CN107827959B

CN107827959B - 识别乙肝病毒(hbv)表面抗原s183-91表位的tcr及其用途

Info

Publication number: CN107827959B
Application number: CN201711099814.5A
Authority: CN
Inventors: 许嘉峰; 夏总平
Original assignee: Hangzhou Ever Slow Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-11-09
Filing date: 2017-11-09
Publication date: 2018-10-30
Anticipated expiration: 2037-11-09
Also published as: WO2019091347A1; CN107827959A

Abstract

本发明公开了一种分离抗原特异性T细胞以及从抗原特异性T细胞中克隆编码抗原特异性TCR基因的方法。本发明还提供了编码HBV表面抗原S183‑91特异性的TCR的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体。本发明的TCR能够与HBV S183‑91抗原短肽复合物FLLTRILTI‑HLA*A0201结合，同时转导了本发明TCR的细胞能够被特异性激活并且对靶细胞具有很强的杀伤作用。

Description

识别乙肝病毒(HBV)表面抗原S183-91表位的TCR及其用途

技术领域

本发明涉及能够识别源自HBV S183-91抗原短肽的TCR，本发明还涉及转导上述TCR来获得的S183-91特异性的T细胞，及他们在预防和治疗HBV感染相关疾病中的用途。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)感染人动物总科(包括人)的肝脏，并且引起称作肝炎的炎症。它是一种DNA病毒并且是引起病毒性肝炎的多种独立病毒中的一种。慢性HBV感染可最终导致肝硬化和肝细胞性肝癌(HCC)，而HCC是一种对目前的化疗反应非常差的致命疾病。

现有的治疗HBV感染的药物只能抑制而非消除HBV。虽然大多数HBV感染者对目前可用的治疗方法有反应，表现为肝组织学和血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平的改善，但是当停止治疗时，几乎所有患者都复发。此外，治疗HBV的更常见的方法包括使用如拉米夫定和阿德福韦的核苷酸类似物药物。然而，这些药物会导致患者的HBV产生抗药性。此时，原有的抗病毒药将几乎没有作用。

在一些受试对象中发现的天然产生的HBV表位特异性T细胞使该受试对象能够天生具有对HBV感染的有效控制。过去的研究已显示，持续/慢性HBV感染患者的HBV表位特异性T细胞缺失或功能改变。因此，随着人们对在HBV感染期间病毒与宿主相互作用的认识的增加，人们推测对慢性HBV感染患者的免疫系统进行治疗性重建可使HBV感染症状消退甚至消除HBV。由于其他疾病(通常是血液系统疾病)需要接受骨髓移植的慢性HBV感染者，在接受了对HBV具有自然免疫的捐献者的骨髓后，这些患者的慢性HBV感染症状消退，直至HBV完全消除，患者HBV表面抗原(HBsAg)恢复血清学正常。然而，仅仅因为HBV慢性感染去进行骨髓移植显然不现实。另外，注射疫苗，通过增强慢性乙肝患者自身的免疫力从而清除HBV的尝试到现在为止还没能让人看到希望。

治疗性疫苗策略失败的可能原因是由于HBV慢性感染者的免疫系统与健康人的免疫系统不同(比如抗原呈递效率不同)。此外，慢性HBV感染者体内的病毒抗原的持续大量产生会删除或耐受HBV抗原特异性T细胞。因此，慢性HBV感染患者的特征为HBV特异性CD4+和CD8+T细胞应答低下或缺失。

T细胞过继免疫治疗是将对靶细胞抗原具有特异性的反应性T细胞转入病人体内，使其针对靶细胞发挥作用。T细胞受体(TCR)是T细胞表面的一种膜蛋白，其能够识别相应的靶细胞表面的抗原短肽。在免疫系统中，通过抗原短肽特异性的TCR与短肽-主要组织相容性抗原(pMHC复合物)的结合引发T细胞与抗原呈递细胞(APC)直接的物理接触，然后T细胞及APC两者的其他细胞膜表面分子就发生相互作用，引起一系列后续的细胞信号传递和其他生理反应，从而使得不同抗原特异性的T细胞对其靶细胞发挥免疫效应。因此，本领域技术人员致力于分离出对HBV抗原表位具有特异性的TCR，以及将该TCR转导T细胞来获得对HBV抗原表位具有特异性的T细胞，从而使他们在细胞免疫治疗中发挥作用。

发明内容

本发明致力于解决上述问题，并且具体而言，采用外源T细胞受体(TCR)通过重新定向慢性HBV感染患者的淋巴细胞的特异性而提供了一种有效且高效的治疗HBV感染的新方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种HBV表位，所述HBV表位为HLA-A2限制性的，包含至少一种乙型肝炎表面抗原；优选地，所述HBV表位是由SEQ ID NO：31组成的HBs183-91表位。

一种HBV表位反应性T细胞受体(TCR)，所述T细胞受体特异性识别权利要求1所述的HBV表位。

一种分离细胞,所述细胞包含权利要求2所述的T细胞受体。

一种分离的多核苷酸，其包含至少一种编码权利要求2所述TCR的α链的序列，和至少一种编码权利要求2所述TCR的β链的序列。

进一步地，所述编码α链的序列包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：6中的至少一种序列、选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7中的至少一种序列以及选自SEQ ID NO：3和SEQID NO：8中的至少一种序列；

所述编码β链的序列包含选自SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：21中的至少一种序列、选自SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：22中的至少一种序列以及选自SEQ ID NO：18和SEQ IDNO：23中的至少一种序列。

进一步地，所述编码α链的序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10，所述编码β链的序列选自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:20或SEQID NO:25。

一种分离多肽，其由上述的至少一种多核苷酸编码得到。

进一步地，上述分离多肽包含：

包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的α链以及包含SEQ ID NO:26、SEQID NO:27和SEQ ID NO:28的β链。

进一步地，所述α链选自SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15，并且所述β链选自SEQ IDNO:29或SEQ ID NO:30。

进一步地，所述多肽为可溶性TCR或其片段。优选地，所述可溶性TCR或其片段的C-或N-末端结合有偶联物；优选地，与所述T细胞受体结合的偶联物为可检测标记物、治疗剂、蛋白激酶修饰部分或任何这些物质的组合；优选地，所述治疗剂为抗病毒药物或抗-CD3抗体。

一种载体，其包含上述的多核苷酸。

一种细胞，其包含上述的载体。

一种细胞，所述细胞的T细胞受体包含上述的分离多肽。

进一步地，所述细胞为造血干细胞或外周血淋巴细胞(PBL)源T细胞。

一种制备至少一种HBV表位反应性外源T细胞受体的方法，该方法包括：

(a)从消退了HBV感染症状的个体中分离外周血淋巴细胞(PBL)，从分离的淋巴细胞中分选能对HBs183-91抗原表位产生应答的T细胞，其中所述表位由SEQ ID NO:31组成；

(b)由步骤(a)分选的HBV表位反应性T细胞克隆编码T细胞受体α链和/或β链的多核苷酸序列；

(c)将步骤(b)的多核苷酸递送至细胞；和

(d)在适合所述细胞表达HBV表位反应性外源T细胞受体的条件下孵育该细胞。

本发明还涉及上述细胞、载体、多肽在制备用于治疗HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的药物中的用途，以及一种检测和/或治疗HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的试剂盒。

