내지 6b34에 나타낸 바와 같은 얻어진 데이타는 필터의 사용이 여과전 크로마토그램 및 여과후 크로마토그램 간의 상이성을 두드러지게 한다는 것을 나타낸다. 이러한 향상은 피크의 검출을 개선시켰다.
특히, 상기 표에 제공된 데이타 및 도 2a 내지 2s에 예시된 크로마토그램은 샘플의 여과가 정상적인 크로마토그램에서 스폿 A에서의 감수성의 10 퍼센트 증가 및 스폿 B에서의 감수성의 9 퍼센트 증가를 야기하였음을 나타낸다. 표에 나타낸 바와 같이, 11개의 정상적인 크로마토그램 중 10개에서, 스폿 A에서의 피크는 여과전 나타난 반면, 정상적인 크로마토그램 모두는 여과후 스폿 A에서 피크를 나타내었다. 마찬가지로, 11개의 정상적인 크로마토그램 중 6개에서, 스폿 B에서의 피크는 여과전 나타난 반면, 정상적인 크로마토그램 중 7개는 여과후 스폿 B에서 피크를 나타내었다.
또한, 도면에 제공된 데이타는 질환을 갖는 샘플의 크로마토그램에서의 특이성의 증가를 표시한다. 여과전 폐암 샘플 8개 중 6개 (도 2l, 2n, 2p, 2q, 2r 및 2s)는 스폿 A에서 피크를 나타내었다. 그러나, 여과후, 이들 피크는 더이상 존재하지 않았다. 그러므로, 스폿 A의 검출의 특이성에서 특이성의 25 퍼센트 증가가 실현되었다.
당업자는 상기 실시예가 폐암을 구체적으로 논의하나, 본 발명이 임의의 특정 질환으로 제한됨을 의미하지 않는다는 것을 인식할 것이다. 본 발명은 정상적인 환자의 질량 크로마토그램과 비교된 질량 크로마토그램에서 상이성을 나타낼 수 있는 임의의 질환에 적용가능하다. 예시적인 질환으로는 생체액 (예를 들어, 혈액 및 혈액 유도체, 뇨, 뇌척수액, 객담, 세척액)에 함유된 분자에 잠재적인 변경이 존재하는, 호흡기, 위장관, 신장, CNS, 내분비계 및 혈액계의 암, 또는 임의의 다른 질환 또는 질환 프로세스 (예를 들어, 괴사, 세포자멸(apoptosis))를 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 생물학적 분자로는 거대분자, 예컨대 폴리펩 티드, 단백질, 핵산, 효소, DNA, RNA, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 탄수화물, 올리고사카라이드, 다당류, 생물학적 거대분자의 단편 (예를 들어, 핵산 단편, 펩티드 단편 및 단백질 단편), 생물학적 거대분자의 복합체 (예를 들어, 핵산 복합체, 단백질-DNA 복합체, 수용체-리간드 복합체, 효소-기질, 효소 억제제, 펩티드 복합체, 단백질 복합체, 탄수화물 복합체, 및 다당류 복합체), 작은 생물학적 분자, 예컨대 아미노산, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 당, 스테로이드, 지질, 금속 이온, 약물, 호르몬, 아미드, 아민, 카르복실산, 비타민 및 조효소, 알콜, 알데히드, 케톤, 지방산, 포르피린, 카로테노이드, 식물 성장 조절인자, 포스페이트 에스테르 및 뉴클레오시드 디포스포-당, 합성 소분자, 예컨대 제약상 또는 치료상 효과적인 작용제, 단량체, 펩티드 유사체, 스테로이드 유사체, 억제제, 돌연변이원, 발암물질, 항유사분열 약물, 항생제, 이온운반체, 항대사물질, 아미노산 유사체, 항박테리아제, 수송 억제제, 표면-활성제 (계면활성제), 미토콘드리아 및 엽록체 기능 억제제, 전자 공여체, 담체 및 수령체, 프로테아제에 대한 합성 기질, 포스파타제에 대한 기질, 에스테라제 및 리파제에 대한 기질, 및 단백질 변형 시약; 및 합성 중합체, 올리고머, 및 공중합체를 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 언급된 물질들의 임의의 적합한 혼합물 또는 조합물이 또한 생물학적 샘플에 포함될 수 있다.
실시예 2
하기 논의는 상기 논의된 본 발명에 따른 장치 및 방법을 사용하여 수행된 특정 췌장암 스크리닝에 대해 논의한다. 혈청에서 상이한 단백질/펩티드 패턴을 나타내는 스펙트럼 샘플 데이타 세트를 생성하는데 MALDI-TOF-MS를 사용하였다. 한 임상 연구에서, 췌장암이 있는 환자 또는 건강한 대조군으로부터 유체를 수술 과정 전에 얻었다. 모든 최종 진단은 조직병리학에 의해 확인하였으며, 모든 대조군은 췌장암에 대해 높은 위험이 있었으나, 임상적 제시 및 CT 스캔 시험을 기초로 하는 췌장암의 증거는 없었다.
혈청 샘플의 매트릭스의 제조에 의해 질량 분광계에 의한 평가를 위해 혈청을 제조하였다. 질량 분광계 매트릭스는 50% 아세토니트릴-0.05% 트리플루오로아세트산 (TFA)에 포화 알파-시아노-4-히드록시신남산을 함유하였다. 유체를 0.1% n-옥틸 β-D-글루코피라노시드에 1:1000으로 희석하였다. 384 정의된 구역을 갖는 샘플 플레이트의 정의된 구역 각각에 매트릭스 0.5 ㎕를 위치시키고, 개체 각각으로부터의 혈청 0.5 ㎕를 정의된 구역에 첨가한 후, 공기에 의해 건조시켰다. 샘플 및 샘플 플레이트 상의 그의 위치를 정확한 데이타 해석을 위해 기록하였다. 크라토스 어낼리티컬 인크.에 의해 제조된 액시마-CFR MALDI-TOF 질량 분광계를 사용하였다. 하기 세부사항에 따라 기기를 셋팅하였다: 튜너 모드, 선형; 질량 범위, 0 내지 약 5,000; 레이저 힘, 90; 프로파일, 100; 1스폿당 화소수, 5. 질량 분광계의 출력을 샘플 데이타 세트의 형태로 컴퓨터 저장소에 저장하였다.
