JP2799747B2 - 疎水相互作用クロマトグラフィーを用いて不安定な生体物質混合物から加工用化学物質を除去する方法 - Google Patents

疎水相互作用クロマトグラフィーを用いて不安定な生体物質混合物から加工用化学物質を除去する方法

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、疎水相互作用クロマトグラフィーを用いて
不安定な生体物質混合物から加工用化学物質（process
chemicals）を除去する方法に関する。更に特定すれ
ば、本発明は、例えば血漿、その低温沈澱物、および血
漿由来の治療用製剤中のウイルスの不活化に用いられる
化学物質など、脂溶性の加工用化学物質の除去に関す
る。
〔従来の技術〕
血液には、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）、非Ａ非Ｂ肝炎
ウイルス（NANBHV）、サイトメガロウイルス、および免
疫不全症ウイルスなど、またそれ以外にも何種類かの異
なるウイルスが、それぞれ含まれていることがある。血
液製剤を製造する過程において、また、血液およびその
分画を治療に適用する前には、これらのウイルスを不活
化しておくことが強く望まれる。哺乳類の血液およびそ
の分画中のHBVのようなウイルスの不活化には、物理的
方法（加熱、放射線照射など）、および化学的方法（ア
ルデヒド、有機溶媒、洗浄剤など）の両者が用いられて
いる。不活化によって、ウイルスは伝染性と病原性とを
失うのである。
哺乳類、特にヒトの血漿中の、Ｂ型肝炎ウイルス（HB
V）のようなウイルスを不活化するために、多数の試み
がなされている。ある国々で実施されているのは、Ｂ型
肝炎ウイルスの蛋白質部分と架橋形成し、あるいはこの
ウイルスの核酸と作用し合う、ウイルス不活化剤に血漿
を接触されることによって、血漿中のＢ型肝炎ウイルス
を不活化することである。例えば、Ｂ型肝炎ウイルス
は、ホルムアルデヒドのようなアルデヒドとの接触によ
って不活化されることが知られている。
ウイルス不活化の方法としては、界面活性剤を加えた
脂質溶媒を用いる方法〔プリンス（A.M.Prince）、ホロ
ヴィッツ（B.Horowitz）、ブロートマン（B.Brotma
n）、ら：「トウィーン80およびエーテルとの接触によ
るＢ型肝炎ウイルス、および非Ａ非Ｂ肝炎ウイルスのハ
ッチンソン株の不活化（Inactivation of Hepatitis B
and Hutschinson Strain non−A,non−B Hepatitis Vir
uses by Exposure to Tween 80 and Ether）」、ボック
ス・サンギニス（Vox Sanguinis）、第46巻（1984年）3
6〜43ページ；プリンス、ホロヴィッツ、およびブロー
トマン：「トリ（ｎ−ブチル）燐酸塩およびコール酸ナ
トリウムとの接触による肝炎ウイルスおよびHTLV−III
ウイルスの殺菌（Sterilisation of Hepatitis and HTL
V−III Viruses by Exposure to Tri（ｎ−Butyl）Phos
phate and Sodium Cholate）」、ザ・ランセット（The
Lancet）、1986年３月29日号、706〜710ページ〕、およ
び、界面活性剤を加えずに脂質溶媒を用いる方法〔ファ
インストーン（S.M.Feinstone）、ミハリク（K.B.Mihal
ik）、上村ら：「クロロホルムによるＢ型肝炎ウイルス
および非Ａ非Ｂ肝炎ウイルスの不活化（Inactivation o
f Hepatitis B Virus and non−A,non−B Hepatitis by
Chloroform）」、インフェクション・アンド・イミュ
ニティー（Infect.Immun.）、第41巻（1983年）816〜82
1ページ；ブラッドレー（D.W.Bradley）、メイナード
（J.E.Maynard）、ポッパー（H.Popper）ら：「輸血後
の非Ａ非Ｂ肝炎：別個の２剤の生理化学的特性（Posttr
ansfusion non−A,non−B Hepatitis:Physiochemical P
roperties of Two Distinct Agents）」、ジャーナル・
オブ・インフェクシャス・ディジージス（J.Infect.Di
s.）、第148巻（1983年）254〜265ページ〕がある。
その内容全体が参照文献として本明細書に取り入れら
れている、米国特許第4,481,189号明細書および第4,54
0,573号明細書には、有機溶媒と洗浄剤とを対合させて
用いることによって、血漿および血漿産物に含まれ、あ
るいはこれに加えられた肝炎ウイルス、その他の特定ウ
イルスの伝染力が、数桁程度減少するとの記載がある。
そのような対合の例としては、有機溶媒としてトリ−ｎ