本发明的主要优点在于：本发明的TCR能够与HBV S183-91抗原短肽复合物FLLTRILTI-HLA*A0201结合，同时转导了本发明TCR的细胞能够被特异性激活并且对靶细胞具有很强的杀伤作用。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明；

图1是用Interferon-γ-PE标记的淋巴细胞的分选流式图；横轴是CD8-FITC,纵轴是IFN-γ-PE。R10表示进行分选的细胞群。

图2是一个细胞来源的cDNA产物，经过2轮nested PCR扩增出含CDR3区域的TCRα基因片段，进一步亚克隆到载体上，挑选了8个克隆，菌落PCR鉴定阳性克隆的琼脂糖凝胶电泳图。

图3：#1-#12为转染了1-12号TCRα/β基因对的T细胞。图3-1是TcR表达图；由于pHAGE质粒带有IRES-ZsGreen原件，因此转染的细胞会表达ZsGreen。图3-2为转染T细胞的五聚体(pentamer)结合能力图；圈门策略为:淋巴细胞->ZsGreen+/mTRBC+双阳性细胞->结合五聚体的细胞。

图4是效：靶比为10(E:T＝10)时，细胞杀伤实验的直方图；#1-#12为1-12对TCRα/β基因。HepG2_S183是S183多肽负载过、未加任何效应T细胞的靶HepG2细胞。C18表示效应T细胞是转染了C18TCRα/β基因，能够识别负载了C18多肽的HLA*A0201的靶细胞。HepG2_C18是C18多肽负载过、未加任何效应T细胞的靶HepG2细胞。

图5是根据不同效：靶比(E:T＝20；E:T＝10；E:T＝5)的细胞杀伤实验的直方图绘制的细胞杀伤曲线。

图6是T细胞分泌细胞因子的能力图。同样的#1-#12为转染了1-12号TCRα/β基因对的T细胞。C18表示效应T细胞是转染了C18TCRα/β基因，能够识别负载了C18多肽的HLA*A0201的抗原呈递细胞。0uM表示未负载任何多肽；1uM表示负载的多肽为1uM(C18负载的是C18多肽，#1-#12负载的是S183多肽)。图6-1是#1-#4的IFN-γ分泌图；图6-2是#5-#8的IFN-γ分泌图；图6-3是#9-#12的IFN-γ分泌图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，找到了能与HLA-A2限制性的HBV S183-91(其序列包含(SEQ ID NO:31)表位结合的细胞，且克隆了与所述表位能够特异性结合的TCR。本发明还提供了编码所述TCR的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体。另外，本发明还提供了转导本发明TCR的细胞。

术语“包含/包括”是指，在实施本发明的过程中可以结合使用各种组分、成分或步骤。因此,术语“包含/包括”涵盖了限制性更强的术语“主要由...组成”和“由...组成”。

术语“主要由...组成”是指,本发明的外源TCR多肽和/或多核苷酸组成一段序列的“实质”部分。本发明的外源TCR多肽和/或多核苷酸序列的5′端和/或3′端可以包含其它序列。相应的,相对于虽然包含序列X，但X序列不是实质的一段多肽,一段“主要由序列X组成”的多肽具有新颖性。

术语“外源T细胞受体”(TCR)是指，通过导入外源的编码TCR的序列，在细胞中表达重组TCR。具体而言,HBV表位反应性TCR可以在没有天然表达或者表达水平过低，不足以在TCR与配体结合时，在表达细胞或应答细胞中产生应答的细胞中表达。

术语“片段”是指，HBV表位反应性外源TCR全长序列的不完全或分离部分,其包含使所述序列具有HBV表位反应性外源TCR的特性和功能的活性部位。具体而言,其可比全长序列短至少一个核苷酸或氨基酸。更具体而言,所述片段包含使HBV表位反应性外源TCR能够识别HBs183-91表位的活性部位。

术语“HBV表位反应性T细胞受体(TCR)”是指这样的TCR，其与主要组织相容性复合体(MHC)结合的HBV表位结合，从而在表达重组TCR的细胞中诱导辅助应答或细胞毒性应答。具体而言,所述HBV表位可为HBs183-91。更具体而言,所述HBV表位可包含SEQ ID NO:31的序列。

术语“HBs183-91表位”是指能够刺激HLAI类限制性T细胞的表位。其可在本发明中与HBs183、HBs183-91、HBs183-91肽和所述肽互换使用。所述表位的序列可为“FLLTRILTI”(SEQ ID NO:31)。在本发明中,除非另作说明,术语HBs183-91指的是在白种人中普遍的基因型为A/D的序列为SEQ ID NO:31的HBs183-91表位。与该表位结合的T细胞受体的区域被称为HBs183-91TCR或HBs183TCR。

术语“免疫治疗有效量”是指在受试对象体内带来免疫介导的预防或治疗效果的量,即,与治疗前相比或与适合的对照相比,将防止或减少至少50％症状的量。

术语“分离的”在本文中被定义为一种生物学成分(如核酸、肽或蛋白质),其实质上已经从在天然产生所述成分的生物体的细胞中与其它生物学成分(即其它的染色体、染色体外的DNA、RNA以及蛋白质)分离开来、单独制备或者纯化出来。因此，已被分离的核酸、肽和蛋白质包括用标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达而制备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。

术语TCR表位的“突变体”或“突变型”是指这样一种TCR表位的“突变体”或“突变型”,其氨基酸序列通过置换、缺失或添加至少一个氨基酸而与至少一个病毒编码的参照序列不同,但保留了结合和激活与非突变表位结合并激活的TCR的能力。具体而言,所述突变体可天然产生、重组或合成的方式产生。

术语“可溶性TCR”是指膜结合TCR(其为T细胞识别特异性抗原的分子)的可溶(分泌)型。在其可溶性型中,除了它识别与MHC分子结合的肽片段而抗体识别在整个蛋白上的决定簇外,它类似于单克隆抗体。具体而言,本发明的分离多肽可用于使用本领域中任何已知的方法制备可溶性TCR。更具体而言,所述可溶性TCR可与HBV的HBs183-91表位结合。

术语“受试对象”是指脊椎动物,尤其是哺乳动物,更尤其是人。为了研究的目的,所述受试对象具体可为至少一种动物模型,例如,小鼠、大鼠等。具体而言,对于动物模型,可以基于物种选择TCRα链和β链的序列。在一些情况下,也可以使用表达人MHC分子的转基因动物来评价本发明的特定实施方式。

