TW202330910A - Ｔ細胞的製造方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係揭示一種調節性T細胞之製造方法，該製造方法包含(1)使導入有表現構築物之可分化成調節性T細胞的細胞分化成調節性T細胞之步驟，該表現構築物係含有(a)Foxp3基因之保守非編碼序列(CNS)1、CNS2及CNS3，(b)啟動子，及(c)編碼FOXP3之核酸；藉由該方法獲得之調節性T細胞，以及含有該調節性T細胞而成之醫藥組成物。
Description
本發明係有關調節性T細胞之製造方法、藉由該方法獲得之調節性T細胞、含有該調節性T細胞而成之醫藥組成物等。又，本發明係有關導入有表現構築物之iPS細胞。
近年來，由於調節性T細胞(regulatory T cell(Treg))具有免疫應答抑制功能，就針對各種免疫障害之治療目的而言，於世界正進行使用了調節性T細胞之細胞治療(Treg therapy)的研究開發。調節性T細胞係被期待有用於移植物對抗宿主疾病(GvHD)、自體免疫性疾病之治療、炎症性疾病、過敏性疾病之治療及預防。
調節性T細胞可以方便地大致上分為內源性調節性T細胞及誘導性調節性T細胞，內源性調節性T細胞定義為於胸腺自然產生者。又，誘導性調節性T細胞定義為於人為之耐受誘導模式中，對應外來刺激從末梢初始T細胞分化誘導者。此等調節性T細胞再依照於此細胞表現之標記之種類而細分。
將屬於內源性調節性T細胞群之一之CD4+CD25+調節性T細胞從生體除去時，各種臟器特異性之自體免疫性疾病會自然發症，此時
若移植CD4+CD25+調節性T細胞，則可阻止自體免疫性疾病之發症，因而認為內源性CD4+CD25+調節性T細胞於末梢之免疫自體耐受性之維持發揮重要的作用。之後，明瞭CD4+CD25+調節性T細胞不僅抑制自體免疫，還可抑制由外來抗原所引發之炎症、由移植所引發之排斥反應、感染免疫、過敏、腫瘤免疫等大多數之免疫反應。又，現在已知轉錄因子FOXP3係作為此CD4+CD25+調節性T細胞之主要調節性因子。
於非專利文獻1有對於藉由於FOXP3之突變引起之IPEX(免疫失調多發性內分泌病腸病X連鎖(Immune dysregulation,polyendocrinopathy,enteropathy,X-linked))症候群，為了回復FOXP3之表現，使用慢病毒載體導入基因至自體之造血幹細胞中，將該細胞投予於IPEX症候群之模型老鼠之記載。其結果，已報導造血幹細胞分化成功能性之調節性T細胞，並從自體免疫性之表現型回復。又，於專利文獻1亦同樣地記載有重組慢病毒載體，該重組慢病毒載體係含有編碼人類FOXP3蛋白質之核苷酸序列。
於專利文獻2揭示有對Treg之生存提升重要的是使Foxp3與Mcl-1一起表現。又，於專利文獻3揭示有包含導入基因的經基因操作之哺乳動物細胞，該導入基因係編碼促進細胞分化成CD4+Treg之分化系列決定因子。於專利文獻4揭示有從幹細胞或前驅細胞調製T細胞之組成物之方法，該方法係藉由培養含有表現Notch配位體之間質細胞之選擇集團及幹細胞或前驅細胞之選擇集團之三維細胞凝集物。
惟，對於調節性T細胞期望有工業上製造效率(產率)高之製造方法，但至今仍未看到有高效率地製造如此之調節性T細胞的製造方法之報告。
己知FOXP3為Treg之主調節器，於Treg中FOXP3恆常性地表現，以及於無抑制功能之通常型T細胞(亦稱為Tconv(傳統T細胞(conventional T細胞))、效應T細胞、炎症性T細胞)中未看到恆常性的表現。因此，進行關於於初級Treg(primary Treg)中的FOXP3之表現維持及於初級Tconv(primary Tconv)或大量(bulk)之CD4單陽性(SP)T細胞中的FOXP3表現誘導之研究，已報導有具有此等表現維持及表現誘導活性之化合物、細胞激素及其組合。如此之化合物、細胞激素及其組合包含屬於CDK8/19抑制藥之AS2863619(非專利文獻2)、屬於mTOR抑制劑之雷帕黴素(Rapamycin)(非專利文獻3、非專利文獻4、非專利文獻5、非專利文獻6)、TNFR2促效劑抗體(非專利文獻5、非專利文獻7、非專利文獻8)、細胞激素TGF-β(非專利文獻2、非專利文獻6)等。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2019/040655號
[專利文獻2]國際公開第2014/180943號
[專利文獻3]國際公開第2021/092581號
[專利文獻4]國際公開第2017/075389號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Cell Stem Cell 24, 309-317, February 7, 2019
[非專利文獻2]Sci. Immunol. 4, eaaw2707(2019)
[非專利文獻3]Nat. Immunol. 20(9), 1208-1219(2019)
[非專利文獻4]Clin., Exp. Immunol., 197(1): 52-63.(2019)
[非專利文獻5]Front. Immunol. 9: 573(2018)
[非專利文獻6]PloS One., 11(2): e0148474.(2016)
[非專利文獻7]PloS One. 11(5), e0156311(2016)
[非專利文獻8]Sci. Signal. 13, eaba9600(2020)
本發明之目的係提供一種可高效率地製造調節性T細胞之調節性T細胞之製造方法。
本發明人等為了達成上述目的經過深入研究之結果，獲得將含有(a)Foxp3基因之CNS1、CNS2及CNS3、(b)啟動子及(c)FOXP3之cDNA之表現構築物導入至可分化成調節性T細胞之細胞(尤其是iPS細胞)，並將獲得之細胞分化誘導成調節性T細胞，藉此可高效率地製造調節性T細胞之見解。
本發明為以此等見解為基礎再次研究而完成者，提供下述之調節性T細胞之製造方法、iPS細胞、調節性T細胞、醫藥組成物等。
[1]一種調節性T細胞之製造方法，該製造方法係包含(1)使導入有表現構築物之可分化成調節性T細胞的細胞分化成調節性T細胞之步驟，
該表現構築物係含有(a)Foxp3基因之保守非編碼序列(Conserved Non-coding Sequence，CNS)1、CNS2及CNS3，
(b)啟動子，及
(c)編碼FOXP3之核酸。
[2]如[1]所述之方法，其中，前述可分化成調節性T細胞之細胞為富潛能幹細胞、造血幹細胞、造血性內皮細胞、T前驅細胞或中胚層前驅細胞。
[3]如[1]或[2]所述之方法，其中，前述可分化成調節性T細胞之細胞為iPS細胞。
[4]如[1]至[3]中任一項所述之方法，其中，前述CNS1、CNS2及CNS3為位於前述啟動子之上流。
[4a]如[1]至[4]中任一項所述之方法，其中，前述啟動子為Foxp3基因之啟動子。
[5]如[1]至[4a]中任一項所述之方法，其中，前述調節性T細胞為CD25+/FOXP3+細胞。
[5a]如[1]至[5]中任一項所述之方法，其中，前述調節性T細胞為CD25+/FOXP3+/CD4+細胞。
[6]如[1]至[5a]中任一項所述之方法，係更包含(2)將表現構築物導入至可分化成調節性T細胞之細胞之步驟，
該表現構築物係含有：
(a)Foxp3基因之CNS1、CNS2及CNS3，
(b)啟動子，及(c)編碼FOXP3之核酸。
[7]如[1]至[6]中任一項所述之方法，係於步驟(1)中，培養3維細胞凝集物，該3維細胞凝集物係含有前述可分化成調節性T細胞之細胞或從此經分化誘導之細胞、以及表現Notch配位體之間質細胞。
[8]如[7]所述之方法，其中，前述可分化成調節性T細胞之細胞或從此經分化誘導之細胞為CD34+細胞。
[9]如[7]或[8]所述之方法，其中，前述可分化成調節性T細胞之細胞或從此經分化誘導之細胞為造血性內皮細胞。
[10]如[7]至[9]中任一項所述之方法，其中，前述Notch配位體為選自由DLL4、DLL1、JAG1及JAG2構成之群組中之至少1種。
[11]一種iPS細胞，係導入有表現構築物者，
該表現構築物係含有：
(a)Foxp3基因之CNS1、CNS2及CNS3，(b)啟動子，及(c)編碼FOXP3之核酸。