필터를 적용하기 전에, 혈청을 0.1% n-옥틸 β-D-글루코피라노시드에서 1:10으로 희석하였다. 마이크로 튜브를 마이크로 Amp 8 스트립 튜브로부터 개별적으로 절단하였다. 0.9 mm 이하의 직경을 갖는 바늘 (벡톤 딕킨슨 20G1)을 사용하여, 마이크로 튜브의 하단부에 홀을 제조하였다. 홀을 갖는 마이크로 튜브를 겔-팩 흡입 장치 (에어 펌프)의 금속 플레이트에 위치시키고, 홀을 공기 펌프의 동일한 공기-흐름 방향으로 조절하였다. 필터를 마이크로 튜브의 상단 상에 위치시켰다. 혈청 20 ㎕를 필터의 상부 상에 로딩하였다. 혈청 용액을 산포하여, 필터의 내부 정사각형을 충전하였다. 수동으로 공기 펌프를 펌프질함으로써 음성 공기 흐름을 적용하였다. 필터로부터 마이크로 튜브로 적가된 혈청 용액을 수집하고, 새로운 튜브로 이동시켰다. 여과된 혈청을 추가로 0.1% n-옥틸 β-D-글루코피라노시드에 1:100으로 희석하였다. 384 정의된 구역을 갖는 샘플 플레이트의 정의된 구역 각각에 매트릭스 0.5 ㎕를 위치시키고, 개체 각각으로부터의 혈청 0.5 ㎕를 정의된 구역에 첨가한 후, 공기에 의해 건조시켰다. 샘플 및 샘플 플레이트 상의 그의 위치를 정확한 데이타 해석을 위해 기록하였다. 크라토스 어낼리티컬 인크.에 의해 제조된 액시마-CFR MALDI-TOF 질량 분광계를 사용하였다. 하기 세부사항에 따라 기기를 셋팅하였다: 튜너 모드, 선형; 질량 범위, 0 내지 약 5,000; 레이저 힘, 90; 프로파일, 100; 1스폿당 화소수, 5. 질량 분광계의 출력을 샘플 데이타 세트의 형태로 컴퓨터 저장소에 저장하였다.
실시예 1과 관련하여 상기 논의된 폐암 스크리닝에서와 같이, 필터의 사용은 췌장암에 대한 여과전 및 여과후 크로마토그램에서 피크의 존재 간의 상이성을 두드러지게 하였다. 이들 결과는 상기 논의된 폐암 스크리닝의 결과의 시험과 동일한 방식으로 도 7a1 내지 7a42를 시험함으로써 당업자에게 명백할 것이다. 명백하게, 필터의 사용은 관련 피크의 검출을 향상시켰다.
당업자는 상기 실시예가 췌장암을 구체적으로 논의하나, 본 발명이 임의의 특정 질환으로 제한됨을 의미하지 않는다는 것을 인식할 것이다. 본 발명은 정상적인 환자의 질량 크로마토그램과 비교된 질량 크로마토그램에서 상이성을 나타낼 수 있는 임의의 질환에 적용가능하다. 예시적인 질환으로는 생체액 (예를 들어, 혈액 및 혈액 유도체, 뇨, 뇌척수액, 객담, 세척액)에 함유된 분자에 잠재적인 변경이 존재하는, 호흡기, 위장관, 신장, CNS, 내분비계 및 혈액계의 암, 또는 임의의 다른 질환 또는 질환 프로세스 (예를 들어, 괴사, 세포자멸)를 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 생물학적 분자로는 거대분자, 예컨대 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 효소, DNA, RNA, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 탄수화물, 올리고사카라이드, 다당류, 생물학적 거대분자의 단편 (예를 들어, 핵산 단편, 펩티드 단편 및 단백질 단편), 생물학적 거대분자의 복합체 (예를 들어, 핵산 복합체, 단백질-DNA 복합체, 수용체-리간드 복합체, 효소-기질, 효소 억제제, 펩티드 복합체, 단백질 복합체, 탄수화물 복합체, 및 다당류 복합체), 작은 생물학적 분자, 예컨대 아미노산, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 당, 스테로이드, 지질, 금속 이온, 약물, 호르몬, 아미드, 아민, 카르복실산, 비타민 및 조효소, 알콜, 알데히드, 케톤, 지방산, 포르피린, 카로테노이드, 식물 성장 조절인자, 포스페이트 에스테르 및 뉴클레오시드 디포스포-당, 합성 소분자, 예컨대 제약상 또는 치료상 효과적인 작용제, 단량체, 펩티드 유사체, 스테로이드 유사체, 억제제, 돌연변이원, 발암물질, 항유사분열 약물, 항생제, 이온운반체, 항대사물질, 아미노산 유사체, 항박테리아제, 수송 억제제, 표면-활성제 (계면활성제), 미토콘드리아 및 엽록체 기능 억제제, 전자 공여체, 담체 및 수령체, 프로테아제에 대한 합성 기질, 포스파타 제에 대한 기질, 에스테라제 및 리파제에 대한 기질, 및 단백질 변형 시약; 및 합성 중합체, 올리고머, 및 공중합체를 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 언급된 물질들의 임의의 적합한 혼합물 또는 조합물이 또한 생물학적 샘플에 포함될 수 있다.
