JP6320473B2 - アロNKT細胞を用いた免疫療法およびそのためのT細胞抗原受容体(TCR)遺伝子のα鎖領域が均一なVα−Jαに再構成されている細胞および該細胞由来NKT細胞のバンキング - Google Patents
アロNKT細胞を用いた免疫療法およびそのためのT細胞抗原受容体(TCR)遺伝子のα鎖領域が均一なVα−Jαに再構成されている細胞および該細胞由来NKT細胞のバンキング Download PDFInfo
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Description
[1]T細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞をin vitroで分化させることにより得られたNKT細胞を含有してなる、免疫細胞療法剤であって、MHC遺伝子座のうち少なくとも1座のジェノタイプが該NKT細胞と一致しない同種異系個体を投与対象とする、剤。
[2]T細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞が、多能性幹細胞である、上記[1]記載の剤。
[3]多能性幹細胞がES細胞である、上記[2]記載の剤。
[4]ES細胞がヒトES細胞である、上記[3]記載の剤。
[5]HLA遺伝子座のうち少なくとも1座のジェノタイプが該ヒトES細胞と一致しない同種異系個体を投与対象とする、上記[4]記載の剤。
[6]多能性幹細胞がiPS細胞である、上記[2]記載の剤。
[7]iPS細胞がヒトiPS細胞である、上記[6]記載の剤。
[8]多能性幹細胞がNKT細胞由来である、上記[2]記載の剤。
[9]NKT細胞がヒトNKT細胞である、上記[8]記載の剤。
[10]HLA遺伝子座のうち少なくとも1座のジェノタイプが該ヒトNKT細胞と一致しない同種異系個体を投与対象とする、上記[9]記載の剤。
[11]HLA遺伝子座が、HLA-A、HLA-BおよびHLA-Cである、上記[5]または[10]記載の剤。
[12]NKT細胞受容体リガンドまたはNKT細胞受容体リガンドでパルスした樹状細胞と組み合わせてなる、上記[1]〜[11]のいずれかに記載の剤。
[13]NKT細胞受容体リガンドがα-ガラクトシルセラミドである、上記[12]記載の剤。
[14]がん、感染症、アレルギー疾患、または自己免疫疾患の予防および/または治療用である、上記[1]〜[13]のいずれかに記載の剤。
[15]T細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞をin vitroで分化させることにより得られたNKT細胞を、MHC遺伝子座のうち少なくとも1座のジェノタイプが該NKT細胞と一致しない同種異系個体に有効量投与することを含む、該個体に対する免疫細胞療法。
[16]T細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞が、多能性幹細胞である、上記[15]記載の方法。
[17]多能性幹細胞がES細胞である、上記[16]記載の方法。
[18]ES細胞がヒトES細胞である、上記[17]記載の方法。
[19]多能性幹細胞がiPS細胞である、上記[16]記載の方法。
[20]iPS細胞がヒトiPS細胞である、上記[19]記載の方法。
[21]多能性幹細胞がNKT細胞由来である、上記[16]記載の方法。
[22]NKT細胞がヒトNKT細胞である、上記[21]記載の方法。
[23]HLA遺伝子座のうち、少なくとも1座のジェノタイプが該ヒトNKT細胞と一致しない同種異系個体を投与対象とする、上記[22]記載の方法。
[24]HLA遺伝子座が、HLA-A、HLA-BおよびHLA-Cである、上記[23]記載の方法。
[25]前記個体に、NKT細胞受容体リガンドまたはNKT細胞受容体リガンドでパルスした樹状細胞を有効量投与することをさらに含む、上記[15]〜[24]のいずれかに記載の方法。
[26]NKT細胞受容体リガンドがα-ガラクトシルセラミドである、上記[25]記載の方法。
[27]がん、感染症、アレルギー疾患または自己免疫疾患の予防および/または治療用である、上記[15]〜[26]のいずれかに記載の方法。
[28]T細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されているヒトNKT細胞由来細胞または該細胞をin vitroで分化させることにより得られたNKT細胞のバンク。
[29]以下の(1)〜(4)の工程を含む、上記[28]記載のバンクの構築方法:
(1)ドナー登録者の特定のHLA遺伝子座のジェノタイプを確定する工程;
(2)ドナー登録者からNKT細胞を採取する工程;
(3)該NKT細胞から、T細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されているヒト細胞を樹立し、必要に応じて樹立したヒト細胞からヒトNKT細胞を樹立する工程;
(4)樹立ヒト細胞からNKT細胞への分化能、分化後の造腫瘍性について検定し、基準を満たしたヒト細胞または該細胞由来NKT細胞を順次バンキングする工程。
[30]
(1)ヒトNKT細胞の投与を必要とする患者と、少なくとも1つのHLA遺伝子座のジェノタイプが一致しないヒトNKT細胞から樹立したT細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞または該細胞由来NKT細胞を、上記[28]に記載のバンクから分譲を受けること、
(2)(1)においてヒトNKT細胞から樹立したT細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞の分譲を受けた場合、該細胞を成熟NKT細胞に分化誘導すること、
(3)該患者に、上記(1)又は(2)で得たヒトNKT細胞の有効量を、投与することを含む、免疫細胞療法。
[31]前記患者に、NKT細胞受容体リガンドまたはNKT細胞受容体リガンドでパルスした樹状細胞を有効量投与することをさらに含む、上記[30]記載の方法。
[32]NKT細胞受容体リガンドがα-ガラクトシルセラミドである、上記[31]記載の方法。
[33]がん、感染症、アレルギー疾患または自己免疫疾患の予防および/または治療用である、上記[30]〜[32]のいずれかに記載の方法。
NKT細胞は、正常のアロ個体へ移入してもアロ免疫反応により拒絶されるので、安全に免疫細胞療法を実施することが出来る。
T細胞抗原受容体(TCR)遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞から分化したNKT細胞はアロ個体へ移入した際にGVHDを引き起こさないため、GVHDに起因する副作用を回避することができる。