[12]如[11]所述之iPS細胞，其中，前述CNS1、CNS2及CNS3為位於前述啟動子之上流。
[13]一種調節性T細胞，係藉由[1]至[10]中任一項所述之方法獲得者。
[14]一種醫藥組成物，係含有[13]所述之調節性T細胞而成者。
[15]如[14]所述之醫藥組成物，其係用於免疫反應異常亢進之預防及/或治療。
[16]一種免疫反應異常亢進之預防及/或治療方法，其係包含將[13]所述之調節性T細胞對需要其之對象投予。
[17]如[13]所述之調節性T細胞，其係用以在免疫反應異常亢進之預防及/或治療中使用。
[18]一種[13]所述之調節性T細胞之用途，其係用以製造於免疫反應異常亢進之預防及/或治療中使用之醫藥。
[19]如[1]至[10]中任一項所述之方法，其係更含有(3)將前述調節性T細胞於mTOR抑制劑及TNFR2促效劑存在下進行培養之步驟。
[19a]如[19]所述之方法，其中，前述mTOR抑制劑為雷帕黴素。
[19b]如[19]或[19a]所述之方法，其中，前述TNFR2促效劑為TNFR2促效劑抗體。
根據本發明，可高效率地製造調節性T細胞。
圖1為表示從iPS細胞分化誘導成Treg後之藉由流式細胞儀所得之分析結果之圖。上：對照之未導入(Untransduced)表現構築物之細胞集團，下：導入(transduced)有CNS-Foxp3構築物之細胞集團，圖表中之數值表示於各細胞集團中之Treg(CD25+/FOXP3+)的比例。
圖2為表示將從iPS細胞分化誘導成Treg後之細胞以含有雷帕黴素及抗TNFR2抗體之培養基進行擴大培養後，藉由流式細胞儀分析之結果之圖。上：對照之未導入(Untransduced)表現構築物之細胞集團，下：導入有CNS-Foxp3構築物之細胞集團，左：對照之經未含有雷帕黴素及TNFR2Ab之培養基培養之細胞集團，右：經含有雷帕黴素及TNFR2Ab之培養基進行培養之細胞集團，圖表中之數值表示於各細胞集團中之Treg(CD3+/CD4+/CD8-/CD25+/Foxp3+)之比例。
圖3為表示於從iPS細胞分化誘導成Treg後之細胞中的TSDR(Treg特異性去甲基化區域(Treg-specific demethylated region))之去甲基化率之圖表。初級Treg(primary Treg)：從人類PBMC單離出之Treg(CD3+/CD4+/CD8-/CD25+/CD127-)細胞集團，初級非Treg(primary Non-Treg)：從人類PBMC單離出之非Treg(CD3+/CD4+/CD8-/CD25-)細胞集團，iPSC-Treg：從iPS細胞分化誘導之Treg(CD3+/CD4+/CD8-/CD25+/Foxp3+)細胞集團，HEC：從iPS細胞誘導之未分化的血球系細胞(CD34+/CD43-/CD73-/CD184-)。
圖4為表示使用了從iPS細胞分化誘導之Treg，並且與源自人類PBMC之同種異體(allogeneic)T細胞進行共培養後，藉由流式細胞儀所得之分析結果之圖。上：從人類PBMC單離之Treg(CD3+/CD4+/CD8-/CD25+/CD127-)細胞集團，下：從iPS細胞分化誘導之Treg(CD3+/CD4+/CD8-/CD25+/Foxp3+)細胞集團。Treg：目標(Target)表示Treg與人類PBMC之細胞數之比。
以下，針對本發明之實施形態加以詳細地說明。
「包含(comprise(s)或comprising)…」意指表示包含接續於此語句之要素，惟不只限於此。因此，暗示包含接續於此語句之要素，惟未暗示排除其他之任意要素。「由...構成(consist(s)of或consisting of)」意指包含接續於此語句之所有要素且只限於此等要素。因此，「由…構成」之語句表示所列舉之要素為被要求或必須，並且實質上不存在其他要素。「主要由…構成(consist(s)essentially of或consisting essentially of)」意指包含接續於此語句之要素，並且該要素係限定為不影響本揭示所特定之活性或作用之其他要素。因此，「主要由…構成」之語句係表示所列舉之要素為被要求或必須，但其他要素為任意選擇，因應該等是否影響所列舉之要素之活性或作用，而有存在之情況，也有不存在的情況。
於本說明書，所謂「培養」意指使細胞於試管內(in vitro)環境維持或/及使增殖。所謂「進行培養」意指於組織外或體外，例如於細胞培養皿或燒瓶中使細胞持續或/及增殖。
於本說明書，所謂「將細胞於物質存在下進行培養」意指例如將細胞於含有物質之培養基中進行培養。如此之培養可列舉例如以只有該物質、或該物質與其他分化誘導因子等共存之培養基之培養。於培養基中添加該物質時，可直接添加於培養基中，或者是將該物質於使用時以適當之溶劑溶解後，再添加至培養基中。又，亦可將該物質於培養時之基板或載體表面上固定化而進行培養。
於本說明書，「陽性(positive(+))」意指蛋白質或基因以由該領域公知之手法之可檢出之量表現。又，蛋白質(例如轉錄因子或其亞基等)係於細胞內表現，但於細胞表面未顯示者時，可使該蛋白質與報告蛋白質一起表現，藉由檢出該報告蛋白質，而可檢出作為對象之蛋白質。基因之檢出可利用例如RT-PCR、微陣列、生物芯片及RNAseq等核酸增幅方法及/或核酸檢出方法進行。
於本說明書，「陰性(negative(-))」意指蛋白質或基因之表現量未達上所述公知手法之手法的全部或任一種之檢出下限值。蛋白質或基因表現之檢出下限值係依各手法而異。
於本說明書，所謂「標記」意指於預定之細胞型中，特異性地表現於細胞表面、細胞質內、核內等之蛋白質或其基因。標記較佳為「細胞表面標記」。所謂「細胞表面標記」意指於細胞表面表現之蛋白質，該蛋白質係可藉由螢光物質標識(染色)，使表現細胞表面標記之細胞之檢出、濃縮、單離等容易進行者。該細胞表面標記意指於預定之細胞型中特異性地表現(陽性標記)或未表現(陰性標記)的基因，具體是指生成(陽性標記)或未生成(陰性標記)藉由基因組中該基因的轉錄所得之mRNA、或藉由此mRNA轉譯所得之蛋白質之物質。
此等細胞表面標記之檢出係可利用使用了針對該細胞表面標記之特異性抗體的免疫學分析，例如ELISA、免疫染色、流式細胞儀進行
於本說明書，所謂「表現(expression)」係定義為藉由細胞內之啟動子而被驅動之特定核苷酸序列之轉錄及/或轉譯。
於本說明書中，「富潛能幹細胞(pluripotent stem cell)」意指胚胎幹細胞(ES細胞)及具有與此類似之分化多能性的細胞，亦即，具有分化成生體之各種組織(所有內胚層、中胚層、外胚層)之潛在能力的細胞。具有與ES細胞類似之分化多能性之細胞可列舉「誘導性富潛能幹細胞(induced pluripotent stem cells)」(於本說明書中亦稱為「iPS細胞」)。
於本說明書，「造血幹細胞(HSC)」為可分化成血球系細胞之多潛能幹細胞(multipotent stem cell)。造血幹細胞於人類生體內主要存在於骨髓，分化成白血球(嗜中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球、淋巴球、單核球、巨噬細胞)、紅血球、血小板、肥大細胞、樹突狀細胞等。於本說明書，造血幹細胞(HSC)可為CD34呈陽性，CD7呈陰性(CD34+/CD7-)。此外，本說明書中、於「CD34+/CD7-」等之表述所使用之「/」意指「及」。
於本說明書，「造血性內皮細胞(hemogenic endothelial cell：HEC)」為表現CD34，且未表現CD43、CD184及CD73(CD34+/CD43-/CD184-/CD73-)之細胞(此外，CD34+/CD43-/CD184-/CD73-細胞由於未表現CD7，CD34+/CD43-/CD184-/CD73-細胞亦表示CD34+/CD7-/CD43-/CD184-/CD73-細胞)。
於本說明書，所謂「T前驅細胞(proT)」意指於人類生體內，於從造血幹細胞分化成CD3陽性T細胞之過程中產生之造血系細胞，CD34及CD7為陽性(CD34+/CD7+細胞)。又，於本說明書中，proT可為CD43、CD1a及/或CD116呈陰性。
於本說明書中，「中胚層前驅細胞」意指例如表現選自由T(與Brachyury同意義)、KDR、FOXF1、FLK1、BMP4、MOX1及SDF1構成
