CN102083979A - Hbv表位反应性外源t细胞受体(tcr)及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了至少一种分离细胞以及制备它们的方法，所述分离细胞包含至少一种HBV表位反应性外源T细胞受体和/或其片段。具体而言，本发明提供了编码至少一种用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)和肝细胞性肝癌(HCC)的HBV表位反应性外源T细胞受体的多核苷酸、构建体和载体。本发明进一步提供了检测HBV和HCC的试剂盒和方法。
Description
技术领域
本发明主要涉及用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)和HBV相关的疾病(如肝硬化和肝细胞性肝癌(HCC))的免疫介导疗法的领域，并且涉及制定这些疗法的方法。具体而言，所述免疫介导疗法可为表达至少一种HBV表位反应性外源T细胞受体的细胞和/或编码HBV表位反应性T细胞受体的多核苷酸、载体和/或多肽的形式。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)感染类人动物总科(包括人)的肝脏，并且引起称作肝炎的炎症。它是一种DNA病毒并且是引起病毒性肝炎的多种独立病毒中的一种。HBV目前感染全世界至少3.5亿人。75％的慢性感染HBV的患者生活在亚洲，但是病毒已在世界范围内扩散。例如，在美国，大约150万美国人或者约0.5％的人口携带HBV。在特定高危人群中，像与其他男人发生性行为的男人、肾透折患者以及患有血友病的人，感染尤其更加常见。慢性HBV感染影响了10～15％的第一代亚裔美国人，并且大约5％的从俄罗斯、亚洲和东欧收养的儿童有慢性HBV感染。慢性HBV感染可最终导致肝硬化和肝细胞性肝癌(HCC)，而HCC是一种对目前的化学疗法反应非常差的致命疾病。
由于现有的药物抑制而非消除HBV，因此，目前对这种全球性大储源的慢性感染者的可用治疗方法正在受到挑战。虽然大多数HBV感染患者对目前可用的治疗方法有反应，表现为肝组织学和血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平的改善，但是当停止治疗时，几乎所有患者都复发。此外，治疗HBV的更常见的方法包括使用如拉米夫定和阿德福韦的药物。然而，这些药物导致患者体内的抗病毒抗药性的形成，每年大约20％的用拉米夫定治疗的患者和大约3％的用阿德福韦治疗的患者出现这种情况。最后，大部分患者会形成抗药性，此时，抗病毒药将几乎没有作用。
因此对有效的抗病毒治疗方法存在着全球性的需求，该方法引起HBV特异性免疫应答从而有效地并成功地消除患者体内的共价闭环形式的HBV。在一些受试对象中发现的天然产生的HBV表位特异性T细胞使该受试对象能够天生具有对HBV感染的有效控制。过去的研究已显示，持续/慢性HBV感染患者的HBV表位特异性T细胞缺失或功能改变。因此，随着人们对在HBV感染期间病毒与宿主相互作用的认识的增加，这些认识促使人们推测对在慢性感染患者体内存在的缺陷性抗病毒免疫力的治疗性重建可能使疾病症状消退。这种观念的正确性在进行骨髓移植并接受了对HBV具有天然免疫力的捐献者的骨髓的慢性HBV感染患者中得到了直接证实。注入健康的HBV致敏的免疫系统导致这些患者体内的慢性HBV感染症状消退。然而，对HBV慢性感染患者来说，骨髓移植显然不是一种容易的治疗选择，而在慢性乙型肝炎患者体内使用多种疫苗来增强HBV特异性免疫力的尝试已经是令人失望的。
治疗性疫苗策略失败的可能原因是这样的事实，即HBV慢性携带者的免疫系统不具有与健康的非HBV感染者相同的效率和特异性谱(repertoire of specificities)。
此外，慢性HBV感染患者体内的病毒抗原的持续大量产生会删除或耐受抗原特异性T细胞。因此慢性HBV感染患者的特征为HBV特异性CD4+和CD8+T细胞应答低下或缺失。而且，有人已推测，由HBV感染产生的T细胞抗体抗原亲和力低和细胞因子谱(cytokine profile)无效可能促进了慢性HBV感染的发展而不是有利于病毒的清除。
显然，为了减少全世界的HBV感染和HBV相关的恶性肿瘤的发病率和死亡率，需要以HBV感染患者的细胞因子谱涉及的分子为靶向的更加有效的疗法。
发明内容
本发明致力于解决上述问题，并且具体而言，采用外源T细胞受体(TCR)转移通过重定向慢性HBV感染患者的淋巴细胞的特异性而提供了一种有效且高效的治疗HBV感染的新方法。
根据第一个实施方式，本发明提供了至少一种分离细胞，其包含至少一种HBV表位反应性外源T细胞受体(TCR)和/或其片段。
具体而言，所述HBV表位可以为HLA-A2限制性的。更具体而言，所述HBV表位可以包含至少一种乙型肝炎核心抗原或一种乙型肝炎包膜抗原或者它们的突变体。甚至更具体而言，所述HBV表位可以包含HBc18-27、HBs370-79和/或它们的突变体。所述HBc18-27表位可以包含选自SEQ IDNO：25～39中的至少一种序列。具体而言，所述HBc18-27表位可以包含序列SEQ ID NO：25。所述HBs370-79表位可以包含选自SEQ ID NO：56～58中的至少一种序列。具体而言，所述HBs370-79表位可以包含序列SEQ IDNO：56。
具体而言，根据本发明的细胞可以进一步包含至少一种第二HBV表位反应性外源TCR和/或其片段，其中，第二HBV表位与第一HBV表位可以是不同的。具体而言，第一HBV表位可为HBc18-27并且第二HBV表位可为HBs370-79。
所述外源TCR可以包含至少一条α链，该α链包含选自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11或它们的突变体中的至少一种氨基酸序列。具体而言，所述外源TCR可以包含至少一条α链，该α链包含序列SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。所述外源TCR可以包含至少一条β链，该β链包含选自SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23或它们的突变体中至少一种氨基酸序列。更具体而言，所述外源TCR可以包含至少一条β链，该β链包含序列SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23。全部序列示于表1和2中。
具体而言，所述外源TCR可以包含至少一条与SEQ ID NO：12或其片段具有至少80％的氨基酸同一性的α链和/或至少一条与SEQ ID NO：24或其片段具有至少80％的氨基酸同一性的β链。更具体而言，所述外源TCR可以包含至少一条SEQ ID NO：12的α链和/或至少一条SEQ ID NO：24的β链。
所述外源TCR可以包含至少一条α链，该α链包含选自SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46或它们的突变体中的至少一种氨基酸序列。具体而言，所述外源TCR包含至少一条α链，该α链包含序列SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46。所述外源TCR可以包含至少一条β链，该β链包含选自SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54或它们的突变体中的至少一种氨基酸序列。更具体而言，所述外源TCR可以包含至少一条β链，该β链包含序列SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54。全部序列示于表1和2中。
具体而言，所述外源TCR可以包含至少一条与SEQ ID NO：47或其片段具有至少80％的氨基酸同一性的α链和/或至少一条与SEQ ID NO：55或其片段具有至少80％的氨基酸同一性的β链。更具体而言，所述外源TCR可包含至少一条SEQ ID NO：47的α链和/或至少一条SEQ ID NO：55的β链。
具体而言，根据本发明的细胞可为至少一种造血干细胞。更具体而言，所述细胞可为至少一种外周血淋巴细胞(PBL)源T细胞。
根据另一个实施方式，本发明提供了至少一种分离多核苷酸，其包含至少一种编码至少一条α链的序列和/或至少一种编码至少一条β链的序列，其中，所述α链和β链可以是至少一种外源HBV表位反应性TCR的部分。所述HBV表位可为HBc18-27和/或HBs370-79。
具体而言，所述编码α链的序列包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5中的至少一种序列、选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6中的至少一种序列以及选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7中的至少一种序列，和/或所述编码β链的序列包含选自SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：17中的至少一种序列、选自SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：18中的至少一种序列以及选自SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：19中的至少一种序列。更具体而言，所述编码α链的序列可以包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7，和/或所述编码β链的序列可以包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19。
具体而言，所述HBV表位反应性外源TCR的α链可与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：8具有至少80％的序列同一性，和/或所述HBV表位反应性外源TCR的β链可与SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：20具有至少80％的序列同一性。更具体而言，所述编码α链的序列可选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8中，和/或所述编码β链的序列可选自SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：20中。更具体而言，所述HBc18-27表位反应性外源TCR的α链的序列可选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8中，和/或所述HBc18-27表位反应性外源TCR的β链的序列可选自SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：20中。
具体而言，所述编码α链的序列包含SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42，和/或所述编码β链的序列包含SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50。更具体而言，所述HBV表位反应性外源TCR的α链可与SEQ ID NO：43具有至少80％的序列同一性，并且所述HBV表位反应性外源T细胞受体的β链可与SEQ ID NO：51具有至少80％的序列同一性。甚至更具体而言，所述编码α链的序列包含SEQ ID NO：43，和/或所述编码β链的序列包含SEQ ID NO：51。更具体而言，所述HBs370-79表位反应性外源TCR的α链的序列可以包含SEQ ID NO：43，和/或所述HBs370-79表位反应性外源TCR的β链的序列可以包含SEQ ID NO：51。
根据另一个实施方式，本发明提供了至少一种分离多肽，其由本发明的至少一种多核苷酸编码。
根据又一个实施方式，本发明提供了至少一种分离多肽，其包含选自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11中的至少一种序列以及选自SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23中的至少一种额外序列。具体而言，所述序列可与SEQ ID NO：12具有至少80％的氨基酸同一性，并且所述额外序列可与SEQ ID NO：24具有至少80％的氨基酸同一性。
本发明还提供了至少一种分离多肽，其包含选自SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：45和SEQ ID NO：46中的至少一种序列和/或选自SEQ ID NO：52、SEQ IDNO：53和SEQ ID NO：54中的至少一种额外序列。具体而言，所述序列可与SEQ ID NO：47具有至少80％的氨基酸同一性，并且所述额外序列与SEQ IDNO：55具有至少80％的氨基酸同一性。
根据本发明的多肽可为至少一种HBV表位反应性外源TCR。具体而言，所述HBV表位可为HBc18-27、HBs370-79和/或它们的突变体。更具体而言，所述多肽可为至少一种可溶性TCR或其片段。甚至更具体而言，所述可溶性TCR或其片段可与至少一种抗病毒药连接。
根据一个实施方式，本发明提供了至少一种构建体，其包含与至少一种启动子可操作地连接的本发明的多核苷酸。
根据另一个实施方式，本发明提供了至少一种载体，其包含根据本发明的构建体或者根据本发明的多核苷酸。
根据又一个实施方式，本发明提供了至少一种T细胞，其包含根据本发明的载体或构建体。
根据一个实施方式，本发明提供了制备至少一种T细胞的至少一种方法，所述T细胞包含至少一种用于递送到至少一种受试对象的HBV表位反应性外源TCR，该方法包括用本发明的构建体或载体转导至少一种从受试对象中分离的T细胞。
根据另一个实施方式，本发明提供了制备至少一种HBV表位反应性外源TCR的至少一种方法，该方法包括：
(a)从消退了HBV感染症状的至少一种HBV感染个体中分离至少一种HBV表位反应性T细胞；
(b)由步骤(a)的HBV表位反应性T细胞克隆编码至少一种TCR细胞受体的至少一条α链和/或β链的至少一种多核苷酸序列；
(c)将步骤(b)的多核苷酸序列递送至至少一种细胞；和
(d)在适合所述细胞表达所述HBV表位反应性外源T细胞受体的条件下孵育该细胞。
具体而言，所述制备至少一种HBV表位反应性外源TCR的方法包括：步骤(a)，至少一种T细胞的分离，该T细胞可以是HBc18-27表位反应性的和/或HBs370-79表位反应性的。
根据一个实施方式，本发明提供了至少一种根据本发明的细胞，用于治疗HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌。
根据另一个实施方式，本发明提供了在至少一种受试对象中治疗HBV和/或抑制HBV复活的至少一种方法，该方法包括向受试对象施用免疫治疗有效量的根据本发明的任一实施方式的至少一种细胞、至少一种载体和/或至少一种多肽。
根据又一个实施方式，本发明提供了在至少一种受试对象中治疗HBV相关的肝细胞性肝癌的至少一种方法，该方法包括向受试对象施用免疫治疗有效量的根据本发明的任一实施方式的至少一种细胞、至少一种载体和/或至少一种多肽。
根据一个实施方式，本发明提供了诊断能够使HBV感染症状消退的至少一种受试对象的至少一种体外方法，该方法包括：
(a)从至少一种受试对象中采集至少一种样本；