染色体上のTCRα鎖領域がNKT細胞特異的な態様で均一に再構成されている細胞からはNKT細胞が選択的に誘導される。従って、該細胞から誘導したNKT細胞を本発明の免疫細胞療法へ用いれば、通常のアロT細胞が混入する可能性を回避し、重篤なGVH反応が生じるリスクを抑制することができる。
本発明の免疫細胞療法においては、ドナーとレシピエントのHLAを一致させなくてもよいので、ドナーを容易に獲得することが出来る。従って、ドナーから提供されたNKT細胞から誘導したiPS細胞等のT細胞抗原受容体(TCR)遺伝子のα鎖(TCRα)領域がNKT細胞特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞あるいは該細胞由来NKT細胞をバンキングすることにより、NKT細胞を安定的に供給することができる。どのようなHLAタイプのT細胞抗原受容体(TCR)遺伝子のα鎖(TCRα)領域が均一なVα-Jαに再構成されているヒトNKT細胞由来細胞あるいは該細胞由来NKT細胞も同じ効果が期待できるため、これらをバンキングすることにより、あらゆるHLAタイプの患者に対して有効なアロNKT細胞を即座に調製し、治療に用いることが可能となる。
(1) Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc(ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5で置換可能である。さらに、c-MycはT58A(活性型変異体), N-Myc, L-Mycで置換可能である。)
(2) Oct3/4, Klf4, Sox2
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(4) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28
(6) Oct3/4, Klf4, Sox2, bFGF
(7) Oct3/4, Klf4, Sox2, SCF
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, bFGF
(9) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SCF
タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent(Gene Therapy Systmes)、Pro-JectTM Protein Transfection Reagent(PIERCE)及びProVectin(IMGENEX)、脂質をベースとしたProfect-1(Targeting Systems)、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrain Peptide(Q biogene)及びChariot Kit(Active Motif)等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。核初期化因子を適当な溶媒(例えば、PBS、HEPES等の緩衝液)に希釈し、導入試薬を加えて室温で5-15分程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した細胞に添加して37℃で1ないし数時間インキュベートする。その後培地を除去して血清含有培地に交換する。
PTDとしては、ショウジョウバエ由来のAntP、HIV由来のTAT、HSV由来のVP22等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。核初期化因子のcDNAとPTD配列とを組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを作製して組換え発現させ、融合タンパク質を回収して導入に用いる。導入は、タンパク質導入試薬を添加しない以外は上記と同様にして行うことができる。
PTD由来のCPPとしては、11R (Cell Stem Cell, 4:381-384(2009)) や9R (Cell Stem Cell, 4:472-476(2009))等のポリアルギニンが挙げられる。
マイクロインジェクションは、先端径1μm程度のガラス針にタンパク質溶液を入れ、細胞に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。
タンパク質導入操作は1回以上の任意の回数(例えば、1回以上10回以下、または1回以上5回以下等)行うことができ、好ましくは導入操作を2回以上(たとえば3回または4回)繰り返して行うことができる。導入操作を繰り返し行う場合の間隔としては、例えば6〜48時間、好ましくは12〜24時間が挙げられる。
核初期化因子のcDNAは、宿主となるNKT細胞等の体細胞で機能し得るプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入される。発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクター、動物細胞発現プラスミド(例、pA1-11,pXT1,pRc/CMV,pRc/RSV,pcDNAI/Neo)などが用いられ得る。
用いるベクターの種類は、得られるNKT-iPS細胞の用途に応じて適宜選択することができる。例えば、アデノウイルスベクター、プラスミドベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが使用され得る。
核初期化因子である核酸を含む発現ベクターは、ベクターの種類に応じて、自体公知の手法により細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクターの場合、該核酸を含むプラスミドを適当なパッケージング細胞(例、Plat-E細胞)や相補細胞株(例、293細胞)に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを細胞に感染させる。一方、プラスミドベクターの場合には、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。
iPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤[例えば、バルプロ酸 (Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA(例、HDAC1 siRNA Smartpool (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等)等の核酸性発現阻害剤など]、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤[例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA(例、G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology)等)等の核酸性発現阻害剤など]等が挙げられるが、それらに限定されない。核酸性の発現阻害剤はsiRNAもしくはshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。
iPS細胞の樹立効率改善物質は、該物質の非存在下と比較してNKT細胞等の体細胞からのNKT-iPS細胞樹立効率が有意に改善される限り、核初期化因子と同時にNKT細胞等の体細胞に接触させてもよいし、また、どちらかを先に接触させてもよい。一実施態様において、例えば、核初期化因子がタンパク性因子をコードする核酸であり、iPS細胞の樹立効率改善物質が化学的阻害物質である場合には、前者は遺伝子導入処理からタンパク性因子を大量発現するまでに一定期間のラグがあるのに対し、後者は速やかに細胞に作用しうることから、遺伝子導入処理から一定期間細胞を培養した後に、iPS細胞の樹立効率改善物質を培地に添加することができる。別の実施態様において、例えば、核初期化因子とiPS細胞の樹立効率改善物質とがいずれもウイルスベクターやプラスミドベクターの形態で用いられる場合には、両者を同時に細胞に導入してもよい。
核初期化因子(及びiPS細胞の樹立効率改善物質)との接触に際し、例えば、カチオニックリポソームなど導入試薬を用いる場合には、導入効率の低下を防ぐため、無血清培地に交換しておくことが好ましい場合がある。核初期化因子(及びiPS細胞の樹立効率改善物質)を接触させた後、細胞を、例えばES細胞の培養に適した条件下で培養することができる。ヒト細胞の場合、通常の培地に分化抑制因子として塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を添加して培養を行うことが好ましい。一方、マウス細胞の場合には、bFGFの代わりにLeukemia Inhibitory Factor(LIF)を添加することが望ましい。また通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞(MEF)の共存下で培養される。MEFとしては、通常STO細胞等がよく使われるが、iPS細胞の誘導には、SNL細胞(McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990))等がよく使われている。
一方、NKT細胞受容体リガンドの代わりにNKT細胞受容体リガンドでパルスしたDCを用いる場合、活性化NKT細胞の作製において上記したような手法により調製されるNKT細胞受容体リガンドでパルスしたDCを、上記水性液に例えば約1.0×106〜約1.0×107細胞/mLとなるように懸濁すればよい。
(1)ドナー登録者の特定のHLA遺伝子座(例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-Cからなる群から選択される少なくとも1つのHLA遺伝子座)のジェノタイプを確定する工程;
(2)ドナー登録者からNKT細胞を採取する工程;
(3)該NKT細胞からヒトNKT-derived細胞を樹立し、必要に応じて樹立したヒトNKT-derived細胞からヒト再分化NKT細胞を樹立する工程;および
(4)樹立ヒトNKT-derived細胞のNKT細胞への分化能、分化後の造腫瘍性について検定し、基準を満たした細胞を順次バンキングする工程。
(1)ドナー登録者の特定のHLA遺伝子座(例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-Cからなる群から選択される少なくとも1つのHLA遺伝子座)のジェノタイプを確定する工程;
(2)ドナー登録者からNKT細胞を採取する工程;
(3)該NKT細胞に核初期化因子を接触させてヒトiPS細胞を樹立し、必要に応じて樹立したヒトiPS細胞からヒトNKT細胞を樹立する工程;および
(4)樹立ヒトiPS細胞のNKT細胞への分化能、分化後の造腫瘍性について検定し、基準を満たした細胞を順次バンキングする工程。
また、前記工程(4)において、樹立したヒトNKT-derived細胞(例、NKT-PS細胞、NKT-iPS細胞)のNKT細胞への分化能は、上述の再分化NKT細胞(例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞)の作製方法を適用して、NKT細胞に分化誘導が達成されるか否かを判定することにより実施できる。一方、分化後の造腫瘍性については、核型分析(染色体標本をギムザ染色し、顕微鏡下で染色体数や染色体構造異常を分析する)、継代数を重ねた細胞による評価(細胞特性に変化がないことを確認する)、軟寒天培地法(造腫瘍性を有する細胞は、増殖のための細胞接着の足場を必要としないことを利用)、免疫不全動物への移植(ヌードマウスなどの筋肉内や皮下にヒトNKT-derived細胞(例、NKT-PS細胞、NKT-iPS細胞)を注入し、腫瘍形成の有無を調べる)などの手法を用いて検定することができる。
以上の検定の結果、NKT細胞への分化能を有し、分化後の造腫瘍性が実質的にないと判定されたヒトNKT細胞由来細胞(例、NKT-PS細胞、NKT-iPS細胞)または該NKT-derived細胞由来NKT細胞(例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞)をバンキングする。バンキングされた細胞は、標準的に使用されている方法により分注された状態で凍結保存され、用時ストックの一部を融解し、必要に応じて適当な培地(例えば、ヒトES細胞培養用培地など)で十分な量にまで増幅した後、上記NKT-derived細胞(例、NKT-PS細胞、NKT-iPS細胞)からNKT細胞への分化誘導法に従って、ヒト再分化NKT細胞(例、PS-NKT細胞、iPS-NKT細胞)を調製することができる。
(1)マウス脾臓細胞由来NKT細胞からのiPS細胞の樹立