之標記基因中之至少1種標記基因之細胞。中胚層前驅細胞並非與中胚層細胞區分者，亦可將上述標記基因之表現弱者稱為中胚層前驅細胞。
於本說明書中，所謂「調節性T細胞」意指在接受通過T細胞受體之刺激時，具有可抑制效應T細胞活化之能力，並且掌控免疫應答的抑制(免疫耐受性)之T細胞。調節性T細胞通常為CD25+/FOXP3+細胞，其中，存在CD4+或CD8+之細胞。於本發明，調節性T細胞可為CD4+之細胞(亦即，CD4+/CD25+/FOXP3+)，亦可為CD8+之細胞(亦即，CD8+/CD25+/FOXP3+)，更佳為CD4+之細胞。又為CD4+/CD25+調節性T細胞之主要調節性因子己知有轉錄因子FOXP3。
於本發明中，造血幹細胞、造血性內皮細胞、T前驅細胞及中胚層前驅細胞可為從骨髓、臍帶血、血液等生體組織被單離出之細胞，亦可為源自ES細胞、iPS細胞等富潛能幹細胞之細胞。
於本說明書，「CD4CD8雙陽性T細胞」意指T細胞之中，表面抗原之CD4及CD8同時為陽性之細胞(CD8+/CD4+)，T細胞由於可藉由屬於表面抗原之CD3及CD45為陽性而辨識，因此CD4CD8雙陽性T細胞可鑑定為CD4、CD8、CD3及CD45為陽性之細胞。
於本說明書，「CD4CD8雙陰性T細胞」意指T細胞之中，表面抗原之CD4及CD8同時為陰性之細胞(CD8-/CD4-)，T細胞由於可藉由屬於表面抗原之CD3及CD45為陽性而辨識，因此CD4CD8雙陰性T細胞可鑑定為CD4及CD8為陰性，CD3及CD45為陽性之細胞。
從適用於治療之之觀點而言，本發明使用之各種細胞較佳為GMP(良好作業規範(Good Manufacturing Practice))規格之細胞。
富潛能幹細胞可列舉例如：胚胎幹細胞(embryonic stem cell：ES細胞)、誘導性富潛能幹細胞(induced pluripotent stem cell：iPS細胞)、胚胎性腫瘤細胞(EC細胞)、胚胎性生殖幹細胞(EG細胞)、Muse細胞，較佳為iPS細胞(更佳為人類iPS細胞)。上述富潛能幹細胞為源自ES細胞或人類胚胎之任意細胞時，其細胞可為將胚胎破壞而製成之細胞，亦可為不將胚胎破壞而製成之細胞，較佳為將胚胎破壞而製成之細胞。
「ES細胞」若為小鼠ES細胞，可利用inGenious targeting laboratory公司、理研(理化學研究所)等建立之各種小鼠ES細胞株，若為人類ES細胞，可利用威斯康辛大學、NIH、理研、京都大學、國家兒童健康與發展中心、Cellartis公司等建立之各種人類ES細胞株。例如，人類ES細胞株可利用：ESI Bio公司出售的CHB-1至CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1至HUES28株等，WiCell Research出售之H1株、H9株等，理研出售之KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。
「誘導性富潛能幹細胞」意指藉由對哺乳動物體細胞或未分化幹細胞導入特定因子(核初期化因子)進行再編程(reprogramming)而獲得之細胞。目前，有各種「誘導性富潛能幹細胞」，除了由山中人等藉由對小鼠纖維母細胞導入Oct3/4‧Sox2‧Klf4‧c-Myc之4因子建立之iPS細胞(Takahashi K.,Yamanaka S.,Cell,(2006)126：663-676)之外，亦可使用將同樣之4因子導入至人類纖維母細胞所建立之源自人類細胞之iPS細胞(Takahashi K.,Yamanaka S.,et al.,Cell,(2007)131：861-872.)；導入上述4因子後，以Nanog之表現作為指標進行挑選而建立之Nanog-iPS細
胞(Okita,K.,Ichisaka,T.,and Yamanaka,S.(2007).Nature 448,313-317.)；以不含c-Myc之方法所製出之iPS細胞(Nakagawa M.,Yamanaka S.,et al.,Nature Biotechnology,(2008)26,101-106)；以無病毒法導入6因子而建立之iPS細胞(Okita K.et al.,Nat.Methods 2011 May；8(5)：409-12,Okita K.et al.,Stem Cells.31(3)：458-66.)。又，亦可使用由Thomson人等製作的導入OCT3/4‧SOX2‧NANOG‧LIN28之4因子而建立之誘導性富潛能幹細胞(Yu J.,Thomson JA.et al.,Science(2007)318：1917-1920.)；由Daley人等製作之誘導性富潛能幹細胞(Park IH.,Daley GQ.et al.,Nature(2007)451：141-146)；由櫻田人等製作之誘導性富潛能幹細胞(日本特開2008-307007號公報)等。
除此之外，可利用已記載於已公開之所有論文(例如Shi Y.,Ding S.,et al.,Cell Stem Cell,(2008)Vol 3,Issue 5,568-574；Kim JB.,Scholer HR.,et al.,Nature,(2008)454,646-650；Huangfu D.,Melton,DA.,et al.,Nature Biotechnology,(2008)26,No 7,795-797)或專利(例如日本特開2008-307007號公報、日本特開2008-283972號公報、美國專利申請公開第2008/2336610號說明書、美國專利申請公開第2009/047263號說明書、國際公開第2007/069666號、國際公開第2008/118220號、國際公開第2008/124133號、國際公開第2008/151058號、國際公開第2009/006930號、國際公開第2009/006997號、國際公開第2009/007852號)中之該領域所公知之誘導性富潛能幹細胞之任一種。
誘導性富潛能幹細胞株可利用NIH、理研、京都大學等建立之各種iPS細胞株。例如，若為人類iPS細胞株可列舉：理研之HiPS-
RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大學之Ff-I01s04株、QHJI株、RWMH株、DRXT株、RJWI株、YZWJ株、ILCL株、GLKV株、253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株等。
所謂「核酸」只要是聚合了核苷酸及具有與該核苷酸同等功能之分子而成之分子則可為任意者，可列舉例如：屬於核糖核苷酸之聚合物之RNA、屬於去氧核糖核苷酸之聚合物之DNA、核糖核苷酸及去氧核糖核苷酸混合成之聚合物及含有核苷酸類似物之核苷酸聚合物，再者，亦可為含有核酸衍生物之核苷酸聚合物。核酸可為單鏈核酸或雙鏈核酸。雙鏈核酸亦包含其中一鏈以嚴格之條件與另一鏈進行雜交之雙鏈核酸。
與RNA或DNA比較，核苷酸類似物只要是為了提昇核酸酶抗性或穩定化、為了提昇與相補鏈核酸之親和力、為了提昇細胞穿透性或者是為了可視化，而對核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、RNA或DNA實施了修飾之分子，則可為任意之分子。核苷酸類似物可為天然存在之分子，亦可為非天然之分子，可列舉例如糖部修飾核苷酸類似物(例如經2’-O-甲基核糖取代之核苷酸類似物、經2’-O-丙基核糖取代之核苷酸類似物、經2’-甲氧基乙氧基核糖取代之核苷酸類似物、經2’-O-甲氧基乙基核糖取代之核苷酸類似物、經2’-O-[2-(胍)乙基]核糖取代之核苷酸類似物、經2’-氟核糖取代之核苷酸類似物、交連結構型人工核酸(BNA：Bridged Nucleic Acid)、鎖定人工核酸(LNA：Locked Nucleic Acid)、乙烯交連結構型人工核酸(ENA：Ethylene bridged nucleic acid)、肽核酸(PNA)、氧肽核酸
(OPNA)、肽核糖核酸(PRNA))、磷酸二酯鍵修飾核苷酸類似物(例如：硫代磷酸酯鍵取代之核苷酸類似物、N3’-P5’磷醯胺鍵取代之核苷酸類似物)等。
