ES2675582T3

ES2675582T3 - Inmunoterapia utilizando células alo-NKT, células para inmunoterapia en las que la cadena alfa del gen del receptor de las células T (TCR) ha sido redistribuida a V alfa-J alfa uniforme, y banco de células NKT derivadas de dichas células

Info

Publication number: ES2675582T3
Application number: ES11844377.9T
Authority: ES
Inventors: Masaru Taniguchi; Haruhiko Koseki; Hiroshi Watarai; Shin-Ichiro Fujii
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2010-12-02
Filing date: 2011-12-02
Publication date: 2018-07-11
Anticipated expiration: 2031-12-02
Also published as: EP2647384A4; EP2647384B1; EP2647384A1; US20130295142A1; JP2016204386A; WO2012074116A1; JP6320473B2; JPWO2012074116A1; US10813950B2

Abstract

Células NKT para uso en la prevención y/o el tratamiento del cáncer, en donde las células NKT han sido obtenidas diferenciando in vitro células que tienen la región de la cadena α del gen del receptor antigénico de las células T redistribuido a Vα-Jα uniforme en una manera específica del receptor de células NKT, en donde las células NKT se administran a un sujeto alogénico que tiene al menos un genotipo de un locus diferente del de las células NKT en loci del gen de MHC, y en donde el receptor de células NKT es un receptor de células T que reconoce específicamente α- galactosilceramida presentada en CD1d.

Description

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DESCRIPCION

Inmunoterapia utilizando células alo-NKT, células para inmunoterapia en las que la cadena alfa del gen del receptor de las células T (TCR) ha sido redistribuida a Va-Ja uniforme, y banco de células NKT derivadas de dichas células

Campo de la técnica

La presente invención se refiere a inmunoterapia que utiliza células alo-NKT derivadas de células en las que la región de la cadena a (TCRa) del gen del receptor antigénico de las células T (TCR) se ha redistribuido a Va-Ja uniforme en una manera específica del receptor de células NKT, y a la formación de bancos de células para ella en donde la región de la cadena a del gen del receptor antigénico de las células T (TCR) se ha redistribuido a Va-Ja uniforme de una manera específica del receptor de la célula NKT y células NKT derivadas de dichas células.

Antecedentes de la técnica

En Japón, el número de muertes debidas al cáncer es de más de 340.000 personas al año, y el cáncer es la causa de muerte número 1 ("Estimación anual del informe de la encuesta de población", 2009, Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar). En cuanto al número de muertes por cáncer, el cáncer de pulmón es el más letal (48.610) en hombres y el segundo más elevado (18.239) en mujeres (encuesta del Centro Nacional del Cáncer, Centro de Control del Cáncer y Servicios de Información en 2008). Se considera que las células cancerosas ya se han diseminado por todo el cuerpo antes de una cirugía de cáncer de pulmón, como consecuencia de lo cual el 50% de los pacientes sufren recidiva después de la cirugía, aumentando así el número de muertes por cada sitio de cáncer.

En la actualidad, el "tratamiento médico avanzado del cáncer" que usa inmunocitos incluye una terapia de transferencia de auto-linfocitos en la que los linfocitos del paciente se activan ex vivo y se devuelven al cuerpo del paciente, una terapia de vacuna contra el péptido del cáncer y similares; sin embargo, los efectos son aún insuficientes. Cuando se espera un efecto antitumoral, es indispensable una acción coadyuvante. A diferencia de las patógenas, las células cancerosas no muestran un efecto coadyuvante por sí mismas y, por lo tanto, la inmunoterapia general no puede a veces proporcionar un efecto de tratamiento suficiente. Además, el tejido canceroso incluye "dos tipos de células cancerosas": "células cancerosas que expresan moléculas del MHC" y "células cancerosas que han perdido moléculas del MHC". A menos que estos "dos tipos de células cancerosas" sean erradicados simultáneamente, el cáncer no puede tratarse drásticamente. Además, se desea el desarrollo de un método de tratamiento capaz de dirigirse a cualquier tipo de cáncer y utilizable para cualquier tipo de cáncer.

Los autores de la presente invención han aclarado que un linfocito, célula T asesina natural (Natural Killer T cell: célula NKT), muestra una acción coadyuvante y tiene un efecto anticanceroso superior, y además desarrolló un nuevo método de tratamiento que ataca a las células cancerosas a través de la activación de las células NKT. Esto es, las células NKT ejercen una fuerte acción inmunopotenciadora mediante una acción coadyuvante, y reclutan otras células (células Nk, CTLs, etc.) en el sistema inmunitario para destruir las células cancerosas. Recientemente se ha aclarado que, en este caso, es efectiva una "terapia de inmunocitos coadyuvante", que incluye la administración de células dendríticas pulsadas con el glucolípido sintético a-galactosilceramida (a-GalCer), que activa las células NKT, a pacientes con cáncer.

