JPH0372045B2 - - Google Patents

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JPH0372045B2
JPH0372045B2 JP57501331A JP50133182A JPH0372045B2 JP H0372045 B2 JPH0372045 B2 JP H0372045B2 JP 57501331 A JP57501331 A JP 57501331A JP 50133182 A JP50133182 A JP 50133182A JP H0372045 B2 JPH0372045 B2 JP H0372045B2
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virus
hepatitis
viruses
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Uiriamu Aaru Toomasu
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Baxter International Inc
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Publication date
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Publication of JPH0372045B2 publication Critical patent/JPH0372045B2/ja
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Description

請求の範囲 １ 感染性ビールスを含有する疑いのある、血液
凝固酵素としてプロトロンビン、因子，因子
，因子またはそれらの混合物を含む血液凝固
酵素組成物を乾燥状態において該ビールスが不活
性化されるまで加熱し、感染性の形の該ビールス
および変形された形の該血液凝固酵素を実質上含
まない該組成物を得ることを特徴とする血液凝固
酵素組成物の製造方法。 ２ ビールスは肝炎Ａ，Ｂまたは非Ａ非Ｂビール
スである請求の範囲第１項の方法。 ３ 組成物は約５重量％までの水を含有する請求
の範囲第２項の方法。 ４ 組成物は約１重量％までの水を含有する請求
の範囲第３項の方法。 ５ 血液凝固酵素がプロトロンビンである請求の
範囲第２項の方法。 ６ 血液凝固酵素が因子である請求の範囲第２
項の方法。 ７ 血液凝固酵素が因子である請求の範囲第２
項の方法。 ８ 血液凝固酵素が因子である請求の範囲第２
項の方法。 ９ 血液凝固酵素が活性化した因子である請求
の範囲第２項の方法。 １０ 血液凝固酵素が活性化した因子である請
求の範囲第２項の方法。 １１ 血液凝固酵素が活性化した因子である請
求の範囲第２項の方法。 １２ 組成物は実質上因子からなる請求の範囲
第２項の方法。 １３ 組成物は実質上トロンビンを含まない請求
の範囲第２項の方法。 １４ 組成物は実質上プラスミノーゲンを含まな
い請求の範囲第２項の方法。 １５ 組成物は実質上フイブリノーゲンを含まな
い請求の範囲第２項の方法。 １６ 組成物は実質上抗血友病因子を含まない請
求の範囲第２項の方法。 １７ 組成物は実質上アルブミンを含まない請求
の範囲第２項の方法。 １８ 組成物は実質上因子を含まない請求の
範囲第２項の方法。 １９ 組成物は実質上抗トロンビンを含まない
請求の範囲第２項の方法。 ２０ 組成物は実質上プラスミンを含まない請求
の範囲第２項の方法。 ２１ 組成物は実質上ガンマグロブリンを含まな
い請求の範囲第２項の方法。 ２２ 組成物が約１ないし３重量％のアルブミン
を含む請求の範囲第２項の方法。 ２３ 組成物はアミノ酸の安定化量を含む請求の
範囲第２項の方法。 ２４ アミノ酸がグリシンまたはプロリンである
請求の範囲第２３項の方法。 ２５ 組成物は非還元性単糖類、オリゴ糖類また
は糖アルコールの安定化量を含む請求の範囲第２
項の方法。 ２６ 組成物は糖アルコールを含む請求の範囲第
２５項の方法。 ２７ 糖アルコールがマンニトールまたはソルビ
トールである請求の範囲第２６項の方法。 ２８ 組成物は1.0モル／以下のアミノ酸およ
び20w／ｗ％以下の非還元性単糖類、オリゴ糖類
または糖アルコールを含有する請求の範囲第２項
の方法。 ２９ 組成物は約6.0ないし8.0のPHを持つ請求の
範囲第２項の方法。 ３０ 組成物は活性化したプロトロンビン複合体
である請求の範囲第２項の方法。 ３１ 組成物は実質上未活性化プロトロンビン複
合体である請求の範囲第２項の方法。 ３２ 組成物は因子を含有し、そして実質上他
の血液凝固因子を含まない請求の範囲第２項の方
法。 ３３ 組成物は単位／mlで表わして以下の血液凝
固酵素、すなわちプロトロンビン約１ないし10；
総因子約73ないし190，活性化された因子約
８ないし80；総因子約15ないし112；因子前
駆体約０ないし30；総因子約１ないし30；活性
化因子約１ないし20；およびトロンビン約
0.003以下を含有する請求の範囲第２項の方法。 ３４ 組成物は組成物が加熱される前に細胞微生
物を除去するため無菌ロ過される請求の範囲第２
項の方法。 ３５ 抗バクテリア剤が組成物へ添加される請求
の範囲第２項の方法。 ３６ 抗バクテリア剤がアジドである請求の範囲
第３５項の方法。 ３７ 組成物は約40ないし80℃で加熱される請求
の範囲第２項の方法。 ３８ 組成物は約50ないし70℃で加熱される請求
の範囲第３７項の方法。 ３９ 組成物は約５ないし200時間加熱される請
求の範囲第３７項の方法。 ４０ 組成物は実質上活性化および未活性化因子
よりなる請求の範囲第２項の方法。 本発明の分野 本発明はもはや患者および医療従事者に対し潜
在的に有害でない組成物を得るため、血液凝固因
子酵素、特にプロトロンビンおよび凝固因子，
，を含む組成物中のビールスの不活性化方法
に関する。特に、本発明はプロトロンビンおよび
因子，およびの混合物である公知の治療用
血漿分画であるプロトロンビン複合体中のビール
スの不活性化に関する。 本発明の背景 こゝで使用する「ビールスの不活性化」または
「感染性ビールスの実質的不存在」なる言葉は、
以後に記載する方法によつて処理した製品中の生
物学的に感染性のビールスの残存力価が、問題の
ビールスに対する複数の普通の動物宿主への該製
品の治療量の注入が統計学的に有意な宿主頭数に
おいて統計学的に有意な感染の臨床的または血清
学的証拠（ｐ＜0.1）をつくらないほど低いこと
を意味する。このことは、代替物がもつと汚染さ
れた物質である場合には低ビールス力価を有する
組成物は治療上の有用性を有するので、該製品が
滅菌され、または完全にビールスを含まないこと
を要するものではない。 ハーゲマン因子、プロトロンビンおよび因子
XI，，およびはすべて血漿酵素原である。
これらはフイブリノーゲンのフイブリン凝塊への
変換を頂点に達せさせる酵素媒介反応の複雑な流
れに参加する。それらのこの流れへの参加は酵素
原を活性タンパク分解酵素へ変換する酵素原の一
次的または変態的構造の変化によつて開始され
る。この変化は酵素原の「活性化」と呼ばれる。
簡略化のため、「血液凝固酵素」とは、酵素的に
機能しない酵素原と、活性化によつて得られたそ
れらの活性型の両方を含む。同様に、こゝで使用
する因子の名称への言及は、これら酵素の両方の
形を含むものと解すべきであり、例えば因子は
活性化された、および活性化されない因子と、
