JPWO2010027062A1 - B細胞由来iPS細胞およびその用途 - Google Patents
B細胞由来iPS細胞およびその用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2010027062A1 JPWO2010027062A1 JP2010527839A JP2010527839A JPWO2010027062A1 JP WO2010027062 A1 JPWO2010027062 A1 JP WO2010027062A1 JP 2010527839 A JP2010527839 A JP 2010527839A JP 2010527839 A JP2010527839 A JP 2010527839A JP WO2010027062 A1 JPWO2010027062 A1 JP WO2010027062A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell
- ips
- immune system
- mouse
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 240
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 98
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 57
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 46
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 claims abstract description 41
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims abstract description 33
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 23
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 13
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 101100351020 Mus musculus Pax5 gene Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 101100351021 Xenopus laevis pax5 gene Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 abstract description 24
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 33
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 19
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 13
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 12
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 11
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- -1 etc.) Proteins 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 9
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 9
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 8
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 6
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 6
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 6
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 6
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 6
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 5
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 5
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 5
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 5
- 101710177504 Kit ligand Proteins 0.000 description 5
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 5
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 5
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 5
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 5
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 4
- 101150111214 lin-28 gene Proteins 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 4
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102100020715 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Human genes 0.000 description 3
- 101710162577 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Proteins 0.000 description 3
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 description 3
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 2
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 2
- 102100027314 Beta-2-microglobulin Human genes 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100039996 Histone deacetylase 1 Human genes 0.000 description 2
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 2
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 2
- 101001035024 Homo sapiens Histone deacetylase 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000018682 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Human genes 0.000 description 2
- 108010066719 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Proteins 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 2
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 2
- NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N Valproic acid Chemical compound CCCC(C(O)=O)CCC NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N benzyl benzoate Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OCC1=CC=CC=C1 SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 2
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101150019028 Antp gene Proteins 0.000 description 1
- 101150049556 Bcr gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010055113 Breast cancer metastatic Diseases 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100342337 Caenorhabditis elegans klf-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100257372 Caenorhabditis elegans sox-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102100037124 Developmental pluripotency-associated 5 protein Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 102000011787 Histone Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108010036115 Histone Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 101000881848 Homo sapiens Developmental pluripotency-associated 5 protein Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000608935 Homo sapiens Leukosialin Proteins 0.000 description 1
- 101000884271 Homo sapiens Signal transducer CD24 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101150072501 Klf2 gene Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102100039564 Leukosialin Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100355655 Mus musculus Eras gene Proteins 0.000 description 1
- 101100446513 Mus musculus Fgf4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100404103 Mus musculus Nanog gene Proteins 0.000 description 1
- 101100310657 Mus musculus Sox1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100310648 Mus musculus Sox17 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100310650 Mus musculus Sox18 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100257376 Mus musculus Sox3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100369076 Mus musculus Tdgf1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100107167 Mus musculus Znf296 gene Proteins 0.000 description 1
- 102220595793 Myc proto-oncogene protein_T58A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000055056 N-Myc Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700026495 N-Myc Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 101150063042 NR0B1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101150012195 PREB gene Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 101710150336 Protein Rex Proteins 0.000 description 1
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 description 1
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100038081 Signal transducer CD24 Human genes 0.000 description 1
- 101150001847 Sox15 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101710192266 Tegument protein VP22 Proteins 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 102400001320 Transforming growth factor alpha Human genes 0.000 description 1
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N Trichostatin A Natural products ONC(=O)C=CC(C)=CC(C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 229960002903 benzyl benzoate Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013000 chemical inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000007941 film coated tablet Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 210000002660 insulin-secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003697 methyltransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- FMURUEPQXKJIPS-UHFFFAOYSA-N n-(1-benzylpiperidin-4-yl)-6,7-dimethoxy-2-(4-methyl-1,4-diazepan-1-yl)quinazolin-4-amine;trihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.C=12C=C(OC)C(OC)=CC2=NC(N2CCN(C)CCC2)=NC=1NC(CC1)CCN1CC1=CC=CC=C1 FMURUEPQXKJIPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000008203 oral pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 230000007651 self-proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007901 soft capsule Substances 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000002511 suppository base Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009772 tissue formation Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N trichostatin A Chemical compound ONC(=O)/C=C/C(/C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000604 valproic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
- C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
- C12N15/8775—Murine embryos
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/235—Leukemia inhibitory factor [LIF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
- C12N2501/602—Sox-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
- C12N2501/603—Oct-3/4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
- C12N2501/604—Klf-4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
- C12N2501/606—Transcription factors c-Myc
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
簡便な手法によるB細胞由来のiPS細胞、該iPS細胞を用いてヒト抗体を安価に提供する技術、該iPS細胞から分化させた細胞を用いた免疫系ヒト化マウス等の提供。B細胞に、C/EBPαおよびPax5発現阻害物質を含まない核初期化因子、特にOct3/4、Sox2、Klf4およびc-Mycをコードする核酸、を接触させることにより得られるクローン化された細胞であって、免疫グロブリン遺伝子が再構成されており、かつ分化多能性および自己複製能を有する細胞(B-iPS細胞)。所定の抗原で免疫したB細胞由来のB-iPS細胞細胞を分化させて得られるB細胞の培養物から抗体を回収することを特徴とする、該所定の抗原に対するモノクローナル抗体の製造方法。B-iPS細胞を分化させて得られるヒト造血・免疫系細胞を、免疫不全マウスに移植することを特徴とする、免疫系ヒト化マウスの作製方法。
Description
本発明は、B細胞由来の人工多能性幹(induced pluripotent stem; 以下、iPSという)細胞、その製造方法およびその用途に関する。
iPS細胞は、胚性幹細胞(ES細胞)と同等の分化能力、組織形成能力を有する。ヒト初代培養細胞からも誘導されうるので、iPS細胞は再生医療の中核を担う能力を潜在的に有する細胞である。山中らはマウスの胚性線維芽細胞(MEF)に4つの因子(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)を導入することで、ES細胞のように分化多能性を持つiPS細胞を樹立した(非特許文献1)。MEF以外にも、種々の細胞(非特許文献2、3)、臓器(非特許文献4)等からマウスiPS細胞の樹立に成功している。さらに、ヒトについても同等の手法によりヒト体細胞からのiPS細胞の樹立が報告されている(非特許文献5−8)。
iPS細胞の臨床応用に向けて、その有効性と安全性を保証していく上で大きな障壁となりうる点は、iPS細胞の多様性である。個人の遺伝背景、細胞種、リプログラミングの程度、不死化された発生段階などにより、iPS細胞の機能はラインごとに異なってくることが想像される。実際、マウスES細胞においてすら、遺伝的背景が違えば遺伝子発現パターンは大きく変わって来るし、分化能もラインごとに大きく異なる。ヒトiPS細胞もラインごとに遺伝子発現パターンが大きく変わってくることが、山中らによってすでに見出されている(非特許文献5)。したがって、iPS細胞ごとに分化能と腫瘍化傾向が著しく変わってくるということが予測される。
また、核初期化プロトコルについても未だ改善の余地があり、種々の改良プロトコルが報告されている(非特許文献9−14)。
また、核初期化プロトコルについても未だ改善の余地があり、種々の改良プロトコルが報告されている(非特許文献9−14)。
造血・免疫系は、輸血に始まり骨髄移植や臍帯血移植にいたるまで、再生医療あるいは細胞治療の対象として長らく位置づけられ、これらの治療法が実質的に有効であることが示されてきた。マウスおよびヒトで、各種の造血・免疫系細胞はES細胞から分化誘導が可能であることも示されてきた。このことは、iPS細胞から造血・免疫系細胞を誘導できれば、従来の枠組みの中で治療法として有効である可能性を示している。
免疫系を構成するリンパ球の系列であるB細胞は抗体産生細胞であり、骨髄由来造血幹細胞を起源とし、脾臓において分化成熟する。この過程において、H鎖・L鎖の遺伝子再構成が引き起こされ、各々のクローンが特有の抗原特異性を発揮する。従来技術においてはミエローマとB細胞とを細胞融合してハイブリドーマを作製し、スクリーニングにより抗原特異的モノクローナル抗体が樹立されてきた。特に医療分野においては、細胞表面抗原やがん抗原、サイトカインや増殖因子などの抗原を標的とする抗体が、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体を中心に、抗体医薬品として多数上市され、あるいは臨床試験中である。例えば、ハーセプチン(癌抗原Her2を標的とする転移性乳がん治療薬、Roche/Genentech)やリツキシマブ(CD20抗原を標的とする非ホジキンリンパ腫治療薬、Genentech)などは、すでにその有効性・安全性・副作用の軽減等が実際に示されている。
しかし、現在市場に流通している抗体医薬はすべて遺伝子工学的手法を用いて作られたものであり、きわめて高価で医療費を圧迫していることが大きな問題となっている。体外免疫法とウイルスによる細胞不死化またはヒト−ヒト(もしくはマウス)ハイブリドーマ作製技術を用いて、ヒトB細胞からヒト抗体を作製する試みもなされてはいるが、実用化には至っていない。
しかし、現在市場に流通している抗体医薬はすべて遺伝子工学的手法を用いて作られたものであり、きわめて高価で医療費を圧迫していることが大きな問題となっている。体外免疫法とウイルスによる細胞不死化またはヒト−ヒト(もしくはマウス)ハイブリドーマ作製技術を用いて、ヒトB細胞からヒト抗体を作製する試みもなされてはいるが、実用化には至っていない。
ある抗原に特異的な抗体を産生するヒトB細胞を初期化した後、再度分化・成熟させることにより、遺伝子工学的手法を用いることなく、大量に抗体産生細胞クローンを増幅することができると期待される。しかし、最終分化した細胞は、未分化な細胞に比べて初期化が容易ではなく、いわゆる4因子あるいは3因子(Oct3/4、Sox2、Klf4)のみではiPS細胞を誘導できず、核初期化因子として他の遺伝子の使用を必要とする場合が多い(非特許文献3)。しかし、導入遺伝子の数を増やすことは、iPS細胞から分化させた細胞の腫瘍化の可能性など、安全性における問題を大きくする懸念がある。
Cell. 2006 Aug 25; 126(4): 663-676.