(b)检测至少一种多核苷酸的存在，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列，或者主要由选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列组成，或者由选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列组成；和/或
(c)检测至少一种多肽的存在，所述多肽包含SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列，或者主要由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：47、SEQ IDNO：55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：55、其同系物和/或片段的氨基酸序列组成；
其中，所述多核苷酸和/或多肽的存在标志着受试对象能够使HBV感染症状消退。
根据再一个实施方式，本发明提供了诊断至少一种受试对象患有HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌或者存在患有HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的风险的至少一种体外方法，该方法包括：
(a)从至少一种受试对象中收集至少一种样本；
(b)检测至少一种多核苷酸的存在，所述多核苷酸包含选自SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：43、SEQID NO：51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列，或者主要由选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列组成，或者由选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列组成；和/或
(c)检测至少一种多肽的存在，所述多肽包含SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列，或者主要由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：47、SEQ IDNO：55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列组成；
其中，所述多核苷酸和/或多肽的缺失与受试对象患有HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌或者存在患有HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的风险的可能性相关。
根据另一个实施方式，本发明提供了根据本发明的任一实施方式的至少一种细胞、至少一种载体和/或至少一种多肽在制备用于治疗HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的药物中的至少一种用途。
根据再一个实施方式，本发明提供了检测和/或治疗HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的至少一种试剂盒，该试剂盒包含根据本发明的任一实施方式的至少一种细胞、至少一种载体和/或至少一种多肽。
附图说明
图1显示了制备包含至少一种HBV表位反应性外源T细胞受体的细胞所涉及的步骤的示意图。其包括从已经消退了感染症状的HLA-A2阳性HBV患者中分离T细胞克隆，使用该T细胞克隆形成编码HBV T细胞受体的逆转录病毒载体构建体，并且使用该载体形成表达HBV表位反应性外源T细胞受体的细胞。图1部分取自文献Schumacher et al.，2002中。
图2(A)显示了外周血淋巴细胞(PBL)(其用HBc18-27肽进行刺激来产生T细胞系)的FACS分析。使用特异性HBc18-27-HLA-A201五聚体和磁性分离来分离HBc18-27特异性T细胞系。用HBc18-27-HLA-A201特异性五聚体使分离的HBc18-27特异性T细胞系染色以证实克隆形成能力。结果显示，100％的T细胞是CD8+和HLA-A2五聚体阳性，这表明其具备克隆形成能力。
图2(B)显示了用TCR Vβ单克隆抗体(MAbs)板染色的潜在T细胞克隆C183(其源于消退了症状的HLA-A201HBV患者)的Vβ分型的结果的图。在识别T细胞克隆方面，与人TCR Vβ区反应的MAbs的特异性几乎和私人特异性MAb一样。因此使用这种方法评价Vβ基因家族的表达。已发现，克隆C183对HBV核心18-27(HBc18-27)表位具有高度特异性。该结果提示所有T细胞均为Vβ8阳性。
图3显示了HBc18-27特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)克隆C183的细胞毒性功能。将羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE))标记的HepG2细胞用HBc18-27(8-10M)表位进行脉冲标记，然后与未用HBc18-27脉冲标记过的HepG2细胞混合。以1∶1的比例在有或没有CTL克隆存在下培养HepG2细胞5小时。通过在C183克隆(+C183)存在下CFSE标记的靶标的消失来测定细胞毒性。5小时共孵育后，结果显示，只剩下CFSE阴性细胞(无HBc18-27肽)，而几乎所有HBc18-27阳性、CFSE阳性的HepG2细胞均被C183杀死了，表明T细胞克隆能够杀死呈递HBV抗原(如HBc18-27)的肿瘤细胞。在没有加入CTL时，细胞计数没有显著差异(无CTL)。
图4显示了C183T细胞克隆识别由肝细胞性肝癌细胞呈递的经内源性处理的病毒抗原。
图4(A)显示了作为对照组的与亲代、仅载体、HepG2细胞系(HepG2TA2-7)一起孵育5小时的HBc18-27特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)C183的结果。测试对照组的细胞因子释放和胞毒脱粒(CD107a+染色)，其表明，由于没有激活脱粒(CD107a+)并且没有产生IFN-γ，因此C183对对照细胞系HepG2TA2-7没有应答。
图4(B)显示了在与HBV抗原表达水平不同的HepG2.105细胞共培养后C183T细胞克隆的激活刺激了IFN-γ的产生和脱粒，这表明C183T细胞克隆识别由肝细胞性肝癌细胞处理且呈递的HBc18-27表位。在与表达HBV的HepG2细胞共培养5小时后，84％的T细胞克隆被激活。
图5显示了C183T细胞克隆如何应答天然感染的肝细胞的结果。将从HLA-A2+或HLA-A2-外植的慢性HBV肝脏中分离的原代肝细胞与C183共培养。在单独孵育C183、与HLA-A2+未感染的人原代肝细胞孵育、与HLA错配HBV感染的人原代肝细胞孵育或者与HLA-A2+HBV感染的人原代肝细胞孵育之后，测量HBc18-27特异性C183T细胞克隆脱粒和IFN-γ产生。仅在与HLA-A2+HBV感染的人原代肝细胞孵育以后观察到C183激活(12％CD107a+)，表明C183T细胞克隆识别由在其细胞表面表达正确的HLA分子的HBV感染的原代肝细胞呈递的经内源性处理的病毒抗原。
图6显示了T细胞克隆C183识别HBc18-27表位的能力，所述HBc18-27表位来自由HLA-A2MHC I类家族的不同亚型呈递的HBV基因型B和C(灰条，亚洲病毒；C18-I)与HBV基因型A和D(黑条，欧洲/美洲病毒；C18-V)。将具有已知的HLA-A2亚型的Epstein-Barr病毒(EBV)转化的B细胞负载浓度渐增的来自不同HBV基因型的HBc18-27表位并与C183T细胞克隆共培养5小时。测量IFN-γ的产生以测定T细胞的激活。数据显示，(A)HLA-A201；(B)HLA-A206；和(C)HLA-A207MHC I类分子能够呈递来自全部基因型的HBV表位，并被C183识别，并因此有效地刺激了T细胞的IFN-γ产生，已发现，C183T细胞克隆能够以高敏感度(＜1pM)识别来自基因型B和C或者基因型A和D的HBc18-27表位，并且当该表位由三种最显性的HLA-A2亚型A0201(A)、A0206(B)和A0207(C)呈递时对其识别几乎是相同的。
图7显示了对T细胞受体(TCR)转导效率的分析。
图7(A)显示了当将外周血淋巴细胞(PBL)进行模拟转导(阴性对照)或用由Vβ8.2和Vα3链组成的HBc18-27A201TCR转导时，对其的FACS分析。转导后3天对PBL的Vβ8链进行染色以确定引入的HBc18-27TCR的表达。模拟转导的PBL表达内源性水平的Vβ8(CD8+＝1.8％；CD4+＝2.1)。与模拟转导的细胞(仅表达内源性水平的Vβ8)相比，用HBc18-27A201TCR转导后，Vβ8的表达大量地增加，表明成功的转导和表达。
图7(B)显示了在用HBc18-27-A201特异性五聚体染色模拟转导的或HBc18-27TCR转导的细胞以确定是否表达Vα3链并在细胞表面上与Vβ8.2链适当地配对时获得的结果。五聚体分析显示了只有HBc18-27TCR转导的T细胞表达了被HBc18-27-A201特异性五聚体识别的适合的α链和β链并且α链和β链在细胞表面上适当地配对。在模拟转导的细胞中没有检测到染色，这是因为PBL来自HLA-A2阴性的健康供体。
图7(C)显示了来自5个健康人、5个HBeAg+的慢性HBV患者(HBV DNA＞107个拷贝/ml)和5个HBeAg-的慢性HBV患者(HBV DNA＜106个拷贝/ml)的Vβ8+T细胞的平均频率。这说明，转导的Vβ8TCR链在慢性HBV患者和健康供体中都表达良好。
图7(D)显示了来自5个健康人、5个HBeAg+的慢性HBV患者(HBV DNA＞107个拷贝/ml)和5个HBeAg-的慢性HBV患者(HBV DNA＜106个拷贝/ml)的HBc18-27-A201特异性五聚体+T细胞的平均频率。这说明，适当配对的转导TCR在慢性HBV患者和健康供体中都表达良好。
图8(A)显示了用HBc18-27 A201 TCR转导的T细胞的FACS分析，以证实引入的HBc18-27TCR是有功能的。将HBc18-27TCR转导的或模拟转导的T细胞与HLA-A2+T2细胞(其首先用HBc18-27肽(″肽″)进行脉冲标记并孵育5小时)共培养过夜。然后通过对IFN-γ(左列)、TNF-α(中间列)和IL-2(右列)的细胞内细胞因子染色来评价T细胞的功能。在没有肽的情况下，HBc18-27TCR转导的细胞没有被激活(首行)。经肽脉冲标记的T2细胞没有激活模拟转导的细胞(中间行)。在与经肽脉冲标记的T2细胞共培养后，HBc18-27TCR转导的细胞被刺激产生IFN-γ、TNF-α和IL-2(底行)。CD8+和CD8-(CD4+T细胞)都能够产生全部三种细胞因子，这证明了在CD4+T细胞中引入的TCR的功能和TCR重定向的细胞的多功能能力。
图8(B)显示了来自慢性HBV患者的HBc18-27TCR转导的T细胞具有与健康供体同样的功能。显示了来自5个健康人、5个HBeAg+的慢性HBV患者(HBV DNA＞107个拷贝/ml)和5个HBeAg-的慢性HBV患者(HBV DNA＜106个拷贝/ml)的IFN-γ、TNF-α和IL-2阳性细胞的平均频率。结果显示，用HBc18-27-A201TCR转导的T细胞变成了多功能的。
图9显示了与原始C183T细胞克隆相比，来自健康人和慢性HBV患者的HBc18-27TCR转导的T细胞的亲和性。
图9(A)显示了在将IFN-γ+CD8+HBc18-27TCR转导的T细胞和C183T细胞克隆与用浓度渐增的HBc18-27肽脉冲标记过的T2细胞共培养5小时后，对IFN-γ染色时的结果。所示的数据为得自5个健康供体、5个HBeAg+的慢性HBV患者(HBV DNA＞107个拷贝/ml)和5个HBeAg-的慢性HBV患者(HBV DNA＜106个拷贝/ml)的HBc18-27TCR转导的T细胞的最大应答的平均百分比，其中当TCR转导的细胞频率变化时C183是100％特异性的。结果显示，当与原始C183T细胞克隆相比并且识别浓度低至0.1～1pg/ml的所述表位时，来源于患者T细胞的CD8+HBc18-27TCR转导的T细胞的病毒表位的亲和性是相同的。
图9(B)显示了在将IFN-γ+CD4+HBc18-27TCR转导的T细胞和和C183T细胞克隆与用浓度渐增的HBc18-27肽脉冲标记过的T2细胞共培养5小时后对IFN-γ染色时的结果。所示的数据为得自5个健康供体、5个HBeAg+的慢性HBV患者(HBV DNA＞107个拷贝/ml)和5个HBeAg-的慢性HBV患者(HBV DNA＜106个拷贝/ml)的HBc18-27TCR转导的T细胞的最大应答的平均百分比，其中当TCR转导的细胞频率变化时C183是100％特异性的。来源于患者T细胞的CD4+HBc18-27TCR转导的T细胞与C183相比敏感度低，但是在100pg/ml时50％的HBc18-27特异性T细胞被激活，这表明即使在没有CD8共同受体的情况下，引入的HBc18-27TCR也是高度敏感的。
图10显示了与野生型HBc18-WT-TCR相比，最优化的HBc18-Opt-TCR的表达。
图10(A)为显示来源于模拟转导、HBc18-WT-TCR转导和HBc18-Opt-TCR转导的PBL细胞的Vβ8+T细胞的百分比的直方图。在最优化的HBc18-TCR转导的细胞与野生型HBc18-TCR转导的细胞之间Vβ8+细胞的频率相当。
图10(B)显示了对模拟转导、HBc18-WT-TCR转导和HBc18-Opt-TCR转导的T细胞的表达水平的比较。为了比较表达水平，使用Vβ8+细胞的平均荧光强度(MFI)。结果显示，在最优化的TCR转导的细胞与野生型TCR转导的细胞之间Vβ8+的表达水平没有显著差异。
图10(C)显示了从HBc18-27HLA-A2特异性五聚体染色获得的结果。来自上述各组的细胞用抗CD8和HBc18-27HLA-A2特异性五聚体染色。结果显示，与野生型TCR相比，在用HBc18-Opt-TCR构建体转导的T细胞中的五聚体阳性细胞的频率增加了将近两倍，这说明与野生型序列相比，密码子最优化的构建体可以更加有效地表达Vα3链。
图11显示了与HBc18-WT-TCR构建体相比，在用HBc18-Opt-TCR转导的T细胞中IFN-γ阳性细胞的频率增加了。在2μg/ml布雷菲德菌素A存在下，用HLA-A2阳性T2细胞(用HBc18-27肽先脉冲标记过的或未脉冲标记过的)刺激模拟转导的T细胞、HBc18-WT-TCR转导的T细胞和HBc18-Opt-TCR转导的T细胞过夜。然后将T细胞用抗CD8PE-Cy7标记并通过细胞内细胞因子染色对IFN-γ染色。结果证明，与用HBc18-WT-TCR转导的T细胞相比，用HBc18-Opt-TCR转导的IFN-γ阳性T细胞的频率增加了将近两倍。五聚体阳性细胞的增加与能够应答肽装载的靶T细胞的功能细胞的增加相关。
图12(A)将表达HLA-A0201、HLA-A0206或HLA-A0207亚型的EBV转化B细胞负载浓度渐增的HBV基因型A/D HBc18-27表位(所述序列在表1中提供)，并且与HBc-18-27TCR转导的T细胞共培养5小时。通过对IFN-γ进行细胞内细胞因子染色来测量T细胞的激活。结果显示，HBc-18-27TCR转导的T细胞识别由多种HLA-A2亚型呈递的HBc18-27表位。
图12(B)将表达HLA-A0201、HLA-A0206或HLA-A0207亚型的EBV转化B细胞负载浓度渐增的HBV基因型B/C HBc18-27表位(所述序列在表1中提供)，并且与HBc-18-27TCR转导的T细胞共培养5小时。通过对IFN-γ进行细胞内细胞因子染色来测量T细胞的激活。结果显示，HBc-18-27TCR转导的T细胞识别由多种HLA-A2亚型呈递的HBc18-27表位。