Hasta ahora, los ensayos clínicos de fase I y fase II de la terapia coadyuvante de inmunocitos antes mencionada, se han completado para 17 casos de cáncer de pulmón avanzado o cáncer de pulmón recidivante. Como consecuencia de ello, la prolongación del tiempo de supervivencia durante un promedio de 19 meses se observó en todos los casos con solo un tratamiento inicial, por lo que se encontró una prolongación significativa del tiempo de supervivencia en comparación con el tratamiento con fármacos dirigidos a moléculas actualmente en uso (aproximadamente 10 meses como promedio). El valor de la mediana del tiempo de supervivencia de los pacientes que respondieron bien a este método de tratamiento (el 60% de todos los casos) fue de 31,9 meses, que no fue inferior a 3 veces el del tratamiento con fármaco de direccionamiento de moléculas. En otros casos, el tiempo de supervivencia promedio fue de 9,6 meses, que era equivalente al efecto del tratamiento de fármaco de direccionamiento de la molécula (documento no de patente 1).

Sin embargo, aproximadamente los 2/3 de los pacientes con cáncer de pulmón avanzado o cáncer de pulmón recurrente muestran una disminución del número de células NKT y no satisfacen los criterios de entrada de esta terapia. Por tanto, solo aproximadamente 1/3 de los pacientes pueden ser el objetivo de esta terapia.

Una vez que se ha desarrollado una técnica para aumentar in vitro las células NKT recogidas de los propios pacientes, es de esperar que la terapia coadyuvante con inmunocitos sea un método de tratamiento efectivo dirigido a una gama más amplia de pacientes. Sin embargo, las células NKT están presentes normalmente en una cantidad traza de no más del 0,1% de los linfocitos de la sangre periférica, y la propia función de las células NKT puede haber disminuido en pacientes con cáncer. Además, todavía no se ha establecido una técnica para expandir eficazmente las células NKT in vitro en un número suficiente para el tratamiento.

Siempre y cuando pueda obtenerse un clon de células NKT en grandes cantidades reprogramando las células NKT recogidas, y similares, expandiéndolos en una gran cantidad y luego permitiendo que se diferencien y maduren de nuevo, se espera que pueda mejorarse el efecto terapéutico de la inmunoterapia con células NKT.

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Los autores de la presente invención han tenido éxito en la producción de células NKT en gran cantidad diferenciando células ES trasplantadas con el núcleo de una célula NKT in vitro (documento de patente 1).

Además, los autores de la presente invención han introducido 4 factores de Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc en células NKT derivadas de bazo de ratón y han establecido con éxito células que tienen propiedades características de las células iPS, en donde la región de cadena a del gen del receptor antigénico de células T (TCR) se ha redistribuido a Va14-Ja18 (en lo sucesivo denominadas "células NKT-iPS"), y además ha diferenciado las células iPS en células NKT maduradas funcionalmente (denominadas en lo sucesivo "células iPS-NKT") por primera vez en el mundo (documento de patente 2, documento no de patente 2). Generalmente, las células diferenciadas finalmente son menos fáciles de reprogramar que las células no diferenciadas. En cuanto a las células B y las células T, se ha publicado que las células iPS no pueden ser inducidas con los cuatro factores o tres factores (Oct3/4, Sox2, Klf4) solamente, y requieren el uso de otro gen como factor de reprogramación nuclear (documento no de patente 3) e inhibición de p53 (documento no de patente 4). Por consiguiente, un establecimiento exitoso de células iPS a partir de células NKT usando solo 4 factores es un hallazgo inesperado. Dado que aumentar el número de genes introducidos e inhibir p53, que es un gen supresor de tumores, son problemáticos en términos de seguridad, ya que aumentan el riesgo de carcinogénesis de las células diferenciadas a partir de las células iPS y similares, el logro de los autores de la presente invención mejora las expectativas de la aplicabilidad de las células iPS en la terapia de inmunocitos.