T細胞抗原受容体α鎖(TCRα)領域が既にNKT細胞で用いられるTCR (NKT-TCR) に再構成しているC57BL/6マウスの脾臓細胞より、NKT細胞を調製した。NKT細胞はMHCクラスI様分子であるCD1dに提示される糖脂質抗原を認識することを特徴とするため、糖脂質抗原であるα-GalCerを挟んだ可溶化型CD1d-マウスIgG1組換え体 (BD Bioscience社製) をAPC標識した抗マウスIgG1抗体に反応性を有する細胞を、抗APC磁気ビーズを利用したMACS法(Miltenyi Biotech社製)を用いてポジティブ選択することにより、細胞を濃縮した。この操作により、α-GalCer loaded CD1d dimer陽性/TCRβ陽性の細胞として規定されるNKT細胞は90%以上の純度となった。濃縮したNKT細胞を、IL-2(10ng/ml)存在下、106個/mlの細胞密度で10%FCSを含むRPMI培地で24時間培養した後、Cell, 126: 663-676 (2006) に記載の方法に準じて、マウス由来の4因子(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycをコードする核酸)を含むレトロウイルス(106pfu/ml)に24時間感染させた。ウイルス感染から3-7日後に細胞を回収し、マウス胚性線維芽細胞(MEF)上への蒔き直しを行い、LIF存在下、ES細胞培養用培地で共培養した。出現したコロニーを形態的に判断し、ES様の形態をとるコロニーについてピックアップし、さらにLIF存在下MEF上で培養することにより、NKT細胞由来iPS細胞(NKT-iPS細胞)を4クローン樹立した(クローン名:2a, 5b, 5d, 5g)。
上記(1)で樹立した4クローンのNKT-iPS細胞がNKT細胞由来であるか証明するために、NKT-TCRへの再構成が行なわれているか否かをgenomic PCRにより確認した。NKT-TCRを有する細胞では、TCRα領域の片方がVα14-Jα18に既に再構成していることから(図1)、下記に示すプライマーを用いて、各NKT-iPSクローンのゲノムを鋳型としてPCRを行うことにより、再構成の有無を確認した。
配列番号1:プライマー1: 5’-gacccaagtggagcagagtcct-3’
配列番号2:プライマー2: 5’-tcacctatgtctcctggaagcctc-3’
配列番号3:プライマー3: 5’-cagctccaaaatgcagcctccctaa-3’
[Vα14-Jα18に再構成していない(ワイルド)場合、プライマー1とプライマー2を用いたPCRにより、349bpのバンドが増幅される。一方、Vα14-Jα18に再構成している(NKT-TCR)場合、プライマー1とプライマー3を用いたPCRにより、317bpのバンドが増幅される。]
その結果、樹立された4クローンいずれもゲノムの片方がNKT-TCRに再構成していることが明らかとなり(図2)、樹立されたiPS細胞がNKT細胞由来であることが確認できた。
上記(2)で確認されたNKT-iPS細胞がiPS様の細胞へリプログラミングされているか否かを確認するために、遺伝子発現プロファイリングを実施した。NKT-iPS細胞、NKT細胞の核移植胚由来のES細胞(NKT-ES細胞)、末梢のNKT細胞からそれぞれtotal RNAをフェノール-クロロホルム法により調製し、ES細胞において発現が知られている一連の遺伝子群の発現をone step RT-PCR法 (Invitrogen社製) により解析した。解析を行った遺伝子と用いたプライマーの配列を下記に列記する。
Endogenous Oct3/4: 5’-tctttccaccaggcccccggctc-3’(配列番号4)
5’-tgcgggcggacatggggagatcc-3’(配列番号5)
Endogenous Sox2: 5’-tagagctagactccgggcgatga-3’(配列番号6)
5’-ttgccttaaacaagaccacgaaa-3’(配列番号7)
Endogenous Klf4: 5’-gcgaactcacacaggcgagaaacc-3’(配列番号8)
5’-tcgcttcctcttcctccgacaca-3’(配列番号9)
Endogenous c-Myc: 5’-tgacctaactcgaggaggagctggaatc-3’(配列番号10)
5’-aagtttgaggcagttaaaattatggctgaagc-3’(配列番号11)
Ecat1: 5’-tgtggggccctgaaaggcgagctgagat-3’(配列番号12)
5’-atgggccgccatacgacgacgctcaact-3’(配列番号13)
Nanog: 5’-caggtgtttgagggtagctc-3’(配列番号14)
5’-cggttcatcatggtacagtc-3’(配列番号15)
Gdf3: 5’-gttccaacctgtgcctcgcgtctt-3’(配列番号16)
5’-agcgaggcatggagagagcggagcag-3’(配列番号17)
Rex1: 5’-acgagtggcagtttcttcttggga-3’(配列番号18)
5’-tatgactcacttccagggggcact-3’(配列番号19)
Zfp296: 5’-ccattaggggccatcatcgctttc-3’(配列番号20)
5’-cactgctcactggagggggcttgc-3’(配列番号21)
HPRT: 5’-ctgtgtgctcaaggggggct-3’(配列番号22)
5’-ggactcctcgtatttgcagattcaacttg-3’(配列番号23)
その結果、解析した全ての遺伝子において、NKT-iPS細胞、NKT-ES細胞で発現が確認され、末梢のNKT細胞では発現が確認されなかった(図3)。この結果は、樹立したNKT-iPS細胞がiPS細胞様の機能を有している可能性を示唆している。
さらに、DNAマイクロアレイ(Affimetrix社製) により、NKT-iPS細胞、NKT-ES細胞、ES細胞、末梢のNKT細胞間での遺伝子発現プロファイルの相関を確認したところ、NKT-iPS細胞はNKT-ES細胞あるいはES細胞と非常に良く似た遺伝子発現パターンを有し、末梢のNKT細胞とは異なることが明らかとなった(図4)。
上記(2)で樹立されたNKT-iPS細胞の形態を顕微鏡下で観察した。その結果、SSEA1やOct3/4の発現局在や細胞自身の形態がES細胞のそれらと酷似していることが明らかとなった(図5)。
上記(2)で樹立されたC57BL/6マウス NKTクローン由来のNKT-iPS細胞と、Balb/c由来細胞から、アグリゲーション法によりキメラマウスを作製した。得られたキメラマウスの脾臓細胞について、細胞表面抗原の解析を行なった。C57BL/6由来の細胞とBalb/c由来の細胞とを、MHCクラスIで見分けることによりゲート(それぞれI-AbとI-Ad)し、NKT細胞の含有率を解析した。その結果、C57BL/6由来の細胞はほとんど全ての細胞が、α-GalCer loaded CD1d dimer陽性/TCRβ陽性のNKT細胞様の表面抗原を有しているのに比して、Balb/c由来の細胞は通常の頻度のT/NKT細胞の含有率であった(図6)。