Nature. 2007 Jul 19; 448(7151): 313-317. Epub2007 Jun 6.
Cell. 2008 Apr 18; 133(2): 250-264. Erratum in: Cell. 2008 Jul 25; 134(2): 365.
Science. 2008 Aug 1; 321(5889): 699-702. Epub2008 Feb 14.
Cell. 2007 Nov 30; 131(5): 861-872.
Science. 2007 Dec 21; 318(5858): 1917-1920. Epub 2007 Nov 20.
Nature. 2008 Jan 10; 451(7175): 141-146. Epub 2007 Dec 23.
Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Feb 26; 105(8): 2883-2888. Epub 2008 Feb 15.
Nat Biotechnol. 2008 Jan; 26(1): 101-106. Epub 2007 Nov 30.
Nat Biotechnol. 2008 Aug; 26(8): 916-24. Epub 2008 Jul 1.
Utikal JS, Arnold K, Jaenisch R, Hochedlinger K. Reprogramming of neural progenitor cells into iPS cells in the absence of exogenous Sox2 expression. Stem Cells. Epub 2008 Jul 17.
Nature. 2008 Jul 31; 454(7204): 646-650. Epub2008 Jun 29.
Cell Stem Cell. 2008 Jun 5; 2(6): 525-528.
Curr Biol. 2008 Jun 24; 18(12): 890-894. Epub 2008 May 22.
本発明の目的は、簡便な手法によりB細胞由来のiPS細胞を提供することであり、該iPS細胞を用いてヒト抗体を安価に提供することである。また、本発明のさらなる目的は、該iPS細胞から分化させた細胞を用いた免疫細胞療法剤や免疫系ヒト化マウス等を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、意外にも、マウス脾臓由来のB細胞にOct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycの4因子のみをレトロウイルスを用いて導入することにより、免疫グロブリン遺伝子が再構成されており、かつ自己増殖能および分化多能性を有する細胞を樹立することに成功した。本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下に示すとおりである。
[1]B細胞に、C/EBPαおよびPax5発現阻害物質を含まない核初期化因子を接触させることにより得られるクローン化された細胞であって、免疫グロブリン遺伝子が再構成されており、かつ分化多能性および自己複製能を有する細胞。
[2]核初期化因子が、Oct3/4、Sox2、Klf4およびc-Mycまたはそれらをコードする核酸、あるいはOct3/4、Sox2およびKlf4またはそれらをコードする核酸である、上記[1]記載の細胞。
[3]B細胞がヒト由来である、上記[1]または[2]記載の細胞。
[4]B細胞が所定の抗原で免疫されている、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の細胞。
[5]上記[4]記載の細胞を分化させて得られるB細胞の培養物から抗体を回収することを特徴とする、所定の抗原に対するモノクローナル抗体の製造方法。
[6]上記[3]記載の細胞を分化させて得られるヒト造血・免疫系細胞を、免疫不全マウスに移植することを特徴とする、免疫系ヒト化マウスの作製方法。
[7]上記[6]記載の方法により得られる免疫系ヒト化マウス。
[1]B細胞に、C/EBPαおよびPax5発現阻害物質を含まない核初期化因子を接触させることにより得られるクローン化された細胞であって、免疫グロブリン遺伝子が再構成されており、かつ分化多能性および自己複製能を有する細胞。
[2]核初期化因子が、Oct3/4、Sox2、Klf4およびc-Mycまたはそれらをコードする核酸、あるいはOct3/4、Sox2およびKlf4またはそれらをコードする核酸である、上記[1]記載の細胞。
[3]B細胞がヒト由来である、上記[1]または[2]記載の細胞。
[4]B細胞が所定の抗原で免疫されている、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の細胞。
[5]上記[4]記載の細胞を分化させて得られるB細胞の培養物から抗体を回収することを特徴とする、所定の抗原に対するモノクローナル抗体の製造方法。
[6]上記[3]記載の細胞を分化させて得られるヒト造血・免疫系細胞を、免疫不全マウスに移植することを特徴とする、免疫系ヒト化マウスの作製方法。
[7]上記[6]記載の方法により得られる免疫系ヒト化マウス。
本発明のB細胞由来iPS細胞を介して作製されるモノクローナル抗体は、遺伝子工学技術を使用しないためきわめて安価に製造することができる。また、本発明のB細胞由来iPS細胞を利用して作製されるヒト化マウスによれば、免疫系に直接作用する新規薬剤について、ヒト免疫系への直接の効果・副作用を前臨床段階で評価することができる。
本発明は、免疫グロブリン遺伝子が再構成されており、かつ分化多能性および自己複製能を有する、B細胞由来のクローン化されたiPS細胞(以下、「B-iPS細胞」という)を提供する。本明細書において「iPS細胞」とは、体細胞に核初期化因子を接触させることにより、人為的に分化多能性および自己複製能を獲得した細胞をいう。ここで「分化多能性」とは、B細胞、T細胞、赤血球、マクロファージまたはその前駆細胞などの複数の系列の造血・免疫系細胞、並びに1以上の造血・免疫系以外の細胞系列に分化し得る能力を意味し、造血幹細胞や多能性前駆細胞における多能性とは区別される。また「自己複製能」とは、細胞が特定の環境(例えば、ES細胞の培養に適した条件)下において、上記「分化多能性」を保持したまま増幅し続けることができる能力を意味する。
本発明のB-iPS細胞は、B細胞に、C/EBPαおよびPax5発現阻害物質を含まない核初期化因子を接触させることにより樹立することができる。本明細書において「B細胞」とは、成熟B細胞だけでなく、最終分化した形質細胞や、preB細胞およびその前駆細胞を除く任意のB前駆細胞をも含む意味で用いられる。細胞表面マーカーの発現としては、IgM+、IgD+、IgG+、CD19+、B220+、CD24+、CD43-、CD25-、c-kit-、IL-7R-などにより特徴付けられる。B細胞は脾臓、リンパ節、末梢血、臍帯血などから、自体公知の方法、例えば、上記各種細胞表面マーカーに対する抗体とセルソーターとを用いてフローサイトメトリーにより、単離することができる。マウスの場合は、B細胞の存在割合が高い脾臓やリンパ節から採取することが好ましいが、ヒトの場合、侵襲性が少なく調製が容易との観点から、末梢血、臍帯血などからB細胞を調製することが望ましい。
本発明に用いることができるB細胞は、当該B細胞に核初期化因子を接触させることによりB-iPS細胞を樹立することができるいかなる動物種由来のものであってもよく、具体的にはヒトおよびマウス由来のものが挙げられるが、好ましくはヒト由来のB細胞である。B細胞の採取源となるヒトまたはマウスは特に制限されないが、得られるB-iPS細胞がヒトの再生医療用途に使用される場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、患者本人またはHLAの型が同一である他人からB細胞を採取することが特に好ましい。また、ヒトに投与(移植)しない場合でも、例えば、患者の薬剤感受性や副作用の有無を評価するためのスクリーニング用の細胞のソースとしてB-iPS細胞を使用する場合には、患者本人または薬剤感受性や副作用と相関する遺伝子多型が同一である他人からB細胞を採取する必要がある。
脾臓、リンパ節、末梢血、臍帯血などから、上述の方法により調製したB細胞は、直ぐに核初期化因子と接触させてB-iPS細胞を誘導してもよいし、あるいは常法により凍結保存し、用時融解して培養した後に核初期化因子と接触させて、B-iPS細胞を誘導することもできる。従って、例えば、健常時に、自身の脾臓、リンパ節、末梢血、臍帯血などから調製したB細胞を長期間凍結保存しておき、後年細胞・臓器移植が必要となった際に、該B細胞からB-iPS細胞を誘導し、そこから分化誘導して得られた細胞、組織等を自家移植するということも可能である。
本発明のB-iPS細胞は、その細胞クローンが由来するB細胞において再構成された免疫グロブリン遺伝子が保存されている。そのため、ある抗原で免疫したB細胞から誘導されたB-iPS細胞を分化させて得られる成熟B細胞や形質細胞では、該抗原に対するモノクローナル抗体が産生される。したがって、本発明の好ましい実施態様においては、B-iPS細胞の作製に供されるB細胞は、予め所定の抗原で免疫されている。免疫される抗原は特に制限されないが、B-iPS細胞を抗体医薬品用の抗体産生細胞のソースとして利用するという観点から、抗体医薬の標的分子となりうる抗原、例えば、細胞表面抗原(例、CD20等)やがん抗原(例、Her2、EGFR等)、サイトカイン(例、IL-1-20、IFNα-γ、TNF等)や増殖因子(例、EGF、TGF-α、PDGF、VEGF等)などのタンパク質やそのフラグメント、さらには糖、核酸、脂質などが挙げられる。
B細胞を抗原で免疫する方法としては、マウスの場合、通常のマウスモノクローナル抗体の作製と同様に、例えば腹腔内注入、静脈注入,皮下注射、皮内注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独であるいは担体、希釈剤と共に投与する方法を用いてもよい。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常1〜6週毎に1回ずつ、計1〜10回程度行われる。抗体価の上昇が認められた個体を選択し、最終免疫の2〜7日後に脾臓またはリンパ節を採取し、B細胞を回収する。
ヒトに対する人為的免疫感作は倫理的に困難であることから、体外免疫法を用いることが好ましい。体外免疫法は、通常の免疫では抗体産生が抑制される抗原に対する抗体を取得できる可能性があることの他、ng〜μgオーダーの抗原量で抗体を得ることが可能であること、免疫が数日間で終了することなどから、不安定で大量調製の困難な抗原に対する抗体を得る方法として、非ヒト動物由来の抗体を調製する場合にも好ましく用いられ得る。