−ブチル燐酸塩（TNBP）、および、非イオン性洗浄剤と
してトリトン（TRITON）Ｘ−100があげられる。
適切な温度および接触時間の条件下での溶媒および洗
浄剤を用いた処理は、脂質と結合した外皮蛋白質を有す
るウイルスを効果的に分解し、しかも、傷つきやすい血
漿蛋白質分子の高次構造および生物学的改正に対して及
ぼす影響は無視し得る程である。有機溶媒および洗浄剤
の双方の存在によって、ウイルスを分解し、弱毒化する
上でのそれぞれの独立した作用を強化することができ
る。ウイルスを不活化するために血液に適用される薬剤
としては、他にもメロシアニン、βプロピオラクトン、
およびシスプラチンが存在するが、不活化は外皮の破断
以外の機構によってなされる。
有機溶媒、洗浄剤、その他のウイルス不活化剤のうち
の特定の物質に対して、ヒト、あるいはその他の、その
物質が用いられる生物学的な系（例えば組織培養など）
の耐容性が不充分な場合は、生物学的産物からこれを除
去する必要がある。血液凝固VIII因子のような血漿蛋白
質の精製、あるいは、選択した蛋白質混合物の調製に際
しては、しばしば精製過程によって、ウイルス不活化剤
からの所望の産物の分離が促進される。したがって、所
望の蛋白質を沈澱させ、あるいは、産物に特異的な固定
化リガンドを用いてこれを吸着すれば、残存する薬剤の
大部分を洗い流すことによって、しばしばその濃度を
「耐容可能な」までに減少させることが可能となる。
膜・蛋白質複合体から脂質・洗浄剤ミセルを除去する
のに用いられる別な方法を、血漿産物その他の生物学的
産物からのそれらの除去に応用することもできる。これ
らは、分子の大きさ、浮遊密度、電荷、結合親和力、相
分配、および溶媒分配の差異に基づいて行われる〔ヘレ
ニウス（A.Helenius）およびサイナス（K.Sinous）：
「洗浄剤を用いた膜の溶解（Solubilization of Membra
nes by Detergents）」、ビオキミカ・エト・ビオフィ
ジカ・アフタ（Biochim.Biophys.Acta）、第415巻（197
5年）29〜79ページ〕。
全血漿、血清、低温消耗した（cryodepleted）血漿、
あるいは低温沈澱物を輸血に直接用いる場合は、ウイル
ス殺菌のための有機溶媒および洗浄剤による方法は実施
されない。これらの物質の調製に際しては、分画、精
製、あるいは浄化の段階が含まれないので、上記の方法
による不活化剤除去を行う適当な機会がないからであ
る。更に、製剤の組成および生物学的活性が実質的に損
なわれないようにする必要性からも、効果的な除去方法
が強く要請される。
ウイルス滅菌済みの血漿、および低温沈澱物の調製の
際しては、処理後に血漿を濾過して、不安定な蛋白質お
よび生物学的活性を失うことなく無菌性を維持するとい
う困難が別に存在する。
このように、ウイルス滅菌の手法が全血漿その他の対
しては適用されないという理由で、輸血の際のウイルス
感染の危険性は、Ｂ型肝炎については0.05％、非Ａ非Ｂ
肝炎については３％も存在するものと推定されている。
生体物質混合物には、合成を刺激し、これに含まれる
ウイルスを不活化し、かつ、混合物中に存在する所望の
成分を安定化し、あるいは精製するために、しばしば外
部から化学物質を添加することがある。所望の成分の構
造および機能には影響を及ぼすことなく、これらの化合
物質を除去することが望ましい。例えば、細胞培養にお
いては、所望するある種の生物学的産物の合成は、培養
液にホルボールエステルを加えることによって誘導、あ
るいは促進することができる。例えば、メゼレイン（me
zerein）は、培養白血球によるγインターフェロン生産
の誘導に〔イップ（Y.H.Yip）、パン（R.H.L.Pang）、
オッペンハイム（J.O.Oppenheim）、ナシュバー（M.S.N
ashbar）、ヘンリクセン（D.Henriksen）、ツェレベッ
キー−エックハルト（T.Zerebeckyj−Eckhardt）および
ヴィルチェク（J.Vilcek）：「ジテルペンエステルによ
るヒトγインターフェロン生産の刺激（Stimulation of
Human Gamma Interferon Production）」、インフェク
ション・アンド・イミュニティー、第39巻（1981年）13
1〜139ページ〕、あるいは、腫瘍壊死因子の生産細胞に
よるその分泌の促進に〔ウィリアムスン（B.D.Williams
on）、カーズウェル（E.A.Carswell）、ルビン（B.Y.Ru
bin）、プレンダガスト（J.S.Prendergast）、およびオ
ールド（H.J.Old）：「ヒトＢ細胞の細胞系によって生
産されるヒト腫瘍壊死因子：ヒトインターフェロンと相
乗的細胞障害性相互作用（Human Tumor Neerosis Facto