图12(C)显示了在将HLA-A2+T2细胞负载HBc18-27表位的各种突变肽并且与HBc-18-27TCR转导的T细胞共培养5小时时的结果。通过对IFN-γ进行细胞内细胞因子染色来测定突变肽的T细胞识别。所述突变肽的序列在表1中提供。从结果可以看出，HBc-18-27TCR转导的T细胞识别HBc18-27表位的各种突变体。Unstim 1和Unstim 2指其中HLA-A2+T2细胞未负载任何突变肽的对照组。
图13(A)在碘化丙锭(PI)存在下以1∶1的效应子∶标靶比值将来源于各患者组(健康人、HBeAg(-)、HBeAg(+))的TCR转导的T细胞与DiOC标记的表达完整HBV基因组的HepG2细胞(HBV-HepG2)或者对照亲代细胞系(Ctrl-HepG2)共培养6小时。濒死的靶细胞为DiOC+/PI+。结果是3次实验的代表。在用肽脉冲标记过的T2细胞刺激后，通过细胞内细胞因子染色确定，效应T细胞被认为是IFN-γ+/CD8+细胞。该结果显示，HBc18-27TCR转导的T细胞能够杀死内源性表达HBV蛋白的HCC细胞系或者载有HBV 18-27肽的HCC细胞系。
图13(B)将DiOC标记的HCC细胞系(HepG2、SNU-387、SNU-368)负载浓度渐增的HBc18-27肽，并且在碘化丙锭(PI)存在下以1∶1的效应子∶标靶比值与HBc-18-27TCR转导的T细胞共培养6小时。濒死的靶细胞为DiOC+/PI+。结果是3次实验的代表。在用肽脉冲标记过的T2细胞刺激后，通过细胞内细胞因子染色确定，效应T细胞被认为是IFN-γ+/CD8+细胞。该结果显示，HBc18-27TCR转导的T细胞能够杀死多种HLA-A2+HCC细胞系。
图14(A)显示了E10-1D T细胞克隆或者HBs370-79TCR转导的T细胞识别载有HBs370-79表位的HLA-A2+T2细胞。根据实施例10提供的方法制备E10-1D T细胞克隆。将T2细胞负载浓度渐增的HBs370-79肽，并将其与E10-1D或HBs370-79TCR转导的T细胞共培养5小时并对IFN-γ染色。数据显示为最大应答的百分比以将各细胞系的不同频率标准化的。该结果显示，HBs370-79特异性TCR是功能性的。
图14(B)显示了HBs370-79TCR转导的T细胞识别HBs370-79表位的基因型变体(所述基因型变体的序列在表2中提供)。将HBs370-79TCR转导的T细胞与载有1μg/ml各种基因型的肽的HLA-A2+T2细胞共培养5小时，并且通过CD107a标记和对IFN-γ染色来评价激活作用。基因型A&D序列是相同的。该结果显示，HBs370-79特异性TCR识别HBs370-79表位的基因型变体。
具体实施方式
为了方便起见，在本说明书中提到的参考文献以文献参考表的形式列出并且添加到实施例结尾处。所述参考文献的全部内容在此通过引用的方式并入。
定义
为了方便起见，将说明书、实施例和所附权利要求书中采用的特定术语集中于此。
术语“包含/包括”在本文中被定义为在实施本发明的过程中可以结合使用各种组分、成分或步骤的情况。因此，术语“包含/包括”涵盖了限制性更强的术语“主要由…组成”和“由…组成”。
当采用术语“主要由…组成”时，应理解为，根据本发明的外源TCR多肽和/或多核苷酸“主要”包含指明的序列作为“主要”成分。在5′端和/或在3′端可以包含其它序列。因此，相对于偶然包含序列X的已知多肽，“主要由序列X组成”的多肽将是新型的。
当采用术语“由…组成”时，应理解为，根据本发明的多肽和/或多核苷酸与至少一种指明的序列(例如用SEQ ID号表示的特定序列或者其同源序列或片段)相对应。
术语“外源T细胞受体”(TCR)在本文中被定义为通过引入外源TCR编码序列在细胞中表达的重组TCR。具体而言，HBV表位反应性TCR可以在其中没有天然表达TCR或者表达TCR的水平不足以诱导细胞应答的细胞中表达，或者当TCR配体结合时在应答细胞中表达。
术语“片段”在本文中被定义为HBV表位反应性外源TCR的完整序列的不完全部分或分离部分，其包含使所述序列具有HBV表位反应性外源TCR的特性和功能的活性部位。具体而言，其可比完整序列短至少一个核苷酸或氨基酸。更具体而言，所述片段包含使HBV表位反应性外源TCR能够识别HBc 18-27表位和/或HBs370-79表位的活性部位。
术语“HBV表位反应性T细胞受体(TCR)”在本文中被定义为这样的TCR，其在主要组织相容性复合体(MHC)分子环境下与HBV表位结合从而在表达重组TCR的细胞中诱导产生辅助子或细胞毒性应答。具体而言，所述HBV表位可为HBc18-27。更具体而言，所述HBV表位可包含SEQ ID NO：25的序列。所述HBV表位可为HBs370-79。更具体而言，所述HBV表位可包含SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：58的序列。
术语“HBc18-27表位”在本文中被定义为能够刺激HLA I类限制性T细胞的表位。其可在本发明中以HBc18、HBc18-27、HBc18-27肽和所述肽互换使用。所述表位的序列可为“FLPSDFFPSV”(SEQ ID NO：25)。在本发明中，除非另作说明，术语HBc18-27用来指SEQ ID NO：25序列在白种人中普遍的基因型A/D的HBc18-27表位。与该表位结合的T细胞受体的区域被称为HBc18-27TCR或HBc18TCR。
术语“HBs370-79表位”在本文中被定义为能够刺激HLA I类限制性T细胞的表位。所述表位的序列可为“SIVSPFIPLL”(SEQ ID NO：56)。在本发明中，除非另作说明，术语HBs370-79用来指SEQ ID NO：56序列在白种人中普遍的基因型A/D的HBc18-27表位。与表位结合的T细胞受体的区域被称为HBs370-79TCR。
术语“免疫治疗有效量”在本文中被定义为在受试对象体内带来免疫介导的预防或治疗效果的量，即，与治疗前的症状相比或者与适合的对照相比，将防止或减少至少50％症状的量。
术语“分离的”在本文中被定义为一种生物学成分(如核酸、肽或蛋白质)，其实质上已经从在天然产生所述成分的生物体的细胞中的其它生物学成分(即其它的染色体和染色体外的DNA和RNA以及蛋白质)中分离出来、单独制备或者纯化出来。已被分离的核酸、肽和蛋白质因此包括用标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还涵盖通过在宿主细胞中重组表达而制备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。
术语“可操作地连接”在本文中被定义为在调节序列(如启动子和/或转录因子结合位点的排列)与第二核酸序列之间的功能连接，其中，所述调节序列控制与第二序列对应的核酸的转录。
术语TCR表位的“突变体”或“突变型”在本文中被定义为这样一种“突变体”或“突变型”，其具有至少一个氨基酸序列，该氨基酸序列通过置换、缺失或添加至少一个氨基酸而与至少一个参照病毒编码序列不同，但保留了结合和激活由非突变表位结合并激活的TCR的能力。具体而言，所述突变体可天然产生或者可以重组或合成的方式产生。
术语“可溶性TCR”在本文中被定义为膜结合TCR(其为负责T细胞识别对其具有特异性抗原的分子)的可溶(分泌)型。在其可溶性型中，除了它识别与MHC分子有关的肽片段而抗体识别在整个蛋白上的决定簇外，它类似于单克隆抗体。具体而言，本发明的分离多肽可用于使用本领域中任何已知的方法制备可溶性TCR。更具体而言，所述可溶性TCR可与HBV的HBc 18-27和/或HBs370-79表位结合。
术语“受试对象”在本文中被定义为脊椎动物，尤其是哺乳动物，更尤其是人。为了研究的目的，所述受试对象具体可为至少一种动物模型，例如，小鼠、大鼠等。具体而言，对于动物模型，可以基于物种选择TCRα链和β链的序列。在一些情况下，也可以使用表达人MHC分子的转基因动物来评价本发明的特定实施方式。
本领域技术人员将理解，根据本文给出的方法，在没有进行过度实验的情况下就可以实施本发明。方法、技术和化学药品记载在给出的参考文献中或者来自标准生物技术和分子生物学教科书中的方案。
在本发明的一个实施方式中，提供了至少一种分离细胞，其包含至少一种HBV表位反应性外源T细胞受体(TCR)和/或其片段。这种细胞可适用于过继转移方案从而提供特别有效的治疗模式。本发明的分离细胞可以克服HBV特异性CD8+和CD4+细胞(可在慢性HBV感染的患者体内存在)的缺失和功能欠佳的问题。具体而言，来源于HBV感染症状消退的患者的TCR可用于重定向慢性HBV患者的淋巴细胞对TCR转移的特异性。
具体而言，HBV反应性TCR可以通过用一种或多种编码功能性α链和/或β链的多核苷酸和/或功能性α链和/或β链的多肽(其可以组装形成至少一种功能性HBV表位反应性TCR)转化或转导至少一种分离细胞而制备。具体而言，所述分离细胞可以使用本领域中已知的任何技术分离。更具体而言，可以使用至少一种细胞分离试剂盒、菲可帕克(Ficoll-Paque)密度梯度离心、BD FACSAria细胞分选系统等分离细胞。
所述分离细胞可为至少一种自身细胞，即，它们可来源于至少一种可接受所制得的转导或转化细胞的受试对象。具体而言，所述分离细胞可来源于受试对象的外周血淋巴细胞和/或造血干细胞。
更具体而言，所述分离细胞可为至少一种T细胞，该T细胞天然地表达至少一种CD4+细胞表面标记，表达至少一种CD8+细胞表面标记，同时表达CD4+和CD8+标记，或者既不表达CD4+细胞表面标记又不表达CD8+细胞表面标记。具体而言，根据本发明的细胞可为至少一种还天然地表达至少一种TCR的T细胞。所述HBV反应性外源TCR可以与天然表达的TCR相同的表位结合，和/或可以结合不同的表位。具体而言，所述HBV反应性外源TCR可以在至少一种细胞中被表达，在该细胞中，TCR可以没有被天然表达或者当与TCR配体结合时，表达TCR的水平可能不足以诱导该细胞的应答或应答细胞的应答。具体而言，根据本发明的分离细胞可以用两种或更多种不同的HBV反应性外源TCR(即与两种或更多种不同的HBV表位结合的TCR)来转导。
已经清除了他们的病毒感染的HBV感染患者可以提供表达高亲和性TCR的HBV反应性T细胞的优异来源。具体而言，所述HBV表位反应性TCR可以通过从至少一个HBV感染的无病毒血症个体(aviremic individual)中分离至少一种HBV反应性T细胞并且从HBV反应性T细胞克隆编码TCR的α链和β链的多核苷酸序列而制备。一旦使用本领域中已知的标准方法克隆了这些序列，就可以将所述序列递送到至少一种分离细胞并且在适合分离细胞表达TCR的条件下孵育所述分离细胞。更具体而言，所述适合条件可以包括标准细胞培养条件。当在体外或离体表达TCR时，如本领域中已知的和如下举例说明的，除了其它的目的参数以外，还可以针对与HBV表位的反应性评价表达TCR的细胞。在一些方案(即其中可以向至少一种受试对象施用载体的那些方案)中，还可以在体内表达TCR从而向至少一种需要治疗的受试对象(即患有急性或慢性HBV感染或者HBV并发症的至少一种受试对象)提供治疗作用。
根据本发明的HBV反应性TCR在它们可被表达的分离细胞中可以是有功能的。具体而言，它们可为与在至少一种I类或II类MHC分子背景下识别至少一种HBV表位的CD3复合物有关的α和βTCR链的功能性异源二聚体。在人类中，至少一种表位的MHC限制可取决于由至少一种抗原呈递细胞表达的至少一种特定的人白细胞抗原(HLA)。在本发明中可以使用可识别受任何HLA型(即HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA和HLA-DRB1)限制的HBV表位的HBV反应性TCR。为了研究的目的，所述HBV反应性TCR在除了人类以外的至少一种物种(例如，H-2K小鼠)的至少一种MHC分子背景下可以识别至少一种HBV表位。
具体而言，所述HBV反应性TCR识别的HBV表位可为HLA-A2限制性的。总人口的大约50％表达MHC I类分子HLA-A2，即一种HLA-A血清型。因此，HLA-A2-限制性TCR可具有普遍的治疗用途。具体而言，该亚型可以识别许多HLA-A*02等位基因的基因产物，包括HLA-A*0201、*0202、*0203、*0206和*0207的基因产物。在白种人群和亚洲人群间的亚型可存在明显的差异。然而，超过95％的HLA-A2阳性白种人群是HLA-A0201，HLA-A2阳性中国人群可划分为：23％HLA-A0201；45％HLA-A0207；8％HLA-A0206；23％HLA-A0203。
本发明的TCR可为HBV表位反应性的。可以在In immunodominance：The choice of the Immune System，J.A.Frelinger，ed(Weinheim：Wiley-VCH)的书中第11章(病原体对免疫系统的影响：病毒性肝炎)第233页中找到已知的免疫反应性HBV表位和它们的序列的列表，该书通过引用的方式将其并入本文。所述HBV表位可以包含至少一种核心抗原、包膜抗原、表面抗原和/或它们的突变体。
具体而言，所述HBV表位可以包含至少一种乙型肝炎核心抗原和/或其突变体。更具体而言，所述HBV表位可以包含HBc18-27和/或其突变体。所述HBc18-27表位可以包含“FLPSDFFPSV”(SEQ ID NO：25)或其突变体。此外，存在于可以包含“FLPSDFFPSV”(SEQ ID NO：25)的基因型A和D(它们在欧洲是最普遍的)中的HBc18-27表位不同于可以包含“FLPSDFFPSI”(SEQ ID NO：26)的基因型B和C(它们在亚洲是最普遍的)的HBc18-27表位。
具体而言，所述HBV表位可以包含至少一种乙型肝炎包膜抗原和/或其突变体。更具体而言，所述HBV表位可以包含HBs370-79和/或其突变体。所述HBs370-79表位可以包含“SIVSPFIPLL”(SEQ ID NO：56)或其突变体。此外，存在于可以包含“SIVSPFIPLL”(SEQ ID NO：56)的基因型A和D(它们在欧洲是最普遍的)中的HBs370-79表位不同于可以包含“NILSPFMPLL”(SEQ ID NO：57)的基因型B的HBs370-79表位和可以包含“NILNPFLPLL”(SEQ ID NO：58)的基因型C(它们在亚洲是最普遍的)的HBs370-79表位。
具体而言，根据本发明的细胞可以进一步包含至少一种第二HBV表位反应性外源TCR和/或其片段，其中，所述第二HBV反应性外源TCR可为与第一表位相同的表位，或者为与第一HBV表位不同的表位。具体而言，第二HBV表位可为HBs370-79，并且第一表位可为HBc 18-27。
所述外源TCR可以包含至少一条α链，该α链包含选自序列SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11和/或它们的突变体中的至少一种氨基酸序列。具体而言，所述外源TCR包含至少一条α链，该α链包含序列SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。更具体而言，所述α链包含全部三种序列：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。所述α链可以连续地包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的序列。具体而言，所述α链可以主要由序列SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11组成。在表1和2中给出本发明所用的全部序列。