体外免疫法に用いられるB細胞は、ヒト、マウス等の末梢血、臍帯血、脾臓、リンパ節などから上記のようにして単離することができる。例えば、マウスB細胞の場合、4〜12週齢程度の動物から脾臓を摘出・脾細胞を分離し、適当な培地(例:ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、RPMI1640培地、ハムF12培地等)で洗浄した後、抗原を含む胎仔ウシ血清(FCS;5〜20%程度)添加培地に浮遊させて4〜10日間程度CO2インキュベーターなどを用いて培養する。抗原濃度としては、例えば0.05〜5μgが挙げられるがこれに限定されない。同一系統の動物(1〜2週齢程度が好ましい)の胸腺細胞培養上清を常法に従って調製し、培地に添加することが好ましい。
ヒト細胞の体外免疫では、胸腺細胞培養上清を得ることは困難なので、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6等数種のサイトカインおよび必要に応じてアジュバント物質(例:ムラミルジペプチド等)を抗原とともに培地に添加して免疫感作を行うことが好ましい。
抗体価の上昇が認められた細胞集団を選択し、体外免疫後4〜10日間培養した後に細胞を回収して抗体産生B細胞を単離する。
体外免疫法に用いられるB細胞は、ヒト、マウス等の末梢血、臍帯血、脾臓、リンパ節などから上記のようにして単離することができる。例えば、マウスB細胞の場合、4〜12週齢程度の動物から脾臓を摘出・脾細胞を分離し、適当な培地(例:ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、RPMI1640培地、ハムF12培地等)で洗浄した後、抗原を含む胎仔ウシ血清(FCS;5〜20%程度)添加培地に浮遊させて4〜10日間程度CO2インキュベーターなどを用いて培養する。抗原濃度としては、例えば0.05〜5μgが挙げられるがこれに限定されない。同一系統の動物(1〜2週齢程度が好ましい)の胸腺細胞培養上清を常法に従って調製し、培地に添加することが好ましい。
ヒト細胞の体外免疫では、胸腺細胞培養上清を得ることは困難なので、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6等数種のサイトカインおよび必要に応じてアジュバント物質(例:ムラミルジペプチド等)を抗原とともに培地に添加して免疫感作を行うことが好ましい。
抗体価の上昇が認められた細胞集団を選択し、体外免疫後4〜10日間培養した後に細胞を回収して抗体産生B細胞を単離する。
別の好ましい一実施態様において、ヒト造血幹細胞を生着させヒト造血をマウスで再現させた免疫不全マウス、すなわち免疫系ヒト化マウスを利用してB細胞を免疫できる。移植に用いるヒト造血幹細胞としては、臍帯血、末梢血、骨髄などから採取したCD34+細胞などが挙げられる。レシピエントとなる免疫不全マウスとしては、例えば、T細胞及びB細胞の生産能を欠く重症複合免疫不全マウス(SCIDマウス)、特に、NK細胞の活性を持たないNOD/SCID/β2ミクログロブリンノックアウトマウス(NOD/SCID/B2M)やNOD/SCID/commonγ-chainノックアウトマウスなどが好ましい。さらに、これらのマウスにヒトHLA(組織適合抗原)を遺伝子導入して作製されたマウスを用いることが望ましい。また、造血幹細胞での免疫系ヒト化マウスの作製に関するさらなる詳細については、例えば、再表2004−110139を参照することができる。抗原での免疫は、上記した方法に準じて行えばよい。ヒト化マウスにおいて抗原特異的なB細胞の生成を促進する、回収を容易にするという目的で人工リンパ節をヒト化マウスに形成させたマウスを用いることも可能である。人工リンパ節とは、3次元構造をもつ支持体小片をマウスの腎臓被膜下などに移植することにより誘導され形成されたリンパ組織である。詳細はWO2007/069755、Suematsu S et al., Nature Biotechnol 22: 1539-45 (2004)を参照することができる。
本発明において「核初期化因子」とは、B細胞から分化多能性および自己複製能を有する細胞を誘導することができる物質(群)であれば、タンパク性因子またはそれをコードする核酸(ベクターに組み込まれた形態を含む)、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。核初期化因子がタンパク性因子またはそれをコードする核酸の場合、好ましくは以下の組み合わせが例示される(以下においては、タンパク性因子の名称のみを記載する)。
(1) Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc(ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5で置換可能である。さらに、c-MycはT58A(活性型変異体), N-Myc, L-Mycで置換可能である。)
(2) Oct3/4, Klf4, Sox2
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(4) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28
(6) Oct3/4, Klf4, Sox2, bFGF
(7) Oct3/4, Klf4, Sox2, SCF
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, bFGF
(9) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SCF
これらの組み合わせの中で、得られるB-iPS細胞を治療用途に用いることを念頭においた場合、Oct3/4, Sox2及びKlf4の3因子の組み合わせが好ましい。一方、B-iPS細胞を治療用途に用いることを念頭に置かない場合(例えば、抗体産生細胞調製のソースとして用いる場合、創薬スクリーニング等の研究ツールとして用いる場合など)は、Oct3/4, Klf4, Sox2及びc-Mycの4因子か、それにLin28またはNanogを加えた5因子が好ましい。特に好ましくは、本発明における核初期化因子は、Oct3/4, Klf4, Sox2及びc-Mycの4因子である。
(1) Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc(ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5で置換可能である。さらに、c-MycはT58A(活性型変異体), N-Myc, L-Mycで置換可能である。)
(2) Oct3/4, Klf4, Sox2
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(4) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28
(6) Oct3/4, Klf4, Sox2, bFGF
(7) Oct3/4, Klf4, Sox2, SCF
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, bFGF
(9) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SCF
これらの組み合わせの中で、得られるB-iPS細胞を治療用途に用いることを念頭においた場合、Oct3/4, Sox2及びKlf4の3因子の組み合わせが好ましい。一方、B-iPS細胞を治療用途に用いることを念頭に置かない場合(例えば、抗体産生細胞調製のソースとして用いる場合、創薬スクリーニング等の研究ツールとして用いる場合など)は、Oct3/4, Klf4, Sox2及びc-Mycの4因子か、それにLin28またはNanogを加えた5因子が好ましい。特に好ましくは、本発明における核初期化因子は、Oct3/4, Klf4, Sox2及びc-Mycの4因子である。
本発明においては、核初期化因子としてC/EBPαおよびPax5発現阻害物質を含まない。ここで「C/EBPα」はタンパク性因子だけでなくそれをコードする核酸も含む。また、「Pax5発現阻害物質」としては、Pax5に対するアンチセンス核酸、siRNA、shRNA、リボザイムおよびそれらをコードする発現ベクターなどが挙げられる。本発明はこれらの因子を核初期化工程で必要としないことにより、より簡便にB-iPS細胞を取得することができ、また、B-iPS細胞から分化誘導される細胞、組織における腫瘍化の潜在的可能性を少なくすることができる。
上記の各タンパク性因子のマウス及びヒトcDNA配列情報は、WO 2007/069666に記載のNCBI accession numbersを参照することにより取得することができ(Nanogは当該公報中では「ECAT4」との名称で記載されている。尚、Lin28のマウス及びヒトcDNA配列情報は、それぞれNCBI accession number NM_145833及びNM_024674を参照することにより取得できる。)、当業者は容易にこれらのcDNAを単離することができる。核初期化因子としてタンパク性因子自体を用いる場合には、得られたcDNAを適当な発現ベクターに挿入して宿主細胞に導入し、該細胞を培養して得られる培養物から組換えタンパク性因子を回収することにより調製することができる。一方、核初期化因子としてタンパク性因子をコードする核酸を用いる場合、得られたcDNAを、ウイルスベクターもしくはプラスミドベクターに挿入して発現ベクターを構築し、核初期化工程に供される。
核初期化因子のB細胞への接触は、該物質がタンパク性因子である場合、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン(PTD)融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent(Gene Therapy Systmes)、Pro-JectTM Protein Transfection Reagent(PIERCE)及びProVectin(IMGENEX)、脂質をベースとしたProfect-1(Targeting Systems)、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrain Peptide(Q biogene)及びChariot Kit(Active Motif)等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。核初期化因子を適当な溶媒(例えば、PBS、HEPES等の緩衝液)に希釈し、導入試薬を加えて室温で5-15分程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した細胞に添加して37℃で1ないし数時間インキュベートする。その後培地を除去して血清含有培地に交換する。