Sin embargo, todavía hay una gran cantidad de problemas que deben resolverse antes de usar células diferenciadas derivadas de células iPS para una terapia de trasplante. Entre ellos, uno de los problemas más difíciles es garantizar la seguridad, como la eliminación del riesgo carcinogénico de las células o tejidos injertados. En vista de esto, está en marcha la mejora de un método que usa un vector de no integración tal como un plásmido, adenovirus, virus hemaglutinante de Japón y similares, y un método de reprogramación que usa la introducción de proteína y un compuesto de bajo peso molecular, el desarrollo de un método para la selección de células iPS de alta calidad, o la prevención de la contaminación de células no diferenciadas, y similares. Sin embargo, todos estos estudios están basados en la premisa principal de "terapia de trasplante = injerto".

Por otra parte, la enfermedad de injerto contra huésped (Graft Versus Host Disease: GVHD) se conoce como una de las complicaciones de la terapia de trasplante. Este es un término genérico para los síntomas causados por el órgano de un donante (proveedor de un órgano) que ataca al órgano o a los órganos del receptor mediante respuestas inmunitarias. La GVHD ocurre después de varios trasplantes de órganos alogénicos, y es particularmente sabido que ocurre especialmente después del trasplante de células madre hematopoyéticas (trasplante de médula ósea), incluyendo el trasplante directo de tejidos inmunes y después de una transfusión de sangre. La GVHD causada por un trasplante de sangre incluye las enfermedades agudas y crónicas. Se supone que el mecanismo de inicio de las primeras implica linfocitos y se supone que las últimas implica muchas más funciones inmunitarias.

La célula NKT se pone como un tipo de linfocito, y se clasifica como una subpoblación de células T ap definidas por las células que expresan la cadena a y la cadena p del receptor de células T, que se caracteriza por la expresión de la cadena a Va24-Ja18 y la cadena p Vp11 en seres humanos, y la cadena a Va14-Ja18y la cadena p Vp8/7/2 en ratones como receptor antigénico de células T, e incluyen células CD4-positivas y CD4-negativas (documento no de patente 5). Las publicaciones han documentado hasta ahora que las células NKT en el lado del receptor actúan supresivamente al iniciarse la GVHD (documentos no de patente 6 - 8). Aunque se ha publicado que las células alo- NKT derivadas de donantes actúan supresivamente dependiendo de las condiciones en un experimento de trasplante usando otros alo-linfocitos en combinación (documento no de patente 9), no hay ninguna publicación acerca de si la GVHD ocurre cuando son trasplantadas solo células alo-NKT. Según los estudios realizados por los autores de la presente invención, se ha dilucidado que las células alo-NKT normalmente diferenciadas en el cuerpo, y las células alo-NKT diferenciadas de las células madre pluripotentes in vitro, son diferentes en su expresión génica (documento no de patente 2), y no hay ninguna publicación relativa a la relación entre las células NKT diferenciadas de dicha célula madre pluripotente y la GVHD.

[Lista de documentos]

[documentos de patente]

documento de patente 1: WO2008/038579 (publicado el 3 de abril, 2008) documento de patente 2: WO2010/027094 (publicado el 11 de marzo, 2010)

[documentos de no patente]

documento de no patente 1: Motohashi S. et al., J. Immunol., 2009; 182: 2492 - 2501

documento de no patente 2: Watarai, H. et al., J. Clin. Invest., 2010 Jun. 1; 120(7): 2610 - 2618

documento de no patente 3: Hanna, J. et al., Cell, 2008 Apr. 18; 133(2): 250-264. Erratum en: Cell. 2008 Jul. 25; 134(2): 365

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documento de no patente 4: Hong, H. et al., Nature, 2009 Ag. 27; 460(7259): 1085 - 1086

documento de no patente 5: Taniguchi M et al., Int. Immunol., 2010; 22: 1 - 6

documento de no patente 6: Hashimoto, D. et al., The Journal of Immunology, 2005; 174; 551 - 556

documento de no patente 7: Haraguchi, K. et al., The Journal of Immunology, 2005; 175; 1320 - 1328

documento de no patente 8: Pillai, A. B. et al., The Journal of Immunology, 2007; 178; 6242 - 6251 documento de no patente 9: Leveson-Gower, D. B. et al., Blood, 2011 117: 3220 - 3229.

Sumario de la invención Problemas a resolver por la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar bancos de células derivadas de células NKT humanas, en donde la región de la cadena a del gen del receptor antigénico de las células T (TCR) se redistribuye a Va-Ja uniforme en una forma específica del receptor de la célula NKT y células NKT derivadas de las células, la célula NKT derivada de célula, y un método de tratamiento de trasplante que utiliza la misma, que utilizan las características de una terapia de inmunocitos y están bajo una concepción completamente nueva.