所述外源TCR可以进一步包含至少一条β链，该β链包含选自序列SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23和/或它们的突变体中的至少一种氨基酸序列。具体而言，所述β链可以包含全部三种序列：SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23。具体而言，所述β链可以连续地包含SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的序列。更具体而言，所述β链可以主要由序列SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23组成。
具体而言，所述外源TCR可以包含至少一条与SEQ ID NO：12或其片段具有至少80％的氨基酸同一性的α链和/或至少一条与SEQ ID NO：24或其片段具有至少80％的氨基酸同一性的β链。具体而言，所述α链和β链与SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：24的同一性可分别为至少约85％、至少约90％或者至少约95％。更具体而言，所述α链可以包含全部SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11序列，并且所述β链可以包含全部SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23序列。
所述外源TCR可以包含至少一条α链，该α链包含选自序列SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46和/或它们的突变体中的至少一种氨基酸序列。具体而言，所述外源TCR包含至少一条α链，该α链包含序列SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46。更具体而言，所述α链可以包含全部三种序列：SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46。所述α链可以连续地包含SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46的序列。具体而言，所述α链可以主要由序列SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46组成。在表1和2中给出本发明所用的全部序列。
所述外源TCR可以进一步包含至少一条β链，该β链包含选自序列SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54和/或它们的突变体中的至少一种氨基酸序列。具体而言，所述β链可以包含全部三种序列：SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54。具体而言，所述β链可以连续地包含SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54的序列。更具体而言，所述β链可以主要由序列SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54组成。
具体而言，所述外源TCR可以包含至少一条与SEQ ID NO：47或其片段具有至少80％的氨基酸同一性的α链和/或至少一条与SEQ ID NO：55或其片段具有至少80％的氨基酸同一性的β链。具体而言，所述α链和β链与SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：55的同一性可分别为至少约85％、至少约90％或者至少约95％。更具体而言，所述α链可以包含全部SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46序列，并且所述β链可以包含全部SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SFQ ID NO：54序列。
编码α链和β链的序列已经分别被确定为用于针对HBV表位HBc18-27和/或HBs370-79反应的TCR的至少一个高效重排的α链和β链的氨基酸序列。
更具体而言，所述针对HBV表位HBc18-27反应的外源TCR可以包含至少一条SEQ ID NO：12的α链和/或至少一条SEQ ID NO：24的β链。甚至更具体而言，所述针对HBV表位HBc18-27反应的外源TCR可以主要由至少一条SEQ ID NO：12的α链和至少一条SEQ ID NO：24的β链组成。所述针对HBV表位HBc18-27反应的外源TCR可以由至少一条SEQ ID NO：12的α链和至少一条SEQ ID NO：24的β链组成。具体而言，所述针对HBV表位HBc18-27反应的外源TCR可以由两条α链和两条β链组成。
更具体而言，所述针对HBV表位HBs370-79反应的外源TCR可以包含至少一条SEQ ID NO：47的α链和/或至少一条SEQ ID NO：55的β链。甚至更具体而言，所述针对HBV表位HBs370-79反应的外源TCR可以主要由至少一条SEQ ID NO：47的α链和至少一条SEQ ID NO：55的β链组成。所述针对HBV表位HBs370-79反应的外源TCR可以由至少一条SEQ ID NO：47的α链和至少一条SEQ ID NO：55的β链组成。具体而言，所述针对HBV表位HBs370-79反应的外源TCR可以由两条α链和两条β链组成。
可以使用Karlin和Altschul的运算法则(Proc.Natl.Acad.Sci.87：2264-68(1990)，modified Proc.Natl.Acad.Sci.90：5873-77(1993))确定同一性百分比。这种运算法则被加入到BLASTx程序中，其可以用于获得与参照多肽同源的氨基酸序列。本发明还可以涵盖具有包括保守氨基酸置换的氨基酸序列的TCRα链和β链。这种置换在本领域中是众所周知的。
根据另一个实施方式，本发明提供了至少一种分离多核苷酸，其包含至少一种编码至少一条α链的序列和/或至少一种编码至少一条β链的序列，其中，所述被编码的α链和β链可以是至少一种HBV表位反应性TCR的一部分。
具体而言，所述编码α链的序列包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5中的至少一种序列、选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6中的至少一种序列以及选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7中的至少一种序列，和/或所述编码β链的序列包含选自SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：17中的至少一种序列、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：18中的至少一种序列以及选自SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：19中的至少一种序列。更具体而言，所述编码α链的序列可包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7，和/或所述编码β链的序列可包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19。
具体而言，所述编码HBc-18-27表位反应性TCR的α链的序列可以与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：8具有至少80％的序列同一性，和/或所述编码HB c-18-27表位反应性外源TCR的β链的序列可以与SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：20具有至少80％的序列同一性。具体而言，所述编码α链和β链的序列与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：8以及SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：20的同一性可分别为至少约85％、至少约90％或者至少约95％。更具体而言，所述编码α链的序列可选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8中，和/或所述编码β链的序列可选自SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：20中。所述HBc-18-27表位反应性外源TCR可以包含两条由SEQ ID NO：8序列编码的α链和两条由SEQ ID NO：20序列编码的β链。更具体而言，所述α链和β链可以由包含分别在SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：8以及SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：20中所示的连续序列的核苷酸序列编码。
甚至更具体而言，所述外源TCR可以主要由至少一条由SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：8编码的α链和至少一条由SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：20编码的β链组成。所述外源TCR可以由至少一条由SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：8编码的α链和至少一条由SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：20编码的β链组成。具体而言，所述外源TCR可以由两条由SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：8编码的α链和两条由SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：20编码的β链组成。
具体而言，所述编码的α链的序列包含SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42，和/或所述编码β链的序列包含SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50。
更具体而言，所述编码HBs370-79表位反应性外源TCR的α链的序列可与SEQ ID NO：43具有至少80％的序列同一性，并且编码HBs370-79表位反应性外源T细胞受体的β链的序列与SEQ ID NO：51具有至少80％的序列同一性。具体而言，所述编码α链和β链的序列与SEQ ID NO：43和/或SEQID NO：51的同一性可分别为至少约85％、至少约90％或者至少约95％。更具体而言，所述编码α链的序列可为SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：51，和/或所述编码β链的序列可为SEQ ID NO：51。所述HBs370-79表位反应性外源TCR可以包含两条由序列SEQ ID NO：43编码的α链和两条由SEQ IDNO：51编码的β链。更具体而言，所述α链和β链可以由包含分别在SEQ IDNO：43和SEQ ID NO：51中所示的连续序列的核苷酸序列编码。
根据另一个实施方式，本发明提供了至少一种由本发明的多核苷酸编码的分离多肽。
根据还一个实施方式，本发明提供了至少一种分离多肽，其包含选自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11中的至少一种氨基酸序列。具体而言，所述多肽可与SEQ ID NO：12具有至少80％的氨基酸同一性。更具体而言，所述多肽与SEQ ID NO：12的同一性可为至少约85％、至少约90％或者至少约95％。
本发明还提供了至少一种分离多肽，其包含选自SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46中的至少一种序列。具体而言，所述多肽可与SEQ ID NO：47具有至少80％的氨基酸同一性。更具体而言，所述多肽与SEQ ID NO：47的同一性可为至少约85％、至少约90％或者至少约95％。
所述多肽可以进一步包含选自SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23中的至少一种序列。具体而言，所述额外序列可与SEQ ID NO：24具有至少80％的氨基酸同一性。更具体而言，所述其它序列与SEQ ID NO：24的同一性可为至少约85％、至少约90％或者至少约95％。甚至更具体而言，所述多肽可以包含分别在SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：24中所示的氨基酸的连续序列。
所述多肽可以进一步包含选自SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54中的至少一种其它序列。具体而言，所述额外序列可与SEQ ID NO：55具有至少80％的氨基酸同一性。更具体而言，所述其它序列与SEQ ID NO：55的同一性可为至少约85％、至少约90％或者至少约95％。甚至更具体而言，所述多肽可以包含分别在SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：55中所示的氨基酸的连续序列。
根据本发明的多肽可为至少一种HBV表位反应性外源TCR。具体而言，所述多肽的功能可以等同于特定的示例性TCR序列的功能，该TCR序列可以通过单个或多个氨基酸置换、通过氨基酸的添加和/或缺失而被修饰或者其中一个或多个氨基酸已被化学修饰，但是无论怎样修饰其仍然保留了本发明的TCR蛋白对HBV表位的结合特异性和高亲和性结合活性。具体而言，所述HBV表位可为HBc18-27、HBs370-79和/或它们的突变体。更具体而言，所述多肽可为至少一种可溶性TCR。甚至更具体而言，所述可溶性TCR蛋白可以缺少天然细胞结合的TCR的部分并且在溶液中可以是稳定的(也就是，当如本文所述进行处理时以及在用于蛋白质溶液的标准条件下其在溶液中通常不聚集)。
所述可溶性TCR可以通过本领域中已知的任何方法制备。可用于制备可溶性TCR的方法的实例可以包括但不限于：构建聚合受体链，其中，可以用TCRα和β可变区置换来自至少一种磷酸胆碱特异性抗体的免疫球蛋白重链可变区；在TCR跨膜区域的上游引入翻译终止密码子或者用用于来自GPI连接蛋白Thy-1的羧基末端的糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接的信号替代TCRα和β链cDNA的跨膜区。
所述可溶性TCR可与至少一种抗病毒药连接。所述抗病毒药可为HBV靶向性药物。例如，抗病毒药可以包括但不限于，阿德福韦二匹伏酯、干扰素α-2b、聚乙二醇干扰素α-2a、拉米夫定、恩替卡韦、替比夫定(telbivudine)等等。
具体而言，所述可溶性TCR可通过本领域中已知的任何方法与抗病毒药连接以形成可溶性TCR-药物偶联物。所述连接可为将可溶性TCR共价结合到药物部分的含有共价键或原子链的化学部分。连接体可包括二价基团，例如，亚烷基、亚芳基、杂亚芳基、如下部分：-(CR2)nO(CR2)n-；烷氧基的重复单元(如聚氧化乙烯、PEG、聚甲醚(polymethyleneoxy))和烷基氨基的重复单元(如聚乙烯胺(polyethyleneamino)，JeffamineTM)；以及包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二甘醇酸酯、丙二酸酯、己酰胺等的二酸酯和酰胺。