실시예 3
하기 논의는 상기 논의된 본 발명에 따른 장치 및 방법을 사용하여 수행된 특정 방광암 스크리닝에 대해 논의한다. 뇨에서 상이한 단백질/펩티드 패턴을 나타내는 스펙트럼 샘플 데이타 세트를 생성하는데 MALDI-TOF-MS를 사용하였다. 한 임상 연구에서, 방광암이 있는 환자 또는 건강한 대조군으로부터 뇨를 수술 과정 전에 얻었다. 모든 최종 진단은 조직병리학에 의해 확인하였으며, 모든 대조군은 방광암에 대해 높은 위험이 있었으나, 임상적 제시 및 CT 스캔 시험을 기초로 하는 방광암의 증거는 없었다.
뇨 샘플의 매트릭스의 제조에 의해 질량 분광계에 의한 평가를 위해 샘플을 제조하였다. 질량 분광계 매트릭스는 50% 아세토니트릴-0.05% 트리플루오로아세트산 (TFA)에 포화 알파-시아노-4-히드록시신남산을 함유하였다. 유체를 0.1% n-옥틸 β-D-글루코피라노시드에 1:1000으로 희석하였다. 384 정의된 구역을 갖는 샘플 플레이트의 정의된 구역 각각에 매트릭스 0.5 ㎕를 위치시키고, 개체 각각으로부터의 뇨 0.5 ㎕를 정의된 구역에 첨가한 후, 공기에 의해 건조시켰다. 샘플 및 샘플 플레이트 상의 그의 위치를 정확한 데이타 해석을 위해 기록하였다. 크라토스 어낼리티컬 인크.에 의해 제조된 액시마-CFR MALDI-TOF 질량 분광계를 사용하였 다. 하기 세부사항에 따라 기기를 셋팅하였다: 튜너 모드, 선형; 질량 범위, 0 내지 약 5,000; 레이저 힘, 90; 프로파일, 100; 1스폿당 화소수, 5. 질량 분광계의 출력을 샘플 데이타 세트의 형태로 컴퓨터 저장소에 저장하였다.
필터를 적용하기 전에, 뇨를 0.1% n-옥틸 β-D-글루코피라노시드에서 1:10으로 희석하였다. 마이크로 튜브를 마이크로 Amp 8 스트립 튜브로부터 개별적으로 절단하였다. 0.9 mm 이하의 직경을 갖는 바늘 (벡톤 딕킨슨 20G1)을 사용하여, 마이크로 튜브의 하단부에 홀을 제조하였다. 홀을 갖는 마이크로 튜브를 겔-팩 흡입 장치 (에어 펌프)의 금속 플레이트에 위치시키고, 홀을 공기 펌프의 동일한 공기-흐름 방향으로 조절하였다. 필터를 마이크로 튜브의 상단 상에 위치시켰다. 뇨 20 ㎕를 필터의 상부 상에 로딩하였다. 뇨 용액을 산포하여, 필터의 내부 정사각형을 충전하였다. 수동으로 공기 펌프를 펌프질함으로써 음성 공기 흐름을 적용하였다. 필터로부터 마이크로 튜브로 적가된 뇨 용액을 수집하고, 새로운 튜브로 이동시켰다. 여과된 뇨를 추가로 0.1% n-옥틸 β-D-글루코피라노시드에 1:100으로 희석하였다. 384 정의된 구역을 갖는 샘플 플레이트의 정의된 구역 각각에 매트릭스 0.5 ㎕를 위치시키고, 개체 각각으로부터의 뇨 0.5 ㎕를 정의된 구역에 첨가한 후, 공기에 의해 건조시켰다. 샘플 및 샘플 플레이트 상의 그의 위치를 정확한 데이타 해석을 위해 기록하였다. 크라토스 어낼리티컬 인크.에 의해 제조된 액시마-CFR MALDI-TOF 질량 분광계를 사용하였다. 하기 세부사항에 따라 기기를 셋팅하였다: 튜너 모드, 선형; 질량 범위, 0 내지 약 5,000; 레이저 힘, 90; 프로파일, 100; 1스폿당 화소수, 5. 질량 분광계의 출력을 샘플 데이타 세트의 형태로 컴퓨 터 저장소에 저장하였다.
실시예 1과 관련하여 상기 논의된 폐암 스크리닝에서와 같이, 필터의 사용은 방광암에 대한 여과전 및 여과후 크로마토그램에서 피크의 존재 간의 상이성을 두드러지게 하였다. 이들 결과는 도 8a 내지 8l (도 8a 내지 8f는 방광암을 갖는 것으로 공지된 샘플의 크로마토그램인 반면, 도 8g 내지 8l은 정상적인 크로마토그램임)를 시험함으로써 당업자에게 명백할 것이다. 명백하게, 필터의 사용은 관련 피크의 검출을 향상시켰다.