Medios de resolver los problemas

En un intento de resolver los problemas mencionados anteriormente, los autores de la presente invención hicieron una nueva estrategia de tratamiento para usar inmunocitos de una forma similar a los medicamentos generales. Dado que los productos farmacéuticos generales son sustancias extrañas para el organismo, influyen negativamente en el cuerpo cuando permanecen en el mismo durante demasiado tiempo. Por tanto, es deseable excretarlos del cuerpo o catabolizarlos metabólicamente con rapidez después del esfuerzo de un efecto de tratamiento deseado. También en el caso de la terapia de inmunocitos, una vez que las células trasplantadas han complementado y/o activado los inmunocitos y se ha conseguido el efecto atacando las células diana de la enfermedad, las células trasplantadas no necesitan ser injertadas completamente para permanecer en el cuerpo del paciente, a diferencia de otras terapias de trasplante, como el trasplante de órganos. En pacientes de cáncer en fase tardía, dado que la recuperación de un número necesario de los propios linfocitos de los pacientes no es fácil, el uso de células alogénicas es más realista. Sin embargo, basándose en el concepto preconcebido, el trasplante de un donante que muestra sustancialmente el mismo tipo de antígeno de histocompatibilidad principal (MHC) es la acción esperada para asegurar el injerto completo. En otras palabras, dado que las células alo-trasplantadas son rechazadas por el sistema inmunitario del paciente, es una práctica común trasplantar las células derivadas de un donante que tiene el mismo tipo de MHC con el paciente, asegurando así el injerto a largo plazo.

Los autores de la presente invención han tomado nota del hecho de que el trasplante de células alo-NKT que tienen un tipo de MHC distinto al del receptor, provoca el rechazo de las células transferidas por inmunorreacción contra células alo, por lo que se pueden evitar los efectos secundarios potencialmente causados por la retención a largo plazo de las células transferidas. Para ser precisos, dado que después de un determinado período de tiempo las células NKT transferidas son excluidas del cuerpo por una inmunorreacción contra células alo en el sistema inmunitario del hospedador, no permanecen en el cuerpo del hospedador durante mucho tiempo y se espera que exhiban el efecto de un medicamento temporal.

Por otra parte, cuando se trasplantan células allo-NKT, si se presenta o no la GVHD es muy importante para la seguridad de las células. Como se ha expuesto anteriormente, hasta ahora no se ha publicado nada sobre la presencia o la ausencia de la aparición de la GVHD cuando solo se trasplantan las células allo-NKT diferenciadas de las células madre pluripotentes in vitro, sin mencionar la presencia o ausencia del comienzo de la GVHD cuando se trasplantan solo las células alo-NKT normalmente diferenciadas en el cuerpo. Por consiguiente, se debe comprobar la seguridad de una terapia de trasplante que usa solo las células alo-NKT diferenciadas de las células que tienen una región de cadena a uniforme del gen del receptor antigénico de las células T (TCR).

Para comprobar la hipótesis anteriormente mencionada, los autores de la presente invención aplicaron una técnica establecida por ellos mismos para establecer células iPS a partir de células NKT que se sometieron a una redistribución del gen del receptor, e inducir la diferenciación de la célula iPS en células NKT maduras, y las células NKT recogidas de un individuo que tiene un tipo de MHC diferente del receptor, establecieron células iPS a partir de las mismas, y además diferenciaron las células en células NKT maduras. Las células iPS-NKT obtenidas se trasplantaron al receptor, se estimularon con a-GalCer y se examinó un efecto coadyuvante y un efecto antitumoral de las células transferidas. Como resultado, se observó un intenso efecto coadyuvante y un efecto supresor del crecimiento tumoral. Además, las células NKT derivadas de iPS trasplantadas permanecieron en el cuerpo del receptor durante un período suficiente para mostrar un notable efecto del tratamiento, y a continuación fueron rechazadas y excluidas por el sistema inmunitario del receptor. Además, para verificar la presencia o ausencia del inicio de GVHd cuando solo se trasplantan las células alo-NKT diferenciadas de las células que tienen una región de cadena a uniforme del gen del receptor antigénico de las células T (TCR), las células NKT rediferenciadas de las

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células iPS establecidas in vitro a partir de células NKT con fondo de C57BL/6 se trasplantaron a un receptor libre de células del sistema inmunitario (ratón RAG KO, fondo genético de BALB/c). Como resultado, la GVHD se desarrolló con células T colaboradoras alo CD4-positivas con fondo de C57BL/6 aisladas del bazo utilizado como grupo diana, pero la GVHD no se desarrolló con células alo-NKT preparadas por rediferenciación a partir de células iPS establecidas a partir de células NKT. De acuerdo con este método, el donante puede obtenerse fácilmente ya que el MHC no necesita ser coincidente entre el donante y el receptor, y además también puede ser resuelto el problema de seguridad de las células NKT derivadas de las células iPS. Además, el método es seguro ya que la GVHD no se desarrolla junto con el trasplante. La presente invención ha sido completada basándose en los hallazgos mencionados anteriormente.