それらの混合物を含むものである。時には因子に
対して略号「Ｆ」が使用されるであろう。 各血液凝固酵素はその独特の特異性を有し、凝
血メカニズムにおいて確立された役目を果す。例
えば、活性化された因子はカルシウムと、タン
パク助因子である因子の存在において因子を
加水分解し、活性化された因子を生成する。ト
ロンビン（活性化されたプロトロンビン）はタン
パク基質であるフイブリノーゲンを分裂し、フイ
ブリンモノマーを生成し、それは結局凝塊を生成
する。 スチユワートプローワー因子とも呼ばれる因子
は分子量87000のアルフアグロブリンである。
プロトロンビン（因子）は分子量約68000を有
する糖タンパク質である。ハーゲマン因子（因子
XII）も糖タンパク質であるが、しかしその分子量
は約82000である。 これら因子すべては血液凝固における酵素原お
よび凝固酵素としてそれらの生物学的役割におい
て共通であり、この役割は抗トロンビン，アル
ブミン，抗血友病因子（因子），ガンマグロブ
リンまたはフイブリノーゲンのような他の血漿タ
ンパクは持つていない。プラスミノーゲンはその
活性化が凝塊の生成に参加せず、その代りに存在
する凝塊中のフイブリンを分解するのであるか
ら、こゝで使用するような意味で血液凝固酵素原
ではない。 血液凝固酵素は個々の血漿供出の大プールから
公知の方法で商業的に製造される。それらの製造
に使用されるすべての血漿単位は、この目的のた
めに許可されたテストシステムを使用して肝炎Ｂ
表面抗原の存在についてテストされる。しかしな
がらこれら免疫学的テストはすべての肝炎Ｂの潜
在的感染性ユニツトを検出するのに十分なほど感
受性ではない。さらに、肝炎ビールスは分画操作
中に濃縮されることがあり得る。このため多量の
血漿プール中に含まれるかも知れない検出不能量
のビールスは、それが数倍濃縮されるとき有意に
感染性となることがある。 肝炎Ａおよび肝炎Ｂについての特異的診断テス
トの発達は、最初二つのどちらにも明らかに免疫
学的に関係がない第３のタイプのビールス肝炎を
同定することを可能にした。この伝播病原非Ａ非
Ｂ肝炎は病原体へさらすことによつてチンパンジ
ーへこの病気を伝播することによつて確認され
た。２種以上の非Ａ非Ｂ肝炎ビールスを指す証拠
のいくつかの列がある。これらは明白な急性非Ａ
非Ｂ肝炎の順次発病、疫学および潜伏期間を含む
臨床上の徴候の多様性をもつた症例を含む。 特に血液凝固酵素の場合には、製品の注入によ
る肝炎伝播は血漿源を肝炎Ｂについてスクリーニ
ングした場合さえも問題として残る。Roberts
et al.，“Thrombos.Diathes.Haemorr.〔Stuttg.〕
33：610−616〔1975〕参照。さらに肝炎に責任の
あるビールス以外の偶発ビールスが製品を汚染し
得ることが考えられる。このようにこれら製剤に
発見し得る肝炎を含むすべてのビールスを不活性
化する方法に対する必要性が存在する。 液体血漿または分画を加熱することにより血漿
または血漿分画溶液中の肝炎ビールスを不活性化
するばらばらの報告が存在する。Murray は
The New York Academy of Medicine 31
（５）：341−358（1955）において、60℃において
10時間加熱することによつて黄だん発生活性を不
活性化することを報告している。この方法はアル
ブミンおよび血漿タンパク分画（PPF）溶液中
の肝炎を不活性化するために長く使用されてい
る。 ベルギー特許第844566号は肝炎ビールスを殺す
ため液体血漿または血清を50ないし60℃において
１／２ないし４時間加熱し、次に血漿または血清を
分画して免疫グロブリンＧを得ることを記載す
る。 西ドイツ公開特許第2916711号は溶液へアミノ
酸および単糖類、オリゴ糖類、または糖アルコー
ルを添加することにより、水溶液中のプラスミノ
ーゲン、プロトロンビン、抗トロンビン、因子
およびを熱に対して安定化することを記載す
る。溶液は肝炎ビールスを不活性化するため30な
いし100℃において１分ないし48時間加熱された。 以上の技術のすべては不利である。ビールスを
不活性化することができるが、ある種の治療的タ
ンパクは、それらが水溶液中で熱的に不安定なた
め、同様に不活性化される。このようにそのよう
なタンパク組成物の感染性の減少は該タンパクの
生物学的活性の損失によつて達成される。 乾燥フイブリノーゲンまたはアルブミン製剤中
のイヌ肝炎ビールスを該製剤を60℃において10時
間加熱することによつて不活性化することが公知
である。Rosenberg et al.XII International
Congress on Blood Transfusion，Abstracts
p.473−474（1969）参照。 本発明の概要 今や血液凝固酵素またはこれら酵素の混合物を
含む組成物中に存在するビールス、特に肝炎ビー
ルスは、該ビールスが不活性化されるまで該酵素
を乾燥状態において加熱することによつて該酵素
の活性に影響することなく不活性化し得ることが
発見された。 上記および請求の範囲において、「血液凝固酵
素」とは、プロトロンビン、因子，因子およ
び因子を指し、前に述べたようにことわりのな
い限りそれら因子の酵素原型および活性型の両方
を含む趣旨である。得られる新規な組成物は非感
染性ビールスを含有し、そして感染性ビールスお
よび変性した血液凝固酵素を実質上含まない。好
ましい組成物は感染性肝炎ビールスを実質上含ま
ない。不活性化はタンパクとあらかじめ定めたビ
ールス力価を含む乾燥生物学的指示薬の使用によ
つてモニターされる。 【図面の簡単な説明】 図面は一方ではSindbisビールスとプロトロン
ビン複合体との関係、他方では温度と時間との関
係のプロツトである。乾燥状態では、凝固因子の
不活性化を表わす点線不活性化線と、ビールスの
不活性化を表わす実線との比較によつて示される
ように、ビールス不活性化速度は凝固因子のそれ
を遥かに上廻る。特に図面はプロトロンビン複合
体中のSindbisビールスの集団は実質上付随する
酵素活性の損失なしに31時間以内に効果的に不活
性化できることを示している。 【発明の詳細な説明】 本発明に従つて処理される凝固因子酵素は任意
の既知方法で血漿から製造することができる。そ
のような方法の好ましい例が米国特許第3560475
号に記載されている。他の方法は当業者には明ら
かであろう。 該酵素は正常ヒト血漿中のそれらの濃度の約３
ないし50倍に精製され、そして正常ヒト血漿中の
タンパクの量の約１％以下を含有する。精製の程
度は重要でない。しかしながらタンパク溶液の限
られた量しか投与できず、そしてこの量は凝固因
子の望む量を含んでいないから、精製の少ない製
品は比較的低い治療上の有用性しか持たないであ
ろう。他方、より高価な精製は所望の治療上の有
用性を得るには不必要に高価であろう。通常製品
はプラスミノーゲン、プラスミン、ガンマグロブ
リン、抗血友病因子、アルブミンおよびフイブリ
ノーゲンを実質上含まないであろう。最適には、
酵素は出発血漿からの還元性単糖類、特にグルコ
ースを実質上含まない程度に十分に純粋である。 酵素組成物はアミノ酸、無害性タンパク、非還
元性単糖類、オリゴ糖類および糖アルコールのよ
うな１種または２種以上の通常の安定剤を含んで
もよい。代表的な安定剤はアルブミン、グリシ
ン、プロリン、マンニトールおよびソルビトール
を含む。もし組成物が治療的に使用されるもので
あれば、生理学的に許容し得る安定剤を生理学的
に許容し得る量で使用しなければならない。一般
に安定剤は約0.5ないし３重量％の範囲の量で存