TCR是由α链/β链或者γ链/δ链以异质二聚体形式存在的细胞膜表面的糖蛋白。在95％的T细胞中TCR异质二聚体由α和β链组成，而5％的T细胞具有由γ和δ链组成的TCR。天然αβ异质二聚体TCR具有α链和β链，α链和β链构成αβ异源二聚TCR的亚单位。广义讲，α和β链包含可变区、连接区和恒定区，β链通常还在可变区和连接区之间含有短的多变区。但该多变区常视作连接区的一部分。各可变区包含嵌合在框架结构(framework regions)中的3个CDR(互补决定区)，CDR1、CDR2和CDR3。CDR区决定了TCR与pMHC复合物的结合，其中CDR3由可变区和连接区重组而成，被称为超变区。TCR的α和β链一般看作各有两个“结构域”即可变域和恒定域，可变域由连接的可变区和连接区构成。TCR恒定域的序列可以在国际免疫遗传学信息系统(IMGT)的公开数据库中找到，如TCR分子α链的恒定域序列为”TRAC*01”,TCR分子β链的恒定域序列为”TRBC1*01”或“TRBC2*01”。此外，TCR的α和β链还包含跨膜区和胞质区，胞质区很短。

在本发明中，术语“本发明多肽”、“本发明的TCR”、“本发明的T细胞受体”可互换使用。

HBs183-91表位

MHC分子是免疫球蛋白超家族的蛋白质，可以是I类或II类MHC分子。不同的个体有不同的MHC，因此，其对于抗原的呈递具有特异性,能呈递一种蛋白抗原中不同的短肽到各自的APC细胞表面。人类的MHC通常称为HLA基因或HLA复合体。

在抗原加工过程中，抗原在细胞内被降解，然后与MHC分子一道被呈递至细胞表面。在人类中,抗原表位的MHC限制性由抗原呈递细胞表达的至少一种特定的人白细胞抗原(HLA)决定。不同HLA分型(即HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA和HLA-DRB1)限制不同的抗原表位。

本发明的HBV反应性TCR识别HLA-A2限制性的HBV表位。大约总人口的50％表达HLA-A2(MHC I类分子),一种HLA-A血清型。因此,HLA-A2-限制性TCR可具有普遍的治疗用途。具体而言,该亚型可以识别许多HLA-A*02等位基因的产物,包括HLA-A*0201、*0202、*0203、*0206和*0207的基因产物。白种人和亚洲人的亚型可存在明显的差异。超过95％的HLA-A2阳性的白种人是HLA-A0201；而HLA-A2阳性的中国人由如下HLA-A2亚型组成:23％HLA-A0201；45％HLA-A0207；8％HLA-A0206；23％HLA-A0203。

HBs183-91表位显示出了可能降低HBV表面抗原(HBsAg)的潜力，而HBsAg的血清学(HBsAg+变成HBsAg-)转换标志着HBV感染者完全清除体内的HBV病毒。

分离细胞

在本发明的第一个实施例中,用到了一种分离细胞,其包含HBV表位反应性外源T细胞受体(TCR)和/或其片段。这种分离的细胞经过培养扩增之后，可直接用于过继治疗方案，成为一种特别有效的治疗模式。本发明的分离细胞可以解决可能存在的慢性HBV感染患者体内HBV特异性CD8+和CD4+细胞缺失和功能欠佳的问题。

具体而言,所述分离细胞可以使用本领域中已知的任何技术分离。更具体而言,可以使用细胞分离试剂盒、Ficoll-Paque密度梯度离心、Beckman Coulter Moflo XDP细胞分选系统等分离细胞。

已经清除了病毒感染的HBV感染者可以提供表达高亲和性TCR的HBV反应性T细胞。具体而言,所述HBV表位反应性TCR可以通过从HBV感染的无病毒个体(aviremicindividual)中分离至少一种HBV反应性T细胞。

TCR分子

本发明的HBV反应性TCR识别与HLA-A2MHC分子结合的由SEQ ID NO：31组成的HBs183-91表位。具体而言,HBV反应性TCR可以通过用一条或多条编码功能性α链和β链的多核苷酸，和/或功能性α链和β链的多肽(其可以组装形成功能性HBV表位反应性TCR)转化或转导分离细胞而制备

本发明的HBV反应性TCR在表达他们的分离细胞中可以是有功能的。具体而言,它们可为与CD3复合物一起，有功能的α和βTCR链异源二聚体，识别与I类或II类MHC分子结合的HBV表位。

更具体地，所述TCR可以包含至少一条α链和至少一条β链,α链包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13；所述β链可以主要由序列SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28组成。

核酸分子

本发明的第二方面提供了编码本发明第一方面TCR分子或其部分的核酸分子，所述部分可以是一个或多个CDR，α和/或β链的可变域，以及α链和/或β链。

编码本发明第一方面TCR分子α链CDR区的核苷酸序列如下：

包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：6中的至少一种序列、选自SEQ ID NO：2和SEQID NO：7中的至少一种序列以及选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：8中的至少一种序列；

编码本发明第一方面TCR分子β链CDR区的核苷酸序列如下：

包含选自SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：21中的至少一种序列、选自SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：22中的至少一种序列以及选自SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：23中的至少一种序列。

更具体地，所述编码α链的序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10，所述编码β链的序列选自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:20或SEQID NO:25。

核苷酸序列可以是经密码子优化的。不同的细胞在具体密码子的利用上是不同的，可以根据细胞的类型，改变序列中的密码子来增加表达量。哺乳动物细胞以及多种其他生物的密码子选择表是本领域技术人员公知的。

本发明的核酸分子全长序列或其片段通常可以用但不限于扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明TCR(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。DNA可以是编码链或非编码链。

多肽

优选地，所述TCR分子是分离的或纯化的。该TCR的α链和β链各具有3个互补决定区(CDR)。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述TCR的α链包含具有以下氨基酸序列的CDR：

αCDR1-SEQ ID NO：11

αCDR2-SEQ ID NO：12

αCDR3-SEQ ID NO：13

所述TCRβ链可变区的3个互补决定区(CDR)为：

βCDR1-SEQ ID NO：26

βCDR2-SEQ ID NO：27

βCDR3-SEQ ID NO：28

可以将上述本发明的CDR区氨基酸序列嵌入到任何适合的框架结构中来制备嵌合TCR。只要框架结构与本发明的TCR的CDR区兼容，本领域技术人员根据本发明公开的CDR区就能够设计或合成出具有相应功能的TCR分子。因此，本发明TCR分子是指包含上述α和/或β链CDR区序列及任何适合的框架结构的TCR分子。

在本发明的一个优选例中，本发明的TCR分子是由α与β链构成的异质二聚体。具体地，一方面所述异质二聚体TCR分子的α链包含可变域和恒定域，所述α链可变域氨基酸序列包含上述α链的CDR1(SEQ ID NO：11)、CDR2(SEQ ID NO：12)和CDR3(SEQ ID NO：13)。另一方面，所述异质二聚体TCR分子的β链包含可变域和恒定域，所述β链可变域氨基酸序列包含上述β链的CDR1(SEQ ID NO：26)CDR2(SEQ ID NO：27)和CDR3(SEQ ID NO：28)。

所述单链TCR分子的α链可变域氨基酸序列包含上述α链的CDR1(SEQ ID NO：11)、CDR2(SEQ ID NO：12)和CDR3(SEQ ID NO：13)。所述单链TCR分子的β链可变域氨基酸序列包含上述β链的CDR1(SEQ ID NO：26)、CDR2(SEQ ID NO：27)和CDR3(SEQ ID NO：28)。