r Produced by Human Bcells Lines:Synergistic Cytot
oxic Interaction with Human Interferon）」、プロシ
ーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンセズ・オブ・ザ・ユナイテド・ステーツ・オブ
・アメリカ（Proc.Nat.Acad.Sci.USA）、第80巻（1983
年）5,397〜5,401ページ〕用いられることがある。
ホルボールエステルには発癌性があるので、リンホカ
イン製剤からは、これをヒトに用いる前にこれらの化合
物を除去しなければならない。従来、ホルボールエステ
ルは、沈澱、クロマトグラフィー、あるいは分子排除を
用いた処理法によって除去されてきた〔ルビン、アンダ
ーソン（S.L.Anderson）、サリバン（S.A.Sullivan）、
ウィリアムスン、カーズウェル、オールド（L.J.Ol
d）、「Luk II細胞株由来のヒト腫瘍壊死因子の精製と
特性記述（Purification and Characterization of a H
uman Tumor Necrosis Factor from the Luk II Cell Li
ne）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンセズ・オブ・ザ・ユナイテド・ス
テーツ・オブ・アメリカ・第82巻（1985年）6,637〜6,6
41ページ〕。
例えば大豆油のような植物油を用いた抽出によって、
生体物質の複雑な混合物からTNBPその他の脂溶性の加工
用化学物質を除去する方法が、1986年３月31日付け米国
特許出願第846,374号に記載されている。洗浄剤は、こ
の方法によってはほとんど除去されない。
長鎖アルコール、あるいはハロゲン化エステルを用い
た抽出によって、TNBP、洗浄剤その他の脂溶性化学物質
を除去する同様な方法は、1987年12月30日に出願して係
属中の米国特許出願第07/139,502号出願書に記載されて
いる。この方法の短所は、高価または有害な化学物質が
必要なこと、また、何らかの残存抽出剤を耐容可能な濃
度にまで下げるためには、必要な段階を追加しなかけれ
ばならないことである。できればTNPBおよび洗浄剤を効
果的に除去し、このような問題を起こさないような代替
え方法が望ましい。
疎水相互作用クロマトグラフィー（HIC）は、生化学
者が会得している分子分離手法の中でも一般的に用いら
れる方法である。HICの原理に関する説明は、ヒェルテ
ン（S.Hjerten）による「疎水相互作用クロマトグラフ
ィーの一般的様相のいくつか（Some General Aspects o
f Hydrophobic Interaction Chromatography）」〔ジャ
ーナル・オブ・クロマトグラフィー（J.Chromatograph
y）、第87巻（1973年）325〜331ページ〕においてなさ
れている。簡単に述べると、不活性マトリックスに結合
したアルキル鎖のような脂質様の部分を用い、相互の親
和力を利用して、類似した疎水性領域を含む分子を水溶
液から分画するのである。アルキル鎖の長さは、炭素数
で２〜24の範囲にわたり、直鎖または側鎖を有し、か
つ、フェニル環のような他の疎水基を含み、またはこれ
を末端に有していてもよい。鎖の長さが増大すると、媒
質の疎水性も増大することになる。
実施に際しては、疎水的相互作用の強さは、溶媒のイ
オン強度、pH、および極性によっても影響される。例え
ば、溶媒中に高濃度（すなわち４モルの）硫酸アンモニ
ウムが存在すると、樹脂と溶質蛋白質の疎水性領域との
間の疎水的相互作用が、したがってまた結合が強まる。
吸収の後、よりイオン強度が低く、カオトロピックイオ
ンが含まれる緩衝液、または、それとともにエチレング
リコールや洗浄剤のような極性を低下させる添加剤を用
いて、蛋白質を樹脂から溶出させることができる。厳密
に疎水性によって反応する樹脂に加え、疎水性とイオン
相互作用との組み合わせを介して作用するアミノヘキシ
ル・セファローズ（Sepharose）〔ニュージャージー州
ピスカタウェー所在エル・ケー・ビー／ファルマシア
（LKB/Pharmacia）社製〕のような材料もあり、これ
は、活性を有する官能基としての６員アルキル鎖の末端
でアミノ基１個を取り込むのである。これらの方法を用
いて精製されている数多くの血漿蛋白質の中には、アル
ブミン、トランスフェリン、チログロブリン、乳酸デヒ
ドロゲナーゼ、βリポ蛋白質、凝固因子、免疫グロブリ
ンなどがある。
HIC媒質の調整の際に疎水基と結合させられる不活性
マトリックスは、アガロースのような多糖類、あるい
は、シリカその他の高分子で構成することができる。ア
ガロースを基本とする媒質は比較的軟らかいので、典型
的なクロマトグラフィー系においては流速を遅くする必