在する。安定剤は凍結乾燥した組成物の溶解とそ
してそのように生成した溶液の透明性を促進す
る。しかしながら処理すべき組成物は安定剤を含
まないことが好ましく、乾燥状態では酵素単独で
顕著な安定性を示すので、安定剤は不必要であ
る。このように組成物はアミノ酸を1.0モル／，
好ましくは約0.75モル／以下、および糖または
糖アルコール20w／ｗ％以下、好ましくは糖また
は糖アルコール約５％以下含有することができ
る。 こゝに記載する方法によつて処理することがで
きる組成物のPHは約6.0ないし8.0であり、そして
好ましくは約PH6.5ないし7.5である。凝固酵素プ
ロトロンビン、因子，およびは実質上他の
ものを含まないようにさらに精製することができ
る。その言葉がこゝで使用されるように、酵素組
成物が実質上他の酵素を含まないという時は、混
存する酵素が組成物全体質量の約２％以下、また
は主体酵素の重量の約10％以下の量で通常存在す
る。因子は公知方法により、例えばヘパリンア
ガロース上のアフイニテイークロマトグラフイー
により、因子の濃度が因子またはトロンビン
の濃度の25ないし50倍になるように単離体のまゝ
で普通製造される。そのような因子製剤は通常
因子を約20ないし120単位／ml含有する。プロ
トロンビンは公知方法で除去することができる。
プロトロンビンを実質上含まないそのような組成
物をこの方法に使用することができる。種々の血
液凝固酵素を分離するための他の技術はよく知ら
れている。 ２種の広く使用されている治療用製品であるプ
ロトロンビン複合体および活性化プロトロンビン
複合体の中には血液凝固酵素の４種が見出され
る。プロトロンビン複合体は通常プロトロンビン
および因子，およびをml当り約以下の単位
範囲，すなわちそれぞれ１〜10，37〜190，15〜
142および１〜30，好ましくは3.6〜8.9，37〜
122，20〜81および１〜25で含有する。 活性化プロトロンビンは公知の方法で製造し得
る。例えば、アイブルらの米国特許第4160025号
参照。そのような組成物は実質上活性化されない
凝固酵素を含まないが、しかし通常の状況では酵
素原との混合物中に活性化酵素が見出される。
こゝに記載する方法によつて未活性化および活性
化凝固酵素が保存されるばかりでなく、酵素原が
熱処理によつて活性化されないことは驚くべきこ
とである。 活性化プロトロンビン複合体（PCC）は一般
に以下の範囲の活性（活性化因子の活性は後記号
“ａ”によつて表わされる）を含む。 【表】 【表】 定
明らかに単位／mlで表わしたこれら因子の各自
の範囲は、製品の意図する用途によつて変えるこ
とのできる活性化PCCの復元容積に依存するで
あろう。上に与えた範囲は患者へ直接投与のため
希釈または復元した活性化PCCについてのもの
である。ことわりのない限り、因子ａの範囲は
以下に記載する凝固法で測定されたものである。 好ましい組成物は、単位／mlでＦ−約20ない
し112単位と、Ｆ−前駆体０ないし約30単位と
を含む。 他の好ましい組成物は、単位／mlでＦ−約37
ないし190単位と、Ｆ−ａ約25ないし80単位を
含む。 さらに好ましい組成物は、単位／mlでＦ−約
１ないし13単位と、Ｆ−ａ約４ないし10単位と
を含む。 同様に有用な製品は因子ａ，ａおよびａ
を含み、非活性化部分的トロンボプラスチン時間
約27ないし70秒を持つている。 第，，，，ａ，前駆体，因子お
よびトロンビンの測定のための分析方法は一般に
慣用のものである。これら定量のすべては、こと
わりのない限りいくつかの共通特徴を有してい
る。第１に各定量法は試験サンプルの２系列の系
統的希釈液と、そして１単位／mlの与えられた力
価を有する標準液を調製することを含む。試験サ
ンプル中の単位／mlによる濃度は、２系列を平均
し、標準液について得られた結果をそれらの以前
の系統的希釈によつて確立されたそれらのそれぞ
れの％濃度に対してプロツトし、該プロツトから
希釈した試験サンプル中の％濃度を読み取り、調
製した系統的希釈について試験サンプル濃度を補
正し、試験サンプル％濃度を平均し、そして平均
値を100で割つて定量した因子の単位／mlに到達
することによつて計算することができる。 第２に、ことわりのない限りすべての定量は37
℃で実施され、そしてすべての試薬はその温度に
あらかじめ加温される。 第３に、単位／mlによる定量標準液は凍結乾燥
したヒト正常血漿，凍結正常ヒト血漿または正常
凝固時間因子活性を代表することを意図した国際
標準液（BOBまたはWHO）を基準とする。凍結
乾燥した正常ヒト血漿は、新たに採血した正常ヒ
ト血漿の三つの別々のプールに対して標準化され
る。各プールは、経口避姙薬、抗炎症剤または関
節炎投薬を服用していない10人の絶食した正常供
血者からの静脈血を採血することによつて調整さ
れる。供血者はまたプロトロンビン時間11ないし
15秒、活性化部分的トロンボプラスチン時間30な
いし45秒、およびフイブリノーゲンレベル200な
いし400mg／dlを有していなければならない。血
液は3.8％クエン酸ナトリウム中に血液９容に対
し抗凝固剤１容の割合で採取し、混合し、
1000RCFで15分間遠心し、その後各血漿上清の
等量をプールする。血漿は１時間以内に定量す
る。以下で定量した各全因子についての３プール
の平均力価を勝手に１単位／mlと設定する。 凍結正常ヒト血漿は、プールを１mlづつプラス
チツクバイアルへ分配し、そして−70℃で凍結す
ることを除き、前記に新たに採血した３プールの
うち任意の一つと同じ方法で調製される。凍結し
たプールは60日以内に使用される。各凍結プール
は各全因子を１単位／ml含むものと考えられる。
以後上記２方法のいずれかにより確立された標準
単位を含有する血漿は、参照または標準血漿と呼
ばれる。 第４に、いくつかの定量において使用される因
子欠乏血漿は、特定の因子が先天的に欠乏してい
る供血者、すなわち正常プール血漿中に存在する
ものの約５％より少ない因子力価を有する供給者
から得た血漿である。 第５に、Ｆ−定量は総および全駆体Ｆ−を
検出する。このことは総Ｆ−のための定量は活
性および不活性Ｆ−活性の合計値を測定し、他
方Ｆ−前駆体定量は実質上活性物質を含まない
ことを意味する。従つてＦ−ａは総Ｆ−から
前駆体活性を差し引くことによつて推算すること
ができる。残りの分析方法、すなわち第，，
および本発明の組成物にとつてその存在は必須
ではないXIおよびXIIのための分析方法は、すべて
活性および酵素原因子の合計を測定することに注
意すべきである。しかしながら簡単にするためこ
れら定量について「総」なる語は使用しない。他
方およびＦ−定量法と対照的に、トロンビン、
ａおよびａ法は活性因子を直接定量する。 トロンビンは以下の方法によつて測定される。
NIHトロンビン標準ロツトＢ−３に対して標準
化されたウシトロンビン標準を通常の食塩水中
0.001，0.002，0.003，0.005および0.010μ／mlに希
釈する。この希釈した標準液2.0mlをフイブリノ
ーゲン基質0.5mlへ加える。混合物を28℃でイン
キユベートする。反応試験管を２分毎にチエツク
する。最初のフイブリンストランドの出現をもつ
て終点とする。試験サンプルは希釈なしで同じよ
うに定量する。このように復元した試験サンプル
の2.0mlをフイブリノーゲン基質0.5mlへ加え、そ
して終点生成を２分毎に観察する。試験サンプル
の凝固時間をトロンビン標準液の凝固時間と比較
する。計算は一般に前に記載したように実施す
る。 第ａ因子はYin et al，“J.Lab.Clin.Med.”