根据一个实施方式，本发明提供了至少一种构建体，其包含与至少一种启动子可操作地连接的本发明的多核苷酸。TCR的α链和β链的编码序列可与至少一种在分离细胞中有功能的启动子可操作地连接。适合的启动子可为组成型和诱导型启动子，并且本领域技术人员可很好地选择合适的启动子。例如，适合的启动子可包括但不限于，逆转录病毒的LTR、SV40启动子、CMV启动子和细胞启动子(例如，β-肌动蛋白启动子)。
根据另一个实施方式，本发明提供了至少一种载体，其包含根据本发明的构建体或者根据本发明的多核苷酸。具体而言，所述载体可包括但不限于，慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体和单纯疱疹病毒载体。更具体而言，如实施例中所述，可以使用逆转录病毒载体来在体外、离体或体内递送所述构建体。
根据又一个实施方式，本发明提供了至少一种T细胞，其包含根据本发明的载体、构建体或多肽。
根据一个实施方式，本发明提供了制备至少一种T细胞的至少一种方法，所述T细胞包含至少一种HBV表位反应性外源TCR，用于递送到至少一种受试对象，该方法包括用本发明的构建体和/或载体转导至少一种从受试对象中分离的T细胞。可以使用本领域技术人员已知的多种方法将根据本发明的构建体或载体递送到体外、离体或体内细胞中。例如，如果所述细胞为体外或离体细胞，可根据标准方案(例如在Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3d ed.，Sambrook and Russell，CSHL Press(2001)中所述的那些方案，该书通过引用的方式并入本文)对其转化或转导。方法的实例可包括但不限于，CaCl2化学法、电穿孔法等。具体而言，根据本发明构建体可被递送到体内细胞中。适合的递送多核苷酸构建体的方法是本领域中已知的，并且可包括但不限于，病毒载体、纳米颗粒、脂质-核酸复合物(lipoplex)和/或多聚物-核酸复合物(polyplex)。
根据另一个实施方式，本发明提供了制备至少一种HBV表位反应性外源TCR的至少一种方法，该方法包括：
(a)从至少一种消退了HBV感染症状的HBV感染个体中分离至少一种HBV表位反应性T细胞；
(b)由步骤(a)的HBV表位反应性T细胞克隆编码至少一种TCR的至少一条α链和/或β链的至少一种多核苷酸序列；
(c)将步骤(b)的多核苷酸序列递送至至少一种细胞；和
(d)在适合由所述细胞表达所述HBV表位反应性外源T细胞受体的条件下孵育该细胞。
具体而言，上述步骤(a)的HBV表位反应性T细胞可为HBc18-27表位反应性的和/或HBs370-79表位反应性的。
根据一个实施方式，本发明提供了根据本发明的所有实施方式的至少一种细胞、至少一种载体和/或至少一种多肽，用于治疗HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的用途。
根据另一个实施方式，本发明提供了在至少一种受试对象中治疗HBV和/或抑制HBV复活的至少一种方法，该方法包括向受试对象施用至少一种免疫治疗有效量的根据本发明的任何实施方式的细胞、至少一种载体和/或至少一种多肽。
另外，所述HBV-TCR重定向方法可以应用在患有肝细胞性肝癌(HCC)的患者中。HBV慢性感染对发展成这种肝肿瘤来说是最重要的危险因子，并且在肿瘤转化细胞中频繁地发生HBV-DNA整合到肝细胞中。采用传统化学疗法、放射或手术切除治疗HCC具有极大的局限性。HBV特异性T细胞可以识别并杀死表达HBV抗原的HCC细胞，并且HBV-TCR-重定向T细胞的过继转移可以使HCC退化。在鼻咽癌、表达Epstein-Barr病毒(EBV)蛋白的肿瘤中得到了这种结果，其中灌输EBV特异性CD8+细胞显示了有价值的结果。因此包含编码TCR的多核苷酸的载体和/或包含至少一种HBV表位反应性TCR的细胞可用于治疗HCC。
因此，本发明提供了在至少一种受试对象中治疗HBV相关的肝细胞性肝癌的至少一种方法，该方法包括向受试对象施用至少一种免疫治疗有效量的根据本发明的任何实施方式的细胞、至少一种载体和/或至少一种多肽。
可以向受试对象适当地施用如上所述制备的包含编码TCR的多核苷酸的载体和/或包含至少一种HBV表位反应性TCR的细胞以治疗受试对象体内的急性或慢性HBV感染或并发症(包括，例如，肝细胞性肝癌)。
可以向至少一种受试对象预防性地施用表达HBV表位反应性TCR的细胞、包含编码HBV表位反应性TCR的多核苷酸的载体和/或编码HBV表位反应性TCR的多肽以抑制HBV感染的再激活。具体而言，可以将本发明的载体施用到来自至少一种受试对象的离体细胞中。更具体而言，多核苷酸和/或病毒载体的施用方式将是特定地和/或主要地将TCR编码序列递送到T细胞和/或造血干细胞中的那些方式。当为逆转录病毒载体时，可以预见，适合的剂量将在约0.1μg/106个细胞至约10μg/106个细胞的范围内，例如，在约1μg/106个细胞至约5μg/106个细胞的范围内。更具体而言，与治疗前的症状相比或者与适合的对照相比，这种剂量可以防止或减少至少50％的HBV相关症状。即使没有治愈，用根据本发明的至少一种逆转录病毒载体进行治疗也可以减轻或减缓HBV感染和/或至少一种并发症，和/或可以降低发展成慢性HBV并发症的发生率。具体而言，可以使用该治疗来治愈或预防急性或慢性HBV感染或包括肝细胞性肝癌的并发症。
具体而言，构成要被施用的免疫治疗有效量的细胞的细胞数量取决于要被治疗的受试对象。其可以取决于但不限于，个体的免疫系统承载TCR介导的免疫反应的能力、患者的年龄、性别和重量以及被治疗病症的严重性。对于至少一种个体的预防或治疗方法，变量的数目可以很大，并且可用的剂量范围相当大。具体而言，可以按至少5×105个细胞/kg体重至1×1010个细胞/kg体重来施用细胞。更具体而言，可以施用5×106个细胞/kg体重至1×108个细胞/kg体重。要向受试对象施用的细胞和/或病毒载体的最大剂量可为不会引起不希望和/或不能耐受的副作用的最高剂量。还可以预期并且可以根据常规方案确定适合的初始施用和附加治疗的方法。
根据另一个实施方式，本发明提供了根据本发明的任一实施方式的至少一种细胞、至少一种载体和/或至少一种多肽在制备用于治疗HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的药物中的至少一种用途。
适合的固体或液体药物制剂形式可为，例如，颗粒剂、粉剂、片剂、包衣片剂、(微)胶囊、栓剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、霜剂、气雾剂、滴剂或安瓿剂形式的可注射溶液，并且还可以是使活性化合物缓释的制剂，如上所述，在所述制剂中常规使用赋形剂和添加剂和/或助剂，如崩解剂、粘合剂、包衣衣料、溶胀剂、润滑剂、调味料、增甜剂或增溶剂。所述药物可适合用于多种药物递送系统。
根据一个实施方式，本发明提供了诊断能够使HBV感染症状消退的至少一种受试对象的至少一种体外方法，该方法包括：
(a)从至少一种受试对象中采集至少一种样本；
(b)检测至少一种多核苷酸的存在，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列，或者主要由选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列组成，或者由选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列组成；和/或
(c)检测至少一种多肽的存在，所述多肽包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列，或者主要由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列组成；
其中，所述多核苷酸和/或多肽的存在表示受试对象能够使HBV感染症状消退。
根据还一个实施方式，本发明提供了诊断至少一种受试对象患有HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌或者存在患有HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的风险的至少一种体外方法，该方法包括：
(a)从至少一种受试对象中采集至少一种样本；
(b)检测至少一种多核苷酸的存在，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列，或者主要由选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列组成，或者由选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列组成；和/或
(c)检测至少一种多肽的存在，所述多肽包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列，或者主要由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列组成；
其中，所述多核苷酸和/或多肽的缺失与受试对象患有HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌或者存在患有HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的风险的可能性相关。
具体而言，测试样本可为尿、血、血清、汗液和/或口腔液体样本。更具体而言，可以使用本领域中已知的几种方法确定本发明的至少一种多核苷酸和/或多肽的存在。所述方法中的一些可以包括但不限于，实时PCR、流式细胞计量术、PCR和/或几何平均荧光强度(MFI)。
根据又一个实施方式，本发明提供了用于检测和/或治疗HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的至少一种试剂盒，该试剂盒包含根据本发明的任何实施方式的至少一种细胞、至少一种载体和/或至少一种多肽。具体而言，所述试剂盒可以包含至少一个提供了关于如何使用该试剂盒的说明的手册。
表1：HBV表位反应性外源TCRα3和β8链以及
天然产生的HBc18-27表位突变肽的序列。
表2：HBV表位反应性外源TCRα12和β7.8链以及
天然产生的HBe 370-79表位突变肽的序列。
现已概括地描述了本发明，通过参照采用举例说明的方式提供的下列实施例将会更加容易地理解本发明，但这些实施例并不用来限制本发明。
实施例
大体上，本领域已知的但未具体描述的标准分子生物学技术如在Sambrook和Russel的分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，纽约(2001)(Sambrook and Russel，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory，New York(2001))中所述。
提供下列实施例以帮助进一步理解本发明。所用的特定材料和条件是用来进一步举例说明本发明但对于所附权利要求的合理范围并没有限制。
实施例1
克隆对HBV核心18-27表位(HBc18-27)具有特异性的乙型肝炎病毒特异性T细胞
从能够使所述疾病症状消退并且为HLA单倍型HLA-A0201的HBV患者(本文称为“症状消退的HLA-A201HBV患者”)获得的新鲜血液中分离外周血淋巴细胞(PBL)。
首先将血液肝素化并使用菲可帕克密度梯度离心分离PBL。然后将PBL在Hanks平衡盐溶液(HBSS)(Invitrogen，卡尔斯巴德，加拿大)中洗涤三次，重新悬浮在Aim-V培养基(2％人AB血清(Invitrogen，卡尔斯巴德，加拿大))中，用1μM的HBV核心18-27表位(“HBc18-27肽”；FLPSDFFPSV；SEQ IDNO：25；Primm SRL，米兰，意大利)加20U/ml白细胞介素2-(R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州)刺激，以及以4×106个细胞/孔平铺在24孔板上10天。
然后，将如上制备的HBc18-27特异性CD8+T细胞在37℃用带有HBc18-27表位的藻红蛋白(PE)结合的HLA-A2I类五聚体(本文称为“HBc18-27-HLA-A201五聚体”和/或“HLA-A2五聚体”)(Proimmune，牛津，英国)标记30分钟，并使用抗PE微珠(Miltenyi Biotech，Surrey，英国)通过磁性细胞分选纯化。在分离后，将细胞用结合Cy-chrome的抗CD8+(BDPharmingen，圣地亚哥，加拿大)标记，并且使用FACScan流式细胞测定器(BDBiosciences，圣地亚哥，加拿大)通过荧光激活细胞分选术(FACS)测定染色T细胞的百分比，并使用CellQuest软件(BD Biosciences)分析。在Gehring等的论文(通过引用方式并入本文)中进一步说明了所用的流式细胞计量术的方法。结果示于图2A中。
然后，使用如在John Wiley and Sons，Inc.的“Current Protocols in Immunology”Copyright2007中描述的有限稀释法来克隆如上所述的CD8+和HBc18-HLA-A201五聚体阳性T细胞，并且使用异源辐照PBL(allogeneic irradiated PBL)作为饲养细胞在含有1.5μg/ml植物凝集素(Sigma-Aldrich，多塞特，英国)的Aim-V 2％AB血清(Invitrogen，卡尔斯巴德，加拿大)、20U/ml IL-2、10ng/ml IL-7和10ng/ml IL-15(R&D，明尼阿波利斯，明尼苏达州)中扩展。将细胞以1个细胞/孔平铺到96孔板上，并且通过根据在Gehring等的论文(通过引用的方式并入本文)中提供的方案通过对IFN-γ进行细胞内细胞因子染色来测试T细胞生长阳性孔对HBc18-27的反应性。
然后使用特异性HBc18-27HLA-A201五聚体(Proimmune，牛津，英国)筛选对肽具有高度反应性的阳性孔，并且为进一步研究选择T细胞克隆(本文称为C183)。图2A中显示的结果说明，100％的CD8+和HBc18-27-HLA-A201五聚体反应性T细胞被检测。使用T细胞受体(TCR)Vβ单克隆抗体(Beckman Coulter，Fullerton，加拿大)板测试克隆形成能力。该操作包括使用Vβ抗体板，其对所有已知的Vβ链家族成员染色并且其中只有一条Vβ链阳性染色意味着极大可能是该克隆的所有T细胞均表达相同的TCR。因此，如图2B中所示，得到的C183的TCR Vβ分布证实，来源于C183的所有T细胞均为Vβ8阳性，这说明C183具有同质性(可能是它们都源自单个细胞)并因此具有克隆形成能力。
因此C183被显示为克隆的CD8+、HBc18-27特异性细胞毒性T细胞克隆，并且在37℃在5％CO2增湿培养箱中在Aim-V 2％AB血清、20U/ml IL-2、10ng/ml IL-7和10ng/ml IL-15(R&D Systems，Abingdon，英国)中生长和维持。
实施例2
C183T细胞克隆识别肿瘤细胞和人原代肝细胞