당업자는 상기 실시예가 방광암을 구체적으로 논의하나, 본 발명이 임의의 특정 질환으로 제한됨을 의미하지 않는다는 것을 인식할 것이다. 본 발명은 정상적인 환자의 질량 크로마토그램과 비교된 질량 크로마토그램에서 상이성을 나타낼 수 있는 임의의 질환에 적용가능하다. 예시적인 질환으로는 생체액 (예를 들어, 혈액 및 혈액 유도체, 뇨, 뇌척수액, 객담, 세척액)에 함유된 분자에 잠재적인 변경이 존재하는, 호흡기, 위장관, 신장, CNS, 내분비계 및 혈액계의 암, 또는 임의의 다른 질환 또는 질환 프로세스 (예를 들어, 괴사, 세포자멸)를 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 생물학적 분자로는 거대분자, 예컨대 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 효소, DNA, RNA, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 탄수화물, 올리고사카라이드, 다당류, 생물학적 거대분자의 단편 (예를 들어, 핵산 단편, 펩티드 단편 및 단백질 단편), 생물학적 거대분자의 복합체 (예를 들어, 핵산 복합체, 단백질-DNA 복합체, 수용체-리간드 복합체, 효소-기질, 효소 억제제, 펩티드 복합체, 단백질 복합체, 탄수화물 복합체, 및 다당류 복합체), 작은 생물학적 분 자, 예컨대 아미노산, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 당, 스테로이드, 지질, 금속 이온, 약물, 호르몬, 아미드, 아민, 카르복실산, 비타민 및 조효소, 알콜, 알데히드, 케톤, 지방산, 포르피린, 카로테노이드, 식물 성장 조절인자, 포스페이트 에스테르 및 뉴클레오시드 디포스포-당, 합성 소분자, 예컨대 제약상 또는 치료상 효과적인 작용제, 단량체, 펩티드 유사체, 스테로이드 유사체, 억제제, 돌연변이원, 발암물질, 항유사분열 약물, 항생제, 이온운반체, 항대사물질, 아미노산 유사체, 항박테리아제, 수송 억제제, 표면-활성제 (계면활성제), 미토콘드리아 및 엽록체 기능 억제제, 전자 공여체, 담체 및 수령체, 프로테아제에 대한 합성 기질, 포스파타제에 대한 기질, 에스테라제 및 리파제에 대한 기질, 및 단백질 변형 시약; 및 합성 중합체, 올리고머, 및 공중합체를 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 언급된 물질들의 임의의 적합한 혼합물 또는 조합물이 또한 생물학적 샘플에 포함될 수 있다.
실시예 4
하기 논의는 특정 질환 치료에 대한 환자의 반응 또는 상기 반응의 결핍을 예측하기 위한, 본 발명의 다양한 실시양태에 따른 방법의 사용을 예시하는데 사용된 특정 시험을 논의한다. 혈청에서 상이한 질량 대 전하 이온 피크를 나타내는 스펙트럼 샘플 데이타 세트를 생성하는데 MALDI-TOF-MS를 사용하였다. 이들 피크는 거대분자, 예컨대 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 효소, DNA, RNA, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 탄수화물, 올리고사카라이드, 다당류, 생물학적 거대분자의 단편 (예를 들어, 핵산 단편, 펩티드 단편 및 단백질 단편), 생물학적 거대분자 의 복합체 (예를 들어, 핵산 복합체, 단백질-DNA 복합체, 수용체-리간드 복합체, 효소-기질, 효소 억제제, 펩티드 복합체, 단백질 복합체, 탄수화물 복합체, 및 다당류 복합체), 작은 생물학적 분자, 예컨대 아미노산, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 당, 스테로이드, 지질, 금속 이온, 약물, 호르몬, 아미드, 아민, 카르복실산, 비타민 및 조효소, 알콜, 알데히드, 케톤, 지방산, 포르피린, 카로테노이드, 식물 성장 조절인자, 포스페이트 에스테르 및 뉴클레오시드 디포스포-당, 합성 소분자, 예컨대 제약상 또는 치료상 효과적인 작용제, 단량체, 펩티드 유사체, 스테로이드 유사체, 억제제, 돌연변이원, 발암물질, 항유사분열 약물, 항생제, 이온운반체, 항대사물질, 아미노산 유사체, 항박테리아제, 수송 억제제, 표면-활성제 (계면활성제), 미토콘드리아 및 엽록체 기능 억제제, 전자 공여체, 담체 및 수령체, 프로테아제에 대한 합성 기질, 포스파타제에 대한 기질, 에스테라제 및 리파제에 대한 기질, 및 단백질 변형 시약; 및 합성 중합체, 올리고머, 및 공중합체를 비롯한 생물학적 분자를 나타낼 수 있다. 또한, 상기 언급된 물질들의 임의의 적합한 혼합물 또는 조합물이 또한 생물학적 샘플에 포함될 수 있다.
혈청 샘플의 매트릭스의 제조에 의해 질량 분광계에 의한 평가를 위해 혈청을 제조하였다. 질량 분광계 매트릭스는 50% 아세토니트릴-0.05% 트리플루오로아세트산 (TFA)에 포화 알파-시아노-4-히드록시신남산을 함유하였다. 혈청을 0.1% n-옥틸 β-D-글루코피라노시드에 1:1000으로 희석하였다. 384 정의된 구역을 갖는 샘플 플레이트의 정의된 구역 각각에 매트릭스 0.5 ㎕를 위치시키고, 개체 각각으로부터의 혈청 0.5 ㎕를 정의된 구역에 첨가한 후, 공기에 의해 건조시켰다. 샘플 및 샘플 플레이트 상의 그의 위치를 정확한 데이타 해석을 위해 기록하였다. 크라토스 어낼리티컬 인크.에 의해 제조된 액시마-CFR MALDI-TOF 질량 분광계를 사용하였다. 하기 세부사항에 따라 기기를 셋팅하였다: 튜너 모드, 선형; 질량 범위, 0 내지 약 5,000; 레이저 힘, 90; 프로파일, 100; 1스폿당 화소수, 5. 질량 분광계의 출력을 샘플 데이타 세트의 형태로 컴퓨터 저장소에 저장하였다.