ヒト末梢血のT細胞に、KSOMを含むウイルスベクターを用いて感染により強制発現させた後、マウス胚性線維芽細胞と21-35日間共培養することでiPS細胞を樹立した(Cell Stem Cell 7: 11-14,15-19, 20-24 (2010))。このようにして樹立されたiPS細胞は網羅的な遺伝子発現プロファイルやES関連遺伝子のエピゲノム状態がヒトES細胞のそれと相関性が高いこと、T細胞抗原受容体領域が遺伝子再構成を起こしていることが確認されている。
ヒト末梢血あるいは臍帯血中に存在するCD1d拘束性のNKT細胞は、Vα24、Vβ11の両方を発現している細胞で、単核球中の0.001%〜0.1%程度を占める。単核球を調製した後、抗ヒトVα24抗体、抗ヒトVβ11抗体、糖脂質リガンド(α-GalCerなど)を挟んだ可溶化型ヒトCD1d組換え体等を用いて、陽性細胞をソーティングにより高純度に分離するか、あるいはNature Protoc, 3: 70-78 (2008)に記載の方法で、単核球に糖脂質リガンドを加えて3日から1ヶ月程度培養してNKT細胞を試験管内で増やした後にソーティングにより高純度に調製する。純化したNKT細胞は、抗ヒトCD3抗体と抗ヒトCD28抗体を固層化したプレートに蒔種し、IL-2、IL-12、IL-23、IL-25などのサイトカイン存在下培養し、レンチウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターに組み込んだKSOMを用いて感染、強制発現させ、1〜2ヵ月マウス胚線維芽細胞などと共培養することで、NKT細胞由来iPS細胞(NKT-iPS細胞)を樹立する。
(1)マウスNKT-iPS細胞からの試験管内分化誘導
ES細胞は、NotchリガンドであるDelta-like1(Dll-1)を強制発現したOP9ストローマ細胞(OP9/Dll-1)と、IL-7およびFlt3リガンド(FL)存在下で共培養することにより、CD4/CD8ダブルポジティブ(DP)のT細胞に分化誘導させることができる(Schmitt TM, de Pooter RF, Gronski MA, Cho SK, Ohashi PS, Zuniga-Pflucker JC. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 2004 Apr;5(4):410-417.)。この知見に基づき、NKT-iPS細胞をOP9/Dll-1細胞とIL-7(1 ng/ml)、FL(5 ng/ml)存在下で20日間共培養したところ、CD4/CD8 DPのα-GalCer loaded CD1d dimer陽性/TCRβ陽性のNKT細胞様の細胞(NKT-iPS細胞由来DP-NKT細胞)が誘導されることが明らかとなった(図7)。さらに詳細に細胞表面抗原の発現解析を行なうと、DP-NKT細胞の表現型は、胸腺内のCD4/CD8 DP細胞のそれと酷似していることが明らかとなった(図8)。この結果は、NKT-iPS細胞がTCRα領域の遺伝子再構成の影響を受けて、NKT様の細胞に分化誘導されやすいことを示唆しているとともに、免疫細胞の遺伝子再構成という特徴を生かした新しいコンセプトを導入することで、目的の免疫細胞 (特にNKT細胞、T細胞、B細胞) を大量に調製する技術を確立できることを示している。
NKT-iPS細胞を培養14日目までOP9/Dll-1と共培養し、培養14日目から20日目までOP9と共培養することによってNKT細胞が誘導されるか否かを解析した。その結果、Lin陰性/CD44陽性/CD25陰性の所謂DN1しか出現していない分化段階早期においても、NKT細胞が出現しうること(図9)、分化誘導したNKT細胞の表面マーカーが末梢のNKT細胞に酷似していること(図9)を見出した。この結果は、NKT細胞が分化段階早期にNotchシグナルが欠損しても、成熟したNKT細胞に分化し得ることを示すものである。
上記(1)で誘導が確認できたNKT-iPS細胞由来DP-NKT細胞を試験管内でさらに増やし成熟化させるために、種々のサイトカインの組み合わせでフィーダー細胞あり、なしの条件で5日間培養を行なった。その結果、OP9あるいはOP9/Dll-1との共培養で、IL-2/IL-15/FLあるいはIL-2/IL-7/IL-15/FLのサイトカインの組み合わせで培養することにより、さらに10倍以上に細胞を増やせることが明らかとなった(図10)。さらに、これら条件で培養した細胞はNK1.1の発現が誘導されており、より分化誘導が進んでいることが推測された(図11)。そこで、OP9あるいはOP9/Dll-1との共培養で、IL-2/IL-15/FLあるいはIL-2/IL-7/IL-15/FLのサイトカインの組み合わせで誘導して得られるNKT細胞について、骨髄細胞由来樹状細胞(GM-CSFで誘導)とα-GalCer存在下で共培養することにより、その増殖能およびサイトカイン産生能を確認した。その結果、OP9/Dll-1でさらに培養した場合に増殖能が確認されること(図12)、その中でもIL-2/IL-15/FLで培養した場合にTh1への偏りがあること(図12)が確認できた。
ヒトNKT-iPS細胞をマウス骨髄ストローマ細胞株OP9及びそれにNotchリガンドであるDll-1を強制発現させた株OP9/Dll-1と共培養することにより、該ヒトNKT-iPS細胞がヒトNKT細胞に分化する。すなわち、ヒトNKT-iPS細胞をOP9と12ないし14日間培養した後、分化した細胞を回収し、さらに15-30日間OP9/Dll-1細胞とIL-7、Flt-3L、SCFなどのサイトカイン存在下で共培養する。このようにして、CD1d拘束性のNKT細胞を分化誘導することができる。
実施例3(3)で誘導されたNKT-iPS細胞由来成熟NKT細胞(IL-7/FL存在下、OP9/Dll-1と20日間共培養した後、IL-2/IL-15/FL存在下、OP9/Dll-1とさらに5日間共培養したもの)が、生体内で機能的であるか否かを評価した。TAPノックアウトマウス由来脾細胞を10mg/mlの卵白アルブミン(OVA)と高張液下培養した後、アポトーシスを誘導し、アポトーシスした細胞2×107個を、2μgのα-GalCerとともに、NKT-iPS細胞由来成熟NKT細胞105個あるいは106個を1時間前に予め移入しておいたJα18ノックアウトマウス(NKT細胞欠損マウス)に移入した。7日後、該マウスより脾臓細胞を採取し、試験管内でOVAペプチド(257-264)により刺激し、細胞内染色によりIFN-γの産生を解析した。その結果、IFN-γ産生能を有するOVA抗原特異的CD8陽性T細胞が移入細胞数依存的に誘導できていることが確認され、NKT-iPS細胞由来成熟NKT細胞が生体内で機能し、強力なアジュバント効果を有することが明らかとなった(図13)。