HepG2是从原代肝细胞性肝癌肿瘤(HCC)中分离的HLA-A2+肝细胞样肿瘤细胞系。HepG2细胞(美国典型菌种收藏所，罗克福德，马里兰州，American Type Culture Collection，Rockford，MD)在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)、20mM HEPES、0.5mM丙酮酸钠、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、MeM氨基酸、L-谷氨酰胺、MeM非必需氨基酸(Invitrogen，卡尔斯巴德，加拿大)和5μg/ml抗疟喹啉(Plasmocin)(InvivoGen，圣地亚哥，加拿大)以防止支原体污染的RPMI 1640中生长和维持。该细胞系的衍生物，HepG2.105(由Freiberg大学的Michael Nassal提供)被改造成在强力霉素依赖性调节剂(如在Sun and Nassal，2006中所述，其使病毒抗原以各种水平被表达)的控制下表达完整的HBV基因组。载体控制亲代细胞系，HepG2TA2-7(由Freiberg大学的Michael Nassal友情提供)用强力霉素依赖性调节剂而不是HBV基因组来稳定地转染。HepG2.105和HepG2TA2-7细胞系在补充有10％经核准的四环素FBS(BD Biosciences，圣地亚哥，加拿大)、20mM HEPES、0.5mM丙酮酸钠、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、MeM非必需氨基酸(Invitrogen)、200μg/ml G418硫酸盐、80μg/ml潮霉素B(AutogenBioclear，威尔特郡，英国)的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基中生长。将强力霉素(0.1至100ng/ml，BD Biosciences)加入到培养物中以调节HBV表达。
在37℃下用0.75μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE；Invitrogen)标记标准HepG2细胞10分钟。洗涤细胞，并在冰上用10-8M HBc18-27肽(Primm SRL，米兰，意大利)脉冲标记所述CFSE标记的靶标1小时。在24孔板中将未标记的(0M HBc18-27肽)和CFSE标记的(加HBc18-27肽)HepG2细胞以1∶1比例(每种HepG2细胞系2×105个细胞)混合在一起并且孵育过夜以使HepG2贴壁。为了确定C183是否能够杀死HCC肿瘤细胞，将从实施例1中得到的C183克隆与粘附到孔中的HepG2细胞(“靶标”)共培养。将共计4×105个C183克隆加入到靶标中并且在37℃孵育5小时。得到的效应子(C183)∶靶标(未标记的+CFSE标记的HepG2细胞)的比值为1∶1。共孵育5小时后，通过胰蛋白酶消化收集HepG2细胞，并且通过在加入或未加入C183的孔中比较肽脉冲标记过的靶细胞与未脉冲标记过的靶细胞的比值来确定细胞毒性。图3中所示的结果说明，与C183共培养的CFSE阴性细胞(无HBc18-27肽)剩余，而如最后一列所示，几乎所有的HBc18-27和CFSE阳性的HepG2细胞均被C183清除。结果表明，HBc18-27特异性细胞毒性T细胞克隆，C183，能够杀死呈递HBV肽的肿瘤细胞。
此外，为了确定C183是否能够识别由HCC细胞呈递的内源性加工的抗原，将C183与HepG2.105或HepG2TA2-7对照系共培养而后测试细胞因子产生和细胞毒性脱粒(CD107a+染色)(间接测量杀死能力)。将各HepG2.105和HepG2TA2-7细胞系的1×105个细胞分别接种到96孔板中并孵育过夜以使HepG2贴壁。为了进行细胞毒性脱粒测定，首先将CD107a-PE抗体(BDPharmingen，圣地亚哥)加入到所有孔中，之后将全部1×105个C183克隆加入到每个具有贴壁的HepG2.105或HepG2TA2-7对照系的孔中，并且在37℃下孵育5小时。得到的效应子(C183)∶靶标(HepG2.105或HepG2TA2-7对照系)的比为1∶1。孵育后，收集C183T细胞，洗涤并用结合Cy-chrome的抗CD8+(BD Pharmingen，圣地亚哥，加拿大)染色，然后使用Cytofix/Cytoperm(BDPharmingen，圣地亚哥)根据制造商的说明书透化和固定。洗涤细胞并在冰上用PE结合的抗人IFN-γ抗体(R&D Systems)孵育30分钟，然后洗涤并使用FACScan流式细胞测定器(BD Biosciences，圣地亚哥，加拿大)通过流式细胞计量术分析以及使用CellQuest软件(BD Biosciences)分析。在Gehring等的论文(通过引用的方式并入本文)中进一步说明了所用的流式细胞计量术方法。
如图4A中所示，C183没有对HBV阴性的对照细胞系HepG2TA2-7产生应答。然而，如图4B中所示，C183与表达HBV的HepG2.105细胞的共培养刺激IFN-γ产生和脱粒，这表明C183克隆识别由肝细胞性肝癌细胞内源性加工和呈递的HBc18-27表位。
为了确定C183T细胞克隆是否能够应答天然感染的肝细胞，根据下述操作，从HLA-A2+或HLA-A2-外植的慢性HBV肝脏中分离原代肝细胞并根据下述步骤将其与C183共培养。
根据协会的伦理道德准则，征得同意后，从HLA-A2+或HLA-A2-外植的慢性HBV患者中得到肝组织。在William′s E培养基(Sigma-Aldrich，多塞特，英国)中收集组织切片并在4℃维持最多2小时，之后分离细胞。通过Strain等人(Strain，Ismail et al.1991)所述的用于处理人类肝脏的酶灌注法加上一些改进来分离肝细胞。简言之，切割下约100至200g的部分肝脏，并将内径为3mm的管插入单一表面上暴露的血管中。以50ml/min，依次用500mlPBS-HEPES洗液(以除去William′s E培养基)、500ml PBS-HEPES-0.5mMEGTA以及再次用500ml PBS-HEPES洗液(溶液购自Invitrogen Ltd.)灌注组织。最后，采用再循环，灌注保持在41℃的300ml酶溶液(0.05％胶原酶(Roche，印第安纳波利斯，印第安纳州)、0.012％透明质酸酶(Sigma，多塞特，英国)、0.025％分散酶II(Roche)、0.005％DNA酶(Roche)(含有5mM CaCl2))，并且继续进行酶消化10至20分钟直到判断肝已经基本软化。在200ml的含有10％FBS、5mM CaCl2的Hanks平衡盐溶液(Invitrogen Ltd.)中机械分离组织。将细胞悬液经由60-μm细胞滤过器过滤并在4℃以37×g沉淀10分钟。将细胞在Hanks平衡盐溶液中洗涤三次，之后，测定生活力和收率。在分离之后立即使用纯化的肝细胞。将100,000个原代肝细胞/孔加入到96孔板中，并且与用于脱粒的抗CD107a-PE抗体(BD Pharmingen，圣地亚哥)加10μg/ml布雷菲德菌素A(Sigma-Aldrich)一起，将75,000个C183克隆，加入到各个孔中5小时。孵育后，收集、洗涤T细胞并用结合Cy-chrome的抗CD8+(BDPharmingen，圣地亚哥，加拿大)对其染色，然后使用Cytofix/Cytoperm(BDPharmingen，圣地亚哥)根据制造商的说明书对其透化和固定。洗涤细胞洗涤并在冰上用FITC结合的抗人IFN-γ抗体(R&D Systems，Abingdon，英国)孵育30分钟，然后洗涤并使用FACScan流式细胞测定器(BD Biosciences，圣地亚哥，加拿大)通过流式细胞计量术分析并且使用CellQuest软件(BDBiosciences)分析。在Gehring等的论文(通过引用的方式并入本文)中进一步说明了所用的流式细胞计量术方法。
图5中的结果显示，C183应答HLA-A2阳性HBV感染的原代肝细胞而不应答HLA-A2阴性HBV感染的肝细胞或HLA-A2+未感染的肝细胞从而释放的细胞毒性颗粒(通过CD107a染色测量)，这表明C183能够识别天然感染的人原代肝细胞。
实施例3
识别其它HLA-A2亚型和变体肽
慢性HBV感染主要是亚洲的问题，因此重要的是，知道HBc18-27特异性TCR是否能够识别在亚洲人口中占支配地位的HLA-A2亚型。HBV总共有五种基因型(A、B、C、D和G)。由HBV基因型B和C表达的HBc18-27表位(FLPSDFFPSI；SEQ ID NO：26)在亚洲是最普遍的。在欧洲和美国最普遍的基因型A和D(FLPSDFFPSV；SEQ ID NO：25)的特征在于第27位是缬氨酸，而基因型B和C的特征在于第27位是异亮氨酸。这对HBV患者呈递HBc18-27表位的能力可具有深刻的影响或者其可影响表位的TCR识别。
使用Epstein-Barr病毒(EBV)转化的具有已知的HLA-A2亚型的B细胞(由新加坡WHO Immunology and Training Research Centre的Chan Soh Ha教授友情提供)来测定C183识别由HLA-A2 MHC I类家族的不同亚型呈递的基因型B和C以及A和D的HBc18-27表位的能力。在这项操作中可以使用来自任何其它来源的EBV转化的B细胞。在25℃用浓度渐增(1pM-1000pM)的来源于HBV基因型A/D或者HBV基因型B/C的HBc18-27肽(HBV基因型A/D＝FLPSDFFPSV；Primm SRL；HBV基因型B/C＝FLPSDFFPSI，Genscript，皮斯卡塔韦，新泽西州)装载EBV转化的B细胞(105个细胞/孔)。将EBV B细胞用HBSS洗涤以除去过量的肽，并在10ug/ml布雷菲德菌素A存在下与7.5×104个C183共培养5小时。如在Gehring等的论文(通过引用的方式并入本文)中所述，通过细胞内细胞因子染色来测量IFN-γ的产生以确定T细胞的激活。
结果示于图6中。结果显示了C183识别来源于四种不同HBV基因型(A、B、C和D)的HBc18-27表位的能力，以及HBc18-27表位由三种最主要的HLA-A2亚型(HLA-A201、HLA-A206和HLA-A207)呈递。以％IFN-γ+细胞来绘制C183T细胞的应答。黑条表示能够对来源于HBV基因型A/D的HBc18-27表位产生应答的IFN-γ+C183T细胞的频率(C18-V)，而灰条表示能够对来源于HBV基因型B/C的HBc18-27表位产生应答的C183T细胞的频率(C18-I)。数据显示，C183识别由(A)HLA-A201；(B)HLA-A206；和(C)HLA-A207MHC I类分子呈递的HBc18-27表位。C183以高度敏感度(≤1pM)识别来源于全部基因型的HBc18-27表位，并且当由三种最主要的HLA-A2亚型(A)A0201、(B)A0206和(C)A0207呈递时对表位的识别几乎相同。
为了进一步显示HBc-18-27TCR转导的T细胞识别由多种HLA-A2亚型呈递的HBc18-27表位和多种HBc18-27表位的突变体，用浓度渐增的HBV基因型A/D HBc18-27表位(图12(A))和HBV基因型B/C HBC18-27表位(图12(B))(所述序列在表1中提供)装载表达HLA-A0201、HLA-A0206或HLA-A0207亚型的EBV转化的B细胞，并与HBc-18-27TCR转导的T细胞共培养5小时。通过对IFN-γ进行细胞内细胞因子染色来测量T细胞的激活。图12(A)和(B)中所示的结果显示，HBc-18-27TCR转导的T细胞识别由多种HLA-A2亚型呈递的HBc18-27表位。
图12(C)显示了当将HLA-A2+T2细胞用HBc18-27表位的各种突变肽装载并与HBc-18-27TCR转导的T细胞共培养5小时时的结果。通过对IFN-γ的细胞内细胞因子染色来确定T细胞对突变肽的识别。表1中提供了突变肽的序列。从结果可以看出，HBc-18-27TCR转导的T细胞识别HBc18-27表位的各种突变体。unstim 1和unstim 2指其中未用任何肽装载的HLA-A2+T2细胞的对照组。
实施例4
C183T细胞受体α和β链DNA的分离
使用TRIzol(Invitrogen)从5×106个C183克隆中分离总RNA。TCR α和β链的克隆在合同的基础上由Primm SRL(米兰，意大利)进行，并在提供在Topo blunt II克隆载体中以用于下游克隆。
序列分析显示，在C183中存在一条TCRβ链(Vβ8.2)和一条TCRα链(Vα3)。使用免疫遗传学V-Quest运算法则(http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/share/textes/)进行的其它DNA序列分析鉴定出在Vα3链中的3个特殊的互补性决定区(CDR)(CDR1α：SEQ ID NO：9，CDR2α：SEQ ID NO：10，CDR3α：SEQ ID NO：11)和在Vβ8.2链中的3个特殊的CDR(CDR1β：SEQ ID NO：21，CDR2β：SEQ ID NO：22，CDR3β：SEQ ID NO：23)。
实施例5
含有HBc18-27特异性TCR(HBc18-27 TCR)的逆转录病毒构建体以及淋巴细胞转导
使用5′Not-1位点和3′BsrG1位点(New England Biolabs，伊普斯威奇，马萨诸塞州)，将根据上述实施例4制备的TCR Vα3和TCR Vβ8.2cDNA单独克隆到如在Engels，Cam et al.2003中所述的逆转录病毒载体MP71(由英国伦敦Royal Free and UCL Medical School的Hans Stauss教授友情提供)中。将TCR Vα3、Vβ8.2和MP71载体用10U的各种酶在37℃消化1小时。通过电泳在1％琼脂糖凝胶上分离消化产物并使用Qiagen凝胶提取试剂盒纯化。将TCR链和MP71载体以1∶1比例混合并用T4DNA连接酶(Promega)在4℃连接过夜以形成逆转录病毒构建体-MP71-TCR Vα3和MP71-TCR Vβ8.2。然后对这些构建体测序以确认DNA插入正确。
为了确定所克隆的TCR的表达和功能，将所述构建体用于制备逆转录病毒上清液，该上清液进一步用于如下所述的T细胞转导。用在每种构建体中发现的病毒长末端重复(LTR)驱动插入的α和β链的表达。
使用瞬时转染方法制备逆转录病毒上清液，该方法包括使用Phoenix双嗜性包装细胞系(Clontech Laboratories，US)，该细胞系首先以2×106个细胞/平皿平铺并在Iscove氏改良Dulbecco氏培养基(IMDM)、10％FBS、25mMHEPES、Glutamax(Invitrogen)和5ug/ml Plasmocin(Invivogen)中贴壁。使用CaCl2方法在24小时内用9μg各MP71-TCR Vα3、MP71-TCR Vβ8.2连同6μg的双嗜性包膜(由英国伦敦Royal Free and UCL Medical School的Hans Stauss教授友情提供)使细胞瞬时共转染。然后用Aim-V 2％人AB血清更换IMDM并且在为转导收集逆转录病毒上清液之前，使Phoenix细胞孵育另外24小时。
使用健康供体和慢性HBV患者外周血淋巴细胞(PBL)来测试克隆的HBc18-27TCR的表达和功能。通过菲可密度梯度离心在征得同意下从志愿者中分离外周血单核细胞(PBMC)。将PBMC用600U/ml白细胞介素2(IL-2；R&D Systems)和50ng/ml抗CD3(OKT-3；eBioscience，圣地亚哥，加拿大)刺激48小时。在4℃下用30ug/ml重组人纤维连接片段(Retronectin)(Takara Bio，大津市滋贺县，日本)涂覆未处理的24孔组织培养平板过夜。然后用HBSS洗涤孔并用PBS 2％BSA封阻30分钟。收集、洗涤、计数淋巴细胞，并且将5×105个细胞平铺到涂覆有重组人纤维连接片段的孔中并与如上所述收集的逆转录病毒上清液混合。将包括作为阴性对照的模拟转导的细胞用来源于未用逆转录病毒载体转染的Phoenix细胞的上清液培养。将IL-2加入到孔中直到终浓度为600U/ml。在逆转录病毒上清液中孵育淋巴细胞24小时，之后用Aim-V 2％人AB血清加100U/ml IL-2更换培养基。使转导的和模拟转导的细胞继续生长3天。3天后，通过免疫荧光染色在TCR转导的和模拟转导的细胞中测量TCR的细胞表面表达。通过流式细胞计量术定量CD8-PE-Cy7(BD Biosciences)、Vβ8-PE表达(Beckman Coulter)和HLA-A201-HBc 18-PE五聚体(Proimmune)染色。使用FACs Canto流式细胞测定器(BD Biosciences)对染色的细胞进行流式细胞计量术，并且用FACs Diva程序(BD Biosciences)分析数据。