在本发明的一个优选例中，本发明的TCR分子的恒定域是人的恒定域。本领域技术人员知晓或可以通过查阅相关书籍或IMGT(国际免疫遗传学信息系统)的公开数据库来获得人的恒定域氨基酸序列。例如，本发明TCR分子α链的恒定域序列可以为“TRAC*01”，TCR分子β链的恒定域序列可以为“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。本发明的TCR分子的恒定域也可以是小鼠的恒定域。将TRAC和TRBC同时换成小鼠来源的恒定域可以避免外源转入的TCR分子与内源的TCR分子错配，造成TCR靶向错误。此效用与外源导入人工二硫键目的类似。

天然存在的TCR是一种膜蛋白，通过其跨膜区得以稳定。如同免疫球蛋白(抗体)作为抗原识别分子一样，TCR也可以被开发应用于诊断和治疗，这时需要获得可溶性的TCR分子。可溶性TCR分子不包括其跨膜区。可溶性TCR有很广泛的用途，它不仅可用于研究TCR与pMHC的相互作用，也可用作检测感染的诊断工具或作为自身免疫病的标志物。类似地，可溶性TCR可以被用来将治疗剂(如细胞毒素化合物或免疫刺激性化合物)输送到呈递特异性抗原的细胞，另外，可溶性TCR还可与其他分子(如，抗-CD3抗体)结合来重新定向T细胞，从而使其靶向呈递特定抗原的细胞。

本发明的TCR也可以多价复合体的形式提供。本发明的多价TCR复合体包含两个、三个、四个或更多个本发明TCR相结合而形成的多聚物，如多个本发明TCR与另一分子结合而形成的复合物。本发明的TCR复合物可用于体外或体内追踪或靶向呈递特定抗原的细胞，也可用于产生具有此类应用的其他多价TCR复合物的中间体。

本发明的TCR可以单独使用，也可与偶联物以共价或其他方式结合，优选以共价方式结合。所述偶联物包括可检测标记物(为诊断目的，其中所述TCR用于检测呈递FLLTRILTI-HLA*A0201复合物的细胞的存在)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。

用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。

另外，本发明的TCR还可以是包含衍生自超过一种物种序列的杂合TCR。例如，有研究显示鼠科TCR在人T细胞中比人TCR能够更有效地表达。因此，本发明TCR可包含人可变域和鼠的恒定域。这一方法的缺陷是可能引发免疫应答。

应理解，本文中氨基酸名称采用国际通用的单英文字母或三英文字母表示，氨基酸名称的单英文字母与三英文字母的对应关系如下：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Try(W)、Tyr(Y)、Val(V)。

载体

本发明还涉及包含本发明的核酸分子的载体，包括表达载体，即能够在体内或体外表达的构建体。常用的载体包括细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。

病毒递送系统包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体。

优选地，载体可以将本发明的核苷酸转移至细胞中，例如T细胞中，使得该细胞表达HBV S183-91抗原特异性的TCR。理想情况下，该载体应当能够在T细胞中持续高水平地表达。

细胞

本发明还涉及用本发明的载体或编码序列经基因工程产生的宿主细胞。所述宿主细胞中含有本发明的载体或染色体中整合有本发明的核酸分子。宿主细胞选自：原核细胞和真核细胞，例如大肠杆菌、酵母细胞、CHO细胞等。

另外，本发明还包括表达本发明的TCR的分离的细胞，特别是T细胞。该T细胞可衍生自从受试者分离的T细胞，或者可以是从受试者中分离的混合细胞群，诸如外周血淋巴细胞(PBL)群的一部分。如，该细胞可以分离自外周血单核细胞(PBMC)，可以是CD4+辅助T细胞或CD8+细胞毒性T细胞。该细胞可在CD4+辅助T细胞/CD8+细胞毒性T细胞的混合群中。一般地，该细胞可以用抗体(如，抗-CD3或抗-CD28的抗体)活化，以便使它们能够更容易接受转染，例如用包含编码本发明TCR分子的核苷酸序列的载体进行转染。

备选地，本发明的细胞还可以是或衍生自干细胞，如造血干细胞(HSC)。将基因转移至HSC不会导致在细胞表面表达TCR，因为干细胞表面不表达CD3分子。然而，当干细胞分化为迁移至胸腺的淋巴前体(lymphoid precursor)时，CD3分子的表达将启动在胸腺细胞的表面表达该引入的TCR分子。

有许多方法适合于用编码本发明TCR的DNA或RNA进行T细胞转染(如，Robbins等.，(2008)J.Immunol.180:6116-6131)。表达本发明TCR的T细胞可以用于过继免疫治疗。本领域技术人员能够知晓进行过继性治疗的许多合适方法(如，Rosenberg等.,(2008)Nat RevCancer8(4):298-308)。

下面的具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如(Sambrook和Russell等，分子克隆：实验室手册(Molecular cloning-A Laboratorymanual(第三版)(2001)CSHL出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1克隆HBVS183-91抗原表位特异性T细胞的TCR基因

从HLA分型为HLA-A*0201的HBV感染康复志愿者获得的新鲜血液中分离外周血淋巴细胞(PBL)。

首先用Ficoll-Hypaque(GE)密度梯度离心的方法分离得到PBL。然后将PBL用DPBS(Life)洗涤后，重新悬浮在RPMI培养基(Life)中(2％human Serum)中，加入终浓度为1uM的HBV S183-91多肽(FLLTRILTI，SEQ ID NO：31；金思瑞)和20IU/ml的白细胞介素2(IL-2；peprotech)，24孔板中培养10天。

10天后，根据IFN-γSecretion Assay cell enrichmentand detection kit(Miltenyi)的说明书，用10uM S183-91多肽进一步刺激后，用流式细胞仪(Moflo XDP，Beckman Coulter)分选CD8+、IFN-γ双阳性的单细胞(分选结果见图1)至96孔PCR板中,离心后放置于-80℃以备后续的反转录。

反转录时，将上述含有单细胞的96孔板置于冰上，加入Superscript ViloMasterMix(Life)。反转录的终体积控制在2.5uL。反转录产物直接用作PCR的模板。加入设计好的引物，用PrimeStar HS DNA polymerase(Takara),两轮nested PCR之后直接将PCR产物送测或亚克隆至合适的载体，菌落PCR鉴定(见图2)后进一步测序。经IMGT分析后，挑选12对TCRα/β基因进行后续实验。

实施例2制备含TCR链的慢病毒

将上述用IMGT初步验证后的TCR基因用基因合成的方法合成基因片段(BGI&Genecreate)后,用overlap PCR的方法组装成完整的TCR链，其中TCR的恒定区替换成小鼠来源的恒定区(CJ,Y et al.2006),以避免导入的TCR与内源TCR基因的错配以及便于后续检验TCR基因的表达。PCR产物用NotI，NheI(FastDigest,Life)剪切后亚克隆至pHAGE载体上。