PTDとしては、ショウジョウバエ由来のAntP、HIV由来のTAT、HSV由来のVP22等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。核初期化因子のcDNAとPTD配列とを組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを作製して組換え発現させ、融合タンパク質を回収して導入に用いる。導入は、タンパク質導入試薬を添加しない以外は上記と同様にして行うことができる。
マイクロインジェクションは、先端径1μm程度のガラス針にタンパク質溶液を入れ、細胞に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。
PTDとしては、ショウジョウバエ由来のAntP、HIV由来のTAT、HSV由来のVP22等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。核初期化因子のcDNAとPTD配列とを組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを作製して組換え発現させ、融合タンパク質を回収して導入に用いる。導入は、タンパク質導入試薬を添加しない以外は上記と同様にして行うことができる。
マイクロインジェクションは、先端径1μm程度のガラス針にタンパク質溶液を入れ、細胞に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。
B細胞への導入の容易さを考慮すると、核初期化因子は、タンパク性因子自体としてよりも、それをコードする核酸の形態で用いることがむしろ好ましい。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。好ましくは該核酸は二本鎖DNA、特にcDNAである。
核初期化因子のcDNAは、宿主となるB細胞で機能し得るプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入される。発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスなどのウイルスベクター、動物細胞発現プラスミド(例、pA1-11,pXT1,pRc/CMV,pRc/RSV,pcDNAI/Neo)などが用いられ得る。
用いるベクターの種類は、得られるiPS細胞の用途に応じて適宜選択することができる。例えば、アデノウイルスベクター、プラスミドベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが使用され得る。
核初期化因子のcDNAは、宿主となるB細胞で機能し得るプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入される。発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスなどのウイルスベクター、動物細胞発現プラスミド(例、pA1-11,pXT1,pRc/CMV,pRc/RSV,pcDNAI/Neo)などが用いられ得る。
用いるベクターの種類は、得られるiPS細胞の用途に応じて適宜選択することができる。例えば、アデノウイルスベクター、プラスミドベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが使用され得る。
発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えばSRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV(サイトメガロウイルス)プロモーター、RSV(ラウス肉腫ウイルス)プロモーター、MoMuLV(モロニーマウス白血病ウイルス)LTR、HSV-TK(単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ)プロモーターなどが用いられる。なかでも、MoMuLV LTR、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
発現ベクターは、プロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリA付加シグナル、選択マーカー遺伝子、SV40複製起点などを含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
核初期化因子である核酸を含む発現ベクターは、ベクターの種類に応じて、自体公知の手法により細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクターの場合、該核酸を含むプラスミドを適当なパッケージング細胞(例、Plat-E細胞)や相補細胞株(例、293細胞)に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを細胞に感染させる。一方、プラスミドベクターの場合には、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。
核初期化因子である核酸を含む発現ベクターは、ベクターの種類に応じて、自体公知の手法により細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクターの場合、該核酸を含むプラスミドを適当なパッケージング細胞(例、Plat-E細胞)や相補細胞株(例、293細胞)に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを細胞に感染させる。一方、プラスミドベクターの場合には、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。
核初期化因子が低分子化合物である場合、該物質のB細胞への接触は、該物質を適当な濃度で水性もしくは非水性溶媒に溶解し、ヒトまたはマウスより単離したB細胞の培養に適した培地(例えば、IL-2、IL-7、SCF、Flt3リガンド等のサイトカイン類、LPS、約5〜20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地(MEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、RPMI1640培地、199培地、F12培地など)中に、核初期化因子濃度がB細胞において核初期化が起こるのに十分で且つ細胞毒性がみられない範囲となるように該物質溶液を添加して、細胞を一定期間培養することにより実施することができる。核初期化因子濃度は用いる核初期化因子の種類によって異なるが、約0.1nM〜約100nMの範囲で適宜選択される。接触期間は細胞の核初期化が達成されるのに十分な時間であれば特に制限はないが、通常は陽性コロニーが出現するまで培地に共存させておけばよい。
従来iPS細胞の樹立効率が低いために、近年、その効率を改善する物質が種々提案されている。よって前記核初期化因子に加え、これら樹立効率改善物質をB細胞に接触させることにより、B-iPS細胞の樹立効率をより高めることが期待できる。
iPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤[例えば、バルプロ酸 (Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA(例、HDAC1 siRNA Smartpool(登録商標) (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等)等の核酸性発現阻害剤など]、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤[例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA(例、G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology)等)等の核酸性発現阻害剤など]等が挙げられるが、それらに限定されない。核酸性の発現阻害剤はsiRNAもしくはshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。
iPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤[例えば、バルプロ酸 (Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA(例、HDAC1 siRNA Smartpool(登録商標) (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等)等の核酸性発現阻害剤など]、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤[例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA(例、G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology)等)等の核酸性発現阻害剤など]等が挙げられるが、それらに限定されない。核酸性の発現阻害剤はsiRNAもしくはshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。
iPS細胞の樹立効率改善物質のB細胞への接触は、該物質が(a) タンパク性因子である場合、(b) 該タンパク性因子をコードする核酸である場合、あるいは(c) 低分子化合物である場合に応じて、核初期化因子についてそれぞれ上記したのと同様の方法により、実施することができる。
iPS細胞の樹立効率改善物質は、該物質の非存在下と比較してB細胞からのB-iPS細胞樹立効率が有意に改善される限り、核初期化因子と同時にB細胞に接触させてもよいし、また、どちらかを先に接触させてもよい。一実施態様において、例えば、核初期化因子がタンパク性因子をコードする核酸であり、iPS細胞の樹立効率改善物質が化学的阻害物質である場合には、前者は遺伝子導入処理からタンパク性因子を大量発現するまでに一定期間のラグがあるのに対し、後者は速やかに細胞に作用しうることから、遺伝子導入処理から一定期間細胞を培養した後に、iPS細胞の樹立効率改善物質を培地に添加することができる。別の実施態様において、例えば、核初期化因子とiPS細胞の樹立効率改善物質とがいずれもウイルスベクターやプラスミドベクターの形態で用いられる場合には、両者を同時に細胞に導入してもよい。