細胞移入や臓器移植において、MHCが不一致の場合には、移入した細胞や移植した臓器は拒絶されることが知られている。例えば、C57BL/6マウスから樹立したNKT-iPS細胞から分化誘導したNKT細胞(C57BL/6バックグラウンド)をBalb/cマウスに移植した場合、ホストであるBalb/cマウスによって、移入したNKT細胞は拒絶される。しかしながら、移入直後のNKT細胞を活性化させることで、自然免疫系、獲得免疫系両方を活性化させることができる。NKT細胞移入と同時にα-GalCerなどNKT細胞を特異的に活性化する薬剤をパルスした樹状細胞を移入することで、免疫系を活性化する。
重症免疫不全マウスであるNOD/SCID/Common γノックアウトマウスに造血幹細胞を移入して作製される免疫系ヒト化マウス(HLA完全不一致)にヒトNKT-iPS細胞から分化誘導させたNKT細胞を移入する。マウスの場合と同様にヒトiPS細胞由来NKT細胞も速やかに拒絶されるので、移入と同時あるいはその直後に活性化する必要がある。この場合、NKT細胞リガンドであるα-GalCerなどをパルスした樹状細胞(単球からGM-CSFとIL-4で誘導する単球由来樹状細胞もしくはLineage陰性CD11c陽性CD123陰性ミエロイド樹状細胞など)、又はα-GalCerをNKT細胞と同時移入すると、拒絶前のNKT細胞が生体内で活性化し、抗腫瘍効果やアジュバント効果を発揮し得る。
実施例1、3および5で、純化したマウスNKT細胞集団からのNKT-iPS細胞の樹立と、該NKT-iPS細胞からのNKT細胞への分化誘導、該細胞がNKT細胞としての機能を有していることなどが明らかとなった。そこで、実施例1と同様の手順により、C57BL/6マウスの脾臓細胞より濃縮操作なしにNKT細胞を調製し、30-50%程度の純度のNKT細胞集団を得た。実施例1と同様に、IL-2(10ng/ml)存在下、106個/mlの細胞密度で24時間この細胞を培養した後、マウス由来の4因子(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycをコードする核酸)を含むレトロウイルス(106pfu/ml)に24時間感染させた。ウイルス感染から3-7日後に細胞を回収し、マウス胚性線維芽細胞(MEF)上への蒔き直しを行い、LIF存在下、ES細胞培養用培地で共培養した。出現したコロニーを形態的に判断し、ES様の形態をとるコロニーについてピックアップし、さらにLIF存在下MEF上で培養することにより、NKT-iPS細胞5クローンの樹立に成功した(クローン名:i12c, i12d, i13g, i13h, i13i)(図14)。
図15に示すように、細胞移入実験を行う目的でC57BL/6バックグラウンドのNKTクローンマウスを作製した。すなわち、C57BL/6マウスの脾臓由来のNKT細胞の核をBDF1マウスの脱核した卵母細胞に移入した。この細胞をBDF1×ICRのES細胞とフュージョンし、仮親の子宮に移入し、産仔であるキメラマウスを得た。得られたキメラマウス(雄)をC57BL/6マウス(雌)と交配することで得られた産仔をC57BL/6バックグラウンドのNKTクローンマウスとした。
この方法で樹立されたNKTクローンマウスは、元となる核が100%、C57BL/6マウスの脾臓由来のNKT細胞に由来するため、完全なC57BL/6であり、C57BL/6マウスとアロジェニックあるいはセミアロジェニックな反応を起こさない。C57BL/6バックグラウンドのNKTクローンマウスとC57BL/6マウスとのゲノム上の相違は、NKT細胞への分化に伴うT細胞レセプター領域の再構成による配列の相違のみと考えられる。遺伝子再構成を終えているC57BL/6バックグラウンドのNKTクローンマウスのT細胞レセプター領域の塩基配列を図16に示す。
従来の山中らにより確立されたマウスiPS細胞の樹立の方法は、胚性線維芽細胞(MEF)にOct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycを導入することによるものである。そこで、参考例2において創生されたNKTクローンマウスのMEFから、iPS細胞の樹立を試み、NKT-iPS細胞7aおよび7gの樹立に成功した。樹立された7aおよび7gは、T細胞レセプター領域がNKT細胞のT細胞レセプターに遺伝子再構成を起こしていることが確認される(図17)とともに、ES細胞マーカーとなり得る遺伝子群の発現がES細胞と同等であることがRT-PCR法により確認された(図18)。また、DNAマイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現解析とそのクラスター解析から、樹立された7a及び7gはES細胞に近く、元となるNKTクローンマウスのMEFとは遠いという結果を得た(図19)。さらに、その形態学的観察を行うと、7aおよび7gはES細胞のそれと非常に良く似ており、ES細胞マーカーであるSSEA1、Oct3/4、Nanogが発現していることも確認された(図20)。さらに、Oct3/4及びNanogの遺伝子発現調節領域のゲノムのメチル化傾向を解析したところ、7aおよび7gにおいてはES細胞と同等に非メチル化されており、十分にリプログラミングされていることが明らかとなった(図21)。また、7a及び7gからはキメラマウスも複数産まれ、C57BL/6マウスとの交配で得られた産仔は全て、NKT細胞のT細胞レセプターに遺伝子再構成を起こしていることから、子孫伝達も確認され、7aおよび7gが多能性を有することが示された(図22)。以上のことから、7aおよび7gはiPS細胞のクライテリアを満たしていると結論付けた。
次に、MEFに由来する7aおよび7gから試験管内でNKT細胞を分化誘導することが可能であるか否かを検証した。7aおよび7gを、骨髄由来ストローマ細胞であるOP9にNotchリガンドであるDll-1を強制発現させた細胞株OP9/Dll-1と、図23に示すプロトコルで25日間共培養した。その結果、図24に示すように、α-GalCer/CD1d dimer陽性、TCRβ陽性のNKT細胞様の細胞(7a dif.および7g dif.)に分化誘導されることが明らかとなった。さらに、7a dif.および7g dif.は、その細胞表面マーカーの発現が、胸腺内に存在するCD4陽性CD8陽性の所謂DP細胞のそれと酷似していた。また、DNAマイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現解析とそのクラスター解析から、7a dif.および7g dif.は分化誘導前の7aおよび7gとは遠く、末梢に存在する脾臓由来NKT細胞に近いという結果を得た(図25)。そこで、7a dif.および7g dif.が機能的にNKT細胞と同等であるか否かを評価するために、樹状細胞との共培養下、糖脂質リガンドであるα-GalCerで刺激し、増殖能およびサイトカイン産生能を調べた。その結果、7a dif.および7g dif.は、末梢のNKT細胞と同様に、顕著な増殖能を有し、大量のIFN-γやIL-4を産生する能力を有することが確認できた(図26)。