测序验证序列正确后，用psPAX2，及pMD2.G 3质粒包装系统共转染293T细胞。转染24小时后，收集第一批慢病毒上清；48小时后，收集第二批慢病毒上清。

实施例3转染T细胞及转染后T细胞的五聚体结合能力。

将Ficoll-Hypaque分离得到的PBL用OKT-3(Biolegend)和IL-2刺激24小时后，1：1加入慢病毒上清和polybrene(sigma,终浓度8ug/mL)，1000g离心60分钟后，放回37℃培养箱。4小时后，换回新鲜cRPMI培养基。cRPMI培养基组分为10％热灭活FBS，1X GlutaMax,1Xsodium pyruvate,1XHEPES(以上均来自Gibco,Life)，50uM 2-ME(sigma)，penicilin/streptomycin(杭州科易)。

24小时后，吸去一半的培养基，重新加入等体积的慢病毒上清，补充polybrene至8ug/ml终浓度，1000g离心60分钟。4小时后换回cRPMI培养基。(同第一次转染)。

转染2-7天后，收集细胞，根据HBV S183-91Pentamer(Proimmune)的说明书，用Wash buffer(0.5％BSA的PBS)清洗细胞后，重悬于～50uL wash buffer中，加入PE标记的S183-91五聚体，室温放置15分钟后，加入APC标记的mTRBC抗体(Biolegend)，室温继续放置15分钟。之后用wash buffer洗细胞后，重悬于～200uLwash buffer中，进行流式分析(Cytoflex S,Beckman Coulter)。TcR表达结果如图3-1所示：#1-#12为转染了1-12号TCRα/β基因对的T细胞。由于慢病毒包装时使用的pHAGE质粒带有IRES-ZsGreen原件，因此转染的细胞会表达ZsGreen。图3-2为转染T细胞的五聚体(pentamer)结合能力图；圈门策略为:淋巴细胞->ZsGreen+/mTRBC+双阳性细胞->结合五聚体的细胞。

五聚体结合实验表明，从HBV感染康复志愿者来源的外周血中分离的HLA-A2限制性的HBVS183-91抗原表位(SEQ ID NO：31)反应性T细胞中克隆得到的12对T细胞受体基因对中，#9，#10两对表现出了五聚体结合能力。

实施例4 转染T细胞的细胞杀伤能力。

将S183-91多肽加入稳定表达ZsGreen的HepG2细胞(HLA*A0201+)中，于冰上放置1小时，之后用PBS清洗后，trypsin消化，1：1与未转染ZsGreen的HepG2混合后，按4X10^5个细胞/孔种植于24孔板中。阳性对照用的效应T细胞转染了能够识别HBV核心抗原C18-27表位的TCR基因，基因序列来自专利CN200980126398；阳性对照用的靶细胞用C18多肽(FLPSDFFPSV；专利CN200980126398)负载。

第二天，将转染的T细胞计数后，根据不同的效:靶比，加入至种有HepG2细胞的24孔板中。12小时后，收集24孔板中的细胞，用流式细胞仪(Cytoflex S,Beckman Coulter)分析存活HepG2细胞中ZsGreen+细胞与ZsGreen-细胞之比(效：靶比为10的流式直方图见图4):#1-#12为1-12对TCRα/β基因。HepG2_S183是S183多肽负载过、未加任何效应T细胞的靶HepG2细胞。C18表示效应T细胞是转染了C18TCRα/β基因，能够识别负载了C18多肽的HLA*A0201的靶细胞。HepG2_C18是C18多肽负载过、未加任何效应T细胞的靶HepG2细胞。

根据流式分析结果绘制的杀伤曲线见图5；效：靶比分别为20，10和5(E:T＝20；E:T＝10；E:T＝5)。

细胞杀伤实验表明，从HBV感染康复志愿者来源的外周血中分离的HLA-A2限制性的HBV S183-91抗原表位(SEQ ID NO：31)反应性T细胞中克隆得到的12对T细胞受体基因对中，#5，#6,#7,#8,#10,#11,#12均表现出与阳性对照(C18)相类似的较强细胞杀伤能力。

实施例5转染T细胞的分泌细胞因子能力

将S183-91多肽加入MCF-7细胞中(HLA*A0201+)，于冰上放置1小时，之后用PBS清洗后，trypsin消化，按4X10^5个细胞/孔种植于24孔板中。阳性对照用C18多肽(FLPSDFFPSV)负载。未负载任何多肽的MCF-7细胞用trypsin消化后，也按4X10^5个细胞/孔种植于24孔板中。

37℃培养过夜后，将转染的T细胞计数，按1:1加入至种有MCF-7细胞的24孔板中，同时加入终浓度为1X的Brefeldin A(Biolegend)。5小时后，收集24孔板中的细胞，根据Biolegend Intracellular Staining Protocol,用Wash buffer清洗后，加入APC-CD8(Biolegnd)抗体，室温避光放置20分钟后，加入fixation buffer(Biolegend),室温避光放置20分钟。之后离心，用Perm/Wash buffer(Biolegend)洗涤3次后，用Perm/Wash Buffer重悬细胞，加入PE标记的IFN-γPE抗体，室温避光孵育20分钟。用Perm/wash buffer再次洗涤之后，重悬于～200uLPerm/Wash Buffer中，进行流式分析。结果见图6。#1-#12为转染了1-12号TCRα/β基因对的T细胞。C18表示效应T细胞是转染了C18TCRα/β基因，能够识别负载了C18多肽的HLA*A0201的抗原呈递细胞。0uM表示未负载任何多肽；1uM表示负载的多肽为1uM(C18负载的是C18多肽，#1-#12负载的是S183多肽)。图6-1是#1-#4的IFN-γ分泌图；图6-2是#5-#8的IFN-γ分泌图；图6-3是#9-#12的IFN-γ分泌图。

细胞因子分泌实验表明，从HBV感染康复志愿者来源的外周血中分离的HLA-A2限制性的HBV S183-91抗原表位(SEQ ID NO：31)反应性T细胞中克隆得到的12对T细胞受体基因对中，#5，#6,#8,#10,#11,#12均表现出与阳性对照(C18)相类似的较强的细胞因子分泌能力。

根据五聚体结合能力、靶细胞杀伤能力、细胞因子分泌能力3方面的实验结果，选择公布#12的TcR序列。#12表达水平较高，除了五聚体结合能力，细胞杀伤毒性和分泌干扰素γ的能力均优于C18这个阳性对照。IMGT分析结果表明#12的α链为TRAV12-1基因；β链为TRBV28。