與核酸比較，核酸衍生物只要是為了提昇核酸酶抗性、為了安定化、為了提高與相補鏈核酸之親和力、為了提高細胞穿透性或為了可視化，而對該核酸附加其他化學物質之分子，則可為任意之分子，其具體例可列舉5’-多胺加成衍生物、膽固醇加成衍生物、類固醇加成衍生物、膽汁酸加成衍生物、維生素加成衍生物、Cy5加成衍生物、Cy3加成衍生物、6-FAM加成衍生物、生物素加成衍生物等。
本發明之調節性T細胞之製造方法(於本說明書，亦有簡稱為「本發明之製造方法」之情形)係含有下列步驟為特徵。
(1)使導入有表現構築物(於本說明書，亦稱為「本發明之表現構築物」、「表現構築物(expression construct)」、「CNS-Foxp3構築物」及「構築物」)之可分化成調節性T細胞的細胞分化成調節性T細胞之步驟，該表現構築物係含有：
(a)Foxp3基因之保守非編碼序列(Conserved Non-coding Sequence)(CNS)1、CNS2及CNS3，(b)啟動子，及(c)編碼FOXP3之核酸。
本發明中之表現構築物(expression construct)係用以使FOXP3表現者，該表現構築物含有(a)Foxp3基因之CNS1(保守非編碼序列1)、CNS2(保守非編碼序列2)及CNS3(保守非編碼序列3)，(b)啟動子及(c)編碼FOXP3之核酸。藉由將如此之表現構築物導入至可分化成調節性T細胞之細胞，可高效率地製造調節性T細胞。表現構築物只要是可使FOXP3表現者則無特別限限定，較佳為除了上述(a)、(b)及(c)以外亦含有
終止子(terminator)、多腺苷酸化信號(polyadenylation signal)、Foxp3 3’UTR等，若為於導入有此等之細胞內進行功能者則更佳。
人類Foxp3基因之鹼基序列係以RefSeq Accession No.NM_001114377(序列編號1)、NM_014009(序列編號2)登錄，胺基酸序列亦以RefSeq Accession No.NP_001107849(序列編號3)、NP_054728(序列編號4)登錄。此處之RefSeq ID為登錄於NCBI之網站者。於本發明，上述基因除了具有登錄於如前述之資料庫之鹼基序列者以外，亦包含其退化產物(degenerate product)及突變體，突變體較佳為編碼具有與由上述胺基酸序列構成之蛋白質同等生物學活性之蛋白質者。突變體可列舉對於天然之胺基酸序列具有80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上同一性的胺基酸序列之突變型之FOXP3。於本說明書中，FOXP3意指蛋白質，Foxp3意指基因，將FOXP3、Foxp3分別作為基因、蛋白質解釋之適當情況中意指基因、蛋白質。
編碼FOXP3之核酸只要是編碼FOXP3蛋白質之核酸則無特別限定，較佳為FOXP3之cDNA。
於本發明使用之CNS1、CNS2及CNS3全為源自Foxp3基因者。CNS1、CNS2及CNS3為Foxp3增強要素(enhancer element)。於本發明使用之啟動子無特別限定，例如為CAG啟動子、泛素(ubiquitin)基因之啟動子、Foxp3基因之啟動子、EF1α啟動子、SRα啟動子、SV40啟動子、LTR啟動子、CMV(巨細胞病毒)啟動子、RSV(勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))啟動子、MoMuLV(莫洛尼小鼠白血病病毒)LTR、HSV-
TK(單純皰疹病毒胸苷激酶)啟動子等，較佳為Foxp3基因之啟動子。人類Foxp3基因之CNS1、CNS2、CNS3及啟動子之較佳鹼基序列可列舉分別記載於序列編號5至8之鹼基序列。該啟動子、CNS1、CNS2及CNS3除了具有如前述之鹼基序列者以外，亦包含突變體，突變體較佳為具有與由上述鹼基序列構成之啟動子、CNS1、CNS2及CNS3同等生物學活性者。突變體可列舉對於天然之鹼基序列具有80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上同一性之鹼基序列者。
啟動子、CNS1、CNS2、CNS3及編碼FOXP3之核酸之表現構築物中之配置(順序)無特別限定，CNS1、CNS2及CNS3較佳為位於啟動子之上流，更佳為從5’末端側依序為CNS1-CNS2-CNS3-啟動子-編碼FOXP3之核酸。
導入上述表現構築物之可分化成調節性T細胞之細胞只要是可分化成調節性T細胞之細胞則無特別限定，可列舉例如：富潛能幹細胞、造血幹細胞、造血性內皮細胞、T前驅細胞、中胚層前驅細胞等，較佳為富潛能幹細胞，更佳為iPS細胞。
可分化成調節性T細胞之細胞可為源自人類，亦可為源自人類以外之哺乳類(非人類哺乳類)之細胞，較佳為人類。非人類哺乳類可列舉例如：小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、兔子、狗、貓、豬、牛、馬、羊、猴子。
用以將上述表現構築物導入至可分化成調節性T細胞之細胞之手段無特別限定，可採用公知或通常之各種手段。典型而言，上述表現
構築物為使用表現載體導入至可分化成調節性T細胞之細胞使表現。表現載體可為直鏈狀，亦可為環狀，也可為質體等之非病毒載體、病毒載體、轉位子(transposon)之載體。
用以將表現載體導入至可分化成調節性T細胞之細胞之手法可為因應實施形態之適當者。例如可藉由病毒感染法、磷酸鈣法、脂質轉染法、顯微注射法等公知之方法，將表現載體導入至可分化成調節性T細胞之細胞。表現載體可藉由公知之手段或使用適當之市售套組(依照其指示書)，調製成各手法中適合使用之形態。
表現載體係可藉由病毒感染法導入至可分化成調節性T細胞之細胞。病毒載體可列舉例如：逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體。使用此等病毒載體時，使用對應之市售套組，將含有表現構築物之載體及各病毒之包裝載體(質體)轉染至宿主細胞而製作出重組病毒後，使獲得之重組病毒感染可分化成調節性T細胞之細胞即可。
表現載體除了表現構築物之外，因應所需亦可含有核定位信號(NLS)、多克隆位點(MCS)等序列。表現載體更可含有將如報告基因(例如，編碼各色之螢光蛋白質之基因)、藥劑選擇基因(例如，卡那黴素(kanamycin)抗性基因、胺苄青黴素(ampicillin)抗性基因、嘌呤黴素(puromycin)抗性基因)、自殺基因(例如，編碼白喉A毒素、單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、羧肽酶G2(CPG2)、羧酸酯酶(CA)、胞嘧啶脫胺酶(CD)、細胞色素P450(cyt-450)、脫氧胞苷激酶(dCK)、硝基還原酶(NR)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、胸苷磷酸化酶(TP)、水痘帶狀疱疹病毒胸苷激酶
(VZV-TK)、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶(XGPRT)、誘導型凋亡蛋白酶9(inducible caspase 9)等之基因)之“功能性基因”編碼之核酸(鹼基序列)。
本發明之製造方法可更包含(2)將表現構築物導入至可分化成調節性T細胞之細胞之步驟，該表現構築物係含有：
(a)Foxp3基因之CNS1、CNS2及CNS3，
(b)啟動子，及(c)編碼FOXP3之核酸。
將表現構築物導入至可分化成調節性T細胞之細胞之方法可列舉前述之方法。
可依照公知之方法實施導入有表現構築物之可分化成調節性T細胞之細胞分化誘導成調節性T細胞。此等方法可列舉例如ATO(人工胸腺類器官(artificial thymic organoid))法(參照國際公開第2017/075389號等)。如此之ATO法係將含有可分化成調節性T細胞之細胞或由此分化誘導出之細胞、以及表現Notch配位體之間質細胞(stromal cell)之3維細胞凝集物進行培養，藉此可以高效率分化誘導成調節性T細胞。ATO法為公知之方法，可參考國際公開第2017/075389號等之記載實施。又，其他方法可列舉於國際公開第2021/092581號記載之分化誘導方法(與MS5-DLL1/4間質細胞、OP9或OP9-DLL1間質細胞或EpCAM-CD56+間質細胞共培養之方法等)。表現Notch配位體之間質細胞較佳為源自強制表現有人類DLL4蛋白質之小鼠之間質細胞株MS5。