필터를 적용하기 전에, 혈청을 0.1% n-옥틸 β-D-글루코피라노시드에서 1:10으로 희석하였다. 마이크로 튜브를 마이크로 Amp 8 스트립 튜브로부터 개별적으로 절단하였다. 0.9 mm 이하의 직경을 갖는 바늘 (벡톤 딕킨슨 20G1)을 사용하여, 마이크로 튜브의 하단부에 홀을 제조하였다. 홀을 갖는 마이크로 튜브를 겔-팩 흡입 장치 (에어 펌프)의 금속 플레이트에 위치시키고, 홀을 공기 펌프의 동일한 공기-흐름 방향으로 조절하였다. 필터를 마이크로 튜브의 상단 상에 위치시켰다. 혈청 20 ㎕를 필터의 상부 상에 로딩하였다. 혈청 용액을 산포하여, 필터의 내부 정사각형을 충전하였다. 수동으로 공기 펌프를 펌프질함으로써 음성 공기 흐름을 적용하였다. 필터로부터 마이크로 튜브로 적가된 혈청 용액을 수집하고, 새로운 튜브로 이동시켰다. 여과된 혈청을 추가로 0.1% n-옥틸 β-D-글루코피라노시드에 1:100으로 희석하였다. 384 정의된 구역을 갖는 샘플 플레이트의 정의된 구역 각각에 매트릭스 0.5 ㎕를 위치시키고, 개체 각각으로부터의 혈청 0.5 ㎕를 정의된 구역에 첨가한 후, 공기에 의해 건조시켰다. 샘플 및 샘플 플레이트 상의 그의 위치를 정확한 데이타 해석을 위해 기록하였다. 크라토스 어낼리티컬 인크.에 의해 제조된 액시마-CFR MALDI-TOF 질량 분광계를 사용하였다. 하기 세부사항에 따라 기기를 셋팅하였다: 튜너 모드, 선형; 질량 범위, 0 내지 약 5,000; 레이저 힘, 90; 프로파일, 100; 1스폿당 화소수, 5. 질량 분광계의 출력을 샘플 데이타 세트의 형태로 컴퓨터 저장소에 저장하였다.
도 5a1 내지 5a34는 치료에 대한 반응자 및 치료에 대한 무반응자에 대한 여과전 및 여과후 샘플의 비교를 예시한다. 도 5a1 내지 5a14는 탁솔-기재 화학요법에 대해 반응을 나타내는 환자의 여과전 및 여과후 샘플을 비교하는 크로마토그램이다. 도 5a15 내지 5a34는 탁솔-기재 화학요법에 대해 반응을 나타내지 않는 환자의 여과전 및 여과후 샘플을 비교하는 크로마토그램이다. 크로마토그램의 분석은 피크가 반응자에 존재하지 않는, 상당한 다수의 무반응자에서 특정 점 C에서 존재한다는 것을 나타낸다. 도면에 나타낸 바와 같이, 점 C는 491의 질량 대 전하 비율에 상응한다. 본 실시예에서, 점 C에서의 피크의 존재는 탁솔-기재 화학요법에 대한 무반응을 예시한다. 그러므로, 본 발명의 방법을 사용하여, 여과된 크로마토그램이 점 C에서 피크를 나타내는 환자는 탁솔-기재 화학요법에 대한 무반응자인 것으로 예측될 수 있다는 것이 예측될 수 있다.
당업자는 상기 실시예가 탁솔-기재 화학요법을 구체적으로 논의하나, 본 발명이 임의의 특정 질환으로 제한됨을 의미하지 않는다는 것을 인식할 것이다. 본 발명은 생체액 (예를 들어, 혈액 및 혈액 유도체, 뇨, 뇌척수액, 객담, 세척액)에 함유된 분자에 잠재적인 변경이 존재하는, 호흡기, 위장관, 신장, CNS, 내분비계 및 혈액계의 암, 또는 임의의 다른 질환 또는 질환 프로세스 (예를 들어, 괴사, 세포자멸)를 포함하나 이에 제한되지 않는 각종 질환을 위한 치료에 대한 반응을 예 측하는데 사용될 수 있다. 이러한 생물학적 분자로는 거대분자, 예컨대 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 효소, DNA, RNA, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 탄수화물, 올리고사카라이드, 다당류, 생물학적 거대분자의 단편 (예를 들어, 핵산 단편, 펩티드 단편 및 단백질 단편), 생물학적 거대분자의 복합체 (예를 들어, 핵산 복합체, 단백질-DNA 복합체, 수용체-리간드 복합체, 효소-기질, 효소 억제제, 펩티드 복합체, 단백질 복합체, 탄수화물 복합체, 및 다당류 복합체), 작은 생물학적 분자, 예컨대 아미노산, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 당, 스테로이드, 지질, 금속 이온, 약물, 호르몬, 아미드, 아민, 카르복실산, 비타민 및 조효소, 알콜, 알데히드, 케톤, 지방산, 포르피린, 카로테노이드, 식물 성장 조절인자, 포스페이트 에스테르 및 뉴클레오시드 디포스포-당, 합성 소분자, 예컨대 제약상 또는 치료상 효과적인 작용제, 단량체, 펩티드 유사체, 스테로이드 유사체, 억제제, 돌연변이원, 발암물질, 항유사분열 약물, 항생제, 이온운반체, 항대사물질, 아미노산 유사체, 항박테리아제, 수송 억제제, 표면-활성제 (계면활성제), 미토콘드리아 및 엽록체 기능 억제제, 전자 공여체, 담체 및 수령체, 프로테아제에 대한 합성 기질, 포스파타제에 대한 기질, 에스테라제 및 리파제에 대한 기질, 및 단백질 변형 시약; 및 합성 중합체, 올리고머, 및 공중합체를 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 언급된 물질들의 임의의 적합한 혼합물 또는 조합물이 또한 생물학적 샘플에 포함될 수 있다.
본 발명은 그의 특정 예시적인 실시양태에 관하여 기재되나, 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 변형물을 제 조할 수 있다. 본원에 사용된 용어 및 기재는 오직 예시에 의해 기술되며, 제한하는 것을 의미하지 않는다. 특히, 본 발명은 실시예에 의해 기재되나, 각종 조성물 및 방법이 본원에 기재된 본 발명의 개념을 실시할 것이다. 본 발명이 다양한 용어 및 특정 실시양태에 기재되고 개시되나, 본 발명의 범위는 이에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않고, 또한 제한되는 것으로 여겨져서는 안되며, 본원의 교시내용에 의해 제안될 수 있는 바와 같이, 이러한 다른 변형 또는 실시양태가 구체적으로 보존되며, 특히 이는 본원에 첨부된 청구의 범위 및 범주내에 포함된다. 당업자는 이들 및 다른 변화물이 첨부된 청구의 범위 및 그의 균등물에 정의된 바와 같은 본 발명의 범위 내에서 가능하다는 것을 인식할 것이다.