如图7A中所示，与模拟转导的细胞相比，Vβ8在HBc18-27TCR转导的淋巴细胞中的表达显著增加，模拟转导的细胞仅表达内源性水平的Vβ8。在CD8+和CD8-细胞中都观察到Vβ8的表达。为了适当地结合五聚体，要求引入的α和β链以及共受体CD8的正确配对和协同相互作用。CD8+HBc18-27TCR转导的T细胞结合HBc18-27-HLA-A201五聚体，表明同样表达了Vα3TCR链并且引入的TCR在转导的淋巴细胞的细胞表面上正确配对(图7B)。
图7(C)中证实了HBc18-27TCR的转导效率，其显示了来源于5个健康人、5个HBeAg+的慢性HBV患者(HBV DNA＞107个拷贝/ml)和5个HBeAg-的慢性HBV患者(HBV DNA＜106个拷贝/ml)的Vβ8+T细胞的平均频率。显示了来源于5个健康人、5个HBeAg+的慢性HBV患者(HBV DNA＞107个拷贝/ml)和5个HBeAg-的慢性HBV患者(HBV DNA＜106个拷贝/ml)的HBc18-27-A201特异性五聚体+T细胞的平均频率的图7(D)证实了转导的HBc18-27TCR正确配对并结合了HBc18-27-HLA-A201五聚体。这些数据证明，来源于健康供体和慢性HBV患者的T细胞均能以相似的效率用HBc18TCR转导。
实施例6
HBc18-27TCR转导的T细胞的功能
为了证实引入的HBc18-27TCR是功能性的，使用HLA-A2阳性T2细胞(美国典型菌种收藏所(罗克福德，马里兰州))来刺激HBc18-27TCR转导的或者模拟转导的淋巴细胞。在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)、20mMHEPES、0.5mM丙酮酸钠、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、MeM氨基酸、Glutamax、MeM非必需氨基酸(Invitrogen Ltd)和5μg/ml Plasmocin(InvivoGen，圣地亚哥，加拿大)的RPMI 1640中培养T2细胞。用1μg/mlHBc18-27肽脉冲标记T2细胞1小时而后洗涤除去过量的肽。
为了刺激根据实施例5制备的HBc18-27TCR转导的淋巴细胞(本文称为HBc18-27TCR转导的T细胞)，在37℃用2ug/ml布雷菲德菌素A将HBc18-27TCR转导的或者模拟转导的T细胞与两种不同类型的T2细胞(用HBc18-27肽脉冲标记过的和未脉冲标记过的)共培养过夜。然后洗涤HBc18-27TCR转导的和模拟转导的T细胞并用抗CD8-PE-Cy7(BD Pharmingen，圣地亚哥，加拿大)染色，使用Cytofix/Cytoperm(BD Pharmingen)根据制造商的说明书固定和透化。然后在冰上对T细胞进行TNF-α-Alexa 488、IL-2-PE和IFN-γ-APC(BD Biosciences)染色30分钟。洗涤细胞洗涤并使用FACs Canto流式细胞测定器(BD Biosciences)通过流式细胞计量术分析，并且用FACs Diva程序(BDBiosciences)分析数据。
图8A中显示了结果。在HBc18-27表位存在或缺失的情况下，模拟转导的T细胞没有产生任何细胞因子(即IFN-γ、TNF-α或IL-2)。在没有肽的情况下，HBc18-27TCR转导的T细胞未对T2细胞产生应答(图8A，第1行)，但是对HBc18-27肽装载的T2细胞产生应答并产生了IFN-γ、TNF-α和IL-2(图8A，第3行)，这表明当其在原代T细胞中表达时，引入的HBc18-27TCR是功能性的。此外，引入的HBc18-27TCR在CD8-细胞(CD4+细胞)以及CD8+细胞中是功能性的，这可能使其在免疫治疗中具有更广泛的用途，因为CD4+T细胞提供了额外的IL-2以维持T细胞存活并提供共刺激性配体(如CD40L)，其具有增强B细胞应答的能力。
图8(B)显示了来源于慢性HBV患者的HBc18-27TCR转导的T细胞与来源于健康供体的转导的T细胞具有同样的功能。如图8A中所示，显示了来自5个健康人、5个HBeAg+的慢性HBV患者(HBV DNA＞107个拷贝/ml)和5个HBeAg-的慢性HBV患者(HBV DNA＜106个拷贝/ml)的IFN-γ、TNF-α和IL-2阳性细胞的平均频率。结果显示，在各患者群中，用HBc18-27-A201TCR转导的T细胞变成多功能的，并且具有与细胞因子阳性细胞相似的频率。
实施例7
HBc18-27TCR转导的T细胞的亲和性
由于引入的HBc18-27TCR的表达水平可能会降低，与原始T细胞克隆(C183)相比，所改造的T细胞可能对实际的病毒表位具有较低的亲和性。为了验证这种假设，根据实施例6中所述的方案用浓度在1fg/ml至1μg/ml范围内变化的HBc18-27肽脉冲标记HLA-A2阳性T2细胞(美国典型菌种收藏所，罗克福德，马里兰州)。将肽装载的T2细胞与来源于5个健康供体、5个HBeAg+的慢性HBV患者(HBV DNA＞107个拷贝/ml)和5个HBeAg-的慢性HBV患者(HBV DNA＜106个拷贝/ml)的TCR转导的T细胞以及原始T细胞克隆C183共培养5小时。通过对IFN-γ的细胞内细胞因子染色来测量T细胞的激活。以IFN-γ最大应答的百分比来显示结果，因为HBc18-27TCR转导的细胞的频率在患者中是变化的，而C183对HBc18-27表位的特异性总是100％。结果显示，CD8+HBc18-27TCR转导的T细胞显示了与降至1pg/ml的C183相同的亲和性(图9A)。
以相同的测定法确定HBc18-27TCR转导的CD4+T细胞的亲和性。把CD8-HBc18-27特异性细胞认为是CD4+T细胞，因为它们能够以抗原特异性、剂量依赖性的方式对HBc18-27表位发生应答。与C183相比，CD4+HBc18-27TCR转导的T细胞显示了略低的亲和性。CD8+和CD4+T细胞之间对病毒表位的亲和性的差异很可能是由于CD8+共受体结合，其稳定了TCR与HLA-A2分子的相互作用。在CD4+T细胞上没有CD8+共受体，并因此亲和性略微下降但仍为高度敏感的。
实施例8
HBc18-27 TCR DNA序列的密码子最优化
由于在遗传密码中存在多余信息，大多数氨基酸可由多种密码子编码，在生物体内以不同的频率和效率使用密码子并且实际上可导致蛋白质的低效率翻译。由于遗传变异和在T细胞发育过程中出现的重组事件，为HBc18-27TCR编码的DNA可能由在人体内未被最优化翻译的密码子组成。因此，对HBc 18-TCR的Vβ8.2和Vα3链进行密码子最优化从而致使HBc 18-27TCR的表达更有效并提高敏感度和功能(由Genscript，皮斯卡塔韦，新泽西提供服务)。
使用如上所述的5′Not-1和3′BsrG1限制性内切酶位点将密码子最优化的Vα3和Vβ8.2各自克隆到MP71载体中。为了证实密码子最优化的TCR(本文称为HBc18-Opt-TCR)仍然能够被表达，用如上所述的HBc18-Opt-Vα3和HBc18-Opt-Vβ8.2TCR构建体转导PBL。对于HBc18-27野生型TCR(本文称为HBc18-WT-TCR)，也用HBc18-WT-Vβ8.2(来自实施例7中的MP71-TCRVβ8.2)和HBc18-WT-Vα3(来自实施例7中的MP71-TCR Vα3)转导PBL用作比较。转导后3天通过流式细胞计量术，分析HBc18-27转导的PBL以检测Vβ8表达和结合HBc18-HLA-A201五聚体(Proimmune，牛津，英国)的能力。结果显示，与HBc18-WT-TCR(21.1％)转导的细胞相比，用HBc18-Opt-TCR(21.5％)转导的PBL的Vβ8+T细胞的频率是相似的(图10A)。
使用FACs Diva软件(BD Biosciences)通过平均荧光强度(MFI)测量在HBc18-Opt-TCR转导的淋巴细胞和HBc18-WT-TCR转导的淋巴细胞中表达的Vβ8的量(图10B)。减去同种型的值以确定特异性MFI。结果显示，在HBc18-Opt-TCR转导的淋巴细胞和HBc18-WT-TCR转导的淋巴细胞中，Vβ8的表达量几乎是相同的(图10B)。
为了确定结合HBc18-HLA-A201五聚体的能力，用抗CD8-PE-Cy7(BDPharmingen，圣地亚哥，加拿大)和HBc18-HLA-A201五聚体(Proimmune，牛津，英国)标记HBc18-Opt-TCR转导的淋巴细胞和HBc18-WT-TCR转导的淋巴细胞。使用FACs Canto流式细胞测定器(BD Biosciences，圣地亚哥，加拿大)通过荧光激活细胞分选术(FACS)测定染色的淋巴细胞的百分比并且使用FACs Diva程序(BD Biosciences)分析。结果显示，HBc 18-HLA-A201五聚体阳性细胞的频率在用HBc18-Opt-TCR转导的细胞中比用HBc18-WT-TCR转导的细胞中高两倍(图10C)，这说明与野生型序列相比，来源于密码子最优化的构建体的Vα3链可被更加有效地表达。由于在图10A中Vβ8的染色相同，五聚体结合的增加可能与更好地表达Vα3链从而在细胞表面上增加了正确配对的HBc18-27TCR的表达有关。
在证实了HBc18-Opt-TCR在转导的T细胞中被适当表达之后，我们测试了HBc18-Opt-TCR与HBc18-WT-TCR相比的功能性。根据实施例6中所述的方案，在有或没有HBc18-27肽加2μg/ml布雷菲德菌素A的情况下，用HLA-A2阳性T2细胞刺激HBc18-Opt-TCR转导的和HBc18-WT-TCR转导的或模拟转导的T细胞。然后用抗CD8PE-Cy7(BD Pharmingen，圣地亚哥，加拿大)标记T细胞并使用Cytofix/Cytoperm根据制造商的说明书对其固定和透化(BD Biosciences)。然后在冰上将细胞用抗IFN-γ-APC(BD Biosciences)染色30分钟，并且通过流式细胞计量术分析IFN-γ的产生。
结果显示，与用HBc18-WT-TCR转导的T细胞相比，用HBc18-Opt-TCR转导的IFN-γ阳性T细胞的频率增加了将近两倍(图11)。在有或没有HBc18-27肽的情况下，模拟转导的细胞都是阴性的。因此，五聚体阳性细胞的增加与能够应答装载肽的靶标的功能细胞的增加相关。
实施例9
HBc18-27TCR转导的T细胞杀死内源性表达HBV蛋白或者用HBV 18-27肽装载的HCC细胞系
在碘化丙锭(PI)存在下，以1∶1的效应子∶靶标比值将来源于各患者组(健康人、HBeAg(-)、HBeAg(+))的HBc18-27TCR转导的T细胞与DiOC标记的表达完整HBV基因组的HepG2细胞(HBV-HepG2)或者对照亲代细胞系(Ctrl-HepG2)共培养6小时。濒死的靶细胞为DiOC+/PI+。通过用抗CD11a-APC(BD Bioscience)染色从分析中排除T细胞。结果为3次实验的代表。效应T细胞被认为是IFN-γ+/CD8+细胞，其在用肽脉冲标记过的T2细胞刺激之后通过细胞内细胞因子染色而确定。图13(A)中所示的结果显示，来自健康供体或慢性HBV患者中的HBc18-27TCR转导的T细胞能够杀死内源性表达HBV蛋白的HCC细胞系。这说明，HBc18TCR转导的T细胞能够识别来源于表达HBV核心抗原的患者的肿瘤细胞。
为了确定TCR转导的T细胞是否能够杀死多种HLA-A2+HCC细胞系，将DiOC标记的HCC细胞系(HepG2得自ATCC；SNU-387，SNU-368得自韩国细胞库(Korean cell line bank))用浓度渐增的HBc 18-27肽标记，并且在碘化丙锭(PI)存在下，以1∶1的效应子胞∶靶标比值与HBc-18-27TCR转导的T细胞共培养6小时。濒死的靶细胞为DiOC+/PI+。通过用抗CD11a-APC(BD Bioscience)染色从分析中排除T细胞。结果是3次实验的代表。效应T细胞被认为是IFN-γ+/CD8+细胞，其通过在用肽脉冲标记过的T2细胞刺激之后的细胞内细胞因子染色而确定。图13(B)所示的结果显示，HBc18-27TCR转导的T细胞能够杀死多种HLA-A2+HCC细胞系。
实施例10
克隆对HBV包膜370-79表位(HBs370-79)具有特异性的乙型肝炎病毒特异性T细胞
根据实施例1的方法分离和制备外周血淋巴细胞(PBL)，并且将其用1μM的HBV包膜370-79表位(″HBs370-79肽″；SIVSPFIPLL；SEQ ID NO：56；Primm SRL，米兰，意大利)加20U/ml白细胞介素2-(R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州)刺激并以4×106个细胞/孔平铺到24孔板中10天。
使用IFN-γ捕捉试验根据制造商的说明书(Miltenyi Biotech，萨里，英国)富集HBs370-79特异性CD8+T细胞。
然后使用如在John Wiley and Sons，Inc.的“Current Protocols in Immunology”Copyright
2007中描述的有限稀释法克隆IFN-γ+HBs370-79-特异性T细胞，并且使用异源辐照PBL作为饲养细胞将在含有1.5μg/ml植物凝集素(Sigma-Aldrich，多塞特，英国)的Aim-V 2％AB血清(Invitrogen，卡尔斯巴德，加拿大)、20U/ml IL-2、10ng/ml IL-7和10ng/mlIL-15(R&D，明尼阿波利斯，明尼苏达州)中扩展。将细胞以1个细胞/孔平铺到96孔板上，并且根据在Gehring等的论文(通过引用的方式并入本文)中提供的方案通过对IFN-γ进行细胞内细胞因子染色来测试T细胞生长阳性孔对HBs370-79的反应性。选择T细胞克隆(本文称为E10-1D)用于进一步研究。
在37℃于5％CO2增湿培养箱中，在Aim-V，2％AB血清、20U/ml IL-2、10ng/ml IL-7和10ng/ml IL-15(R&D Systems，Abingdon，英国)中生长和维持E10-1D HBs370-79特异性细胞毒性T细胞克隆。
实施例11
HBs370-79特异性TCR转导的T细胞的亲和性和功能以及基因型变体肽的识别
采用HBs370-79特异性TCR转导的T细胞进行与实施例6中所述相似的实验。E10-1D T细胞克隆或HBs370-79TCR转导的T细胞识别HBs370-79表位装载的HLA-A2+T2细胞。用浓度渐增的HBs370-79肽装载T2细胞并与E10-1D或HBs370-79TCR转导的T细胞共培养5小时并对IFN-γ染色。数据显示为最大应答百分比以将各细胞系的不同频率标准化。图14(A)中所示的结果显示，HBs370-79特异性TCR是功能性的，但是与原始T细胞克隆E10-1D相比，HBs370TCR转导的T细胞的亲和性较低。
此外，采用HBs370-79特异性TCR转导的T细胞进行与实施例3中所述相似的实验。HBs370-79TCR转导的T细胞识别HBs370-79表位的基因型变体(所述基因型变体的序列在表2中提供)。将HBs370-79TCR转导的T细胞与载有1μg/ml各种基因型的肽的HLA-A2+T2细胞共培养5小时，并且通过CD107a标记和对IFN-γ染色来测定激活。基因型A&D序列是相同的。图14(B)中所示的结果显示，HBs370-79特异性TCR识别HBs370-79表位的基因型变体。