所位可分化成調節性T細胞之細胞或由此分化誘導出之細胞意指「導入有表現構築物之可分化成調節性T細胞之細胞」或「從導入有該表現構築物之可分化成調節性T細胞之細胞分化誘導出之細胞」，可對
導入有表現構築物之可分化成調節性T細胞之細胞(亦即，導入有表現構築物之細胞)實施ATO法，亦可對從導入有該表現構築物之可分化成調節性T細胞之細胞(亦即，導入有表現構築物之細胞)分化誘導出之細胞實施ATO法。
實施ATO法之可分化成調節性T細胞之細胞或由此分化誘導出之細胞無特別限定，可列舉例如CD34+細胞、中胚層前驅細胞、CD4CD8雙陰性T細胞、CD4CD8雙陽性T細胞等，較佳為CD34+細胞或中胚層前驅細胞，更佳為CD34+/CD7-細胞或中胚層前驅細胞，再較佳為造血性內皮細胞、造血幹細胞、中胚層前驅細胞，特佳為造血性內皮細胞。供給至ATO法之細胞更佳為從上述可分化成調節性T細胞之細胞分化誘導出之細胞。上述CD34+細胞為表現CD34之(CD34+)細胞，尤其是表現CD34，且未表現CD7之(CD34+/CD7-)細胞。CD34+細胞可列舉例如造血性內皮細胞、造血幹細胞。
其中，較佳為使用富潛能幹細胞(尤其是iPS細胞)作為可分化成調節性T細胞之細胞，將此分化誘導成CD34+細胞(尤其是造血性內皮細胞)，對該CD34+細胞(尤其是造血性內皮細胞)實施ATO法，使其分化成調節性T細胞。
富潛能幹細胞分化誘導成CD34+細胞可依照公知之方法實施，富潛能幹細胞為iPS細胞時，可藉由例如國際公開第2017/221975號、國際公開第2018/135646號及Cell Reports 2(2012)1722-1735中記載之方法，將造血前驅細胞分化誘導而製造CD34+細胞。對造血性內皮細胞實施ATO法時，可對含有造血性內皮細胞之CD34+細胞實施ATO法(亦即，實
施ATO法前不實施造血性內皮細胞之分離步驟)，又，亦可依照公知之方法(例如流式細胞儀、磁性細胞分離法)對分離後之造血性內皮細胞實施ATO法。
Notch配位體無特別限定，包含國際公開第2017/075389號記載之標準性Notch配位體及非標準性Notch配位體。標準性Notch配位體可列舉例如DLL4(Delta樣配位體4)、DLL1(Delta樣配位體1)、JAG1(Jagged1)、JAG2(Jagged2)等。此等可單獨使用1種，亦可將2種以上組合使用。非標準性Notch配位體可列舉例如接觸素(Contactin)-1、NOV/CCN3、接觸素-6、骨膜素(periostin)/OSF-2、DLK2/EGFL9、Pref-1/DLK1/FA1、DNER、血小板反應蛋白-2、MAGP-1/MFAP2、血小板反應蛋白-3、MAGP-2/MFAP5、血小板反應蛋白-4及Netrin-1。Notch配位體較佳使用人類DLL4。
3維細胞凝集物例如可藉由將可分化成調節性T細胞之細胞或由此分化誘導出之細胞、以及表現Notch配位體之間質細胞進行離心分離而形成。間質細胞可列舉例如：小鼠間質細胞株、人類間質細胞株等，較佳為於間質細胞導入用以表現Notch配位體之核酸。間質細胞：可分化成調節性T細胞之細胞或由此分化誘導出之細胞之比率可列舉100：1至1：100、20：1至1：20、10：1至4：1，較佳為10：1至4：1。
用以培養3維細胞凝集物之培養基無特別限定，可列舉例如不含血清之培養基，尤其是含有胰島素(進一步為生物素、運鐵蛋白及白蛋白)的不含血清之培養基。
用以培養3維細胞凝集物之基礎培養基可列舉例如：AIM V、X-VIVO-15、神經基礎培養基(NeuroBasal)、EGM2、TeSR、BME、BGJb、CMRL 1066、格拉斯哥最低必需培養基(Glasgow MEM)、Improved MEM Zinc Option、IMDM、199培養基、伊格爾(Eagle)MEM、αMEM、DMEM、Ham、RPMI-1640、飛世爾(Fisher)培養基等。此等培養基可單獨使用任何1種，亦可將2種以上混合使用。此外，可適當地調配國際公開第2017/075389號中記載之培養基成分等。
用以培養3維細胞凝集物之培養條件例如培養溫度為約20至40℃，CO2濃度為約2至10%，氧濃度為約1至20%，培養期間為例如1至100日左右。培養開始時之細胞密度例如可設為例如1.0×104至1.0×1010cells/mL左右。
於本發明之製造方法中使用之培養基、培養條件等可使用適合於進行培養之細胞之種類者。
於此等培養基中使用之基礎培養基只要是可於動物細胞培養中使用者則無特別限定，可列舉例如前述者。
培養基可含有血清，亦可為無血清。培養基亦可含有血清代替物(例如，白蛋白、運鐵蛋白、Knockout血清替代品(Knockout Serum Replacement，KSR)、脂肪酸、胰島素、膠原蛋白前驅物、微量元素、2-巰基乙醇、3’-硫醇甘油、ITS-補充劑等)。血清代替物可使用1種或2種以上。
再者，培養基亦可含有脂質、胺基酸(非必須胺基酸等)、L-麩醯胺酸、維生素、增殖因子、細胞激素、抗生物質、抗氧化劑、丙酮酸、緩
衝劑、無機鹽類等之1種以上的物質。培養基較佳為使用未含有血清等不明成分之化學成分確定(chemically-defined)之培養基，可降低培養基批次間之差異，調製品質穩定之細胞。
培養基之pH通常為7.0至7.8，較佳為7.2至7.6。培養基於使用前為了防止污染，較佳為藉由過濾、紫外線照射、加熱滅菌、放射線照射等方法進行滅菌。培養於滋養細胞(feeder cell)存在下或不存在下實施。培養條件無特別限制，可使用於細胞培養通常使用之條件。在培養中，為了獲得期望量之細胞，可進行必須次數之傳代，亦可進行培養基之追加及交換。培養容器無特別限定，可從盤、碟、培養皿(Schale)、燒瓶、袋、瓶、槽(培養槽)、生物反應器等之中適當地選擇。
為了將獲得之調節性T細胞濃縮，本發明之製造方法更可包含將調節性T細胞分離之步驟。調節性T細胞之分離可藉由使用流式細胞儀之方法、磁性細胞分離法等公知之方法進行。
本發明之製造方法可更包含(3A)將前述調節性T細胞於選自由CDK8及/或CDK19抑制劑、TNFR2促效劑、mTOR抑制劑及TGF-βR促效劑構成之群組中之至少1種物質的存在下進行培養之步驟。本發明之製造方法較佳可更包含(3)將前述調節性T細胞於mTOR抑制劑及TNFR2促效劑的存在下進行培養之步驟。
CDK8(週期蛋白依賴性激酶8(cyclin-dependent kinase 8))及/或CDK19抑制劑定義為抑制CDK8及/或CDK19功能之物質，尤其是抑制CDK8及/或CDK19之激酶活性之物質，可為CDK8及CDK19雙方之抑制劑，亦可為任一方之抑制劑。CDK8及/或CDK19抑制劑可列舉
例如：4-[1-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基]-1,2,5-噁二唑-3-胺(AS2863619)(以下，亦稱為「化合物1」)；3-{1-[1-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基]-4-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基}吡
-2-胺(AS3334366)(以下，亦稱為「化合物2」)；用於編碼CDK8及/或CDK19之基因及/或此等之轉錄產物之siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA；反義核酸及表現此等之表現載體；美國專利第8598344號說明書、國際公開第2013/116786號、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109 13799-13804(2012)、國際公開第2013/001310號、國際公開第2013/040153號、國際公開第2014/029726號、國際公開第2014063778號、國際公開第2014/072435號、國際公開第2014/090692號、國際公開第2014/106606號、國際公開第2014/123900號、國際公開第2014/154723號、國際公開第2014/194245號、國際公開第2015/049325號、國際公開第2015/100420號、國際公開第2015/144290號、國際公開第2015/159937號、國際公開第2015/159938號、國際公開第2016/009076號及國際公開第2018/159805號中記載之化合物等。其中，較佳為化合物1、化合物2、用於編碼CDK8及/或CDK19之基因及/或此等之轉錄產物之siRNA，更佳為化合物1。CDK8及/或CDK19抑制劑可單獨使用1種或將2種以上組合使用。