iPS細胞の樹立効率改善物質は、該物質の非存在下と比較してB細胞からのB-iPS細胞樹立効率が有意に改善される限り、核初期化因子と同時にB細胞に接触させてもよいし、また、どちらかを先に接触させてもよい。一実施態様において、例えば、核初期化因子がタンパク性因子をコードする核酸であり、iPS細胞の樹立効率改善物質が化学的阻害物質である場合には、前者は遺伝子導入処理からタンパク性因子を大量発現するまでに一定期間のラグがあるのに対し、後者は速やかに細胞に作用しうることから、遺伝子導入処理から一定期間細胞を培養した後に、iPS細胞の樹立効率改善物質を培地に添加することができる。別の実施態様において、例えば、核初期化因子とiPS細胞の樹立効率改善物質とがいずれもウイルスベクターやプラスミドベクターの形態で用いられる場合には、両者を同時に細胞に導入してもよい。
ヒトまたはマウスから分離したB細胞は、その培養に適した自体公知の培地(例えば、IL-2、IL-7、SCF、Flt3リガンド等のサイトカイン類、約5〜20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地(MEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、RPMI1640培地、199培地、F12培地など)で前培養することも可能である。
核初期化因子(及びiPS細胞の樹立効率改善物質)との接触に際し、例えば、カチオニックリポソームなど導入試薬を用いる場合には、導入効率の低下を防ぐため、無血清培地に交換しておくことが好ましい場合がある。核初期化因子(及びiPS細胞の樹立効率改善物質)を接触させた後、細胞を、例えばES細胞の培養に適した条件下で培養することができる。ヒト細胞の場合、通常の培地に分化抑制因子として塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を添加して培養を行うことが好ましい。一方、マウス細胞の場合には、bFGFの代わりにLeukemia Inhibitory Factor(LIF)を添加することが望ましい。また通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞(MEF)の共存下で培養される。MEFとしては、通常STO細胞等がよく使われるが、iPS細胞の誘導には、SNL細胞(McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990))等がよく使われている。
核初期化因子(及びiPS細胞の樹立効率改善物質)との接触に際し、例えば、カチオニックリポソームなど導入試薬を用いる場合には、導入効率の低下を防ぐため、無血清培地に交換しておくことが好ましい場合がある。核初期化因子(及びiPS細胞の樹立効率改善物質)を接触させた後、細胞を、例えばES細胞の培養に適した条件下で培養することができる。ヒト細胞の場合、通常の培地に分化抑制因子として塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を添加して培養を行うことが好ましい。一方、マウス細胞の場合には、bFGFの代わりにLeukemia Inhibitory Factor(LIF)を添加することが望ましい。また通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞(MEF)の共存下で培養される。MEFとしては、通常STO細胞等がよく使われるが、iPS細胞の誘導には、SNL細胞(McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990))等がよく使われている。
B-iPS細胞の候補コロニーの選択は、薬剤耐性とレポーター活性を指標とする方法と目視による形態観察による方法とが挙げられる。前者としては、例えば、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子(例えば、Fbx15、Nanog、Oct3/4など、好ましくはNanog又はOct3/4)の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子及び/又はレポーター遺伝子をターゲッティングした組換えB細胞を用い、薬剤耐性及び/又はレポーター活性陽性のコロニーを選択するというものである。一方、目視による形態観察で候補コロニーを選択する方法としては、例えばTakahashi et al., Cell, 131, 861-872 (2007)に記載の方法が挙げられる。レポーター細胞を用いる方法は簡便で効率的ではあるが、B-iPS細胞がヒトの治療用途への適用を目的として作製される場合、安全性の観点から目視によるコロニー選択が望ましく、目視による形態観察によっても十分効率よくB-iPS細胞の候補コロニーを選択することができる。
選択されたコロニーの細胞がB-iPS細胞であることの確認は、自体公知の種々の試験方法、例えばES細胞特異的遺伝子(例えば、Oct3/4、Sox2、Nanog、Cripto、Dax1、ERas、Fgf4、Esg1、Rex1、Zfp296等)の発現解析などにより行うことができる。さらに正確を期す場合は、選択された細胞をマウスに移植してテラトーマ形成を確認すればよい。
また、B-iPS細胞がB細胞由来であることの確認は、後記実施例2に示されるように、B細胞受容体(BCR)の遺伝子再構成の有無を、ゲノミックPCRにより調べることにより行うことができる。
このようにして樹立されたB-iPS細胞は、種々の目的で使用することができる。例えば、ES細胞や造血幹細胞等で報告されている分化誘導法を利用して、B-iPS細胞から種々の細胞(例、B細胞、形質細胞、T細胞、NK細胞、NKT細胞、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、マクロファージ等の造血・免疫系細胞、心筋細胞、網膜細胞、神経細胞、血管内皮細胞、インスリン分泌細胞等)・組織・臓器への分化を誘導することができる。例えば、特開2006−141356に記載の方法に準じて、B-iPS細胞から造血幹細胞を経てB細胞に分化させることができる。
好ましい一実施態様において、B-iPS細胞は抗体産生細胞としての利用のために、成熟B細胞や形質細胞に分化させられる。したがって、本発明はまた、所定の抗原で免疫したB細胞から上記方法により作製されたB-iPS細胞を分化させて得られるB細胞の培養物から抗体を回収することを特徴とする、該所定の抗原に対するモノクローナル抗体の製造方法を提供する。抗体の大量生産を目的とする場合、B-iPS細胞は、B細胞への分化を誘導する前に、十分大量増幅させておくことが好ましい。B-iPS細胞の増殖用培地としては、ES細胞の培養に用いられる培地が一般に使用可能である。
B-iPS細胞からB細胞への分化を誘導する方法としては、例えば、IL-2、IL-4、IL-7、SCF、Flt3リガンド等のサイトカイン類、LPS、約5〜20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地(MEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、RPMI1640培地、199培地、F12培地などの培地中で、ストローマ細胞(例、OP9細胞、S17細胞など)と、数週間共培養する方法が挙げられるが、これに限定されない。
得られる成熟B細胞や形質細胞を常法に従って培養し、その培養上清から目的のモノクローナル抗体を回収する。モノクローナル抗体の分離精製には、一般的な蛋白質の分離精製技術を組み合わせて用いることができるが、抗原を固定化したカラムを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーなどが特に好ましい。
以上のようにして得られるモノクローナル抗体が治療用抗体である場合には、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは他の哺乳動物(例、マウス等)に対して経口的または非経口的(例、血管内投与、皮下投与など)に投与することができる。
投与に用いられる医薬組成物としては、上記の抗体と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってもよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
投与に用いられる医薬組成物としては、上記の抗体と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってもよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記の抗体を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール(例、エタノール)、ポリアルコール(例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO−50(polyoxyethylene(50mol)adduct of hydrogenated castor oil)〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤(糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む)、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤(ソフトカプセル剤を含む)、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、抗体の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤(アンプル)、坐剤が挙げられる。抗体は、投薬単位剤形当たり通常5〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mg含有されていることが好ましい。
上記の抗体を含有する上記医薬の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、通常、抗体の1回量として、0.01〜20mg/kg体重程度、好ましくは0.1〜10mg/kg体重程度、さらに好ましくは0.1〜5mg/kg体重程度を、例えば1〜2週間に1回の頻度で数回、又は2〜3週間に1回の投与で約2ヶ月間、静脈注射により投与する。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
別の好ましい一実施態様において、本発明のB-iPS細胞は、造血もしくは免疫系細胞に分化させた後、免疫不全マウスに移植することにより、免疫系ヒト化マウスの作製に利用することができる。造血・免疫系細胞としては特に制限はないが、例えば、造血幹細胞、多能性前駆細胞などが挙げられる。当該細胞は分化ステージが均一な細胞集団である必要はなく、ヘテロな細胞集団であってよい。B-iPS細胞から造血幹細胞、さらにB細胞系列への分化を誘導する方法としては、例えば、特開2006−141356に記載の方法などが挙げられるが、これに限定されない。