En consecuencia, la presente invención se refiere a lo siguiente.

[1] Células NKT para su uso en profilaxis y/o el tratamiento del cáncer,

en donde las células NKT han sido obtenidas diferenciando in vitro células que tienen la región de la cadena a del gen del receptor antigénico de las células T redistribuida en Va - Ja de una manera específica del receptor de la célula NKT,

en donde las células NKT son administradas a un sujeto alogénico que tiene al menos un genotipo de un locus diferente del de las células NKT en loci del gen de MHC, y

en donde el receptor de la célula NKT es un receptor de las células T que reconoce específicamente la a- galactosilceramida presentada en CD1d.

[2] Las células NKT para uso según [1], en donde dichas células que tienen la región de cadena a del gen del receptor antigénico de las células T redistribuido en Va - Ja uniforme de una manera específica del receptor de la célula NKT, son células madre pluripotentes.

[3] Las células NKT para su uso según [2], en donde las células madre pluripotentes son (i) células ES o (ii) células iPS.

[4] Las células NKT para su uso según [3], en donde las células madre pluripotentes son (i) células ES humanas o (ii) células iPS humanas.

[5] Las células NKT para su uso según [4], en donde el sujeto alogénico tiene al menos un genotipo de locus diferente del de las células ES humanas en loci del gen de HLA.

[6] Las células NKT para su uso según [2] a [4], en donde las células madre plutipotentes se derivan de una célula NKT.

[7] Las células NKT para su uso según [6], en donde la célula NKT es una célula NKT humana.

[8] Las células NKT para su uso según [7], en donde un sujeto alogénico tiene al menos un genotipo de un locus diferente del de la célula NKT humana en loci del gen de HLA.

[9] Las células NKT para su uso según [5] a [8], en donde los loci del gen de HLA incluyen HLA-A, HLA-B y HLA-C.

[10] Las células NKT para su uso según [1] a [9], que son administradas en combinación con un ligando del receptor de la célula NKT, o células dendríticas pulsadas con el ligando del receptor de la célula NKT.

[11] Las células NKT para su uso según [10], en donde el ligando del receptor de la célula NKT es a- galactosilceramida.

[12] Células NKT humanas para su uso en la profilaxis y/o el tratamiento del cáncer, en donde una cantidad efectiva de las células NKT humanas es administrada a un paciente en necesidad de la administración de células NKT humanas, en donde las células NKT

(1) son proporcionadas por un banco de células derivadas de la célula NKT humana en donde la región de la cadena a del gen del receptor de la célula T ha sido redistribuída a Va-Ja uniforme de una manera específica del receptor de la célula NKT, o células NKT obtenidas diferenciando dichas células in vitro, y derivadas de células que tienen la región de la cadena a de un gen del receptor de la célula T redistribuida a Va-Ja uniforme de una manera específica del receptor de la célula NKT, que han sido establecidas a partir de un célula NKT humana en donde al menos uno de los loci del gen HLA tiene un genotipo diferente del genotipo del paciente, o

(2) son células NKT maduradas inducidas a diferenciación a partir de células provistas de dicho banco, en donde las células provistas tienen la región de la cadena a de un gen del receptor de la célula T redistribuida a Va-Ja uniforme de una manera específica del receptor de la célula NKT y han sido establecidas a partir de una célula NKT humana en donde al menos uno de los loci del gen HLA tiene un genotipo diferente del genotipo del paciente, y

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en donde el receptor de la célula NKT es un receptor de la célula T que reconoce específicamente la a- galactosilceramida presentada en CD1d.

[13] Las células NKT humanas para su uso según [12], que son administradas en combinación con una cantidad efectiva de un ligando del receptor de la célula NKT, o células dendríticas pulsadas con el ligando del receptor de la célula NKT, al paciente anteriormente mencionado.

[14] Las células T humanas para su uso según [13], en donde el ligando del receptor de la célula NKT es una a- galactosilceramida.

Efecto de la invención.