mTOR(雷帕黴素的機械靶標(mechanistic target of rapamycin)抑制劑定義為抑制mTOR功能之物質，其中，包含抑制mTOR本體功能之物質、以及抑制屬於mTOR複合物之mTOR complex 1(mTORC1)及mTOR complex 2(mTORC2)功能之物質。mTOR抑制劑
可列舉例如：雷帕黴素或其衍生物、依維莫司(Everolimus)、替西羅莫司(temsirolimus)、利達福莫司(Ridaforolimus)、西羅莫司(sirolimus)、KU0063794、AZD805、AZD8055、WYE-354、WAY-600、WYE-687、Pp121、Pp242、達妥昔布(Dactolisib)、薩帕尼替布(Sapanisertib)、奧米昔布(Omipalisib)、維塞替布(Vistusertib)、Torin 1、Torin 2等。mTOR抑制劑除此之外亦可列舉：用於編碼mTOR之基因及/或此轉錄產物之siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、反義核酸；以及表現此等之表現載體，再者，可列舉用於編碼將mTOR磷酸化而活化之酵素的基因及/或此轉錄產物之siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、反義核酸；以及表現此等之表現載體等。mTOR抑制劑其中較佳為雷帕黴素或其衍生物，更佳為雷帕黴素。mTOR抑制劑可單獨使用1種，或將2種以上組合使用。
TNFR2(腫瘤壞死因子受體(Tumor necrosis Factor Receptor-2))促效劑定義為與TNFR2結合，可將TNFR2之信號傳達活化之物質，例如為抗體(例如抗TNFR2抗體)、肽、低分子化合物、蛋白質等。TNFR2促效劑抗體可列舉例如：殖株MR2-1(Hycult Biotech公司製造)、殖株MAB2261(R & D Systems公司製造)等之與TNFR2結合之單殖株抗體等。TNFR2促效劑亦可為TNF-α突變蛋白，其係作為促效劑僅與TNFR2結合者。TNFR2促效劑可單獨使用1種，或將2種以上組合使用。
TNFR2促效劑較佳為TNFR2促效劑抗體。該抗體可為其功能性斷片，功能性斷片可列舉例如：Fd、Fv、Fab、F(ab’)、F(ab)2、F(ab’)2、單鏈Fv(scFv)、二聚體、三聚體(triabody)、四聚體(tetrabody)及微體。抗體可列舉源自小鼠、大鼠、牛、兔子、山羊、家羊、天竺鼠等動物者。抗體
之同型(isotype)無特別限定，同型可列舉例如：IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA、IgD、IgE及IgM。又，抗體可為單殖株抗體及多殖株抗體之任一種，較佳為單殖株抗體，又，抗體亦可為人類化抗體、嵌合抗體、多重特異性抗體(例如雙重特異性抗體)等。抗體可藉由公知之方法製造，例如可藉由構築含有編碼抗體之核酸之表現載體，將導入該核酸之轉形體進行培養，將產生抗體之雜交瘤進行培養等而生產。
TGF-βR(乙型轉化生長因子(Transforming Growth Factor-β Receptor)促效劑定義為與TGF-βR結合，可將TGF-βR之信號傳達活化之物質。TGF-βR促效劑可列舉屬於TGF-β超家族之因子，TGF-β超家族存在有TGF-β家族、活化素家族及BMP家族(bone morphogenetic protein)。屬於如此之TGF-β超家族之因子可列舉例如：TGF-β(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)、活化素A、活化素B、GDF-8、GDF-11等。TGF-βR促效劑較佳為TGF-β。TGF-βR促效劑可單獨使用1種，或將2種以上組合使用。
又，CDK8及/或CDK19抑制劑、TNFR2促效劑、mTOR抑制劑及TGF-βR促效劑可以游離之狀態或鹽狀態使用。鹽可列舉例如：與鈉鹽、鎂鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋁鹽等無機鹼之鹽；與甲胺鹽、乙胺鹽、乙醇胺鹽等有機鹼之鹽；與離胺酸、鳥胺酸、精胺酸等鹼性胺基酸之鹽及銨鹽。該鹽亦可為酸加成鹽，所述之鹽可具體列舉：與鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等無機酸；與甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、蘋果酸、酒石酸、富馬酸、琥珀酸、乳酸、馬來酸、檸檬酸、甲磺酸、乙磺酸等有機酸；與天門冬胺酸、麩醯胺酸等酸性胺基酸之酸加成鹽。CDK8及/或
CDK19抑制劑、TNFR2促效劑、mTOR抑制劑、及TGF-βR促效劑亦包含水合物、溶劑化物、多結晶型等。
CDK8及/或CDK19抑制劑、TNFR2促效劑、mTOR抑制劑及TGF-βR促效劑含有不對稱碳時，此等中亦包含R體、S體及以任意比例含有兩者之混合物(消旋體等)之任一種。
培養基中之CDK8及/或CDK19抑制劑之濃度只要可將調節性T細胞擴大培養則無特別限定，可根據使用之CDK8及/或CDK19抑制劑之種類等適當地調整。CDK8及/或CDK19抑制劑之濃度為例如0.1至300nM，較佳為0.5至150nM。
培養基中之mTOR抑制劑的濃度只要能將調節性T細胞擴培養則無特別限定，可根據使用之mTOR抑制劑之種類等適當地調整。mTOR抑制劑之濃度為例如1至3000nM，較佳為5至1000nM，更佳為10至100nM。
培養基中之TNFR2促效劑的濃度只要能將調節性T細胞擴培養則無特別限定，可根據使用之TNFR2促效劑之種類等適當地調整。TNFR2促效劑之濃度為例如0.0001至100μg/mL，較佳為0.01至10μg/mL，更佳為1至5μg/mL。
培養基中之TGF-βR促效劑的濃度只要能將調節性T細胞擴培養則無特別限定，可根據使用之TGF-βR促效劑之種類等適當地調整。TGF-βR促效劑之濃度為例如0.1至100ng/mL，較佳為1至50ng/mL。
於步驟(3)或(3A)之培養使用之培養基係以動物細胞培養中使用之培養基作為基礎培養基，包含前述之CDK8及/或CDK19抑制劑、
TNFR2促效劑、mTOR抑制劑及TGF-βR促效劑者。培養基及培養條件可列舉前述者。又，對於培養期間亦無特別限定，只要是所屬技術領域具有通常知識者則可一邊監測調節性T細胞之數目等一邊適地決定，例如為10日以上，較佳為1週以上，更佳為2週以上。培養期間之上限無特別限定，例如為35日以下，較佳為28日以下，更加為21日以下。
對藉由本發明之製造方法獲得之調節性T細胞導入外來基因，可更製造導入有外來基因之調節性T細胞。
「外來基因」係為了於調節性T細胞中表現期望之蛋白質，從外部導入之基因，可因應調節性T細胞之用途而適當地選擇。
外來基因可設為例如用以表現CAR(嵌合抗原受體)之基因，其更可包含用以表現細胞激素及/或趨化因子之基因。表現調節性T細胞之CAR基本上與一般或公知之CAR相同，下列各部位之肽係因應所需通過間隔基(spacer)連結而構成：(i)辨識癌細胞之細胞表面抗原之抗原辨識部位(例如單鏈抗體)、(ii)細胞膜貫通區域、及(iii)誘導T細胞活化之信號傳達區域。又，外來基因係亦可設為例如用以表現外源性T細胞受體(TCR)之基因。外源性TCR意指對於被導入編碼外源性TCR之核酸之T細胞為外源性的，外源性TCR之胺基酸序列可與該T細胞之內源性TCR相同，亦可不同。外來基因可導入1種或2種以上(例如CAR及外源性TCR)
用以將外來基因導入至調節性T細胞之手段可列舉前述之方法。
藉由本發明之製造方法所製出之調節性T細胞係對免疫反應異常亢進之動物(尤其是人類)之治療有用，例如對免疫失調多發性內分泌