81：298（1973）の方法の変法で測定する。参照標
準を含むすべての試薬はシグマ、ケミカル、カン
パニーから市販されている。試験サンプルはYin
et al が使用した緩衝液中に１：８，１：16お
よび１：32（サンプルの部対緩衝液の部）または
その希釈度0.01単位／mlにおける第ａ標準液の
凝固時間より長くなるまでの高希釈度へ系統的に
２本宛希釈する。 標準第ａ因子は最初同じ緩衝液中へ１：４に
希釈し、そして２本宛１：64へ系統的に希釈す
る。標準Ｆ−ａの１：４希釈液をＦ−a1単
位／mlと定める。標準Ｆ−ａはこゝに記載する
定量において１：２希釈度において平均凝固時間
14秒を生ずるものと定義される。各最終希釈度
0.1mlをフイブロメーターカツプ中へピペツトし、
次に凝固を開始させるため0.025CaCl20.1mlおよ
びウシ血漿−ウサギセフアリン溶液0.2mlをピペ
ツトする。各試験管についての凝固時間を測定
し、そしてＦ−ａ活性を前に記載したように計
算する。 Ｆ−ａは前記の凝固法の代替法として色原体
法によつても測定することができる。定量結果を
「色原体法」であると断わりがない限り、Ｆ−
ａは凝固法によつて測定したものと思われたい。
色原体法は殆どKosow，“Thrombosis
Research”１：565−573（1976）に記載されてい
る。これは405nmにおけるその光吸収によつて検
出し得る色原体を得るように、Ｆ−ａによつて
特異的に加水分解された合成基質を使用する。こ
の基質Ｓ−2222はOrtho Diagnostics，Inc.より
市販されている。標準Ｆ−ａはSigma
Chemical Cc.から得られるが、使用前NaCl 1.33
重量％を含む0.05Mトリス緩衝液PH8.3中へ１：
４に希釈される。Ｆ−a0.5単位／mlを含む１：
４希釈標準液は定量において405nmにおける平均
光学密度0.260を示さなければならない。この定
量の実施において、サンプルおよび希釈した標準
液はトリス緩衝液中に系統的に希釈される。各希
釈液の0.4mlをガラス試験管へピペツトし、0.5M
CaCl2 および0.1M NaCl を含む溶液0.075ml
および１分後NaCl 0.9重量％を含む0.05Mトリス
緩衝液PH8.3中のＳ−2222溶液0.5mlをピペツトす
る。50％酢酸0.1mlを３分後に加えて反応を停止
し、そして吸収を緩衝液ブランクに対し405nmに
おいて読み取る。計算は一般に前に記載したよう
に実施する。 第因子は“Thromb.et Diath”２：24
（1958）記載のBachman et al.法の変法で測定す
るが、ザイツロ過した雄ウシ血漿の代りに第因
子欠乏血漿を使用し、フイブロメーターを終点検
出のために使用し、そして希釈液はProctor et
al“Am.J.Clin.Path.”36（３）：214（1961）記載
の塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム含有
ベロナール緩衝液である。ラツセルマムシ毒液お
よびセフアリンは、それぞれバロース、ウエルカ
ム、アンド、カンパニーおよびトラベノール、ラ
ボラトリーズ社のハイランド、テレビジヨンから
得た。計算は一般に前に記載したように実施し
た。 プロトロンビン（第因子）は以下の手法で定
量される。Tocantins，Ed.，Blood
Coaguration，Hemorrhage and Thrombosis，
vol.1，pp−144−148（1964）中のPechet法によつ
て調整した第因子欠乏血漿0.1mlを８本の試験
管へそれぞれ分配する。100％参照血漿は参照血
漿をイミダゾール1.72w／ｖ％緩衝液PH7.0中へ
１：10に希釈することによつて調整される。この
参照血漿は次に同じ緩衝液中に１：５，１：10，
１：20および１：40にさらに希釈される。各希釈
液の0.1ml部分標品２本宛第因子欠乏基質を含
む試験中へピペツトされる。試験管の各２到セツ
ト中へ参照血漿をピペツトした直後、CaCl2で凍
結乾燥したウサギ脳トロンボプラスチン0.2mlを
プラスチツク先端ピペツトを使用して各試験管へ
加える。15秒混合した後、各試験管を光源の上で
２秒に１回前後に傾け、そして最後のゲル生成ま
での経過時間を記録する。以上の操作を、イミダ
ゾール緩衝液中の１：100希釈液を１：５，１：
10，１：20および１：40の希釈液をつくる前につ
くることを除いて、試験サンプルについて操り返
す。データは前に記載したのと同じ方法で処理さ
れる。 Ｆ−は前に引用したProctor et alの方法と
実質的に同じである以下の方法によつて測定され
る。活性化PCC試験サンプルの最小の１：20前
希釈は正常な食塩水中に調製される。参照血漿は
前希釈されない。試験サンプルおよび参照血漿の
バルビタール緩衝食塩水中へ２本宛の１：５，
１：10，１：20および１：40希釈液は、Proctor
et alに記載の部分的トロンボプラスチン−カオ
リン0.1mlおよび正常Ｆ−活性の５％以下を有
するＦ−先天的欠乏血漿0.1mlを既に収容して
いる試験管へピペツトする。３分後、0.03M
CaCl2 0.1ml試験管内容物と混合し、30秒間イン
キユベートし、そして次に各試験管を光源の前で
最終ゲル生成であるまで２秒に１回以下傾ける。
CaCl2添加からゲル生成までの時間を記録し、そ
してデータを一般に前に記載したように処理す
る。 Ｆ−前駆体は、最初の試験サンプルの最小
１：20希釈を普通の食塩水でなく、Ｆ−欠乏基
質中につくることを除いて、総Ｆ−についての
前記方法に同じ方法で定量する。 第因子は、凝固点をClotek器具で測定し、
そして希釈液が前に引用したProctor et alが記
載した希釈液であることを除き、Bang et al.，
Ed.，Thrombosis and Bleeding Disorders，
Theory and Methods，pp−197−198（1971）記
載のEsnouf et al法によつて測定される。 第ａ因子はサンプルを最初ベンズアミジン−
セフアローズアフイニテイ−マトリツクスで吸着
することによつて定量される。ベンズアミジン−
セフアローズアフイニテイ−マトリツクスは、例
えばSchmer，“Z.Physiol.Chem.”353：810−814
（1972）に記載されている良く知られたアフイニ
テイーゲルである。吸着されない分画を0.1M
NaHCO3 PH7.8で洗うことによりマトリツクス
から除去する。次に0.5M NaClおよび0.3Mベン
ズアミジンHClを含む同じ緩衝液がＦ−ａを含
有する分画を除去するために使用される。ａに
ついて後者の分画の定量は、Ｆ−に使用した同
じ定量法および参照により実施される。 第XI因子の定量は、CaCl2溶液が0.03Mであり、
トラベノール、ラボラトリーズ社のハイランド、
デイビジヨンから販売されているセフアリン−カ
オリンを使用し、そして凝固点をClotek装置を
使用することを除いて、Rappaport et al.，J.