要があり、分離過程が長引くことになる。シリカを基本
とする媒質は圧縮性がなく、典型的には高圧クロマトグ
ラフィーに用いられるが、比較的速い流速で低圧系にお
いて用いることもできる。
HICは、一般的には、生体物質の複雑な混合液から蛋
白質、ホルモン、その他の生体分子を単離するのに用い
られるが、膜を分解するのには洗浄剤が用いられ、ある
種の生物学的調製物からその洗浄剤を除去するにも利用
されている。例えば、ラット脳のホモジネートからトリ
トンＸ−100、蛋白質、塩類、その他の干渉化合物を除
去して、組織抽出物中のイノシトールの測定を容易にす
ることを目的として、イオン交換カラムやカートリッジ
に充填された炭素数18のHIC媒質〔セプパック（Sep−Pa
k）、マサチューセッツ州ミルフォード所在ウォーター
ズ・アソシエーツ（Watera Associates）社製〕が用い
られている〔ローセン（S.E.Laursen）、ナル（H.R.Knu
ll）、ベルクナップ（J.K.Belknap）：「イノシトール
測定用試料の作成：洗浄剤除去におけるセプパックC18
の利用（Sample Preparation for Inositol Measuremen
t:Sep−Pak C18 Use in Detergent Removal）」、アナ
リティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）、
第153巻（1986年）387〜390ページ〕。
〔発明が解決しようとする課題〕
全く意外なことに、生物学的調製物からの蛋白質、ホ
ルモン、その他の物質の単離用に装填する溶媒中の塩類
の濃度が高いというような、厳しい条件において実施さ
れるのが通例であるHICが、穏やかな、すなわち、生体
液中の蛋白質、塩類、その他の生理学的成分が生体濃度
であるという条件下においても、夾雑ウイルスの不活化
を目的として加えられた有機溶媒および洗浄剤の抽出に
用いることができることを見出した。
更に、疎水性媒質による変性、不活化、あるいは吸着
を特別に受けやすい蛋白質である、凝固因子その他の酵
素のような、血漿、低温沈澱物などに含まれるある種の
成分は、本発明によりウイルス不活化剤を除去した後で
も高濃度で、かつ高い生物活性を保って存在することを
見出したのも意外であった。
また、長鎖アルコール、特に２−オクタノール、また
は、ハロゲン化エーテル、特にイソフルラン、あるいは
その両者の組み合わせを生体材料の純化に用いて、ウイ
ルス不活化剤を抽出する場合、HICの適用によって、こ
れらの化合物の残存量を痕跡程度にまで減少されること
ができるという知見も驚くべきことである。
本発明の目的は、所望の成分の特性を損なうことな
く、ウイルス不活化溶媒及び／又は洗浄剤、及び／又
は、ホルボールエステルのようなその他の加工用化学物
質を生体物質から除去する方法の提供にある。
〔課題を解決するための手段〕
上記およびその他の目的は本発明によって達成される
のであって、それによれば、例えばウイルス不活化溶
媒、またはある種の洗浄剤、またはホルボールエステル
など、脂溶性の加工用化学物質を含有する、例えば不安
定な生体物質などの生体物質を、炭素数６〜24の樹脂を
充填剤とする疎水相互作用クロマトグラフィー（HIC）
のカラムを通過させることによって、上記の脂溶性の加
工用化学物質が上記の生体物質から除去される。この疎
水的相互作用クロマトグラフィーは、シリカマトリック
スの支持剤に結合させたオクタデシル（炭素数18）鎖の
ものを用いて行うのが望ましい。本発明による方法は、
血漿、低温沈澱物、あるいは抗血友病因子濃縮物のよう
な複雑な生体物質混合物から、凝固因子活性の損失が僅
少またはが皆無であり、かつ蛋白質組成の変化が最小限
であるようにして、トリ−ｎ−ブチル燐酸塩（TNBP）お
よび「トリトンＸ系」洗浄剤を除去するのに特に有用で
ある。
本発明による方法においては、生体物質の活性は実質
的に保持される。更に、カラム通過中に吸着される生体
物質は僅少または皆無である。
本発明は、ウイルスに対する弱毒化溶媒が添加された
生体物質から、そのような溶媒を除去する方法に関す
る。また、本発明は、溶媒とともに、あるいはそれを用
いずに、ウイルスに対するある種の弱毒化洗浄剤が添加
された生体物質から、該洗浄剤を除去する方法にも関す
る。
更に、本発明は、生体物質からその他の殺ウイルス剤
を除去する方法にも関する。
また、本発明は、安定化剤として生体物質に添加され
た加工用化学物質を除去する方法にも関する。
また、本発明は、生体物質の精製の際にも用いられた
加工用化学物質を除去する方法にも関する。
また、本発明は、天然の脂質、および、その他の内因
性または、例えば「トリトンＸ−45」およびTNBPのよう
な、外因性の脂溶性化合物を生体物質から除去し、しか
もその除去の結果、該物質の特性、例えば濾過可能性、