La presente invención se basa en la idea completamente nueva de utilizar células trasplantadas de manera similar a la de los medicamentos generales, en donde las células desaparecen después de ejercer su eficacia en el cuerpo durante un período apropiado. Se utiliza la propiedad de que las células transferidas son excluidas por el sistema inmunitario del hospedador cuando HLA es diferente entre un donante y el receptor. Por ejemplo, las células iPS se establecen a partir de células NKT humanas (donantes) en donde los loci del gen A, B y C son completamente dispares, mantenidos y expandidos, las células iPS son inducidas a diferenciarse en células NKT cuando se usan, y las células NKT obtenidas son trasplantadas al paciente (receptor). Dado que las células NKT trasplantadas tienen haplotipos A, B y C diferentes de los del receptor, las células NKT no son injertadas sino excluidas por el sistema inmunitario del huésped, durante el cual se espera que las células NKT puedan ejercer un efecto coadyuvante suficiente.

De acuerdo con la presente invención, el tratamiento puede realizarse también para pacientes con cáncer avanzado o cáncer recidivante que convencionalmente no podrían satisfacer los criterios de entrada de la terapia coadyuvante de inmunocitos debido al reducido número de células NKT.

Dado que las células NKT son rechazadas mediante una inmunorreacción contra células alo, incluso cuando se transfieren a un individuo alo normal, puede realizarse de manera segura una terapia con inmunocitos.

Dado que las células NKT diferenciadas de células en las que la región de la cadena a de un receptor de antígeno de las células T (TCR) el gen se ha redistribuido a Va-Ja uniforme de una manera específica del receptor de células NKT no causa GVHD cuando se transfecta en un individuo alo, pueden evitarse los efectos secundarios causados por GVHD.

Las células NKT son inducidas selectivamente a partir de células en las que la región de la cadena a de TCR en el cromosoma ha sido redistribuida uniformemente de una manera específica de las células NKT. Por tanto, cuando células NKT inducidas a partir de dichas células se usan para la terapia de inmunocitos de la presente invención, se puede evitar la posibilidad de contaminación con alo-células T convencionales, y se puede eliminar el riesgo de desarrollar una reacción de GVH severa.

En la terapia de inmunocitos de la presente invención, dado que no es necesaria la coincidencia del HLA del donante y el del receptor, es fácil obtener un donante. Por tanto, las células NKT pueden ser suministradas de manera estable por células de banco, tales como las células iPS, en donde la región de la cadena a (TCRa) del gen del receptor de antígeno de las células T (TCR) se ha redistribuido para uniformar Va-Ja de una manera específica de las células NKT inducidas a partir de células NKT proporcionadas por un donante, y similares, o células NKT derivadas de dichas células. Dado que puede esperarse el mismo efecto a partir de cualquier tipo de células HLA derivadas de una célula NKT humana en la que la región de la cadena a (TCRa) de un gen del receptor de células T (TCR) se ha redistribuido a Va-Ja uniforme, y las células NKT derivadas a partir de dichas células, es posible preparar inmediatamente células alo-NKT efectivas para pacientes de cualquier tipo de HLA y usar las células para el tratamiento.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un diagrama esquemático de los loci del gen TCRa de células de tipo silvestre y NKT.

La Fig. 2 es un dibujo que muestra la redistribución de Va-Ja en células NKT-iPS.

La Fig. 3 es un dibujo que muestra la expresión de genes específicos de células ES en células NKT-iPS.

La Fig. 4 es un dibujo que muestra las correlaciones de perfiles de expresión génica entre células NKT-iPS y células NKT-ES o células ES, y entre células NKT-iPS y células NKT esplénicas de tipo silvestre.

La Fig. 5 es un dibujo que muestra la similitud de células NKT-iPS con células iPS derivadas de MEF o células ES, en morfología y en la expresión de los genes SSEA1 y Oct3/4.

La Fig. 6 es un dibujo que muestra la expresión de TCRa/p en células derivadas de cada uno de los ratones C57BL/6 y Balb/C en esplenocitos de un ratón quimérico NKT-iPS generado a partir de un clon 2a de células NKT- iPS derivadas del ratón C57BL/6 y células derivadas del ratón Balb/C.

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La Fig. 7 es un dibujo que muestra la inducción de la diferenciación in vitro de células DP-NKT a partir de células NKT-iPS.

La Fig. 8 es un dibujo que muestra los resultados de un análisis del fenotipo de células DP-NKT.

La Fig. 9 es un dibujo que muestra la inducción de la diferenciación in vitro de células NKT que exhiben el mismo fenotipo que las células NKT periféricas, a partir de células NKT-iPS.