実施例10に記載のように7a dif.および7g dif.が末梢のNKT細胞と同等の機能を有することから、生体内において同様の効果があるか否かをNKT細胞欠損マウスを用いて解析した。NKT細胞欠損マウスに7a dif.および7g dif.を移入後、1週間および2週間における移入細胞の存在を確認すると、肝臓に、α-GalCer/CD1d dimer陽性、TCRβ陽性の7a dif.および7g dif.が存在することが明らかとなった(図27)。そこで図28に示すプロトコルに基づいて、抗原特異的CD8陽性T細胞の誘導とそれに伴う抗腫瘍効果を確認した。TAPノックアウトマウス由来脾細胞を10mg/mlの卵白アルブミン(OVA)と高張液下培養した後、アポトーシスを誘導し、アポトーシスした細胞2×107個を、2μgのα-GalCerとともに7a dif.および7g dif.を一週間前に移入したNKT細胞欠損マウスに移入した(TOG免疫)。7日後、該マウスより脾臓細胞を採取し、試験管内でOVAペプチド(257-264)により刺激し、細胞内染色により、IFN-γの産生を解析した。その結果、IFN-γ産生能を有するOVA抗原特異的CD8陽性T細胞が野生型マウスと同等に誘導できていることが確認され、7a dif.および7g dif.が生体内で機能し、強力なアジュバント効果を有することが明らかとなった(図29)。そこで、該マウスにC57BL/6 マウスの胸腺腫細胞系 EL4あるいはEG7(EL4 OVA- transfectant)を使用した悪性腫瘍拒絶モデルによる評価を行なった。その結果、OVA強制発現株であるEG7においては、TOG免疫を行なっていない野生型マウスでは悪性腫瘍の進行が見られるのに対して、TOG免疫を行なった7a dif.および7g dif.移入NKT細胞欠損マウスにおいては、TOG免疫を行なった野生型マウスと同様に進行が確認されなかった。EL4においては、TOG免疫を行なった野生型マウスとNKT細胞欠損マウスとで同様の進行が見られることから、移入した7a dif.および7g dif.による抗原特異的なアジュバント効果によってもたらされているものと結論付けた(図30)。
以上の結果は、如何なる細胞であれ、T細胞レセプターが再構成しているものであるならば、該T細胞レセプターに再構成している、機能的な免疫担当細胞に分化誘導させうることを示している。
ヒトES細胞からCD4陽性CD8陽性T細胞様細胞の分化誘導系(J Immunol, 183: 4859-4870(2009))を参考に、ヒトNKT-iPS細胞から試験管内NKT細胞分化誘導を行った。NKT-iPS細胞をOP9細胞と12-14日間共培養する。その後、NKT細胞前駆細胞を回収し、OP9/Dll-1細胞と、IL-7、Flt3L、SCF存在下、14-35日間共培養することで、CD1d拘束性のVα24陽性Vβ11陽性のNKT細胞が出現する。
正常マウスにアロのNKT細胞を移入することで速やかに拒絶が起こり、移入NKT細胞はGvHを起こさずに排除される。この条件でNKT細胞リガンドであるα-GalCerをパルスした樹状細胞ないし、α-GalCerを同時移入すると、拒絶前のNKT細胞が生体内で活性化し、抗腫瘍効果やアジュバント効果を発揮し得る。
実施例8に示すように野生型マウスの脾臓細胞由来のNKT細胞からのiPS細胞の樹立に成功しているが、より効率的なiPS細胞樹立方法を確立した。
すなわち、脾細胞よりMACSビーズを用いてCD1d拘束性のNKT細胞を濃縮後、FACSソーティングにより純度99.9%のNKT細胞を得る。該NKT細胞は、抗CD3抗体(10μg/ml)および抗CD28抗体(10μg/ml)による刺激下、IL-2(10ng/ml)及びIL-12(10ng/ml)を加えることにより、増殖サイクルに入れることができる。この条件下で、該NKT細胞をOct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycをコードする核酸を含むレトロウイルスに感染させることで、実施例8よりも10倍以上効率的にiPS細胞を樹立することが可能であることが明らかとなり、NKT-iPSクローン14kの樹立に成功した(図31)。図32に示すように、14kはES細胞様の形態とES細胞マーカーの発現、さらにT細胞レセプター領域のNKT細胞T細胞レセプターの再構成が起こっている。また、実施例9に記載の方法により、NKT細胞様の細胞への分化がみられ、試験管内での糖脂質刺激によって増殖し、サイトカインを産生する機能的な細胞となった(図33)。
実施例3の(1)で誘導が確認できたNKT-iPS細胞由来DP-NKT細胞を試験管内でさらに増やし成熟化させるために、種々のサイトカインの組み合わせで5日間培養を行った。その結果、OP9/Dll-1との共培養で、IL-7/Flt3-L、 IL-7/IL-15/Flt3-L、IL-7/Flt-3L/IL-2あるいはIL-2/IL-7/IL-15/Flt3-Lのサイトカインの組み合わせで培養することにより、さらに10倍以上に細胞を増やせることが明らかとなった(図34)。さらに、これら条件で培養した細胞はNK1.1の発現が誘導されており、より分化誘導が進んでいることが推測された(図35)。そこで、OP9あるいはOP9/Dll-1との共培養で、IL-2/IL-15/FLあるいはIL-2/IL-7/IL-15/FLのサイトカインの組み合わせで誘導して得られるNKT細胞について、骨髄細胞由来樹状細胞(GM-CSFで誘導)とα-GalCer存在下で共培養することにより、その増殖能およびサイトカイン産生能を確認した。その結果、OP9/Dll-1でさらに培養した場合に増殖能が確認されること(図36)、その中でもIL-7/Flt3-Lで培養した場合にTh1への偏りがあること(図36)が確認できた。