본 발명의 특정 실시양태의 상기 기재는 예시 및 설명을 위해 제공된다. 이것이 전부이거나 또는 본 발명을 개시된 정밀한 형태로 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 명백하게, 상기 교시내용의 관점에서 많은 변형물 및 변화물이 가능하다. 본 발명의 원리 및 그의 실시 적용을 최선으로 설명하여 이에 의해 당업자가 본 발명을 최선으로 사용할 수 있게 하기 위해 실시양태가 선택되고 기술되었으나, 특정 용도에 적합한 다양한 변형이 있는 다양한 실시양태가 또한 가능하다. 본 발명의 범위는 본원에 첨부된 청구의 범위 및 그의 균등물에 의해서만 한정된다.

Claims (74)

  1. 생체액을 홀 어레이 필터를 통해 여과하는 단계;
    여과된 생체액으로부터 질량 스펙트럼 데이타를 생성하는 단계; 및
    질량 스펙트럼 데이타를 데이타베이스와 비교하는 단계
    를 포함하는, 질환의 확률의 결정 방법.
  2. 제1항에 있어서, 질환이 폐암인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 질환이 방광암인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 질환이 췌장암인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 질량 스펙트럼 데이타가 MALDI-TOF-MS에 의해 취해지는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 생체액이 혈청인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 생체액이 뇨인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 생체액이 혈장인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 홀 어레이 필터가 적어도 약 1 내지 10 ㎛의 직경을 갖는 홀을 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 홀 어레이 필터가 적어도 약 6 내지 10 ㎛의 두께를 갖는 홀 어레이 층을 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 홀 어레이 필터가
    홀 어레이를 갖는 제1 구역; 및
    제1 구역의 두께보다 큰 두께를 갖는, 필터 강성의 유지를 위한 제2 구역
    을 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 홀 어레이 필터가 제2 Si 층의 두께보다 큰 두께를 갖는 제1 Si 층, SiO2 층 및 제2 Si 층을 포함하는 것인 방법.
  13. 질환 A의 치료에 반응하는 집단으로부터의 샘플의 제1 세트로부터, 홀 어레이 필터를 통한 샘플의 제1 세트의 여과후에 질량 스펙트럼 데이타의 제1 세트를 생성하는 단계;
    질환 A의 동일한 치료에 반응하지 않는 집단으로부터의 샘플의 제2 세트로부터, 홀 어레이 필터를 통한 샘플의 제2 세트의 여과후에 질량 스펙트럼 데이타의 제2 세트를 생성하는 단계; 및
    질량 스펙트럼 데이타의 제1 및 제2 세트에서 상응하는 피크들을 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 상응하는 피크에서의 상이성은 피크가 질환 A의 치료에 대한 반응의 우도(likelihood)를 표시하는 하나 이상의 마커를 나타낸다는 것을 표시하고;
    여기서 하나 이상의 마커의 확인시 질환의 치료에 대한 반응의 우도를 예측하기 위해 하나 이상의 마커를 사용하는 것인
    질환 치료에 대한 반응의 예측 방법.
  14. 제13항에 있어서, 샘플의 제1 세트를 여과하는 홀 어레이 필터의 구조와, 샘플의 제2 세트를 여과하는 홀 어레이 필터의 구조가 실질적으로 동일한 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 샘플이 각각 별개의 홀 어레이 필터를 통해 여과되는 것인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 샘플의 제1 세트를 여과하는 홀 어레이 필터 및 샘플의 제2 세트를 여과하는 홀 어레이 필터가 각각 적어도 약 1 내지 10 ㎛의 직경을 갖는 홀을 포함하는 것인 방법.
  17. 제13항에 있어서, 샘플의 제1 세트를 여과하는 홀 어레이 필터 및 샘플의 제2 세트를 여과하는 홀 어레이 필터가 각각 적어도 약 6 내지 10 ㎛의 두께를 갖는 홀 어레이 층을 포함하는 것인 방법.
  18. 제13항에 있어서, 홀 어레이 필터가
    홀 어레이를 갖는 제1 구역; 및
    제1 구역의 두께보다 큰 두께를 갖는, 필터 강성의 유지를 위한 제2 구역
    을 포함하는 것인 방법.
  19. 제13항에 있어서, 홀 어레이 필터가 제2 Si 층의 두께보다 큰 두께를 갖는 제1 Si 층, SiO2 층 및 제2 Si 층을 포함하는 것인 방법.
  20. 제13항에 있어서, 샘플의 제1 세트 및 샘플의 제2 세트가 생체액인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 생체액이 혈청, 뇨 또는 혈장인 방법.
  22. 제13항에 있어서, 질환 A가 폐암인 방법.
  23. 제13항에 있어서, 질환 A가 방광암인 방법.
  24. 제13항에 있어서, 질환 A가 췌장암인 방법.
  25. 제13항에 있어서, 질량 스펙트럼 데이타가 MALDI-TOF-MS에 의해 생성되는 것인 방법.
  26. 제13항에 있어서, 샘플의 제1 세트를 여과하는 홀 어레이 필터 및 샘플의 제2 세트를 여과하는 홀 어레이 필터가 별개의 홀 어레이 필터인 방법.