レシピエントとなる免疫不全マウスとしては、例えば、T細胞及びB細胞の生産能を欠く重症複合免疫不全マウス(SCIDマウス)、特に、NK細胞の活性を持たないNOD/SCID/β2ミクログロブリンノックアウトマウス(NOD/SCID/B2M)やNOD/SCID/commonγ-chainノックアウトマウスなどが好ましい。好ましくは、胎児及び生後7日以内、より好ましくは生後2日以内の新生児をレシピエントとして用いる。
レシピエントマウス動物を予め放射線全身照射した後、所定の量に調製した造血・免疫系細胞を該マウスに移植する。移植する細胞数は、マウスの系統、齢などに応じて適宜定めることができるが、例えば、1匹あたり1×103細胞以上、好ましくは、1×105〜1×107細胞を移植することができる。
免疫系ヒト化マウスの作製に関するさらなる詳細については、例えば、再表2004−110139を参照することができる。
免疫系ヒト化マウスの作製に関するさらなる詳細については、例えば、再表2004−110139を参照することができる。
上記のようにして調製される免疫系ヒト化マウスは、例えば、免疫系に作用する医薬候補化合物の、ヒト免疫系に対する薬効および/または副作用についての情報を、前臨床段階において得ることができる点で有用である。従来のマウスやサルを用いたモデル試験では、ヒト免疫系への効果を直接評価することは不可能である。免疫系に作用する薬剤の中には、実験動物において有効であってもヒトに対して全く無効であったり、ヒトに対して重篤な副作用を引き起こす例が少なくないので、臨床試験の前にヒトへの薬効や副作用に関する予備的知見が得られることは大いに有利である。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
実施例1 マウス脾臓細胞由来B細胞からiPS細胞の樹立
常法により、C57BL/6マウスの脾臓細胞よりB細胞を調製した(純度70%)。B細胞をIL-2(10 ng/ml)存在下、106個/mlの細胞密度で10% FCSを含むRPMI培地で24時間培養した後、Cell, 126: 663-676 (2006) に記載の方法に準じて、マウス由来の4因子(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycをコードする核酸)を含むレトロウイルス(106 pfu/ml)に24時間感染させた。ウイルス感染後に細胞を回収し、マウス胚性線維芽細胞(MEF)上への蒔き直しを行い、LIF存在下、ES細胞培養用培地で共培養した。出現したコロニーを形態的に判断し、ES様の形態をとるコロニーについてピックアップし、さらにLIF存在下MEF上で培養することにより、B細胞由来iPS細胞(B-iPS細胞)を6クローン樹立した(クローン名:9a, 9b, 9c, 9d, 9e, 9f)。
常法により、C57BL/6マウスの脾臓細胞よりB細胞を調製した(純度70%)。B細胞をIL-2(10 ng/ml)存在下、106個/mlの細胞密度で10% FCSを含むRPMI培地で24時間培養した後、Cell, 126: 663-676 (2006) に記載の方法に準じて、マウス由来の4因子(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycをコードする核酸)を含むレトロウイルス(106 pfu/ml)に24時間感染させた。ウイルス感染後に細胞を回収し、マウス胚性線維芽細胞(MEF)上への蒔き直しを行い、LIF存在下、ES細胞培養用培地で共培養した。出現したコロニーを形態的に判断し、ES様の形態をとるコロニーについてピックアップし、さらにLIF存在下MEF上で培養することにより、B細胞由来iPS細胞(B-iPS細胞)を6クローン樹立した(クローン名:9a, 9b, 9c, 9d, 9e, 9f)。
実施例2 B-iPS細胞のcharacterization
実施例1で樹立した6クローンのB-iPS細胞がB細胞由来であるか証明するために、B細胞受容体(BCR)への再構成が行なわれているか否かをgenomic PCRにより確認した。各々のB細胞はBCRが既に再構成していることから、下記に示すプライマーを用いて、各B-iPSクローンのゲノムを鋳型としてPCRを行なうことにより、再構成の有無を確認した。
<センスプライマー>
DHL:MTTTTTGTSAAGGGATCTACTACTGTG(配列番号1)
JH3:CTCACAAGAGTCCGATAGACCCTGG(配列番号2)
Vβ10:TCCAAGGCGCTTCTCACCTCAGTC(配列番号3)
Vβ5:CCCAGCAGATTCTCAGTCCAACAG(配列番号4)
Vβ8:GCATGGGCTGAGGCTGATCCATTA(配列番号5)
VH7183:GAASAMCCTGTWCCTGCAAATGASC(配列番号6)
VJ558:CARCACAGCCTWCATGCARCTCARC(配列番号7)
VHQ52:ACTGARCATCASCAAGGACAAYTCC(配列番号8)
<アンチセンスプライマー>
Dβ1:TTATCTGGTGGTTTCTTCCAGC(配列番号9)
Dβ2:GCACCTGTGGGGAAGAAACT(配列番号10)
Jβ1.5:CAGAGTTCCATTTCAGAACCTAGC(配列番号11)
Jβ2.6:TGAGAGCTGTCTCCTACTATCGATT(配列番号12)
その結果、樹立された6クローンのうち3クローン(9a, 9b, 9f)でDH−JHの遺伝子再構成が、4クローン(9a, 9b, 9e, 9f)でVDJの再構成が起こっていることが確認された(図1)。即ち、B細胞からも4つの因子(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)のみでiPS細胞が樹立できることが確認できた。
実施例1で樹立した6クローンのB-iPS細胞がB細胞由来であるか証明するために、B細胞受容体(BCR)への再構成が行なわれているか否かをgenomic PCRにより確認した。各々のB細胞はBCRが既に再構成していることから、下記に示すプライマーを用いて、各B-iPSクローンのゲノムを鋳型としてPCRを行なうことにより、再構成の有無を確認した。
<センスプライマー>
DHL:MTTTTTGTSAAGGGATCTACTACTGTG(配列番号1)
JH3:CTCACAAGAGTCCGATAGACCCTGG(配列番号2)
Vβ10:TCCAAGGCGCTTCTCACCTCAGTC(配列番号3)
Vβ5:CCCAGCAGATTCTCAGTCCAACAG(配列番号4)
Vβ8:GCATGGGCTGAGGCTGATCCATTA(配列番号5)
VH7183:GAASAMCCTGTWCCTGCAAATGASC(配列番号6)
VJ558:CARCACAGCCTWCATGCARCTCARC(配列番号7)
VHQ52:ACTGARCATCASCAAGGACAAYTCC(配列番号8)
<アンチセンスプライマー>
Dβ1:TTATCTGGTGGTTTCTTCCAGC(配列番号9)
Dβ2:GCACCTGTGGGGAAGAAACT(配列番号10)
Jβ1.5:CAGAGTTCCATTTCAGAACCTAGC(配列番号11)
Jβ2.6:TGAGAGCTGTCTCCTACTATCGATT(配列番号12)
その結果、樹立された6クローンのうち3クローン(9a, 9b, 9f)でDH−JHの遺伝子再構成が、4クローン(9a, 9b, 9e, 9f)でVDJの再構成が起こっていることが確認された(図1)。即ち、B細胞からも4つの因子(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)のみでiPS細胞が樹立できることが確認できた。
実施例3 純化したマウスB細胞からのiPS細胞の樹立
C57BL/6マウスから採取した脾臓細胞をFITC-conjugated anti-CD19で染色し、anti-FITCビーズを用いてMACS(Miltenyi Biotec社)によってCD19陽性B細胞を純化した。
得られた成熟B細胞をIL-4(10 ng/ml)、 LPS (25μg/ml)存在下、106個/mlの細胞密度で10% FCSを含むRPMI培地で24時間培養した後、Cell, 126: 663-676 (2006) に記載の方法に準じて、マウス由来の4因子(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycをコードする核酸)を含むレトロウイルス(106 pfu/ml)に24時間感染させた。ウイルス感染後に細胞を回収し、マウス胚性線維芽細胞(MEF)上への蒔き直しを行い、LIF存在下、ES細胞培養用培地で共培養した。出現したコロニーを形態的に判断し、ES様の形態をとるコロニーについてピックアップし、さらにLIF存在下MEF上で培養することにより、成熟B細胞由来iPS細胞を樹立した。図2(a)にはその簡略化した手順を示している。また、得られた成熟B細胞由来iPS細胞の一例を図2(b)に示す。
C57BL/6マウスから採取した脾臓細胞をFITC-conjugated anti-CD19で染色し、anti-FITCビーズを用いてMACS(Miltenyi Biotec社)によってCD19陽性B細胞を純化した。
得られた成熟B細胞をIL-4(10 ng/ml)、 LPS (25μg/ml)存在下、106個/mlの細胞密度で10% FCSを含むRPMI培地で24時間培養した後、Cell, 126: 663-676 (2006) に記載の方法に準じて、マウス由来の4因子(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycをコードする核酸)を含むレトロウイルス(106 pfu/ml)に24時間感染させた。ウイルス感染後に細胞を回収し、マウス胚性線維芽細胞(MEF)上への蒔き直しを行い、LIF存在下、ES細胞培養用培地で共培養した。出現したコロニーを形態的に判断し、ES様の形態をとるコロニーについてピックアップし、さらにLIF存在下MEF上で培養することにより、成熟B細胞由来iPS細胞を樹立した。図2(a)にはその簡略化した手順を示している。また、得られた成熟B細胞由来iPS細胞の一例を図2(b)に示す。
続いて、得られた成熟B細胞由来iPS細胞を白ネズミの胚に注入したところ、図2(c)に示すように、注入されたiPS細胞に由来する組織が混在したマウス(キメラマウス)を作製することができた。上記iPS細胞樹立のために用いたB細胞は黒ネズミから単離されたものであり、図2(c)のマウスでは黒色の部分がiPS細胞に由来すると考えられる。この結果は、樹立したiPS細胞が全能性を有することを示している。
実施例4 抗原特異的B細胞からのiPS細胞の樹立