安定性などが改善され、あるいは、ウイルス殺菌用試薬
の効果が高められるような方法にも関する。
したがって、本発明は、外因性または内因性の脂溶性
化合物を含有する生体物質から該脂溶性化合物を除去す
ることによって、生物体液の濾過可能性または安定性を
改善する方法に関し、しかもこの方法は、生物学的活性
を有し、かつ脂溶性化合物を含有する生体物質を、炭素
数６〜24の樹脂を含む疎水的相互作用クロマトグラフィ
ーのカラムを通過させる段階から成り、その生物学的活
性が実質的に保持され、かつ、該カラム通過中に吸着さ
れる生体物質が僅少または皆無である。
また、本発明は、生体物質から、リンホカイン誘導性
のホルボールエステル（すなわち、リンホカイン合成の
誘導物質）のような化学的誘導物質を除去する方法にも
関する。
さらに、本発明は、血液細胞に添加された加工用薬剤
を、細胞を破裂させることなく除去する方法にも関す
る。
血液は、固形物（細胞、すなわち赤血球、白血球、お
よび血小板）と液体（血漿）とから成っている。これら
の細胞にはヘモグロビンのような潜在的価値の高い物質
が含まれており、これらの細胞を誘導して、インターフ
ェロン、成長因子、その他の生体応答調節物質のよう
な、潜在的価値の高い他の物質を生成させることができ
る。血漿は、主として水、塩類、脂質、および蛋白質で
構成されている。この蛋白質は、フィブリノーゲン、血
清グロブリン、および血清アルブミンとよばれる群に分
類される。ヒトの血漿中に見出される典型的な抗体（免
疫グロブリン）としては、流行性肝炎、Ｈ型インフルエ
ンザなどに対する抗体がある。
血液中に見出される細胞としては、赤血球、各種白血
球、および血小板がある。細胞型の分画には、典型的に
は遠心分離が利用されるが、ヒドロキシエチル澱粉のよ
な連銭形成促進剤の添加、免疫学的特異性に基づく分離
など、他の形態の分画降法が必要な場合もある。
ヒトの血漿中に見出される蛋白質としては、プレアル
ブミン、レチノール結合蛋白質、アルブミン、αグロブ
リン、βグロブリン、γグロブリン（免疫血清グロブリ
ン）、血液凝固蛋白質〔アンチトロンビンIII、プロト
ロンビン、プラスミノーゲン、抗血友病因子（凝固VIII
因子）、フィブリン安定化因子（凝固XIII因子）、フィ
ブリノーゲン〕、免疫グロブリン〔免疫グロブリン（I
g）Ｇ、Ａ、Ｍ、Ｄ、およびＥ〕、および補体成分があ
る。かつて記載されたことのある血漿蛋白質は、現在10
0種類を超えている。より詳細なリストはプトナム（F.
W.Putnam）編、「ザ・プラズマ・プロティン（The Plas
ma Protein）」〔ニューヨーク所在アカデミック・プレ
ス（Academic Press）社発行（1975年）〕に見ることが
できる。
血球分画に見出される蛋白質としては、ヘモグロビ
ン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、炭水化物お
よび蛋白質の代謝に関わる酵素、血小板由来増殖因子な
どがある。更に、インターフェロンや成長因子のような
他の蛋白質の生合成が誘導されることもある。
誘導可能な白血球蛋白質の詳細なリストは、スタンリ
ー・コーエン（Stanley Cohen）著、エドガー・ピック
（Edgar Pink）、およびオッペンハイム（J.J.Oppenhei
m）、「バイオロジー・オブ・ザ・リンフォカインズ（B
iology of the Lymphokines）」〔アカデミック・プレ
ス社発行（1979年）〕に見ることができる。
血漿の分別には一般に、低温でエタノール、エーテ
ル、およびポリエチレングリコールのような有機溶媒を
用い、かつ、pH値を制御して、１種ないしそれ以上の血
漿蛋白質を含有する特定の分画を沈澱させる必要があ
る。次いで、得られた上清自体を沈澱させることを繰り
返して、所望の程度の分画を最終的に達成することがで
きる。最近では、クロマトグラフィー法に基づいて分離
が行われる。血液分画に関しては、「カーク・オスマー
ズ・エンサイクロペディア・オブ・ケミカル・テクノロ
ジー（Kirk−Othmer's Encyclopedia of Chemical Tech
nology」第３版〔インターサイエンス・パブリッシャー
ズ（Interscience Publisher）社発行、第４巻25〜62ペ
ージ〕に優れた概説ぎ掲載されている。
低温エタノール分画による主要成分は下記のとおりで
ある。
上記分画体系は、これを更に分画するための根拠とし
て役立つ。例えば第II分画および第III分画を更に分画
して、免疫血清グロブリン（ISG）を得ることができ
る。
この他に、凍結血漿を用い、これを解凍してAHF（抗
血友病因子）およびフィブロネクチン含有の低温沈澱物
および低温上清とする方法が用いられる分画体系もあ
る。次いで、低温沈澱物をフィブロネクチンと抗血友病
因子とに分画するのである。