La Fig. 10 es un dibujo que muestra la expansión en masa de células NKT a partir de células DP-NKT usando diversas combinaciones de citocinas.

La Fig. 11 es un dibujo que muestra la expresión de TCRa invariante, la expresión de CD4/CD8 y la expresión de NK1.1 en células obtenidas cultivando conjuntamente células DP-NKT con células estromales que (A) no expresan / (B) expresan un ligando de Notch usando varias combinaciones de citocinas.

La Fig. 12 es un dibujo que muestra la capacidad de respuesta de a-GalCer de las células NKT inducidas por diferenciación a partir de células NKT-iPS.

La Fig. 13 es un dibujo que muestra el efecto coadyuvante in vivo de las células NKT inducidas por diferenciación a partir de células NKT-iPS.

La Fig. 14 es un dibujo que muestra el establecimiento de células iPS de esplenocitos de ratón silvestre C57BL/6.

La Fig. 15 es un dibujo que muestra la generación de un ratón clon NKT con fondo de C57BL/6.

La Fig. 16 es un dibujo que muestra la secuencia de bases de la región del receptor de células T de un ratón clon NKT con fondo C57BL/6.

La Fig. 17 es un dibujo que muestra un análisis de redistribución génica de los clones 7a y 7g de células NKT-iPS.

La Fig. 18 es un dibujo que muestra un análisis de la expresión génica de los clones de células NKT-iPS 7a y 7g.

La Fig. 19 es un dibujo que muestra un análisis de microarrays de ADN y un análisis de correlación de los clones 7a

y 7g de células NKT-iPS.

La Fig. 20 es un dibujo que muestra la morfología y la expresión de marcadores de células ES en clones 7a y 7g de células NKT-iPS.

La Fig. 21 es un dibujo que muestra un análisis de metilación de ADN de clones 7a y 7g de células NKT-iPS.

La Fig. 22 es un dibujo que muestra la transmisión de clones 7a y 7g de células NKT-iPS a la progenie.

La Fig. 23 es un dibujo que muestra un método de inducción in vitro de la diferenciación de células NKT a partir de los clones 7a y 7g de células NKT-iPS.

La Fig. 24 es un dibujo que muestra la expresión de marcadores de superficie celular en células de diferenciación inducida a partir de clones 7a y 7g de células NKT-iPS in vitro.

La Fig. 25 es un dibujo que muestra un análisis de correlación de la expresión génica completa de las células 7a dif. y 7g dif. de diferenciación inducida in vitro.

La Fig. 26 es un dibujo que muestra un análisis funcional in vitro de células 7a dif. y 7g dif. de diferenciación inducida in vitro.

La Fig. 27 es un dibujo que confirma la presencia de células transferidas a 1 semana (1w) y 2 semanas (2w) después de la transferencia de las células 7a dif. y 7g dif. de diferenciación inducida in vitro en un ratón deficitario en células NKT.

La Fig. 28 es un dibujo que muestra el protocolo de una evaluación in vivo de células 7a dif. y 7g dif. de diferenciación inducida in vitro.

La Fig. 29 es un dibujo que muestra la inducción de células T CD8-positivas específicas del antígeno por las células 7a dif. y 7g dif. de diferenciación inducida in vitro.

La Fig. 30 es un dibujo que muestra el rechazo de un tumor maligno por células 7a dif. y 7g dif. de diferenciación inducida in vitro.

La Fig. 31 es un dibujo que muestra un método para establecer eficientemente células iPS a partir de células NKT de tipo silvestre.

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La Fig. 32 es un dibujo que muestra las propiedades del clon 14k de células NKT-iPS.

La Fig. 33 es un dibujo que muestra una evaluación funcional in vitro de células inducidas por diferenciación a partir

del clon 14k de NKT-iPS.

La Fig. 34 es un dibujo que muestra la expansión en masa de células NKT a partir de células DP-NKT usando varias combinaciones de citocinas.

La Fig. 35 es un dibujo que muestra la expresión de TCRa, TCRp, CD3e y NK1.1 invariantes en células obtenidas cultivando conjuntamente células DP-NKT con células estromales que expresan un ligando de Notch con varias combinaciones de citocinas.

La Fig. 36 es un dibujo que muestra la capacidad de respuesta de a-GalCer de las células NKT inducidas por diferenciación a partir de células NKT-iPS.

La Fig. 37 es un dibujo que muestra que las células alo-NKT inducidas a partir de células iPS no inducen la GVHD.

La Fig. 38 es un dibujo que muestra que las células allo-NKT de un ratón clon NKT no inducen la GVHD.