Lab.Clin.Med.57：771（1961）に記載されてい
る。 第XII因子は実質上第XI因子と同じ方法で測定さ
れる。しかしながらこの場合第XII因子欠乏血漿を
使用し、そして定量はプラスチツク物品との接触
で実施される。 本発明の方法によつて処理された活性化PCC
は全体として因子欠乏または阻害血漿の凝固時間
を修正するそれらの能力により、そして特に個々
の凝固因子の量もしくは活性、非活性化部分的ト
ロンボプラスチン時間で示される全体の凝血促進
活性、トロンビン活性および処置した患者に因子
に対する免疫レスポンスを誘発する物質の実質
上不含有、および最適には最終製品中の抗トロン
ビン約３単位／mlとによつて特徴付けられる。
活性化および非活性化PCCの両方ともヘパリン
を約１単位／ml以上，通常約１ないし３単位／ml
を含むことができる。 酵素組成物およびこゝにさらに記載する生物学
的指示薬は乾燥状態で熱処理されなければならな
い。このことは液体中性溶媒が存在しようがしま
いが、それらは水約５重量％以下を含むべきであ
ることを意味する。組成物は粉末、ケーキまたは
他の適当な形でよい。通常の条件下での組成物の
凍結乾燥は一般に約3.5％以下の水の重量％を持
つ製品を製造するが、約１重量％以下の水を有す
る組成物を製造するように十分に凍結乾燥するこ
とが好ましい。 血漿凝固酵素はガラスバイアルのような最終容
器中へ通常の慣用包装の後に、すなわち無菌ロ過
した（細胞状生物のため）水溶液として容器中に
小分けし、凍結乾燥し、そしてシールした後に最
適に処理される。最終的に包装したシールした容
器を熱処理することが好ましい。そのような容器
中での不活性化は以下に記載する生物学的指示薬
の使用によつて実施される。 熱処理すべき酵素の上には何ら特別のふん囲気
を供給することは必要でない。空気はそれが何ら
特別の包装工程の必要をなくすから最も経済的で
ある。しかしながら最善の結果は残存水分および
酸素を減らすため乾燥窒素で駆逐後真空または酸
素不含ふん囲気をもつて可視的に達成される。 実質上感染性ビールスを含まない組成物の製造
のため、または単にビールス力価を減らすための
最適条件は処理される血液凝固製品の性状による
であろう。例えば、酵素およびビールスの比較不
活性化率に影響し得る製品変動は、組成物中の塩
の濃度およびタイプ、ビールス汚染の程度、他の
タンパクに対する酵素の相対的割合、組成物の保
有水含量、乾燥前の因子溶液のPH，および単糖
類、抗酸化剤等のような添加剤の溶液中の存在を
含む。処理すべき製品は生物学的ソースから誘導
されるのでしばしば大きく変わるので、製品特性
に適するように不活性化条件を変えることが好ま
しい。酵素活性を保存しながらビールス不活性化
を最適化するため最も好都合に変えられる条件は
熱処理の時間と温度である。しかしながらこれは
プロセスを助けるための製品特性を改変する可能
性を排除するものではない。例えば酵素溶液は予
備的精製、例えばある汚染源ビールスを該ビール
スに特異的な不溶性抗体へ吸着し、それによりビ
ールスを不活性化するのに必要な熱処理の程度を
減らすように処理することができる。 不活性化温度はビールスおよび酵素の不活性化
の率に正比例する。そのため温度が高ければ高い
ほど、ビールスおよび凝固因子酵素の両方の不活
性化は速くなる。この方法はビールスおよび酵素
の比較不活性化率は先分れし、そのため凝固因子
酵素を実質上不活性化することなくビールスを不
活性化することができる現象に依存する。このよ
うに最適温度はそれら率が最も離れる点、すなわ
ち時間に対するビールス不活性化のプロツトの傾
斜と、時間に対する酵素不活性化のプロツトの傾
斜との差が最大である点として関数的に表わすこ
とができる。しかしながら正味の熱処理時間を減
らすように最大差の点よりも高い温度を使用する
ことが望ましいであろう。通常約40ないし80℃が
満足であり、約50ないし60℃が好ましく、そして
大部分の酵素組成物に対して約60℃が最適であ
る。 熱は適当な加熱装置、たとえば普通のオーブ
ン、赤外線照射、砂浴または水浴によつて供給さ
れる。水浴が好ましい。 上の温度におけるビールス不活性化のために必
要な時間は一般に約５ないし200時間、通常約10
ないし40時間である。凝固酵素の均一ロツトに対
しては標準化した時間を使用することができる
が、不活性化が完全かどうかを決定するためビー
ルス生物活性について組成物を定量することが好
ましい。定量すべきビールスは組成物を汚染する
疑いのあるもの、例えば肝炎Ｂまたは非Ａ非Ｂ肝
炎でよく、またはビールスは生物学的指示薬とし
て使用するためあらかじめ選定されたものでよ
い。生物学的指示薬は無生命部分が製品を真似
し、一方生きている生物は期待される汚染物を真
似するように選択される１種の製品代用品として
作用する。 これまで生物学的指示薬は滅菌剤抵抗性細胞生
物またはそのような生物の胞子であつた。これら
既知の生物学的指示薬は滅菌剤、例えば水蒸気に
透過性の包装に収容されたある種の細菌、例えば
バチルスの耐熱性胞子を含浸した乾燥した吸水性
片として最も普通に入手可能であつた。こゝで提
供される生物学的指示薬は血液タンパクと、血清
肝炎感染の候補でない感染性ビールスのあらかじ
め定められた力価を含む。これはビールス肝炎に
対する病因剤を使用することができるが、しかし
それらは感染した供血者からの血漿の注入によつ
て伝播し得るものであつてはならないことを意味
する。例えば肝炎Ｂは血清肝炎病原である。理想
的にはビールスは全く肝炎感染の候補ではないで
あろう。 血液タンパクはビールス不活性化処理を受ける
製品中のタンパクの効果を真似する。このように
指示薬タンパクは同一性，割合または起源の種に
関して処理される製品中のタンパクと同じでも、
異なつてもよい。このように普通に商業的に入手
し得る血漿タンパク、例えば免疫グロブリン、ア
ルブミン、抗血友病因子、抗トロンビン、凝固
酵素およびそれらの混合物を使用することができ
る。該タンパクは実質上アルブミンおよびフイブ
リノーゲンを含まないことが望ましい。AHFを
使用する場合、組成物はタンパクｇ当り約35国際
単位以上約200単位までを含有するであろう。好
ましい具体例において指示薬タンパクは処理すべ
き製品中のそれと実質的に同一である。実際好適
な指示薬は処理すべき各血漿タンパクロツトの部
分標本からつくることができる。タンパクは好ま
しくはヒトタンパクであるが、ウシまたはブタ起
源を使用することができる。 ビールスは好ましくは通常ヒトに感染性ではな