本発明の方法は、血球、血漿、その血液分画、および
上述の血液蛋白質、低温沈澱物、低温消耗した血清など
の生体物質に適用することができ、より一般的には、例
えば正常細胞、癌細胞、培地中で増殖させた癌細胞から
の滲出液、培地中で増殖させた正常細胞からの滲出液、
ハイブリドーマ細胞、遺伝子スプライシングによる産
物、植物細胞濃縮物、植物細胞懸濁液、動物細胞の抽出
物、植物細胞の抽出物、および微生物のような、生体の
細胞および体液に適用可能である。
本発明に用いるための有機長鎖アルコールの例として
は、ヘキサノール、ヘプタノール、１−オクタノール、
２−オクタノール、１−ノナノール、１−デカノール、
およびウンデカノールがあるが、これらに限られるわけ
ではない。
本発明に用いるためのハロゲン化（例えば、弗素、塩
素、沃素、または臭素を含有する）炭化水素の例として
は、1,2,2−トリフルオロトリクロロエタン、「エスラ
ン（ETHRANE）」（エンフルラン、すなわち２−クロロ
−1,1,2−トリフルオロエチルジフルオロメチルエーテ
ル）、「フォラン（FORANE）」（イソフルオラン、すな
わち１−クロロ−2,2,2−トリフルオロエチルジフルオ
ロメチルエーテル）があるが、これらに限られるわけで
はない。本発明に好適なハロゲン化炭化水素には、弗
素、塩素、およびエーテルが含まれる。
本発明を用いて除去される典型的な溶媒は、適用時の
温度では液相であって、抽出を受ける水溶液と混和せ
ず、適用時の条件下で蛋白質および細胞を変性させず、
容易に除去され、爆発性がなく、かつ、適用時の条件下
で生体溶液中に残留する量では無害な液体である。
本発明の方法を用いて除去されるジアルキル燐酸また
はトリアルキル燐酸、洗浄剤、および界面活性剤は、米
国特許第4,540,573号明細書、および米国特許第4,481,1
89号明細書に記載されている。
本発明によるHICに付される、処理された生体物質中
に存在する溶媒および洗浄剤の濃度範囲は下記の通りで
ある。
溶 媒:1,000〜20,000ppm 洗浄剤:1,000〜10,000ppm とりわけ、本発明は血漿、低温沈澱物、血漿分画など
のような蛋白質含有組成物の製造を特に志向したもので
あって、該組成物には伝染性ウイルスは実質的に存在せ
ず、しかも、酵素学的または生物学的活性を有する（未
変性の）蛋白質が相当量保持され、また、加工用化学物
質が除去されているため、得られた組成物には、生理学
的に許容可能な濃度を超えるそのような加工用化学物質
は存在しない。
本発明に用いられる生物体液としては、血漿、血漿分
画、血液分別による沈澱、および、血液分画による上清
がある。また、全血球、赤血球、白血球、血小板、血小
板に富む血漿、血小板に乏しい血漿などの濃縮物、およ
び、顆粒球、単球、またはリンパ球、あるいは、インタ
ーフェロン、腫瘍壊死因子（TNF）その他の免疫調節因
子またはリンホカイン生成が可能なその他の細胞などの
濃縮物、あるいは、そのような濃縮物または懸濁液から
分離された培養液などの処理も企図されている。
本発明によれば、蛋白質含有組成物、特に全血漿、あ
るいは全血清の製造が企図されており、それらは、エイ
ズウイルス（HIVI）、Ｂ型肝炎ウイルス、および非Ａ非
Ｂ肝炎ウイルスのようなウイルスに対する（中和）対数
が６を上回る程度にまでウイルスを不活化し、生物活性
が特に高い蛋白質に対する機能的活性を少なくとも45
％、好ましくは最低75％、より好ましくは最低95％、そ
して最も好ましくは98〜100％保持し、かつ、生理学的
に許容可能な濃度を超える量の脂溶性の加工用化学物質
を含むことがない。
凝固因子活性は、その本来の水準の60％を、好ましく
は75〜85％を、最も好ましくは90〜98％を上回る活性が
保持される。
本発明による（ウイルスが滅菌された）全血漿、血
清、低温沈澱物、あるいは低温析出後の血漿は、これを
例えばヒトを始めとする哺乳類などの罹患動物に直接輸
注することができる。そのようにせずに、本発明による
（ウイルスが滅菌された）全血漿、血清、低温析出後の
血漿、あるいは低温沈澱物を分画して、精製血漿蛋白質
誘導体を製造することもできる（このような誘導体は、
これを例えばヒトなどの患者に直接輸注することができ
る）。
また、本発明による全血漿あるいは血清は、細胞培養
の際に、また品質管理用試薬として、これを用いること
もできる。
更に、血液に由来しないもの、例えば、正常な（非癌
性の）細胞または癌細胞、培地で増殖させた癌または正
常細胞からの滲出液、遺伝子スプライシングによるハイ
ブリドーマおよび産物、植物細胞の濃縮物または懸濁
液、動植物組織抽出物、あるいは微生物などを、本発明
における生物体液として用いることもできる。
本発明の方法は、材料および条件が蛋白質の吸着およ
び分離が最小限となり、かつ、記載の脂溶性の加工用化
学物質の除去が最大限となるように用いられるという点