  27. 샘플을 홀 어레이 필터를 통해 여과하는 단계; 및
    여과된 샘플로부터 질량 스펙트럼 데이타를 생성하는 단계
    를 포함하는, 질량 분광측정 방법에서 피크의 확인을 향상시키는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 홀 어레이 필터가 적어도 약 1 내지 10 ㎛의 직경을 갖는 홀을 포함하는 것인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 홀 어레이 필터가 적어도 약 6 내지 10 ㎛의 두께를 갖는 홀 어레이 층을 포함하는 것인 방법.
  30. 제27항에 있어서, 홀 어레이 필터가
    홀 어레이를 갖는 제1 구역; 및
    제1 구역의 두께보다 큰 두께를 갖는, 필터 강성의 유지를 위한 제2 구역
    을 포함하는 것인 방법.
  31. 제27항에 있어서, 홀 어레이 필터가 제2 Si 층의 두께보다 큰 두께를 갖는 제1 Si 층, SiO2 층 및 제2 Si 층을 포함하는 것인 방법.
  32. 제27항에 있어서, 질량 스펙트럼 데이타가 MALDI-TOF-MS에 의해 생성되는 것인 방법.
  33. 제27항에 있어서, 샘플이 생체액인 방법.
  34. 제27항에 있어서, 샘플이 혈청인 방법.
  35. 제27항에 있어서, 샘플이 뇨인 방법.
  36. 제27항에 있어서, 샘플이 혈장인 방법.
  37. 질환 A를 갖는 집단으로부터의 생체액 샘플의 제1 세트로부터, 홀 어레이 필터를 통한 생체액 샘플의 제1 세트의 여과후에 질량 스펙트럼 데이타의 제1 세트를 생성하는 단계;
    질환 A를 갖지 않는 집단으로부터의 생체액 샘플의 제2 세트로부터, 홀 어레이 필터를 통한 생체액 샘플의 제2 세트의 여과후에 질량 스펙트럼 데이타의 제2 세트를 생성하는 단계; 및
    질량 스펙트럼 데이타의 제1 및 제2 세트를 비교하는 단계
    를 포함하며, 여기서 질량 스펙트럼 데이타의 제1 및 제2 세트에서 상응하는 피크 간의 상이성은 하나 이상의 질환 A 음성 마커를 표시하는 것인, 질환 검출에서 감수성 및 특이성의 증가 방법.
  38. 제37항에 있어서, 환자가 질환 A를 갖는가를 검출하기 위해 하나 이상의 질환 A 음성 마커를 사용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  39. 제37항에 있어서, 질량 스펙트럼 데이타가 MALDI-TOF-MS에 의해 생성되는 것인 방법.
  40. 제37항에 있어서, 생체액 샘플이 혈청인 방법.
  41. 제37항에 있어서, 생체액 샘플이 뇨인 방법.
  42. 제37항에 있어서, 생체액 샘플이 혈장인 방법.
  43. 제37항에 있어서, 샘플의 제1 세트를 여과하는 홀 어레이 필터의 구조와, 샘플의 제2 세트를 여과하는 홀 어레이 필터의 구조가 실질적으로 동일한 것인 방법.
  44. 제37항에 있어서, 샘플의 제1 세트를 여과하는 홀 어레이 필터 및 샘플의 제2 세트를 여과하는 홀 어레이 필터가 각각 적어도 약 1 내지 10 ㎛의 직경을 갖는 홀을 포함하는 것인 방법.
  45. 제37항에 있어서, 샘플의 제1 세트를 여과하는 홀 어레이 필터 및 샘플의 제2 세트를 여과하는 홀 어레이 필터가 각각 적어도 약 6 내지 10 ㎛의 두께를 갖는 홀 어레이 층을 포함하는 것인 방법.
  46. 제37항에 있어서, 홀 어레이 필터가
    홀 어레이를 갖는 제1 구역; 및
    제1 구역의 두께보다 큰 두께를 갖는, 필터 강성의 유지를 위한 제2 구역
    을 포함하는 것인 방법.
  47. 제37항에 있어서, 홀 어레이 필터가 제2 Si 층의 두께보다 큰 두께를 갖는 제1 Si 층, SiO2 층 및 제2 Si 층을 포함하는 것인 방법.
  48. 제37항에 있어서, 질환 A가 폐암인 방법.
  49. 제37항에 있어서, 질환 A가 방광암인 방법.
  50. 제37항에 있어서, 질환 A가 췌장암인 방법.
  51. 제37항에 있어서, 샘플의 제1 세트를 여과하는 홀 어레이 필터 및 샘플의 제2 세트를 여과하는 홀 어레이 필터가 별개의 홀 어레이 필터인 방법.
  52. 제37항에 있어서, 샘플이 각각 별개의 홀 어레이 필터를 통해 여과되는 것인 방법.
  53. 하나 이상의 홀 어레이 필터를 포함하며;
    여기서, 질환 A의 치료에 대해 반응하는 집단으로부터의 샘플의 제1 세트는 상기 하나 이상의 홀 어레이 필터 중 하나를 통해 여과되고;
    질량 스펙트럼 데이타의 제1 세트는 상기 하나 이상의 홀 어레이 필터 중 하나를 통한 여과후 샘플의 제1 세트로부터 생성되고;
    질환 A의 동일한 치료에 대해 반응하지 않는 집단으로부터의 샘플의 제2 세트는 상기 하나 이상의 홀 어레이 필터 중 하나를 통해 여과되고;
    질량 스펙트럼 데이타의 제2 세트는 상기 하나 이상의 홀 어레이 필터 중 하나를 통한 여과후 샘플의 제2 세트로부터 생성되고;
    질량 스펙트럼 데이타의 제1 및 제2 세트에서 상응하는 피크는 비교되고, 여기서 상응하는 피크에서의 상이성은 피크가 질환 A의 치료에 대한 반응의 우도를 표시하는 하나 이상의 마커를 나타낸다는 것을 표시하는 것인,
    질환 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 생체액 여과용 장치.