く、それにより混入コストを低くする。しかしな
がら研究室作業者の安全のため、そして処理した
製品の完全性を確実にするため、該ビールスはヒ
トに注入した場合肝炎感染に責任ある候補または
既知病原ではないことが重要である。そ合ような
ビールスは有害であり、そしてそれらに血漿分画
製造環境への導入は避けなければならない。ビー
ルスの濃度はタンパク約0.01ないし１ｇ中約３な
いし80log10プラツク形成単位の範囲であろう。 指示薬は通常ビールスをタンパクの水溶液中に
懸濁し、ガラスまたはプラスチツク製の10または
30ml容器へ充填し、凍結乾燥し、そして真空また
は窒素のような不活性ガス下シールする。組成物
は復元時水溶性である。 それらは指示薬を処理した組成物のビールスを
不活性化するために使用した同じ条件へさらし、
次に生物学的指示薬中に不活性化されないで残つ
ているかも知れないビールスを定量する。生物学
的指示薬は製品バイアル中に入れ、熱処理するこ
とが好ましく、これは不活性化条件が実質上同じ
であることが確実になることを助ける。 生物学的指示薬に使用するのに適したビールス
は細菌、植物および動物ビールスを含む。動物ビ
ールスは好ましくは安全性理由のため通常ヒトに
感染性ではない。またビールスは理想的には生物
学的指示薬に使用したタンパクの提供者種に対し
ても感染性であつてはならない。この理由はその
ようなタンパクが提供者の以前の感染またはワク
チン投与の結果として該ビールスに対する抗体で
汚染されることがあり、そして該抗体がビールス
培養を妨害することがあるからである。こゝでこ
の目的のための最良の生物学的指示薬は高度に熱
に安定なビールスを使用する。この点に関しバク
テリオフアージとして知られる細菌ビールスがす
ぐれた選択である。最後に、該ビールスは容易に
培養できなければならない。大部分の植物および
動物ビールスはこの好ましい基準に合致するが、
しかしバクテリオフアージはもつとも容易に、安
価に培養される。 例示的ビールスは脳心筋炎ビールス（EMC），
マウス脳せき髄炎ビールス、サル腸内ビールス、
およびウシ腸内ビールスのようなピコルナビール
ス；シンドビス、セスリキ森林ビールス、西部ウ
マ脳炎ビールス、および黄熱病ビールスを含むト
ガビールス；ウラス家鶏肉腫ビールスのようなレ
トロビールス；ニユーキヤツスル病ビールスのよ
うなパラミキソビールス；ポリオマビールスおよ
びサルビールス40を含むパポビールス；ヘルペス
シンプレツクス，偽狂犬病ビールスおよびマレツ
クス病ビールスのようなヘルペスビールス；感染
性イヌ肝炎およびアデノビールスのようなアデノ
ビールス族のメンバー；およびR17，ラダム、
T1，T2，T4，T7およびパイX174のようなバク
テリオフアージを含む。ビールスの混合物も使用
し得る。 処理した製品または生物学的指示薬中のビール
スを測定するための適当な方法は全く慣用的であ
り、当業者には自明である。そのような一方法は
プラツク形成試験である。この方法においては、
テストサンプルの生物学的希釈剤中の希釈液が生
きている感受性細胞の固定層へ接触させれら、ビ
ールスが細胞へ吸収される時間を許容し、細胞を
成育媒地ゲル上へ重ね、そして細胞培養物の生存
を他の点で最適化する他の条件が設定される。感
染し細胞内で増殖するビールスは寒天上層によつ
て偏在化される。ビールスは一次的に感染した細
胞から隣接した細胞へ広がり、プラツクと呼ばれ
る細胞退化の円形区域または焦点を形成する。こ
れらの焦点は生体染料中性レツドで単層を染色す
ることによつて普通可視化される。感染した細胞
の焦点は生体染料を集めることがなく、従つて着
色した背景に対して透明な区域として現われる。
従つてプラツクの数はテストサンプルの感染性の
測定である。 使用し得る他の定量法は感染性宿主に対する感
染性のための生体内テストを含む。そのような方
法は良く知られている。肝炎Ｂはこれまでのビー
ルスを試験管内で培養することが不可能であるか
らこの方法で定量しなければならない。通常の操
作は肝炎Ｂ抗体陰性チンパンジーまたはマルモセ
ツトに試験すべきサンプルを接種し、数週間イン
キユベートし、そして次に肝炎Ｂ感染の臨床的お
よび血清学的証拠を観察する。 処理したサンプル中の正常なビールス抗原に対
する免疫アツセイはもしも抗原が検出不能である
ときだけ合理的最終結果が得られ、そして前述の
ように免疫アツセイは十分に感受性である。もし
両方の要件を満たせば、この処理はビールス外皮
部位を完全に変性するのに十分に厳しかつたこと
になる。このような処理はビールスを生物学的に
不活性に、従つて非感染性にしたものと考えるこ
とは一般に安全である。しかしながら抗原を変性
するのに要する条件は多くの場合ビールスを生物
学的に不活性化するのに必要な条件よりも遥かに
厳しいであろうから、ビールスの不活性化が起つ
た点をこのような定量の使用によつて決定するこ
とは好ましくない。このように製品の不必要なロ
スがサンプルが非感染性であると証明できる前に
発生するであろう。 こゝで記載する方法の特に価値ある特徴は、す
べての肝炎ビールスを熱処理によつて不活性化す
ることができるが、しかし酵素活性には有意な低
下がないことである。これは肝炎Ａ，肝炎Ｂおよ
び非Ａ非Ｂ肝炎を含む。これらビールスは治療用
血液凝固酵素組成物の主要な既知汚染源である。
この方法の利益は、生物学的指示薬として使用す
るための上記のビールスの特定個性と、それに前
記肝炎ビールスの生体内活性とが酵素活性の同時
に匹敵する低下なしに完全に破壊し得ることであ
る。しかしながらこゝに記載する方法は血液凝固
酵素組成物中に存在するすべてのビールスに対し
広い適用性を有する。 こゝに記載する新規方法によつて製造された組
成物は、それらは生物学的に感染性のビールスを
実質上含まないが、熱処理された生物学的に非感
染性ビールスの残渣を含まない点において独特な
ものである。例えば、生体内で非感染性にされた
肝炎汚染酵素組成物は活性ビールスについての慣
用的アツセイにおいて免疫競合的置換によつて現
行技術水準のもとに検出し得るように、感染性ビ
ールスと一部なお免疫交差反応性の残渣を含有す
る。 さらに、この組成物は実質上変性された血液凝
固酵素を含まない。変性した血液凝固酵素は一般
に水溶液中の加熱により、またはビールスを不活
性化するために使用する他の技術により、酵素活
性が不可逆的に破壊されたものと定義される。こ
の組成物は変性および活性酵素の全モル数を基準
にして約10モル％未満の変性酵素を含有するであ
ろう。組成物は好ましくは変性酵素を５モル％以