が、他のHICの応用と異なる。
本発明に用いられる樹脂としては、粒子径が55〜105
ミクロンで、孔径が120オングストロームのウォーター
ズ・アソシエーツ社製バルク（Bulk）Ｃ−18充填剤が好
適である。活性を有する官能基は、シリカマトリックス
に結合させた炭素数18の直鎖である。マトリックスの未
結合部位は、ジメチルシランで遮蔽しておく。
この材料のトリトンＸ−100なる洗浄剤との結合能力
は、乾燥樹脂１グルムあたり洗浄剤が約160mg（0.25ミ
リモル）である。ボンダパック（Bondapack）Ｃ−18ま
たはメガボンド（Megabond）Ｃ−18のような、同社の他
のＣ−18系樹脂、あるいは他のメーカーのこれらと同等
の樹脂によっても、ほぼ同じ能力がもたらされる。シリ
カマトリックスの使用によって、より圧縮性の高いクロ
マトグラフィー媒質を用いて達成されるよりも高い流速
および圧力で、抽出過程を進行させことができる。典型
的には、マガロースを基剤とする樹脂における毎時25〜
50ml/cm2に対して、毎時125〜175ml/cm2ないしそれ以上
という流速でカラムを通すことができる。
実用上は、樹脂はステンレス鋼またはガラス製のクロ
マトグラフィーカラムに充填するのが好ましい。カラム
の容積は、物質中の「トリトン」の濃度が１％（重量／
容積）である場合は、加える物質の容積の少なくとも８
分の１であるのが好ましい。樹脂は、イソプロパノー
ル、次いで水を用いた洗浄によって活性化される。エタ
ノールおよびアセトニトリルは、樹脂の活性化および再
生に適した有機相である。装填に先立ち、カラムを食塩
水または適当な緩衝液を用いて平衡状態にしておくのが
好ましい。
この方法に対する温度範囲は４〜37℃であるのが好ま
しく、20〜25℃であるのが最も好適である。
カラムに吸着させる生体物資は15重量％を超えてはな
らず、５〜10重量％以下であるのが好ましい。カラムへ
の吸着が２〜５重量％以下であるのが最も好適である。
ウイルス不活化剤の吸収後は、水、および、15％から
100％へと次第に濃度を上昇させたエタノールまたはイ
ソプロパノール、次いで再び水を用いてカラムを洗浄・
再生するのが好ましい。エタノールを用いる場合、好ま
しくは、この後更にカラム容積一杯の100％イソプロパ
ノールを用いるべきである。
本発明によって処理される物質としては、例えば、TN
BPおよび「トリトンＸ−100」を含有する、血漿、低温
沈澱物、AHF濃縮物、免疫グロブリン、およびプロトン
ビン複合体がある。ワクチン、凝固因子、血清など、他
の複合蛋白質混合物も、ここに記載の方法で処理するこ
とができる。
〔実施例〕
次に、本発明を制約するものではない下記の実施例に
ついて本発明を説明する。
実施例1:ウイルスが滅菌してある血漿の調製 新鮮な凍結血漿６単位を融解させ、溜めておく。トリ
（ｎ−ブチル）燐酸（TNBP）およびトリトンＸ−100を
１％（重量／容積）の濃度になるように加え、溶液を穏
やかに撹拌しつつ、37℃で４時間インキュベートする。
インキュベーション後、必要であればこの材料に10,000
xGで遠心分離を施して、清澄化する。次いで、予めカラ
ム容量の数倍のイソプロパノール、次いで滅菌食塩水で
洗っておいたバルクＣ−18媒体（マサチューセッツ州ミ
ルフォード所在ウォーターズ・アソシエーツ社製）60g
を含むカラムに血漿を通す。カラム中の流速は毎時約15
0ml/cm2とし、作業温度は23〜25℃とする。血漿の処理
後、食塩水、次いで15％から95％へと漸増する濃度のエ
タノール、更に100％のイソプロパノールを用いた洗浄
によって、カラムを再生する。下記の第１表に、TNBPお
よびトリトンＸ−100の除去効率、および、記載どおり
に処理した血漿のバッチ８個における凝固Ｖ因子および
凝固VIII因子の回収率を示す。活性化部分トロンボプラ
スチン時間（APTT）は、血餅形成因子（clotting facto
r）活性の包括的な尺度である。第１表の結果は、血餅
形成因子活性の80〜95％が保持されていることを示して
いる。第２表は、蛋白質分画、酵素、およびその他の成
分の数に関しては、溜めておいた血漿には記載の処理の
前後でわずかながら差が存在することを示している。測
定した成分すべての量は、概して正常な生理的範囲内に
ある。しかしながら、脂質の含量は低く、その結果、濾
過可能性が増大している。
実施例2:いくつかの産物試料からのTNBPおよび「トリト
ン」の除去 各産物をTNBP（血漿および低温産物については１％、
その他の産物については0.3％）および１％トリトンＸ
−100とともに最低３時間インキュベートして、不活化
する。必要であれば10,000xGで遠心分離を施して、この
材料を清澄化し、その後カラムに加える。カラムには、
試料を加えるに先立ってカラム容量の数倍の有機相（イ
