CN1231580C - 简易纯化超氧化物歧化酶的提取方法 - Google Patents
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Abstract
对新鲜抗凝血,一升血的初提液加一倍丙酮、粗品析出量少,超氧化物歧化酶(SOD)沉淀不完全,用少量Zn2+、Mg2+离子和调PI、加一倍丙酮沉淀超氧化物歧化酶(SOD),对沉淀物用弱碱性水溶液溶解。水溶上清液加丙酮使SOD沉淀,25℃以下真空干燥、得淡绿色产品。根据应用需要,本法能制备纯度不同的产品,产率为1.1~1.5g/L红血球。本法避开了热变性、离子交换、超滤浓缩的复杂工艺,生产率比传统方法大幅度提高。本法简单易行、产品活性高,用途广泛,效益显著。
Description
(一)技术领域
本发明涉及简易纯化超氧化物歧化酶(SOD)的提取方法。
(二)背景技术
超氧化物歧化酶(SOD),美、德、澳等国均有产品。对SOD的化学、药理、临床及其作用机制进行的一系列研究,发现SOD的存在与抗机体衰老及肿瘤发生、自身免疫疾病和防辐射等有关。目前主要用于炎症、类风湿性关节炎、慢性多发性关节炎及放射治疗后的炎症等。在我国多用于化妆品、酒类、食品等。因报道的从动物细胞(红细胞、肝细胞等)制备SOD的传统方法中,用有机溶剂和热变性法去除杂蛋白后,均用丙酮沉淀SOD,因沉淀的量较少,导致产率低。另外,粗品的精制要用离子交换法、洗脱液要用超滤浓缩法,造成生产成本高、操作技术性强,制约了SOD的提取和广泛应用。因此,无论是从红细胞、还是从基因工程细胞制备SOD,急需研究增加产品的回收率、提高活性、降低成本及简单易行的提取方法。
(三)发明内容
本发明的目的是研发一种和简易纯化超氧化物歧化酶的提取新法。
红细胞或者其它生物细胞的SOD粗提液,用少量Zn2+、Mg2+离子和调PI、加一倍冷丙酮沉淀SOD,该沉淀用弱碱性水溶液溶解(37℃水浴)。水溶上清液加二倍冷丙酮沉淀SOD,25℃以下真空干燥、得淡绿色产品。详细操作程序见附图说明。
该方法涉及的设备有:离心机、搅拌器、pH试紙、干燥器、真空泵。试剂有:柠檬酸三钠、氯化钠、乙醇、氯仿、丙酮、硫酸镁、醋酸锌、氢氧化钠、盐酸。
利用本法提取SOD工艺流程短、操作方法简便易行,能获得高活性、高产率的产品,用途广泛。
(四)附图说明
图1:简易纯化超氧化物歧化酶的提取方法流程图
图1中的1是采集新鲜抗凝血(猪或牛的)经离心去血浆。离心,得红细胞;2是用2倍体积0.9%NaCl溶液浮洗红细胞、离心,收集红细胞。再重复2次。红细胞冷冻保存;3是冷的红细胞加等体积去离子水,5℃下搅拌30min成为血水;4是在血水中加入预冷的95%乙醇~氯仿(0.25倍~0.15倍)体积的混合液,搅拌15min、离心,弃沉淀。收集上清液,用稀盐酸调节pH=5.5~6.0,冷冻至0℃以下;5是在搅拌下缓慢加入等体积预冷的丙酮,再加锌、镁离子混和液(浓度为1mol/L)达终浓度为1%(V/V),冷冻后离心,倒出上清液(回收)。其沉淀为SOD粗品;6是在SOD粗品中加等体积弱碱性水溶液、搅拌(37℃水浴),离心,收集上清SOD纯化液,其沉淀再重复处理1次。上清液合并,调pH=6.0,冷冻保存;7是搅拌冷冻的SOD纯化液(0℃水浴)、缓慢加入2倍量预冷丙酮,冷冻后离心,倒出上清丙酮(回收),沉淀用表面皿收集;8是沉淀经冷冻千燥,得淡绿色产品。
(五)具体实施方式
实施例:
在洁净消毒的容器中,每100ml 3.8%(V/V)的柠檬酸三钠水溶液加1升刚采集的血液,立即混匀。离心、3500r/min,15min,收集血球。加2倍体积的生理盐水浮洗血球两次,经离心、3000r/min,8min,得血球。取1000ml血球冷冻后,加等体积蒸馏水搅拌1h(冰水浴)。再加冷冻的95%乙醇~氯仿(0.25倍~0.15倍)体积(500+300)ml的混合液,继续搅拌15min、离心,4000r/min,30min,弃沉淀。收集的上清液约1150ml,用稀盐酸调节pH=5.5~6.0,冷冻至0℃以下,在搅拌下缓慢加入等体积预冷的丙酮,再加锌、镁离子混和液浓度为1mol/L达终浓度为1%(V/V)约23ml,冷冻后离心,3500r/min,15min,倒出上清液(回收丙酮),其沉淀为SOD粗品。在SOD粗品中加等体积弱碱性水溶液、搅拌(37℃水浴)均匀,离心,3000r/min,8min,收集上清SOD纯化液,其沉淀再重复处理1次。上清液合并,调pH=5.5~6.0,冷冻保存。搅拌冷冻的SOD纯化液(0℃水浴)、缓慢加入2倍量预冷丙酮,冷冻后离心,倒出上清液(回收丙酮),沉淀用表面皿收集,经冷冻后,25℃下真空干燥,得淡绿色产品。产率为1.1~1.5g/L红血球,本法简单易行,产品活性高,用途广泛,效益显著。
Claims (1)
1、一种纯化超氧化物歧化酶的提取方法,其特征在于在生产过程中,对新鲜抗凝血的粗提液先调整pH值至超氧化物歧化酶的等电点附近,再用一倍体积的冷丙酮沉淀,然后加浓度为1mol/l锌、镁离子加速与增加超氧化物歧化酶的沉淀,终浓度按照体积百分比应达到1%,再直接用少量弱碱性水溶液溶解超氧化物歧化酶粗品,离心,收集上清液,对其沉淀作重复水溶处理,将该液加两倍体积丙酮,使超氧化物歧化酶沉淀析出,25℃以下真空干燥,获得淡绿色产品。
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