病腸病X連鎖(immune dysregulation polyendocrinopathy enteropathy X-linked，IPEX)症候群、移植物對抗宿主疾病(GVHD)、臟器移植之排斥反應、自體免疫性疾病、炎症性疾病、過敏性疾病(花粉症、氣喘、異位性皮膚炎、濕疹、食品過敏、食物過敏症、蕁麻疹、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、藥劑過敏)等之治療及預防有用，惟不限定於此等。藉由本發明之製造方法所製出之調節性T細胞可用於自體移植，亦可用於異體移植。又，亦可與其他藥劑併用。
實施如此之細胞治療時，從不會引起排斥反應觀點而言，從其中分離出用於調節性T細胞的製造中使用之細胞的對象，較佳為與被投予調節性T細胞之對象有一致的HLA類型，更佳為與被投予調節性T細胞之對象為相同之對象。
根據本發明可製造含有調節性T細胞之醫藥組成物(以下，亦稱為本發明之醫藥組成物)。本發明之醫藥組成物較佳為依照公知之手段(例如日本藥典中記載之方法等)，將有效量之調節性T細胞與藥學上容許之載體混合等，而製造成非經口製劑。本發明之醫藥組成物較佳為製造成注射劑、懸濁劑、點滴劑等非經口製劑。非經口之投予方法可列舉靜脈內、動脈內、肌肉內、腹腔內、皮下投予等方法。藥學上容許之載體可列舉例如溶劑、基劑、稀釋劑、賦形劑、無痛化劑、緩衝劑、保存料、穩定劑、懸濁劑、等張化劑、界面活性劑、溶解補助劑等。
本發明醫藥組成物之投予量可因應病患之體重、年齡、性別、症狀等各種條件而適當地決定，通常，以細胞數而言，相對於體重60kg之對象，以每1次通常成為1×106至1×1010個，較佳為成為1×107至1×109
個，更佳為成為5×107至5×108個之方式投予。又，可以1次投予，亦可分成複數次投予。本發明之醫藥組成物可作成適用於非經口投予之公知形態，例如作成注射或注入劑。又，本發明之醫藥組成物為了穩定地維持細胞，亦可含有生理食鹽水、磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)、培養基等。培養基無特別限定，可列舉RPMI、AIM-V、X-VIVO10等培養基，惟不限定於此等。又，該醫藥組成物以穩定化為目的，亦可添加醫藥上容許之載體(例如，人類血清白蛋白)、保存劑等。本發明之醫藥組成物係適用於包含人類之哺乳動物者。
於本說明書及申請專利範圍使用時，除非上下文有特別要求，否則單數形之用語包含複數形，複數形之用語包含單數形。因此，單數形之冠詞(例如為英語時「a」、「an」、「the」等)除非特別提及，可理解為亦包含其複數形之概念。
[實施例]
以下，列舉實施例更詳細地說明本發明，惟本發明不限於此等實施例等。
(1)CNS-Foxp3構築物之製作
將登錄於GenBank之序列(MK012431)內之mStrawberry蛋白質序列變更為dTomato序列之DNA序列，將該DNA序列引入至第3世代慢病毒載體製作用之轉移質體，而設計並合成出質體序列。將收到之質體與慢病毒載體製作用之包裝質體(packaging plasmid)及包膜質體(envelope plasmid)一起對HEK293系統之細胞進行轉染，將含有產生之慢病毒載體之上清液回收後，以高速離心法濃縮而取得待導入iPS細胞之慢病毒載體。
(2)構築物導入至iPS細胞及從導入了構築物之iPS細胞分化為HEC
含有造血性內皮細胞之細胞集團係使用將京都大學iPS細胞研究所供給之iPS細胞(Ff-I01s04株：源自健常人的末梢血單核球)根據公知之方法(例如記載於Cell Reports 2(2012)1722-1735及國際公開第2017/221975號之方法)而分化成的浮遊細胞集團。
具體而言，將Ff-I01s04株以1×104cells/well播種於24孔盤，以最終濃度為10μg/mL之方式添加精蛋白(protamine)後，直接添加編入有CNS-Foxp3基因之慢病毒溶液，製作出病毒感染iPS細胞。於經超低附著處理之6孔盤中(Corning)將經病毒感染之Ff-I01s04株以1×106cells/well播種(Day0)，於EB培養基(StemPro34(Gibco)中添加10μg/ml人類胰島素、5.5μg/ml人類運鐵蛋白、5ng/ml亞硒酸鈉(ITS，Gibco)、2mM L-麩醯胺酸(Sigma-Aldrich)、45mM α-單硫代甘油(NACALAI TESQUE,INC.)及50μg/ml抗壞血酸2-磷酸(Sigma-Aldrich))中添加50ng/ml BMP4(R & D systems)、50ng/ml bFGF(富士軟片和光純藥股份有限公司)、50ng/ml VEGF(R & D systems)、2μM SB431542(富士軟片和光純藥股份有限公司)，於低氧條件下(5%O2)進行4日培養(Day4)。接著，以添加有50ng/ml bFGF、50ng/ml VEGF、50ng/ml SCF(R & D systems)之培養基再進行4日培養(Day8)，獲得含有HEC之細胞集團。含有HEC之上述浮遊細胞集團係使用下述表1之抗體套組進行染色。
[表1]
於獲得之細胞集團中以流式細胞儀法確認HEC(CD34+/CD43-/CD73-/CD184-細胞)含有約15%。對照組係除了使用未導入於(1)製作之表現構築物之iPS細胞(Ff-I01s04株)以外，其餘與上述同樣地施作，獲得含有HEC之細胞集團(Untransduced)。
(3)從HEC分化誘導成Treg
參考ATO法(國際公開第2017/075389號等中記載之方法)，使含有於上述(2)獲得之HEC之細胞集團分化成Treg(CD25+/FOXP3+)。
具體而言，將源自小鼠之間質細胞株MS5中強制表現有人類DLL4蛋白質者作為支撐體、及於上述(2)製作之源自導入有CNS-Foxp3之人類iPS細胞的HEC，以4：1之細胞比進行共培養。培養基使用含有最終濃度為2x B27 supplement(Invitrogen)、1x PSG(Sigma-Aldrich)、1x Glutamax(Invitrogen)、5ng/mL IL-7(PeproTech)、5ng/mL F1T3L(PeproTech)、50μg/mL抗壞血酸(Sigma-Aldrich)之RPMI-1640(富士軟片和光純藥股份有限公司)，將於30mm Millicell(親水性PTFE、
孔尺寸0.4μm、高度5mm、Merck Millipore)上進行共培養者靜置於6孔盤(TPP)內，一邊以3-4日一次之頻率交換培養基一邊培養9週。
培養後回收獲得之細胞，以組合於上述(1)所示之Foxp3基因之下流的dTomato作為指標，利用FACS Aria分取目標之細胞畫分。將此根據國際公開第2020/032179號中記載之方法進行擴大培養，藉此確保充分之細胞數後，使用下述表2之抗體套組進行細胞內染色，評估源自人類iPS細胞之Treg之誘導。可以流式細胞儀(FACS Aria Fusion、BD Bioscience)確認誘導了CD4+Treg(CD4+/CD25+/FOXP3+)，與對照組(未導入(Untransduced))比較，於導入有CNS-Foxp3構築物之群中可確認以高比例誘導了Treg(相對於導入Foxp3之iPS細胞為56.4%之比例，於未導入細胞為11.2%)(圖1)。
[表2]
(4)iPS-Treg之擴大培養
將於上述(3)獲得之從iPS細胞分化誘導成Treg後之細胞，以含有雷帕黴素(Merck)10nM及抗TNFR2抗體(Hycult Biotech、克隆MR2-1)3μg/mL之下述培養基進行擴大培養。