図3(a)に示すように、C57BL/6マウスに1匹当たり100μgのNP-CG/Alumを腹腔投与して免疫し、1週間後に脾臓細胞を採取した。得られた脾臓細胞から、MACSビーズによってT細胞系列(anti-Thy1.2, anti-CD3, anti-NK1.1)、ミエロイド系列(anti-Gr1)、抗体産生細胞(anti-CD138)、Ig κB細胞(anti-Igκ)を除いた。さらに、セルソーターを用いてB220陽性Igλ陽性NIP(免疫した抗原)陽性細胞を抗原特異的B細胞として単離した(図3(b))。得られた抗原特異的B細胞を用いて、実施例3と同様の手順によりiPS細胞を樹立した。
続いて、樹立したiPS細胞由来のDNAのシークエンスを行った。NP抗原特異的B細胞の免疫グロブリン遺伝子は、H鎖のV領域のV186.2と軽鎖のl鎖が組み合わされているものが特異的に多い。従って、樹立したiPS細胞クローンのゲノムの免疫グロブリン遺伝子を解析して、H鎖のV領域のV186.2と軽鎖のl鎖が再構成されていれば,NP抗原特異的B細胞に由来すると見なすことができる。
シークエンスの結果、例えばiPS細胞クローンi56H1#12では、H鎖はV186.2領域が再構成されており、また、L鎖の方はκ鎖は再構成されているがフレームが合わずにタンパク質をつくれない型(unproductive)である一方で、λ鎖の再構成はフレームが合っていた。従って、iPS細胞クローンi56H1#12は、抗原特異的B細胞由来のiPS細胞であると結論づけることができる。
図3(a)に示すように、C57BL/6マウスに1匹当たり100μgのNP-CG/Alumを腹腔投与して免疫し、1週間後に脾臓細胞を採取した。得られた脾臓細胞から、MACSビーズによってT細胞系列(anti-Thy1.2, anti-CD3, anti-NK1.1)、ミエロイド系列(anti-Gr1)、抗体産生細胞(anti-CD138)、Ig κB細胞(anti-Igκ)を除いた。さらに、セルソーターを用いてB220陽性Igλ陽性NIP(免疫した抗原)陽性細胞を抗原特異的B細胞として単離した(図3(b))。得られた抗原特異的B細胞を用いて、実施例3と同様の手順によりiPS細胞を樹立した。
続いて、樹立したiPS細胞由来のDNAのシークエンスを行った。NP抗原特異的B細胞の免疫グロブリン遺伝子は、H鎖のV領域のV186.2と軽鎖のl鎖が組み合わされているものが特異的に多い。従って、樹立したiPS細胞クローンのゲノムの免疫グロブリン遺伝子を解析して、H鎖のV領域のV186.2と軽鎖のl鎖が再構成されていれば,NP抗原特異的B細胞に由来すると見なすことができる。
シークエンスの結果、例えばiPS細胞クローンi56H1#12では、H鎖はV186.2領域が再構成されており、また、L鎖の方はκ鎖は再構成されているがフレームが合わずにタンパク質をつくれない型(unproductive)である一方で、λ鎖の再構成はフレームが合っていた。従って、iPS細胞クローンi56H1#12は、抗原特異的B細胞由来のiPS細胞であると結論づけることができる。
参考例1 iPS細胞からの抗体産生細胞の作製
図4(a)にその手順を示すようにして、iPS細胞からのB細胞の誘導を行った。具体的には、以下の通りである。マウス間葉系細胞由来iPS細胞を1枚のOP9ストローマ細胞当たり5x104個で播種した。6日後に細胞をTrypsin-EDTAではがして回収し、新しいOP9ストローマ細胞上に蒔き直した。この時Flt-3Lを5ng/mlの濃度で加えた。さらに4日間の培養後、ストローマ細胞上にある細胞をピペッティングによって回収し、新しいOP9ストローマ細胞上にまき直した。この時Flt-3Lを5ng/ml、IL-7を1ng/mlの濃度でそれぞれ加えた。さらに10日間培養した。そのようにして得られた細胞からのFACSプロファイルを図4(b)に示す。該FACSプロファイルでは、B220陽性細胞群の中にIgM陽性細胞群が見られ、B細胞の誘導が確かめられた。
続いて、得られたB細胞から抗体産生細胞を誘導するために、B細胞をLPS (25mg/ml)、 IL-4 (10ng/ml)で刺激した。図4(c)には、該刺激のなし(下段左)およびあり(下段右)のそれぞれの場合からのFACSプロファイルを示しており、抗原で刺激することによって、CD138陽性抗体産生細胞が得られたことが分かる。なお、CD138は、抗体産生細胞(形質細胞)のマーカーである。また、図4(d)には、iPS細胞から得られた抗体産生細胞(形質細胞)の一例を示している。
以上の結果から、iPS細胞からB細胞(IgM陽性細胞、形質細胞)への誘導が可能なことが確認された。このことから、所定の抗原で免疫されている本発明のB-iPS細胞を用いることにより、該抗原に対するモノクローナル抗体の産生を効率的に行うことが可能となることが期待される。
図4(a)にその手順を示すようにして、iPS細胞からのB細胞の誘導を行った。具体的には、以下の通りである。マウス間葉系細胞由来iPS細胞を1枚のOP9ストローマ細胞当たり5x104個で播種した。6日後に細胞をTrypsin-EDTAではがして回収し、新しいOP9ストローマ細胞上に蒔き直した。この時Flt-3Lを5ng/mlの濃度で加えた。さらに4日間の培養後、ストローマ細胞上にある細胞をピペッティングによって回収し、新しいOP9ストローマ細胞上にまき直した。この時Flt-3Lを5ng/ml、IL-7を1ng/mlの濃度でそれぞれ加えた。さらに10日間培養した。そのようにして得られた細胞からのFACSプロファイルを図4(b)に示す。該FACSプロファイルでは、B220陽性細胞群の中にIgM陽性細胞群が見られ、B細胞の誘導が確かめられた。
続いて、得られたB細胞から抗体産生細胞を誘導するために、B細胞をLPS (25mg/ml)、 IL-4 (10ng/ml)で刺激した。図4(c)には、該刺激のなし(下段左)およびあり(下段右)のそれぞれの場合からのFACSプロファイルを示しており、抗原で刺激することによって、CD138陽性抗体産生細胞が得られたことが分かる。なお、CD138は、抗体産生細胞(形質細胞)のマーカーである。また、図4(d)には、iPS細胞から得られた抗体産生細胞(形質細胞)の一例を示している。
以上の結果から、iPS細胞からB細胞(IgM陽性細胞、形質細胞)への誘導が可能なことが確認された。このことから、所定の抗原で免疫されている本発明のB-iPS細胞を用いることにより、該抗原に対するモノクローナル抗体の産生を効率的に行うことが可能となることが期待される。
本発明のB-iPS細胞によれば、遺伝子工学技術を使用せずにヒトモノクローナル抗体を製造することができるため、抗体医薬品をきわめて安価に提供することができ、現在、癌などの難病に偏っている抗体医薬品の市場をcommon diseasesに拡大することができる点で有用である。また、本発明のB-iPS細胞を利用して作製されるヒト化マウスによれば、免疫系に直接作用する薬剤の、ヒト免疫系への直接の効果・副作用を前臨床段階で評価することができるので、医薬品候補化合物の開発の継続可否を判断する上でも有用である。
本出願は日本で出願された特願2008−227325(出願日:2008年9月4日)を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
Claims (7)
- B細胞に、C/EBPαおよびPax5発現阻害物質を含まない核初期化因子を接触させることにより得られるクローン化された細胞であって、免疫グロブリン遺伝子が再構成されており、かつ分化多能性および自己複製能を有する細胞。
- 核初期化因子が、Oct3/4、Sox2、Klf4およびc-Mycまたはそれらをコードする核酸、あるいはOct3/4、Sox2およびKlf4またはそれらをコードする核酸である、請求項1記載の細胞。
- B細胞がヒト由来である、請求項1または2記載の細胞。
- B細胞が所定の抗原で免疫されている、請求項1〜3のいずれかに記載の細胞。
- 請求項4記載の細胞を分化させて得られるB細胞の培養物から抗体を回収することを特徴とする、所定の抗原に対するモノクローナル抗体の製造方法。
- 請求項3記載の細胞を分化させて得られるヒト造血・免疫系細胞を、免疫不全マウスに移植することを特徴とする、免疫系ヒト化マウスの作製方法。
- 請求項6記載の方法により得られる免疫系ヒト化マウス。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008227325 | 2008-09-04 | ||
JP2008227325 | 2008-09-04 | ||
PCT/JP2009/065534 WO2010027062A1 (ja) | 2008-09-04 | 2009-09-04 | B細胞由来iPS細胞およびその用途 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2010027062A1 true JPWO2010027062A1 (ja) | 2012-02-02 |
Family
ID=41797226
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010527839A Pending JPWO2010027062A1 (ja) | 2008-09-04 | 2009-09-04 | B細胞由来iPS細胞およびその用途 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20110231944A1 (ja) |
EP (1) | EP2333050A4 (ja) |
JP (1) | JPWO2010027062A1 (ja) |
WO (1) | WO2010027062A1 (ja) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101685209B1 (ko) * | 2008-07-30 | 2016-12-09 | 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 | 유도된 다능성 줄기 세포의 효율적인 확립 방법 |
WO2010098419A1 (en) | 2009-02-27 | 2010-09-02 | Kyoto University | Novel nuclear reprogramming substance |
CN102782122B (zh) | 2010-02-16 | 2015-02-25 | 国立大学法人京都大学 | 有效建立经诱导的多能干细胞的方法 |
CA2806858C (en) | 2010-08-04 | 2021-06-15 | Cellular Dynamics International, Inc. | Reprogramming immortalized b cells |
AU2014360678A1 (en) * | 2013-12-06 | 2016-06-23 | Fuwan Pty Ltd | A method of treating neoplasia |
KR101636405B1 (ko) * | 2014-05-20 | 2016-07-05 | 국방과학연구소 | B 세포 분화 유도 세포 |