下含有する。変性した酵素は慣用技術を使用する
イムノアツセイによつて検出し得る。 こゝに記載した方法によつて製造された酵素組
成物は治療上有効な濃度に復元し、患者へ投与す
ることができる。そのような組成物は無菌であ
る。しかしながら組成物はもしそれらを診断テス
トに試薬として使用するのであれば無菌である必
要はない。例えば与えられた凝固酵素を含む組成
物は該凝固酵素の標準またはコントロールとして
機能し得る。そのような組成物は普通復元され、
そして使用のためある期間貯蔵され、その間にバ
クテリアが生育し試薬に影響することがあるか
ら、好ましくはアジトのような抗微生物剤が組成
物に含有される。その代りに診断試薬は無菌ロ過
および包装によつて滅菌することができる。 もし血漿またはその成分の還元糖の含量がデヒ
ドロゲナーゼおよびクレアチンフオスフオリナー
ゼのような酵素に対して比較的非破壊的なレベル
で減らされるならば、全または脱フイブリン血漿
を血液凝固酵素と同じ方法で肝炎ビールス不含コ
ントロールおよび標準として使用するためにつく
ることができる。糖は必要であれば熱処理後に血
漿へ加えることができる。 本発明は以下の実施例を参照してもつと十分に
理解されるであろう。 実施例 １ この実施例は乾燥プロトロンビン複合体の熱安
定性を証明する。この製品は実質上活性化されて
いない。実質上Feketeらの米国特許第3560475号
の方法によつて製造した市販のプロトロンビン複
合体の２ロツトのそれぞれからの凍結乾燥プロト
ロンビン複合体の30ml密封バイアルを３本づつ表
２に記載の時間および温度で加熱した。プロトロ
ンビン複合体因子、活性化された因子（ａ），
活性化された因子（トロンビン）およびPHを前
に記載した慣用方法に従つて定量した。サンプル
希釈度１：100におけるキングドン時間をPepper
et al.，British Journal Hematology 36：573
（1977）またはKingdon eh al.，Abstract No.86
ｏ the meeting of the American Society of
Hematology，Atlanta（1974）によつて測定し
た。このアツセイは非活性化部分トロンボプラス
チン時間テストとしても知られる。タンパク分解
活性を２種の合成色原体プロテアーゼ基質、すな
わちオルソダイアグノステイツクス社より入手し
得るＳ−2160（Ｎ−ベンゾイル−フエニルアラニ
ル−バリル−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド
HCl）およびＳ−2238（Ｄ−フエニルアラニル−
ピペコリル−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド
HCl）を使用して定量した。 【表】 【表】 ４種の未活性化凝固因子についての平均残存活
性％を各温度について４日および７日目に計算
し、次に図面に点線にプロツトした。 実施例 ２ この実施例はプロトロンビン複合体中のビール
スの熱不安定性を扱う。シンドビス，脳心筋炎
（EMC）、ポリオ１型およびアデノ５型ビールス
の懸濁液をそれぞれプロトロンビン複合体の部分
標本中に希釈し、５mlバイアル中へ１ml部分標本
に分注し、凍結乾燥し、そして真空包装した。バ
イアルを70℃および60℃で40時間まで加熱し、サ
ンプルバイアルを規則的間隔で取り出した。５℃
のコントロールおよび熱処理バイアルの中味を１
mlの無菌水で復元し、以下に記載するようにビー
ルス力価について定量した。シンドビスビールス
のコントロール濃度は復元したml当り６ないし
7log10プラツク形成単位（PFU／ml）であり、
EMCおよびポリオビールスは約4log10PFU／ml
であつた。アデノビールス濃度はml当り約4.5×
log10組織培養50％感染性用量（TCID−50）であ
つた。 このTCID表記法は以下のように説明し得る。
生物学的定量においては、終点は通常テスト系の
ある割合が反応するかまたは死滅する点の希釈度
として決められる。100％終点がしばしば使用さ
れる。しかしながらその正確性は小さいチヤンス
変動によつて大きく影響される。望ましい終点は
テスト系の半分が反応し、他の半分が反応しない
ような状況を表わす終点である。最良の方法は50
％反応値付近の近接して離れた希釈度におけるテ
スト系の多数を使用し、そして正確な値を補間す
ることである。 TCID50 終点力価の負対数＝（使用した最高ビー
ルス濃度の負対数） −〔（各希釈度における％死亡率の合計／10
0−0.5）×（希釈度の対数）〕 組成物培養50％終点は接種した培養物中の細胞
の50％に細胞病理学的変化をもたらすビールス力
価を表わす。濃度の測定に前記技術を適用する場
合、最低必須培地プラス２％胎児コウシ血清中に
対数希釈を用意する。各希釈度の0.2mlをミクロ
タイタープレート中のBGMK（バツフアロー、グ
リーン、モンキー、キドニー）の反復用培養物へ
添加する。接種した培養物を５％CO2のもとで36
℃でインキユベートし、顕微鏡で７ないし８日観
察する。与えられた希釈度において培養物中の細
胞の死滅％を屈折性の細胞で証明される細胞退化
を観察することによつて測定する。TCID50は上
に示したようにして計算される。 EMC，ポリオビールスおよびシンドビスビー
ルスのアツセイは前述のようにビールス懸濁液の
希釈液を調製することによつて得られる。
BGMK細胞単層は35mmペトリ皿に調製された。
細胞へのビールス吸収は該単層へ懸濁液0.2mlを
加えることによつて開始された。１時間後、単層
を栄養寒天培地に重ね、そして37℃において24な
いし72時間インキユベートした。生成したプラツ
クを次に細胞を食塩水中１：2000中性レツドで染
色することによつて可視化した。 シンドビスビールスについての結果をデータへ
直線をあてはめることを許容するため最小自乗法
で回帰解析にかけ、図面にプロツトした。見られ
るように、不活性化率は47℃におけるよりも60℃
においてかなり高いが、５℃コントールには変化
が起きなかつた。同様な結果は他の３種のビール
スについても得られる。図面にプロツトした実施
例１および２の結果の比較は、乾燥したプロトロ
ンビン複合体酵素はビールスに比較すると非常に
低い割合で熱で不活性化されることを示す。不活
性化率の最大の差は約60℃において発生する。こ
のときプロトロンビン複合体の無視できる損失だ
けがビールスが完全に不活性化される時に発生し
た。 実施例 ３ この期待される実施例は活性化および未活性化