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Claims (42)
1.一种分离细胞，其包含至少一种HBV表位反应性外源T细胞受体和/或其片段。
2.根据权利要求1所述的细胞，其中，所述HBV表位为HLA-A2限制性的。
3.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述HBV表位包含至少一种乙型肝炎核心抗原、至少一种肝炎包膜抗原和/或它们的突变体。
4.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述HBV表位包含HBc 18-27、HBs370-79和/或它们的突变体。
5.根据权利要求4所述的细胞，其中，所述HBc18-27表位包含SEQ IDNO：25和/或SEQ ID NO：26，并且所述HBs370-79表位包含选自SEQ IDNO：56至58中的任一序列。
6.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其进一步包含至少一种第二HBV表位反应性外源T细胞受体和/或其片段，其中，所述第二HBV表位与第一HBV表位不同。
7.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述外源T细胞受体包含至少一条α链，该α链包含：
(a)选自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11和/或它们的突变体中的至少一种序列；和/或
(b)选自SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46和/或它们的突变体中的至少一种序列。
8.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述外源T细胞受体包含至少一条α链，该α链包含序列：
(a)SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11，或者它们的突变体；和/或
(b)SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46，或者它们的突变体。
9.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述外源T细胞受体包含至少一条β链，该β链包含选自下列序列中至少一种序列：
(a)SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23和/或它们的突变体；和/或
(b)SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54和/或它们的突变体。
10.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述外源T细胞受体包含至少一条β链，该β链包含序列：
(a)SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23或者它们的突变体；和/或
(b)SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54或者它们的突变体。
11.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述外源T细胞受体包含：
(a)至少一条与SEQ ID NO：12或其片段具有至少80％氨基酸同一性的α链和/或至少一条与SEQ ID NO：24或其片段具有至少80％氨基酸同一性的β链；和/或
(b)至少一条与SEQ ID NO：47或其片段具有至少80％氨基酸同一性的α链和/或至少一条与SEQ ID NO：55或其片段具有至少80％氨基酸同一性的β链。
12.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述外源T细胞受体包含：
(a)至少一条SEQ ID NO：12的α链和/或至少一条SEQ ID NO：24的β链：和/或
(b)至少一条SEQ ID NO：47的α链和/或至少一条SEQ ID NO：55的β链。
13.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述细胞为至少一种造血干细胞。
14.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述细胞为至少一种外周血淋巴细胞(PBL)源T细胞。
15.一种分离多核苷酸，其包含至少一种编码至少一条α链的序列和/或至少一种编码至少一条β链的序列，其中，所述α链和β链为至少一种HBV表位反应性外源T细胞受体。
16.根据权利要求15所述的分离多核苷酸，其中，所述编码α链的序列包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5中的至少一种序列、选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6中的至少一种序列以及选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7中的至少一种序列，和/或所述编码β链的序列包含选自SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：17中的至少一种序列、选自SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：18中的至少一种序列以及选自SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：19中的至少一种序列。
17.根据权利要求15或16所述的分离多核苷酸，其中，所述编码α链的序列包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7，和/或所述编码β链的序列包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19。
18.根据权利要求15～17中任一项所述的分离多核苷酸，其中，所述HBV表位反应性外源T细胞受体的α链与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：8具有至少80％的序列同一性，并且所述HBV表位反应性外源T细胞受体的β链与SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：20具有至少80％的序列同一性。
19.根据权利要求15～18中任一项所述的分离多核苷酸，其中，所述编码α链的序列选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8中，和/或所述编码β链的序列选自SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：20中。
20.根据权利要求15所述的分离多核苷酸，其中，所述述编码α链的序列包含SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42，和/或所述编码β链的序列包含SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50。
21.根据权利要求15或20所述的分离多核苷酸，其中，所述HBV表位反应性外源T细胞受体的α链与SEQ ID NO：43具有至少80％的序列同一性，并且所述HBV表位反应性外源T细胞受体的β链与SEQ ID NO：51具有至少80％的序列同一性。
22.根据权利要求15、20和21中任一项所述的分离多核苷酸，其中，所述编码α链的序列包含SEQ ID NO：43，和/或所述编码β链的序列包含SEQ ID NO：51。
23.一种分离多肽，其由根据权利要求15～22中任一项所述的至少一种多核苷酸编码。
24.一种分离多肽，其包含：
(a)选自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11中的至少一种氨基酸序列和/或选自SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23中的至少一种额外氨基酸序列；和/或
(b)选自SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46中至少一种氨基酸序列和/或选自SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54中的至少一种额外氨基酸序列。
25.根据权利要求24所述的分离多肽，其中：
(a)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：12具有至少80％的氨基酸同一性，并且所述额外氨基酸序列与SEQ ID NO：24具有至少80％的氨基酸同一性；和/或
(b)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：47具有至少80％的氨基酸同一性，并且所述额外氨基酸序列与SEQ ID NO：55具有至少80％的氨基酸同一性。
26.根据权利要求23～25中任一项所述的多肽，其中，所述多肽为至少一种HBV表位反应性外源T细胞受体。
27.根据权利要求26所述的多肽，其中，所述HBV表位为HBc18-27、HBs370-79和/或它们的突变体。
28.根据权利要求23～27中任一项所述的多肽，其中，所述多肽为至少一种可溶性TCR或其片段。
29.根据权利要求28所述的多肽，其中，所述可溶性TCR或其片段与至少一种抗病毒药连接。
30.一种构建体，其包含与至少一种启动子可操作地连接的根据权利要求15～22中任一项所述的多核苷酸。
31.一种逆转录病毒载体，其包含权利要求30所述的构建体或者根据权利要求15～22中任一项所述的多核苷酸。
32.一种T细胞，其包含权利要求31所述的载体。
33.一种制备至少一种T细胞的方法，所述T细胞包含用于递送到至少一种受试对象的至少一种HBV表位反应性外源T细胞受体，该方法包括用根据权利要求30所述的构建体或根据权利要求31所述的载体转导至少一种从所述受试对象中分离的T细胞。
34.一种制备至少一种HBV表位反应性外源T细胞受体的方法，该方法包括：
(a)从至少一种消退了HBV感染症状的HBV感染个体中分离至少一种HBV表位反应性T细胞；
(b)由步骤(a)的HBV表位反应性T细胞克隆编码至少一种T细胞受体的至少一条α链和/或β链的至少一种多核苷酸序列；
(c)将步骤(b)的多核苷酸序列递送至至少一种细胞；和
(d)在适合所述细胞表达所述HBV表位反应性外源T细胞受体的条件下孵育该细胞。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，在步骤(a)中分离的所述T细胞是HBc18-27表位反应性的和/或HBs370-79表位反应性的。
36.根据权利要求1～14和32中任一项所述的细胞用于治疗HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的用途。
37.一种在至少一种受试对象中治疗HBV和/或抑制HBV复活的方法，该方法包括向受试对象施用至少一种免疫治疗有效量的根据权利要求1～14和32中任一项所述的细胞、至少一种根据权利要求31所述的载体和/或至少一种根据权利要求23～29中任一项所述的多肽。
38.一种在至少一种受试对象中治疗HBV相关的肝细胞性肝癌的方法，该方法包括向受试对象施用至少一种免疫治疗有效量的根据权利要求1～14和32中任一项所述的细胞、至少一种根据权利要求31所述的载体和/或至少一种根据权利要求23～29中任一项所述的多肽。
39.一种诊断能够使HBV感染症状消退的至少一种受试对象的体外方法，该方法包括：
(a)从至少一种受试对象中采集至少一种样本；
(b)检测至少一种多核苷酸的存在，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：43、SEQID NO：51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列，或者主要由选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列组成，或者由选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列组成；和/或
(c)检测至少一种多肽的存在，所述多肽包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列，或者主要由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列组成；
其中，所述多核苷酸和/或多肽的存在标志着受试对象能够使HBV感染症状消退。
40.一种诊断至少一种受试对象患有HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌或者存在患有HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的风险的体外方法，该方法包括：
(a)从至少一种受试对象中采集至少一种样本；
(b)检测至少一种多核苷酸的存在，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列，或者主要由选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列组成，或者由选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列组成；和/或
(c)检测至少一种多肽的存在，所述多肽包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列，或者主要由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：47、SEQ IDNO：55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列组成；
其中，所述多核苷酸和/或多肽的缺失与受试对象患有HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌或者存在患有HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的风险的可能性相关。
41.至少一种根据权利要求1～14和32中任一项所述的细胞、至少一种根据权利要求31所述的载体和/或至少一种根据权利要求23～29中任一项所述的多肽在制备用于治疗HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的药物中的用途。
42.一种检测和/或治疗HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的试剂盒，该试剂盒包含至少一种根据权利要求1～14和32中任一项所述的细胞、至少一种根据权利要求31所述的载体和/或至少一种根据权利要求23～29中任一项所述的多肽。
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