  54. 제53항에 있어서, 상기 하나 이상의 홀 어레이 필터가 하나 이상의 제1 홀 어레이 필터 및 하나 이상의 제2 홀 어레이 필터를 포함하는 것인 장치.
  55. 제54에 있어서, 샘플의 제1 세트가 하나 이상의 제1 홀 어레이 필터를 통해 여과되고, 샘플의 제2 세트가 하나 이상의 제2 홀 어레이 필터를 통해 여과되는 것인 장치.
  56. 제55에 있어서, 샘플이 각각 별개의 홀 어레이 필터를 통해 여과되는 것인 장치.
  57. 제53에 있어서, 하나 이상의 마커의 확인시 하나 이상의 마커가 질환의 치료 에 대한 반응의 우도의 예측에 사용되는 것인 장치.
  58. 제53에 있어서, 상기 하나 이상의 홀 어레이 필터가 각각 적어도 약 1 내지 10 ㎛의 직경을 갖는 홀을 포함하는 것인 장치.
  59. 제53에 있어서, 상기 하나 이상의 홀 어레이 필터가 각각 적어도 약 6 내지 10 ㎛의 두께를 갖는 홀 어레이 층을 포함하는 것인 장치.
  60. 제53에 있어서, 상기 하나 이상의 홀 어레이 필터가 각각
    홀 어레이를 갖는 제1 구역; 및
    제1 구역의 두께보다 큰 두께를 갖는, 필터 강성의 유지를 위한 제2 구역
    을 포함하는 것인 장치.
  61. 제53에 있어서, 상기 하나 이상의 홀 어레이 필터가 각각 제2 Si 층의 두께보다 큰 두께를 갖는 제1 Si 층, SiO2 층 및 제2 Si 층을 포함하는 것인 장치.
  62. 하나 이상의 홀 어레이 필터를 포함하며;
    여기서, 질환 A를 갖는 집단으로부터의 생체액 샘플의 제1 세트는 상기 하나 이상의 홀 어레이 필터 중 하나를 통해 여과되고;
    질량 스펙트럼 데이타의 제1 세트는 상기 하나 이상의 홀 어레이 필터 중 하나를 통한 여과후 생체액 샘플의 제1 세트로부터 생성되고;
    질환 A를 갖지 않는 집단으로부터의 생체액 샘플의 제2 세트는 상기 하나 이상의 홀 어레이 필터 중 하나를 통해 여과되고;
    질량 스펙트럼 데이타의 제2 세트는 상기 하나 이상의 홀 어레이 필터 중 하나를 통한 여과후 생체액 샘플의 제2 세트로부터 생성되고;
    질량 스펙트럼 데이타의 제1 및 제2 세트는 비교되고, 여기서 질량 스펙트럼 데이타의 제1 및 제2 세트에서 상응하는 피크 간의 상이성은 하나 이상의 질환 A 음성 마커를 표시하는 것인,
    여과된 생체액의 질량 스펙트럼 데이타의 측정에 의해 질환을 검출하기 위한 생체액 여과용 장치.
  63. 제62에 있어서, 상기 하나 이상의 홀 어레이 필터가 제1 홀 어레이 필터 및 제2 홀 어레이 필터를 포함하는 것인 장치.
  64. 제63에 있어서, 샘플의 제1 세트가 제1 홀 어레이 필터를 통해 여과되고, 샘플의 제2 세트가 제2 홀 어레이 필터를 통해 여과되는 것인 장치.
  65. 제64에 있어서, 샘플이 각각 별개의 홀 어레이 필터를 통해 여과되는 것인 장치.
  66. 제62에 있어서, 상기 하나 이상의 홀 어레이 필터가 각각 적어도 약 1 내지 10 ㎛의 직경을 갖는 홀을 포함하는 것인 장치.
  67. 제62에 있어서, 상기 하나 이상의 홀 어레이 필터가 각각 적어도 약 6 내지 10 ㎛의 두께를 갖는 홀 어레이 층을 포함하는 것인 장치.
  68. 제62에 있어서, 상기 하나 이상의 홀 어레이 필터가 각각
    홀 어레이를 갖는 제1 구역; 및
    제1 구역의 두께보다 큰 두께를 갖는, 필터 강성의 유지를 위한 제2 구역
    을 포함하는 것인 장치.
  69. 제62에 있어서, 상기 하나 이상의 홀 어레이 필터가 각각 제2 Si 층의 두께보다 큰 두께를 갖는 제1 Si 층, SiO2 층 및 제2 Si 층을 포함하는 것인 장치.
  70. 홀 어레이 필터를 포함하며;
    여기서 생체액 샘플은 상기 홀 어레이 필터를 통해 여과되고;
    질량 스펙트럼 데이타는 여과된 생체액 샘플로부터 생성되는 것인,
    질량 분광측정 방법에서 피크의 확인을 향상시키기 위한 생체액 여과용 장 치.
  71. 제70에 있어서, 상기 홀 어레이 필터가 적어도 약 1 내지 10 ㎛의 직경을 갖는 홀을 포함하는 것인 장치.
  72. 제70에 있어서, 상기 홀 어레이 필터가 적어도 약 6 내지 10 ㎛의 두께를 갖는 홀 어레이 층을 포함하는 것인 장치.
  73. 제70에 있어서,
    상기 홀 어레이 필터가
    홀 어레이를 갖는 제1 구역; 및
    제1 구역의 두께보다 큰 두께를 갖는, 필터 강성의 유지를 위한 제2 구역
    을 포함하는 것인 장치.
  74. 제70에 있어서, 상기 하나 이상의 홀 어레이 필터가 각각 제2 Si 층의 두께보다 큰 두께를 갖는 제1 Si 층, SiO2 층 및 제2 Si 층을 포함하는 것인 장치.
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