#12的进一步IMGT分析结果如下：

α链CDR区的核苷酸序列：

αCDR1-(SEQ ID NO:1)、αCDR2-(SEQ ID NO:2)、αCDR3-(SEQ ID NO:3)；

β链CDR区的核苷酸序列：

βCDR1-(SEQ ID NO:16)、βCDR2-(SEQ ID NO:17)、βCDR3-(SEQ ID NO:18)；

密码子优化后的α链CDR区的核苷酸序列：

αCDR1-(SEQ ID NO:6)、αCDR2-(SEQ ID NO:7)、αCDR3-(SEQ ID NO:8)；

β链CDR区的核苷酸序列：

βCDR1-(SEQ ID NO:21)、βCDR2-(SEQ ID NO:22)、βCDR3-(SEQ ID NO:23)。

序列表

<110> 上海续缓生物科技有限公司

<120> HBV表位反应性T细胞受体及其用途

<160> 31

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 1

agcaacagtg cttctcagtc tttc 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 2

tccgtatact ccagtggtaa tgaa 24

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 3

tgtgtggtga acattggtaa ctatggtcag aattttgtct tt 42

<210> 4

<211> 822

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 4

atgatatcct tgagagtttt actggtgatc ctgtggcttc agttaagctg ggtttggagc 60

caacggaagg aggtggagca ggatcctgga cccttcaatg ttccagaggg agccactgtc 120

gctttcaact gtacttacag caacagtgct tctcagtctt tcttctggta cagacaggat 180

tgcaggaaag aacctaagtt gctgatgtcc gtatactcca gtggtaatga agatggaagg 240

tttacagcac agctcaatag agccagccag tatatttccc tgctcatcag agactccaag 300

ctcagtgatt cagccaccta cctctgtgtg gtgaacattg gtaactatgg tcagaatttt 360

gtctttggtc ccggaaccag attgtccgtg ctgccctata tccagaaccc tgaccctgcc 420

gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt gacaagtctg tctgcctatt caccgatttt 480

gattctcaaa caaatgtgtc acaaagtaag gattctgatg tgtatatcac agacaaaact 540

gtgctagaca tgaggtctat ggacttcaag agcaacagtg ctgtggcctg gagcaacaaa 600

tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta ttccagaaga caccttcttc 660

cccagcccag aaagttcctg tgatgtcaag ctggtcgaga aaagctttga aacagatacg 720

aacctaaact ttcaaaacct gtcagtgatt gggttccgaa tcctcctcct gaaagtggcc 780

gggtttaatc tgctcatgac gctgcggctg tggtccagct ga 822

<210> 5

<211> 810

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 5

atgatatcct tgagagtttt actggtgatc ctgtggcttc agttaagctg ggtttggagc 60

caacggaagg aggtggagca ggatcctgga cccttcaatg ttccagaggg agccactgtc 120

gctttcaact gtacttacag caacagtgct tctcagtctt tcttctggta cagacaggat 180

tgcaggaaag aacctaagtt gctgatgtcc gtatactcca gtggtaatga agatggaagg 240

tttacagcac agctcaatag agccagccag tatatttccc tgctcatcag agactccaag 300

ctcagtgatt cagccaccta cctctgtgtg gtgaacattg gtaactatgg tcagaatttt 360

gtctttggtc ccggaaccag attgtccgtg ctgccctata tccagaaccc agaacctgct 420

gtgtaccagt taaaagatcc tcggtctcag gacagcaccc tctgcctgtt caccgacttt 480

gactcccaaa tcaatgtgcc gaaaaccatg gaatctggaa cgttcatcac tgacaaaact 540

gtgctggaca tgaaagctat ggattccaag agcaatgggg ccattgcctg gagcaaccag 600

acaagcttca cctgccaaga tatcttcaaa gagaccaacg ccacctaccc cagttcagac 660

gttccctgtg atgccacgtt gaccgagaaa agctttgaaa cagatatgaa cctaaacttt 720

caaaacctgt cagttatggg actccgaatc ctcctgctga aagtagcggg atttaacctg 780

ctcatgacgc tgaggctgtg gtccagttga 810

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 6

tctaatagcg cctcccagtc tttc 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 7

agcgtgtaca gctccggcaa cgag 24

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 8

tgcgtggtga acatcggcaa ttatggccag aacttcgtgt tt 42

<210> 9

<211> 822

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 9

atgatcagcc tgagggtgct gctggtcatc ctgtggctgc agctgtcttg ggtgtggagc 60

cagaggaagg aggtggagca ggacccagga ccttttaacg tgccagaggg cgccaccgtg 120

gccttcaact gcacatactc taatagcgcc tcccagtctt tcttttggta tcggcaggac 180

tgtagaaagg agcccaagct gctgatgagc gtgtacagct ccggcaacga ggatggcagg 240

tttaccgccc agctgaatcg cgcctcccag tatatctctc tgctgatcag ggactccaag 300

ctgagcgatt ccgccaccta cctgtgcgtg gtgaacatcg gcaattatgg ccagaacttc 360

gtgtttggac caggaacaag gctgagcgtg ctgccttaca tccagaatcc agaccccgcc 420

gtgtatcagc tgagagacag caagtctagc gataagagcg tgtgcctgtt caccgacttt 480

gattctcaga caaacgtgtc tcagagcaag gacagcgacg tgtacatcac cgacaagaca 540

gtgctggata tgcggtccat ggactttaag tccaactctg ccgtggcctg gagcaataag 600

tccgatttcg cctgcgccaa tgcctttaac aattccatca tccctgagga taccttcttt 660

ccttctccag agtcctcttg tgacgtgaag ctggtggaga agagcttcga gaccgataca 720

aacctgaatt ttcagaacct gtccgtgatc ggcttccgga tcctgctgct gaaggtggcc 780

ggcttcaatc tgctgatgac actgagactg tggagctcct ga 822

<210> 10

<211> 810

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 10

atgatcagcc tgagggtgct gctggtcatc ctgtggctgc agctgtcctg ggtgtggtct 60

cagaggaagg aggtggagca ggatccagga cctttcaacg tgcctgaggg agcaacagtg 120

gcctttaact gcacctacag caattccgcc tctcagagct tcttttggta tcggcaggat 180

tgtagaaagg agcccaagct gctgatgagc gtgtacagct ccggcaacga ggacggcagg 240

ttcacagccc agctgaatcg cgccagccag tatatctccc tgctgatcag agactccaag 300

ctgtccgatt ctgccacata cctgtgcgtg gtgaacatcg gcaattatgg ccagaacttc 360

gtgtttggac caggaaccag gctgtccgtg ctgccttaca tccagaatcc agagcccgcc 420

gtgtatcagc tgaaggaccc acggtctcag gatagcaccc tgtgcctgtt caccgacttt 480

gattcccaga tcaacgtgcc caagaccatg gagtctggca ccttcatcac agacaagacc 540

gtgctggata tgaaggccat ggacagcaag tccaacggcg ccatcgcctg gtctaatcag 600

acaagcttca cctgccagga tatctttaag gagacaaatg ccacctaccc ttctagcgac 660

gtgccatgtg atgccaccct gacagagaag agcttcgaga cagacatgaa cctgaatttt 720

cagaacctgt ccgtgatggg cctgcggatc ctgctgctga aggtggccgg ctttaatctg 780

ctgatgaccc tgagactgtg gtcctcttga 810

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 11

Ser Asn Ser Ala Ser Gln Ser Phe

1 5

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 12

Ser Val Tyr Ser Ser Gly Asn Glu

1 5

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 13

Cys Val Val Asn Ile Gly Asn Tyr Gly Gln Asn Phe Val Phe

1 5 10

<210> 14

<211> 273

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 14

Met Ile Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser

1 5 10 15

Trp Val Trp Ser Gln Arg Lys Glu Val Glu Gln Asp Pro Gly Pro Phe

20 25 30

Asn Val Pro Glu Gly Ala Thr Val Ala Phe Asn Cys Thr Tyr Ser Asn

35 40 45

Ser Ala Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Cys Arg Lys Glu

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Met Ser Val Tyr Ser Ser Gly Asn Glu Asp Gly Arg