US10221395B2 (en) * | 2016-06-16 | 2019-03-05 | Cedars-Sinai Medical Center | Efficient method for reprogramming blood to induced pluripotent stem cells |
CN111304248B (zh) | 2018-12-25 | 2021-08-24 | 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 | 人源化细胞因子il15基因改造非人动物的构建方法及应用 |
WO2023037544A1 (ja) * | 2021-09-13 | 2023-03-16 | 公益財団法人京都大学iPS細胞研究財団 | 多能性幹細胞の製造方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007069755A1 (ja) * | 2005-12-12 | 2007-06-21 | Riken | 人工リンパ節を用いた効率的な抗原特異的ハイブリドーマの作成法 |
WO2008038579A1 (fr) * | 2006-09-25 | 2008-04-03 | Riken | diffÉrentiation/induction in vitro de lymphocytes À partir de cellules souches dont le gÉnotype rÉsulte d'une reconstitution gÉnÉtique |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN100360565C (zh) * | 2001-12-22 | 2008-01-09 | 4-抗体股份公司 | 制备脊椎动物淋巴细胞和生产结合蛋白的方法 |
AU2003235652A1 (en) * | 2002-01-15 | 2003-07-30 | Advanced Cell Technology, Inc. | Cloning b and t lymphocytes |
JP3958160B2 (ja) | 2002-09-13 | 2007-08-15 | 株式会社リコー | 電子回路チップ定着装置 |
EP1645183B1 (en) * | 2003-06-16 | 2013-03-13 | Kyushu University, National University Corporation | Process for producing human-origin immunocompetent cell |
JP2006141356A (ja) | 2004-11-24 | 2006-06-08 | Institute Of Physical & Chemical Research | Es細胞から樹立された造血幹細胞 |
CN101864392B (zh) | 2005-12-13 | 2016-03-23 | 国立大学法人京都大学 | 核重新编程因子 |
JP5079360B2 (ja) | 2007-03-15 | 2012-11-21 | ローム株式会社 | 発光ダイオード駆動装置 |
CA3071055A1 (en) * | 2007-04-07 | 2008-10-16 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Reprogramming of somatic cells |
WO2010003103A2 (en) * | 2008-07-02 | 2010-01-07 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Non-human mammals with t or b cells having predefined specificity |
-
2009
- 2009-09-04 US US13/062,439 patent/US20110231944A1/en not_active Abandoned
- 2009-09-04 EP EP09811587.6A patent/EP2333050A4/en not_active Withdrawn
- 2009-09-04 JP JP2010527839A patent/JPWO2010027062A1/ja active Pending
- 2009-09-04 WO PCT/JP2009/065534 patent/WO2010027062A1/ja active Application Filing
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007069755A1 (ja) * | 2005-12-12 | 2007-06-21 | Riken | 人工リンパ節を用いた効率的な抗原特異的ハイブリドーマの作成法 |
WO2008038579A1 (fr) * | 2006-09-25 | 2008-04-03 | Riken | diffÉrentiation/induction in vitro de lymphocytes À partir de cellules souches dont le gÉnotype rÉsulte d'une reconstitution gÉnÉtique |
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
CELL, vol. 133, no. 2, JPN6014007983, April 2008 (2008-04-01), pages 250 - 264, ISSN: 0002756745 * |
HOCHEDLINGER,K. ET AL: "Monoclonal mice generated by nuclear transfer from mature B and T donor cells.", NATURE (LOND), vol. 415, no. 6875, JPN6009064446, 2002, pages 1035 - 1038, XP002978799, ISSN: 0002756744, DOI: 10.1038/nature718 * |
IMMUNITY, vol. 28, no. 5, JPN6014007985, May 2008 (2008-05-01), pages 606 - 608, ISSN: 0002756746 * |
古関 明彦: "人工多能性幹細胞(iPS細胞)作製・制御等の医療基盤技術 ヒトiPS細胞の分化能と腫瘍化傾向を反映するマー", 平成21年度 戦略的創造研究推進事業 CREST研究年報[ONLINE], JPN6014007987, September 2010 (2010-09-01), ISSN: 0002756747 * |
最新医学, vol. 60, no. 8, JPN6014033334, August 2005 (2005-08-01), pages 1677 - 1682, ISSN: 0002958139 * |
細胞工学, vol. 23, no. 11, JPN6014033337, 2004, pages 1260 - 1263, ISSN: 0002958142 * |
蛋白質核酸酵素, vol. 49, no. 6, JPN6014033335, 2004, pages 704 - 709, ISSN: 0002958140 * |
蛋白質核酸酵素, vol. 50, no. 6, JPN6014033336, May 2005 (2005-05-01), pages 546 - 550, ISSN: 0002958141 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2333050A1 (en) | 2011-06-15 |
US20110231944A1 (en) | 2011-09-22 |
WO2010027062A1 (ja) | 2010-03-11 |
EP2333050A4 (en) | 2013-07-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO2010027062A1 (ja) | B細胞由来iPS細胞およびその用途 | |
JP5652783B2 (ja) | NKT細胞由来iPS細胞およびそれ由来のNKT細胞 | |
JP6933898B2 (ja) | 養子細胞治療製品を製造するための誘導多能性幹細胞の適用 | |
JP7181219B2 (ja) | 抗原特異的免疫エフェクター細胞 | |
CN108368520B (zh) | 多能细胞的基因组工程改造 | |
KR101811235B1 (ko) | T 세포 및 조혈 세포의 재프로그래밍 | |
JP2023516632A (ja) | 多能性幹細胞からナチュラルキラー細胞を産生するための方法 | |
US20220064599A1 (en) | Car nk cells | |
JP6320473B2 (ja) | アロNKT細胞を用いた免疫療法およびそのためのT細胞抗原受容体(TCR)遺伝子のα鎖領域が均一なVα−Jαに再構成されている細胞および該細胞由来NKT細胞のバンキング | |
TW202330910A (zh) | T細胞的製造方法 | |
EP4324917A1 (en) | Cell bank composed of ips cells for introducing t cell receptor gene | |
CN117480249A (zh) | 包含未重排的t细胞受体(tcr)基因座的干细胞及其使用方法 | |
JP2021069322A (ja) | Cd4陽性制御性t細胞の製造方法 | |
Eminli et al. | Differentiation stage determines reprogramming potential of hematopoietic cells into iPS cells | |
EA046022B1 (ru) | Антигенспецифические иммунные эффекторные клетки | |
WO2012045157A1 (en) | Arih2 regulates dendritic cell activation and autoimmunity |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120904 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140304 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140502 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20141209 |