ソプロパノール、アセトニトリル、あるいはエタノール
のいずれか）を用いて活性化し、次いで、数カラム容量
の蒸留水を用いて洗っておいたバルクＣ−18充填剤（ウ
ォーター・アソシエーツ社製）12gを詰めておく。下記
第３表に、回収率をカラム段階の歩留まりとして示す。
本明細書および請求項は、説明を目的として記載され
たものであって、制約を目的とするものではないこと、
また、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、
各種の変更および変形を行い得ることは明らかである。

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】生物学的活性を有し、かつ脂溶性の加工用
    化学物質を含有する生体物質を、炭素数６〜24の樹脂を
    充填した疎水相互作用クロマトグラフィーカラムを通過
    させることを含み、該生物学的活性が実質的に保持さ
    れ、かつ、該カラム通過中に吸着される生体物質が僅少
    または皆無である、該生体物質から該脂溶性化学物質を
    除去する方法。
  2. 【請求項２】外因性または内因性の脂溶性化合物を含有
    する生体物質から該脂溶性化合物を除去することによっ
    て、生物体液の濾過可能性または安定性を改善する方法
    であった、生物学的活性を有し、かつ該脂溶性化合物を
    含有する該生体物質を、炭素数６〜24の樹脂を充填した
    疎水相互作用クロマトグラフィーカラムを通過させるこ
    とを含み、該生物学的活性が実質的に保持され、かつ、
    該カラム通過中に吸着される生体物質が僅少または皆無
    である方法。
  3. 【請求項３】樹脂が、活性のある官能基およびその支持
    部分を含み、該活性官能基はオクタデシル鎖で構成さ
    れ、該支持部分はシリカマトリックスで構成される請求
    項（１）又は（２）に記載の化学物質除去の方法。
  4. 【請求項４】シリカマトリックスが、ジメチルシランで
    ブロックされた未結合部位を有する請求項（２）に記載
    の化学物質除去の方法。
  5. 【請求項５】樹脂の活性化を、イソプロパノール、エタ
    ノール、およびアセトニトリルから成る群から選択され
    た有機溶媒を用いて行う請求項（１）又は（２）に記載
    の化学物質除去の方法。
  6. 【請求項６】カラムの操作を、毎時125〜175ml/cm2の流
    速で行う請求項（１）又は（２）に記載の化学物質除去
    の方法。
  7. 【請求項７】４〜37℃の温度で実施する請求項（１）又
    は（２）に記載の化学物質除去の方法。
  8. 【請求項８】脂溶性の加工用化学物質が、有機溶媒、洗
    浄剤、長鎖アルコール、およびハロゲン化エーテルから
    成る群から選択される請求項（１）に記載の化学物質除
    去の方法。
  9. 【請求項９】脂溶性の加工用化学物質がリンホカイン合
    成誘導物質の１種である請求項（１）に記載の化学物質
    除去の方法。
  10. 【請求項１０】生体物質を、全血漿、血清、低温消耗し
    た血漿、および低温沈澱物から成る群から選択する請求
    項（１）に記載の化学物質除去の方法。
  11. 【請求項１１】生体物質が細胞である請求項（１）に記
    載の化学物質除去の方法。
  12. 【請求項１２】生体物質を、血漿、血清、低温沈澱物、
    低温消耗した血清、第Ｉ分画、第II分画、第III分画、
    第IV−１分画、第IV−４分画、第Ｖ分画、第VI分画、フ
    ィブロネクチン、抗血友病因子、プレアルブミン、レチ
    ノール結合蛋白質、アルブミン、αグロブリン、βグロ
    ブリン、γグロブリン、抗トロンビンIII、プロトロン
    ビン、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、凝固XIII
    因子、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＡ、免疫グロ
    ブリンＭ、免疫グロブリンＤならびにＥ、プラスミンイ
    ンヒビター、プロトロンビン、トロンビン、抗トロンビ
    ン、凝固Ｖ因子、凝固VII因子、凝固VIII因子、凝固IX
    因子、凝固Ｘ因子、正常細胞、癌細胞、培地中で増殖さ
    せた癌細胞の滲出液、培地中で増殖させた正常細胞の滲
    出液、ハイブリドーマ細胞、遺伝子スプライシング産
    物、植物細胞濃縮物、植物細胞懸濁液、動物組織抽出
    物、植物組織抽出物、および、微生物から成る群から選
    択する請求項（１）に記載の化学物質除去の方法。
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