CN1231580C - 简易纯化超氧化物歧化酶的提取方法 - Google Patents

简易纯化超氧化物歧化酶的提取方法 Download PDF

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Abstract

对新鲜抗凝血，一升血的初提液加一倍丙酮、粗品析出量少，超氧化物歧化酶(SOD)沉淀不完全，用少量Zn2+、Mg2+离子和调PI、加一倍丙酮沉淀超氧化物歧化酶(SOD)，对沉淀物用弱碱性水溶液溶解。水溶上清液加丙酮使SOD沉淀，25℃以下真空干燥、得淡绿色产品。根据应用需要，本法能制备纯度不同的产品，产率为1.1～1.5g/L红血球。本法避开了热变性、离子交换、超滤浓缩的复杂工艺，生产率比传统方法大幅度提高。本法简单易行、产品活性高，用途广泛，效益显著。

Description

简易纯化超氧化物歧化酶的提取方法
(一)技术领域
本发明涉及简易纯化超氧化物歧化酶(SOD)的提取方法。
(二)背景技术
超氧化物歧化酶(SOD)，美、德、澳等国均有产品。对SOD的化学、药理、临床及其作用机制进行的一系列研究，发现SOD的存在与抗机体衰老及肿瘤发生、自身免疫疾病和防辐射等有关。目前主要用于炎症、类风湿性关节炎、慢性多发性关节炎及放射治疗后的炎症等。在我国多用于化妆品、酒类、食品等。因报道的从动物细胞(红细胞、肝细胞等)制备SOD的传统方法中，用有机溶剂和热变性法去除杂蛋白后，均用丙酮沉淀SOD，因沉淀的量较少，导致产率低。另外，粗品的精制要用离子交换法、洗脱液要用超滤浓缩法，造成生产成本高、操作技术性强，制约了SOD的提取和广泛应用。因此，无论是从红细胞、还是从基因工程细胞制备SOD，急需研究增加产品的回收率、提高活性、降低成本及简单易行的提取方法。
(三)发明内容
本发明的目的是研发一种和简易纯化超氧化物歧化酶的提取新法。
红细胞或者其它生物细胞的SOD粗提液，用少量Zn2+、Mg2+离子和调PI、加一倍冷丙酮沉淀SOD，该沉淀用弱碱性水溶液溶解(37℃水浴)。水溶上清液加二倍冷丙酮沉淀SOD，25℃以下真空干燥、得淡绿色产品。详细操作程序见附图说明。
该方法涉及的设备有：离心机、搅拌器、pH试紙、干燥器、真空泵。试剂有：柠檬酸三钠、氯化钠、乙醇、氯仿、丙酮、硫酸镁、醋酸锌、氢氧化钠、盐酸。
利用本法提取SOD工艺流程短、操作方法简便易行，能获得高活性、高产率的产品，用途广泛。
(四)附图说明
图1：简易纯化超氧化物歧化酶的提取方法流程图
图1中的1是采集新鲜抗凝血(猪或牛的)经离心去血浆。离心，得红细胞；2是用2倍体积0.9％NaCl溶液浮洗红细胞、离心，收集红细胞。再重复2次。红细胞冷冻保存；3是冷的红细胞加等体积去离子水，5℃下搅拌30min成为血水；4是在血水中加入预冷的95％乙醇～氯仿(0.25倍～0.15倍)体积的混合液，搅拌15min、离心，弃沉淀。收集上清液，用稀盐酸调节pH＝5.5～6.0，冷冻至0℃以下；5是在搅拌下缓慢加入等体积预冷的丙酮，再加锌、镁离子混和液(浓度为1mol/L)达终浓度为1％(V/V)，冷冻后离心，倒出上清液(回收)。其沉淀为SOD粗品；6是在SOD粗品中加等体积弱碱性水溶液、搅拌(37℃水浴)，离心，收集上清SOD纯化液，其沉淀再重复处理1次。上清液合并，调pH＝6.0，冷冻保存；7是搅拌冷冻的SOD纯化液(0℃水浴)、缓慢加入2倍量预冷丙酮，冷冻后离心，倒出上清丙酮(回收)，沉淀用表面皿收集；8是沉淀经冷冻千燥，得淡绿色产品。
(五)具体实施方式
实施例：
在洁净消毒的容器中，每100ml 3.8％(V/V)的柠檬酸三钠水溶液加1升刚采集的血液，立即混匀。离心、3500r/min，15min，收集血球。加2倍体积的生理盐水浮洗血球两次，经离心、3000r/min，8min，得血球。取1000ml血球冷冻后，加等体积蒸馏水搅拌1h(冰水浴)。再加冷冻的95％乙醇～氯仿(0.25倍～0.15倍)体积(500+300)ml的混合液，继续搅拌15min、离心，4000r/min，30min，弃沉淀。收集的上清液约1150ml，用稀盐酸调节pH＝5.5～6.0，冷冻至0℃以下，在搅拌下缓慢加入等体积预冷的丙酮，再加锌、镁离子混和液浓度为1mol/L达终浓度为1％(V/V)约23ml，冷冻后离心，3500r/min，15min，倒出上清液(回收丙酮)，其沉淀为SOD粗品。在SOD粗品中加等体积弱碱性水溶液、搅拌(37℃水浴)均匀，离心，3000r/min，8min，收集上清SOD纯化液，其沉淀再重复处理1次。上清液合并，调pH＝5.5～6.0，冷冻保存。搅拌冷冻的SOD纯化液(0℃水浴)、缓慢加入2倍量预冷丙酮，冷冻后离心，倒出上清液(回收丙酮)，沉淀用表面皿收集，经冷冻后，25℃下真空干燥，得淡绿色产品。产率为1.1～1.5g/L红血球，本法简单易行，产品活性高，用途广泛，效益显著。

Claims (1)

1、一种纯化超氧化物歧化酶的提取方法，其特征在于在生产过程中，对新鲜抗凝血的粗提液先调整pH值至超氧化物歧化酶的等电点附近，再用一倍体积的冷丙酮沉淀，然后加浓度为1mol/l锌、镁离子加速与增加超氧化物歧化酶的沉淀，终浓度按照体积百分比应达到1％，再直接用少量弱碱性水溶液溶解超氧化物歧化酶粗品，离心，收集上清液，对其沉淀作重复水溶处理，将该液加两倍体积丙酮，使超氧化物歧化酶沉淀析出，25℃以下真空干燥，获得淡绿色产品。
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