65 70 75 80

Phe Thr Ala Gln Leu Asn Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Ser Leu Leu Ile

85 90 95

Arg Asp Ser Lys Leu Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Val Val Asn

100 105 110

Ile Gly Asn Tyr Gly Gln Asn Phe Val Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu

115 120 125

Ser Val Leu Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu

130 135 140

Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe

145 150 155 160

Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile

165 170 175

Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn

180 185 190

Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala

195 200 205

Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu

210 215 220

Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr

225 230 235 240

Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu

245 250 255

Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser

260 265 270

Ser

<210> 15

<211> 269

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 15

Met Ile Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser

1 5 10 15

Trp Val Trp Ser Gln Arg Lys Glu Val Glu Gln Asp Pro Gly Pro Phe

20 25 30

Asn Val Pro Glu Gly Ala Thr Val Ala Phe Asn Cys Thr Tyr Ser Asn

35 40 45

Ser Ala Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Cys Arg Lys Glu

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Met Ser Val Tyr Ser Ser Gly Asn Glu Asp Gly Arg

65 70 75 80

Phe Thr Ala Gln Leu Asn Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Ser Leu Leu Ile

85 90 95

Arg Asp Ser Lys Leu Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Val Val Asn

100 105 110

Ile Gly Asn Tyr Gly Gln Asn Phe Val Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu

115 120 125

Ser Val Leu Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu

130 135 140

Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe

145 150 155 160

Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile

165 170 175

Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn

180 185 190

Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile

195 200 205

Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp

210 215 220

Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe

225 230 235 240

Gln Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala

245 250 255

Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

260 265

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 16

gatatggacc atgaaaatat g 21

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 17

ttctcatatg atgttaaaat gaaa 24

<210> 18

<211> 51

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 18

tgtgccagca gtcccatagt ggcctccctg gggaacactg aagctttctt t 51

<210> 19

<211> 945

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 19

atgggaatca ggctcctgtg tcgtgtggcc ttttgtttcc tggctgtagg cctcgtagat 60

gtgaaagtaa cccagagctc gagatatcta gtcaaaagga cgggagagaa agtttttctg 120

gaatgtgtcc aggatatgga ccatgaaaat atgttctggt atcgacaaga cccaggtctg 180

gggctacggc tgatctattt ctcatatgat gttaaaatga aagaaaaagg agatattcct 240

gaggggtaca gtgtctctag agagaagaag gagcgcttct ccctgattct ggagtccgcc 300

agcaccaacc agacatctat gtacctctgt gccagcagtc ccatagtggc ctccctgggg 360

aacactgaag ctttctttgg acaaggcacc agactcacag ttgtagagga cctgaacaag 420

gtgttcccac ccgaggtcgc tgtgtttgag ccatcagaag cagagatctc ccacacccaa 480

aaggccacac tggtgtgcct ggccacaggc ttctaccccg accacgtgga gctgagctgg 540

tgggtgaatg ggaaggaggt gcacagtggg gtcagcacag acccgcagcc cctcaaggag 600

cagcccgccc tcaatgactc cagatactgc ctgagcagcc gcctgagggt ctcggccacc 660

ttctggcaga acccccgcaa ccacttccgc tgtcaagtcc agttctacgg gctctcggag 720

aatgacgagt ggacccagga tagggccaaa cctgtcaccc agatcgtcag cgccgaggcc 780

tggggtagag cagactgtgg cttcacctcc gagtcttacc agcaaggggt cctgtctgcc 840

accatcctct atgagatctt gctagggaag gccaccttgt atgccgtgct ggtcagtgcc 900

ctcgtgctga tggccatggt caagagaaag gattccagag gctag 945

<210> 20

<211> 927

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 20

atgggaatca ggctcctgtg tcgtgtggcc ttttgtttcc tggctgtagg cctcgtagat 60

gtgaaagtaa cccagagctc gagatatcta gtcaaaagga cgggagagaa agtttttctg 120

gaatgtgtcc aggatatgga ccatgaaaat atgttctggt atcgacaaga cccaggtctg 180

gggctacggc tgatctattt ctcatatgat gttaaaatga aagaaaaagg agatattcct 240

gaggggtaca gtgtctctag agagaagaag gagcgcttct ccctgattct ggagtccgcc 300

agcaccaacc agacatctat gtacctctgt gccagcagtc ccatagtggc ctccctgggg 360

aacactgaag ctttctttgg acaaggcacc agactcacag ttgtagagga tctgagaaat 420

gtgactccac ccaaggtctc cttgtttgag ccatcaaaag cagagattgc aaacaaacaa 480

aaggctaccc tcgtgtgctt ggccaggggc ttcttccctg accacgtgga gctgagctgg 540

tgggtgaatg gcaaggaggt ccacagtggg gtcagcacgg accctcaggc ctacaaggag 600

agcaattata gctactgcct gagcagccgc ctgagggtct ctgctacctt ctggcacaat 660

cctcgcaacc acttccgctg ccaagtgcag ttccatgggc tttcagagga ggacaagtgg 720

ccagagggct cacccaaacc tgtcacacag aacatcagtg cagaggcctg gggccgagca 780

gactgtggga ttacctcagc atcctatcaa caaggggtct tgtctgccac catcctctat 840

gagatcctgc tagggaaagc caccctgtat gctgtgcttg tcagtacact ggtggtgatg 900

gctatggtca aaagaaagaa ttcatga 927

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 21

gacatggatc acgagaatat g 21

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 22

ttctcctatg acgtgaagat gaag 24

<210> 23

<211> 51

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 23

tgcgcctcta gccctatcgt ggcctctctg ggcaataccg aggccttctt t 51

<210> 24

<211> 945

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 24

atgggcatca ggctgctgtg ccgcgtggcc ttctgttttc tggccgtggg cctggtggac 60

gtgaaggtga cccagagctc ccggtacctg gtgaagagaa caggcgagaa ggtgttcctg 120

gagtgcgtgc aggacatgga tcacgagaat atgttttggt atcggcagga tcctggcctg 180

ggcctgagac tgatctactt ctcctatgac gtgaagatga aggagaaggg cgatatccca 240

gagggctaca gcgtgtccag ggagaagaag gagcggttca gcctgatcct ggagtctgcc 300

agcaccaacc agacatccat gtatctgtgc gcctctagcc ctatcgtggc ctctctgggc 360

aataccgagg ccttctttgg acagggaacc aggctgacag tggtggagga cctgaacaag 420

gtgttccccc ctgaggtggc cgtgtttgag ccctctgagg ccgagatcag ccacacccag 480

aaggccaccc tggtgtgcct ggcaaccggc ttctaccctg atcacgtgga gctgtcctgg 540

tgggtgaatg gcaaggaggt gcacagcggc gtgtccacag acccacagcc cctgaaggag 600

cagccagccc tgaacgattc caggtactgc ctgtcctctc ggctgagagt gtctgccacc 660

ttctggcaga acccccggaa tcacttcaga tgtcaggtgc agttttatgg cctgtctgag 720

aacgacgagt ggacccagga tagggccaag cccgtgacac agatcgtgag cgccgaggca 780

tggggaaggg cagactgtgg ctttacatcc gagtcttatc agcagggcgt gctgagcgcc 840

accatcctgt acgagatcct gctgggcaag gccacactgt atgccgtgct ggtgagcgcc 900

ctggtgctga tggccatggt gaagaggaag gattcccgcg gctga 945

<210> 25

<211> 927

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 25

atgggcatca ggctgctgtg ccgcgtggcc ttctgttttc tggccgtggg cctggtggac 60

gtgaaggtga cccagagctc caggtacctg gtgaagcgca caggcgagaa ggtgttcctg 120

gagtgcgtgc aggacatgga tcacgagaac atgttttggt ataggcagga tccaggactg 180

ggactgaggc tgatctactt cagctatgac gtgaagatga aggagaaggg cgatatccct 240

gagggctaca gcgtgtcccg ggagaagaag gagcggttca gcctgatcct ggagtctgcc 300

agcaccaacc agacatccat gtatctgtgc gcctctagcc ccatcgtggc ctctctgggc 360

aataccgagg ccttctttgg acagggaacc aggctgacag tggtggagga cctgagaaac 420

gtgacacccc ctaaggtgtc cctgttcgag ccatctaagg ccgagatcgc caataagcag 480

aaggccaccc tggtgtgcct ggcaaggggc ttctttccag accacgtgga gctgtcttgg 540

tgggtgaacg gcaaggaggt gcacagcggc gtgtccaccg atcctcaggc ctacaaggag 600

tctaattaca gctattgcct gtcctctcgg ctgagagtgt ccgccacatt ttggcacaac 660

cctcggaatc acttcagatg tcaggtgcag tttcacggcc tgagcgagga ggacaagtgg 720

ccagagggat ccccaaagcc agtgacccag aacatctctg ccgaggcatg gggaagggca 780

gattgtggaa tcacctccgc ctcttatcag cagggcgtgc tgtccgccac aatcctgtac 840

gagatcctgc tgggcaaggc caccctgtat gccgtgctgg tgagcacact ggtggtcatg 900

gccatggtga agcgcaagaa ttcctga 927

<210> 26

<211> 7

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 26

Asp Met Asp His Glu Asn Met

1 5

<210> 27

<211> 8

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 27

Phe Ser Tyr Asp Val Lys Met Lys

1 5

<210> 28

<211> 17

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 28

Cys Ala Ser Ser Pro Ile Val Ala Ser Leu Gly Asn Thr Glu Ala Phe

1 5 10 15

Phe

<210> 29

<211> 314

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 29

Met Gly Ile Arg Leu Leu Cys Arg Val Ala Phe Cys Phe Leu Ala Val

1 5 10 15

Gly Leu Val Asp Val Lys Val Thr Gln Ser Ser Arg Tyr Leu Val Lys

20 25 30

Arg Thr Gly Glu Lys Val Phe Leu Glu Cys Val Gln Asp Met Asp His

35 40 45

Glu Asn Met Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu

50 55 60

Ile Tyr Phe Ser Tyr Asp Val Lys Met Lys Glu Lys Gly Asp Ile Pro

65 70 75 80

Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Arg Phe Ser Leu Ile

85 90 95

Leu Glu Ser Ala Ser Thr Asn Gln Thr Ser Met Tyr Leu Cys Ala Ser

100 105 110

Ser Pro Ile Val Ala Ser Leu Gly Asn Thr Glu Ala Phe Phe Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Arg Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro

130 135 140

Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln

145 150 155 160

Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val

165 170 175

Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser

180 185 190

Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg

195 200 205

Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn

210 215 220

Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu

225 230 235 240

Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val

245 250 255

Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser

260 265 270

Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu

275 280 285

Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met

290 295 300

Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly

305 310

<210> 30

<211> 308

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 30

Met Gly Ile Arg Leu Leu Cys Arg Val Ala Phe Cys Phe Leu Ala Val

1 5 10 15

Gly Leu Val Asp Val Lys Val Thr Gln Ser Ser Arg Tyr Leu Val Lys

20 25 30

Arg Thr Gly Glu Lys Val Phe Leu Glu Cys Val Gln Asp Met Asp His

35 40 45

Glu Asn Met Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu

50 55 60

Ile Tyr Phe Ser Tyr Asp Val Lys Met Lys Glu Lys Gly Asp Ile Pro

65 70 75 80

Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Arg Phe Ser Leu Ile

85 90 95

Leu Glu Ser Ala Ser Thr Asn Gln Thr Ser Met Tyr Leu Cys Ala Ser

100 105 110

Ser Pro Ile Val Ala Ser Leu Gly Asn Thr Glu Ala Phe Phe Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Arg Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro

130 135 140

Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln

145 150 155 160

Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val

165 170 175

Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser

180 185 190

Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser

195 200 205

Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His

210 215 220

Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp

225 230 235 240

Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala

245 250 255

Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly

260 265 270

Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr

275 280 285

Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys

290 295 300

Arg Lys Asn Ser

305

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> hepatitis b virus

<400> 31

Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile

1 5

Claims

1.一种HBV表位反应性T细胞受体（TCR)，其特征在于，所述T细胞受体特异性识别由SEQID NO：31组成的HBs183-91表位，TCR包含α链和β链，所述编码α链的序列包含选自SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：6中的至少一种序列、选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7中的至少一种序列以及选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：8中的至少一种序列；

所述编码β链的序列包含选自SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：21中的至少一种序列、选自SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：22中的至少一种序列以及选自SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：23中的至少一种序列；

通过以下方法制备得到：

（a）从消退了HBV感染症状的个体中分离外周血淋巴细胞（PBL），从分离的淋巴细胞中分选能对HBs183-91抗原表位产生应答的T细胞，其中所述表位由SEQ ID NO:31组成；

（b)由步骤（a）分选的HBV表位反应性T细胞克隆编码T细胞受体α链和/或β链的多核苷酸序列；

（c）将步骤（b）的多核苷酸递送至细胞；和

（d）在适合所述细胞表达HBV表位反应性外源T细胞受体的条件下孵育该细胞。

2.一种分离细胞,其特征在于，所述细胞包含权利要求1所述的T细胞受体。

3.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1所述TCR序列。

4.一种分离多肽，其由权利要求3中所述的多核苷酸编码得到。

5.根据权利要求4所述的分离多肽，其包含：

6.根据权利要求5所述的分离多肽，其中：

所述α链选自SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 15，并且所述β链选自SEQ ID NO: 29或SEQID NO: 30。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的多肽，其中，所述多肽为可溶性TCR或其片段。

8.一种载体，其包含权利要求3所述的多核苷酸。

9.一种细胞，其包含权利要求8所述的载体。

10.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，所述细胞为造血干细胞或外周血淋巴细胞（PBL）源T细胞。