プロトロンビン複合体中の肝炎Ｂの不活性化に関
する。活性化因子の低力価を有する市販プロトロ
ンビン複合体（プロプレツクス分画、ハイランド
ラボラトリーズ社）の製造ロツトの部分標本を約
30000チンパンジー感染投与量／10mlを得るのに
十分な肝炎Ｂビールス（FDA生物学局肝炎支所
から得た）と混合した。活性化プロトロンビン複
合体（オートプレツクス濃縮物，ハイランドラボ
ラトリーズ社）も同様に肝炎Ｂビールスで接種し
た。分画中のビールスの量は三代肝炎Ｂ抗原
（HBSAg）検出システムの感受性においてまたは
その付近で検出可能であつた。 ビールスとプロトロンビン複合体とを混合した
後、感染した製品をバイアル中へ10ml部分標本と
して分注し、凍結乾燥し、乾燥窒素で掃気し、シ
ールした。汚染した活性化および未活性化プロト
ロンビン複合体を含むバイアル２本づつを60℃に
保つた水浴中に72時間浸漬し、ビールスを不活性
化した。感染した製品を含む未処理バイアルはコ
ントロールとして冷蔵庫に貯蔵した。 ６頭のチンパンジー（Pan troglodytes）を研
究のために選定した。いずれも以前如何なる種類
の肝炎Ｂ研究に使用されたことはなく、血液また
は血液製剤を投与されたこともなく、すべてどの
ような臨床的肝炎徴候はなく、そして許可された
ラジオイムノアツセイ操作によつてHBSAg，
HBSAgに対する抗体（抗HBS）および肝炎コア
抗原（抗HBC）に対する抗体に対して陰性であ
つた。ベースライン値はアラニンアミノトランス
フエラーゼ（ALT），アスパルテートアミノトラ
ンスフエラーゼについて各動物からの８週毎の血
液サンプルから、および完全血液カウントについ
て２週毎から確立された。チンパンジーは一旦そ
れらの健康が確立され、そして併発症が存在しな
いことが決定されれば適当であると判定された。 上で調製した肝炎Ｂ接種製品のバイアルは無菌
水中に10mlの容積にそれぞれ復元された。各バイ
アルの復元した中味はチンパンジーへ静注され
た。２頭のチンパンジーは２種のコントロールの
ための受容体として使用された。コントロールは
無菌水10ml中に復元され、熱処理した製品と同じ
方法で投与された。 チンパンジーは注意深く検疫され、そして肝炎
感染の微候について８ケ月間監視された。HBS
Ag，抗HBS，抗HBC，ALT，ASTおよび肝炎Ａ
ビールスに対する抗体が毎週測定された。そして
完全血液カウントが接種後24週は２週毎に、その
後は28週および32週毎に測定された。肝臓は６ケ
月まで１ケ月毎に、そしてその後32週目に生検さ
れた。コントロール動物は該ビールスの通常の潜
伏期間をもつて肝炎を発病したが、熱処理したプ
ロトロンビン複合体および活性プロトロンビン複
合体を注射した４頭のチンパンジーは感染しなか
つた。 実施例 ４ この期待される実施例はプロトロンビン複合体
中の非Ａ非Ｂ感染性ビールスの不活性化を証明す
る。この研究に使用した非Ａ非Ｂ肝炎ビールスの
ソースはBradley et al.，J.Med.Virology ３：
253−269（1979）によつて記載された。このソー
スは少なくとも３mlの量で静注したとき肝炎Ａま
たはＢ以外の肝炎を起こすことが示された抗血友
病因子ロツト（ヘモフイル濃縮物ロツト
059D056AA）であつた。該ソースのAHFは製造
者の指示書に従つて復元し、プロトロンビン複合
体の商業ロツト（プロプレツクス濃縮物）中にソ
ース１部対プロトロンビン複合体９部の比で希釈
し、10ml部分標本にバイアルへ注入し、凍結乾燥
し、乾燥窒素で掃気し、シールした。バイアル２
本を実施例３と同じ方法で加熱し、コントロール
は貯蔵した。 実施例３において熱処理した材料を投与され、
そのため肝炎症候のない４頭のチンパンジーのう
ち３頭がこの研究において実験対象として使用さ
れた。バイアルは復元され、適当に注射され、検
疫され、８ケ月間監視された。テストおよびテス
トスケジユールは実質上実施例３と同じである。
コントロール動物も肝炎の生化学的証拠が明らか
になつた時チトメガロビールスおよびEpstein−
Barrビールスに対する抗体力価について試験し
た。コントロール動物は非Ａ非Ｂ肝炎を発病した
と判定されたが、熱処理材料の受容体はいずれも
感染しなかつた。 実施例 ５ 肝炎Ａをこの期待実施例に従つて不活性化し
た。肝炎Ａビールスのソースは市販の肝炎Ａに対
するラジオイムノアツセイによつて決定された肝
炎Ａの急性期にある患者の糞サンプルであつた。
糞サンプルを食塩水10ml中にホモジネートし、次
に粒状物を除去するため1500Gで遠心した。上清
を注意深く傾斜し、遠心チユーブの底にビールス
ペレツトが集まるまで超遠心機中50000Gで遠心
した。このペレツトを免疫電子顕微鏡を用いて約
10log10粒子／mlの力価に食塩水中に再懸濁した。
この懸濁液を前記実施例で使用した市販プロトロ
ンビン複合体ロツトの部分標本中に１：５に希釈
し、10mlをバイアル中に分注し、凍結乾燥し、そ
して真空下シールした。 材料を実施例４と同じ方法で熱処理し、チンパ
ンジーにテストした。熱処理したプロトロンビン
複合体は非感染性であつた。 実施例 ６ この期待実施例は血漿タンパク製品中のビール
ス熱不活性化を確認するために適した生物学的指
示薬の製造および使用を記載する。指示薬に使用
する代表的な血漿タンパクはAHF15国際単位／
mlおよび製造者の指示書に従つて復元した時タン
パク約0.05ｇ／mlを含有する市販のAHF含有組
成物であつた。組成物はAHFに加えてフイブリ
ノーゲンおよび同定されない血漿タンパクを含む
が、しかし検出し得る還元糖は含有しなかつた。
無菌水のT4バクテリオフアージを復元した組成
物がフアージ粒約６×log10／ml含有するのに十
分な量で乾燥した無菌AHF組成物へ添加した。
組成物１mlをアンプルへ充填し、凍結乾燥し、ア
ンプルを窒素気流下シールした。２本のアンプル
を因子の複数のバイアルと並列に60℃で90時間
熱処理した。その後アンプルの中味を無菌水１ml
に溶解し、無菌水中へ１：２ないし１：64に系列
的に希釈し、各希釈液をE.coliバクテリアで接種
した栄養寒天を含むペトリ皿へ重ねた。どの希釈
度においても４ないし８時間インキユベーシヨン
後プラツクが出現せず、AHF組成物中のT4フア
ージの不活性化を示し、そしてそれにより熱処理
が因子製剤中に存在したかも知れないどんな外
来ビールスの不活性化にも成功であつたことを結
論した。
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