具體而言，將於上述(3)獲得之源自導入CNS-Foxp3之人類iPS細胞的Treg，以結合了抗CD3抗體(eBioscience)之48孔細胞培養盤培養3日後，重新播種於24孔G-Rex細胞培養盤繼續培養。培養基係使用α-MEM(Invitrogen)，其以最終濃度含有FBS(15%，Corning)、L-麩醯胺酸-盤尼西林-鏈黴素溶液(1/100，Invitrogen，Sigma-Aldrich)、胰島素-運鐵蛋白-硒補充劑(1/100，Invitrogen)、抗壞血酸2-磷酸(50μg/mL，Sigma-Aldrich)、IL-2(10ng/mL，Peprotech)、IL-7(10ng/mL，Peprotech)、IL-12(50ng/mL，Merck)、IL-15(10ng/mL，Peprotech)、IL-18(50ng/mL，MBL)、IL-21(20ng/mL，Peprotech)、TL-1A(50ng/mL，Peprotech)，最初3日針對上述組成更添加抗CD28抗體(1.5μg/mL，BioLegend)、抗CD30抗體(300ng/mL，R & D systems)及凋亡蛋白酶抑製劑(10μM，R & D systems)。培養係於培養開始第3日及其以後以3-4日1次之頻率一邊進行培養基交換一邊培養9或10日。各細胞集團使用下述抗體套組進行染色(Zombie NIR，BV510 CD3，BV421 CD4，PE/Cy7 CD8，APC CD25，FITC Foxp3)。進行(5)TSDR去甲基化量之檢討及(6)Treg抑制性功能之評估時，繼續上述之擴大培養，將使用FACSAria(Becton Dickinson)精製CD4+Foxp3+細胞群後之細胞集團使用於各個評估中。此外，進行精製時使用下述抗體套組進行染色(BV421 CD4，PE/Cy7 CD8，APC CD25)。
圖2表示進行上述擴大培養後藉由流式細胞儀所得之分析結果。以含有雷帕黴素及抗TNFR2抗體之培養基進行擴大培養獲得之細胞集團中，與對照組(Untransduced)比較，源自導入CNS-Foxp3構築物之iPS細胞之細胞可確認以高比例維持Treg(相對於導入了CNS-Foxp3構築物之
群為84.8%之比例，未導入群為10.4%)。又，以未含有雷帕黴素及TNFR2Ab之培養基進行擴大培養獲得之細胞集團，與對照組(Untransduced)比較，源自導入CNS-Foxp3構築物之iPS細胞之細胞亦以高比例維持Treg(相對於導入了CNS-Foxp3構築物之群為56.4%之比例，未導入群為10.1%)。
(5)Treg特異性去甲基化區域(TSDR)之去甲基量之檢討使用從iPS細胞分化誘導成Treg後之細胞，檢討TSDR之去甲基化。使用之細胞為如下所述。初級Treg(Primary Treg)：從人類PBMC單離出之Treg(CD3+/CD4+/CD8-/CD25+/CD127-)細胞集團，初級非Treg(Primary Non-Treg)：從人類PBMC單離出之非Treg(CD3+/CD4+/CD8-/CD25-)細胞集團，iPSC-Treg：從iPS細胞分化誘導之Treg(CD3+/CD4+/CD8-/CD25+/Foxp3+)細胞集團，HEC：從iPS細胞誘導之未分化的血球系細胞(CD34+/CD43-/CD73-/CD184-)。iPSC-Treg係使用導入了CNS-Foxp3構築物之iPS細胞，以上述(1)至(3)之方法分化誘導成之細胞，HEC係使用未導入CNS-Foxp3構築物，以(1)至(2)之方法分化誘導成之細胞。
具體而言，從上述之各細胞使用PureLink基因組DNA迷你套組(PureLink Genomic DNA Mini Kit(賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific)製造)萃取DNA，將其DNA使用PureQuant Treg Assay(賽默飛世爾科技公司製造)將基因組DNA之去甲基化藉由qRCR進行定量。步驟準則(protocol)依照套組推薦的步驟準則。圖3表示其結果。iPSC-Treg與分化前之HEC比較，TSDR以高比例引起去甲基化(相對於iPSC-
Treg之80%，HEC為0%)，又，顯示與初級Treg相同程度之高比例(初級Treg為88%)。
(6)Treg抑制性功能之評估
使用於上述(3)獲得之從導入有CNS-Foxp3構築物之iPS細胞分化誘導成之Treg，與源自人類PBMC之同種異體(allogeneic)T細胞共培養後藉由流式細胞儀進行分析。
具體而言，將與Treg為源自其他捐贈者之未經或經抗CD3抗體處置之PBMC，以CellTrace Violet(賽默飛世爾科技公司製造)染色者作為目標細胞使用，與Treg進行共培養。培養基係使用α-MEM(Invitrogen)，該α-MEM係以最終濃度含有FBS(15%，Corning)、L-麩醯胺酸-盤尼西林-鏈黴素溶液(1/100，Invitrogen，Sigma-Aldrich)、胰島素-運鐵蛋白-硒補充劑(1/100，Invitrogen)及抗壞血酸2-磷酸(50μg/mL，Sigma-Aldrich)之，並培養4日。各細胞集團使用下述抗體套組進行染色(Zombie NIR，PE/Cy7 CD3，FITC HLA-A24)。
圖4表示與源自人類PBMC之同種異體T細胞進行共培養後藉由流式細胞儀分析之結果。與只以目標細胞培養時相比，與iPS-Treg進行共培養之群中強力地抑制目標細胞之細胞分裂(相對於在Treg：目標(Target)=2：1之條件下目標細胞之23.5%引起細胞分裂，只以目標細胞培養時為74.9%)。又，其抑制性功能與初級Treg為同程度或更強(與初級Treg共培養時，目標細胞之47.5%引起細胞分裂)。
本專利申請以2021年9月27日於日本提出申請之日本特願第2021-157187號為基礎，其內容全包含於本說明書中。
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Claims (19)
- 一種調節性T細胞之製造方法，其係包含：(1)使導入有表現構築物之可分化成調節性T細胞的細胞分化成調節性T細胞之步驟，該表現構築物係含有：(a)Foxp3基因之保守非編碼序列(Conserved Non-coding Sequence)(CNS)1、CNS2及CNS3、(b)啟動子、及(c)編碼FOXP3之核酸。
- 如請求項1所述之製造方法，其中，前述可分化成調節性T細胞之細胞係富潛能幹細胞、造血幹細胞、造血性內皮細胞、T前驅細胞或中胚層前驅細胞。
- 如請求項1所述之製造方法，其中，前述可分化成調節性T細胞之細胞係iPS細胞。
- 如請求項1所述之製造方法，其中，前述CNS1、CNS2及CNS3係位於前述啟動子之上流。
- 如請求項1所述之製造方法，其中，前述調節性T細胞係CD25+/FOXP3+細胞。
- 如請求項1所述之製造方法，係更包含(2)將表現構築物導入至可分化成調節性T細胞之細胞之步驟，該表現構築物係含有：(a)Foxp3基因之CNS1、CNS2及CNS3、(b)啟動子、及(c)編碼FOXP3之核酸。
- 如請求項1所述之製造方法，其中，於步驟(1)中培養3維細胞凝集物，該3維細胞凝集物係含有前述可分化成調節性T細胞之細胞或從此經分化誘導之細胞、以及表現Notch配位體(ligand)之間質細胞。
- 如請求項7所述之製造方法，其中，前述可分化成調節性T細胞之細胞或從此經分化誘導之細胞係CD34+細胞。
- 如請求項7所述之製造方法，其中，前述可分化成調節性T細胞之細胞或從此經分化誘導之細胞係造血性內皮細胞。
- 如請求項7所述之製造方法，其中，前述Notch配位體係選自由DLL4、DLL1、JAG1及JAG2構成之群組中之至少1種。
- 一種iPS細胞，係導入有表現構築物，該表現構築物係含有：(a)Foxp3基因之CNS1、CNS2及CNS3、(b)啟動子、及(c)編碼FOXP3之核酸。
- 如請求項11所述之iPS細胞，其中，前述CNS1、CNS2及CNS3係位於前述啟動子之上流。
- 一種調節性T細胞，係藉由請求項1所述之製造方法獲得者。
- 一種醫藥組成物，係含有請求項13所述之調節性T細胞而成者。
- 如請求項14所述之醫藥組成物，其係用於免疫反應的異常亢進之預防及/或治療。
- 一種免疫反應的異常亢進之預防及/或治療方法，其係包含將請求項13所述之調節性T細胞對需要其之對象投予之步驟。
- 如請求項13所述之調節性T細胞，其係用以於免疫反應的異常亢進之預防及/或治療中使用。
- 一種請求項13所述之調節性T細胞之用途，係用以製造使用於免疫反應的異常亢進之預防及/或治療中之醫藥。
- 如請求項1所述之製造方法，係更含有(3)將前述調節性T細胞於mTOR抑制劑及TNFR2促效劑(agonist)存在下進行培養之步驟。
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