アロT細胞あるいはNKT細胞移入による急性GVHDの発症効果を確認するために、T細胞、B細胞及びNKT細胞が欠損したRAG欠損マウス(BALB/cバックグラウンド)に、野生型マウス(C57BL/6バックグラウンド)脾臓由来CD4陽性ヘルパーT細胞あるいはNKTクローンマウス(C57BL/6バックグラウンド)脾臓由来NKT細胞を、細胞数のドーズをふって移入した。CD4陽性ヘルパーT細胞の場合、1x107個ないし3x106個の細胞を移入することで、激しい下痢を伴う体重減少が認められ(図37)、急性GVHDを発症していることが観察された。一方で、クローンマウス脾臓由来NKT細胞を移入した場合、CD4陽性ヘルパーT細胞と同数の細胞を移入しても下痢や体重減少は認められない(図38)ことから、GVHDは引き起こされていないと考えられた。C57BL/6バックグラウンド脾臓由来NKT細胞からOct-3/4, Sox2, Klf4, c-Mycを強制発現させることによって樹立されたiPS細胞を、OP9/Dll-1細胞とIL-7(1 ng/mL)とFlt3リガンド(10 ng/mL)存在下、25日間培養することで得られたNKT細胞を上記と同数移入した場合においても、下痢や体重減少は認められない(図37)ことから、GVHDは引き起こされていないと考えられた。これらの結果より、アロのNKT細胞あるいはアロのiPS細胞由来NKT細胞は、CD4陽性ヘルパーT細胞とは異なり、移植によってGVHDを発症しないことが示唆された。
NKT欠損マウス(Ja18-KOマウス)にNKT細胞を輸注後、OVA蛋白抗原とα-GalCerを共投与する系でアジュバント効果を評価した。
(頁3左図) 野生型マウス(C57BL/6バックグラウンド)にOVAとα-GalCerを投与し、一週間後に脾臓の細胞を単離し、CD8T細胞のエピトープであるクラスI拘束性のOVAペプチドで再刺激して細胞内染色で解析したところ、抗原特異的なCD8T細胞のIFN-γ産生が認められた(図39、左)。しかしながら、Ja18-KOマウス(C57BL/6バックグラウンド)にOVAとα-GalCerを投与した場合は、アジュバント効果は発揮できなかった(図39、中)。この両者の結果は、NKT細胞がアジュバント効果を示すことを意味する。
一方で、セミアロ細胞であるB6/129由来のES細胞から分化させたNKT細胞をJa18-KOマウス(C57BL/6バックグラウンド)に投与して、OVAとα-GalCerを投与した場合には、CD8T細胞の免疫応答が認められた(図39、右)。この結果は、ES細胞由来NKT細胞がアロでありながら、アジュバント効果を示すことを意味する。
上記でアロのNKT細胞がOVA抗原特異的CD8陽性T細胞へのアジュバント効果を発揮することが明らかになったことから、OVAを疑似抗原とした腫瘍細胞の除去に対するアロNKT細胞の効果を確認した。マウスリンパ腫の細胞株であるEL4とEL4にOVAを強制発現させた細胞株であるEG7をマウスに接種した。以下の3群について腫瘍細胞投与後の腫瘍径を測定した:(i) C57BL/6野生型マウス、(ii) 腫瘍細胞接種1週間前にOVA及びα-GalCerを投与したC57BL/6野生型マウス、(iii) セミアロ細胞であるB6/129由来のES細胞から分化させたNKT細胞、OVA及びα-GalCerを腫瘍細胞接種1週間前に投与したJa18欠損マウス(C57BL/6バックグラウンド)。EL4接種群では3群とも同じように経時的な腫瘍の増大が確認された(図40、右グラフ)ことから、この実験系がワークしていることが確認された。この条件下、EG7を移入した群については、(ii)及び(iii)の群において腫瘍の増大が確認できなかった(図40、左グラフ)。この結果は、NKT細胞依存的に抗原特異的なアジュバント効果が誘導されること((ii)の系)、セミアロNKT細胞でも移入によって抗原特異的なアジュバント効果が誘導されること((iii)の系)を示している。
本バンキングシステムの事業化達成により、実用化に耐えるヒト免疫細胞iPS化基礎技術の開発、標的疾患治療を明確にした応用技術開発とベッドサイドとの連携医療基盤が構築され、このパイプラインの確立は、他の疾患領域へのiPS技術を活用した先進免疫治療技術基盤のプロトタイプとして活用され、わが国はもとより世界各国の保健医療に大きな波及効果をもたらすことが期待される。
本出願は米国仮出願No.61/419,064(出願日:2010年12月2日)を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
Claims (14)
- T細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されているNKT細胞を含有してなる、がん、感染症、アレルギー疾患または自己免疫疾患の予防および/または治療用の免疫細胞療法剤であって、
該NKT細胞は、T細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞を、in vitroで分化させることにより得られたものであり、
該NKT細胞受容体はCD1d上に提示されたα−ガラクトシルセラミドを特異的に認識するT細胞受容体であり、
MHC遺伝子座のうち少なくとも1座のジェノタイプが該NKT細胞と一致しない同種異系個体を投与対象とする、
剤。 - NKT細胞がヒトNKT細胞である、請求項1記載の剤。
- HLA遺伝子座のうち少なくとも1座のジェノタイプが該ヒトNKT細胞と一致しない同種異系個体を投与対象とする、請求項2記載の剤。
- HLA遺伝子座が、HLA-A、HLA-BおよびHLA-Cである、請求項3記載の剤。
- NKT細胞受容体リガンドまたはNKT細胞受容体リガンドでパルスした樹状細胞と組み合わせてなる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の剤。
- NKT細胞受容体リガンドがα-ガラクトシルセラミドである、請求項5記載の剤。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の免疫細胞療法剤の製造方法であって、T細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞を、in vitroで分化させて、T細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されているNKT細胞を得ることを含む、製造方法。
- T細胞抗原受容体遺伝子のα鎖領域がNKT細胞受容体特異的な態様で均一なVα-Jαに再構成されている細胞が、多能性幹細胞である、請求項7記載の製造方法。
- 多能性幹細胞がES細胞である、請求項8記載の製造方法。
- ES細胞がヒトES細胞である、請求項9記載の製造方法。
- 多能性幹細胞がiPS細胞である、請求項8記載の製造方法。
- iPS細胞がヒトiPS細胞である、請求項11記載の製造方法。
- 多能性幹細胞がNKT細胞由来である、請求項8記載の製造方法。
- NKT細胞がヒトNKT細胞である、請求項13記載の製造方法。
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