La Fig. 39 es un dibujo que muestra un efecto coadyuvante de células semi-alo-NKT sobre células T CD8.

La Fig. 40 es un dibujo que muestra un efecto coadyuvante de células semi-alo-NKT sobre una acción antitumoral específica del antígeno.

Descripción de las formas de realización

El agente para una terapia de inmunocitos de la presente invención contiene como ingrediente activo células NKT obtenidas diferenciando in vitro células (excluyendo las células NKT) que tienen capacidad de autorrenovación y capacidad para diferenciarse en células NKT, y que tienen la región de la cadena a (TCRa) del gen TCR redistribuido a Va-Ja uniforme de una manera específica del receptor de la célula NKT. Aunque tales células no están particularmente limitadas siempre y cuando la región de la cadena a (TCRa) del gen de tCr se redistribuya a Va-Ja uniforme de una manera específica del receptor de células NKT, los ejemplos de las mismas incluyen células iPS establecidas a partir de una célula NKT en la que se ha completado la redistribución (es decir, células en las que la región de la cadena a (TCRa) de un gen TCR ha sido redistribuida a Va-Ja uniforme en un receptor específico de células NKT, que posee propiedades características de células iPS tales como la propiedad de autorrenovación y pluripotencia, un patrón de expresión génica similar a células ES y similares (células NKT-iPS)), células madre pluripotentes en las que la región de la cadena a (TCRa) de un gen TCR ha sido redistribuida a Va-Ja uniforme en una manera específica del receptor de células NKT o en el que se ha insertado Va-Ja uniforme de un modo específico del receptor de células NKT en una región particular en el genoma para permitir la expresión del mismo, insertando un gen en células madre pluripotentes para permitir la expresión de la cadena a y de la cadena p de un gen TCR específico de células NKT, células madre pluripotentes establecidas a partir de un embrión transferido nuclearmente de células NKT, células establecidas a partir de una célula NKT en donde la redistribución ha sido completada y que tienen al menos capacidad de rediferenciación en células NKT (por ejemplo, células madre hematopoyéticas ) y similares.

En la presente memoria, la "célula madre pluripotente" significa una célula madre que puede cultivarse in vitro y que tiene una capacidad para diferenciarse en cualquier célula que constituya el cuerpo (tejidos derivados de tres capas germinales (ectodermo, mesodermo, endodermo)) excepto la placenta (pluripotencia). La célula madre pluripotente incluye células iPS, células madre embrionarias (célula ES), células germinales embrionarias (células EG) y similares.

En la presente invención, se usan generalmente células de mamíferos. Los ejemplos de mamíferos incluyen animales de experimentación tales como roedores (por ejemplo, ratón, rata, hámster, conejo de Indias y similares), conejo y similares, animales domésticos tales como ganado porcino, bovino, caprino, equino, ovino y similares, animales de compañía tal como perros, gatos y similares, y primates tales como seres humanos, monos, orangutanes, chimpancés y similares. Los mamíferos son preferiblemente roedores (ratón, etc.) o primates (seres humanos, etc.), más preferiblemente ratones o seres humanos.

Como se usa en el presente texto, "una célula iPS" se refiere a una célula que ha adquirido pluripotencia y competencia de autorrenovación conferida artificialmente poniendo en contacto factores de reprogramación nuclear con una célula somática, y que es similar a las células ES en términos del perfil de expresión génica. Aquí, "pluripotencia" significa la capacidad de diferenciarse en una diversidad de series de células inmunohepatopoyéticas tales como células NKT, células T, células B, eritrocitos, macrófagos y células progenitoras de las mismas, así como en una o más series de células distintas del sistema inmunitario-hematopoyético, y se distingue de la multipotencia en células madre hematopoyéticas y células progenitoras multipotentes. La expresión "competencia de autorrenovación" significa la capacidad de una célula para continuar expandiéndose en un entorno particular (p. ej., condiciones adecuadas para cultivar células ES) reteniendo al mismo tiempo la "pluripotencia" descrita anteriormente. Además, "similares a células ES en términos del perfil de expresión génica" significa que el

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coeficiente de correlación (r) entre el conjunto de datos de expresión génica en las células sujeto y el conjunto de datos de expresión génica en células ES es 0,9 o más. Las células ES para la comparación incluyen células ES generadas a partir de un huevo fertilizado derivado de la misma especie, preferiblemente a partir de la misma cepa, células ES generadas a partir de un embrión transferido nuclear de una célula NKT, y similares.

Las células NKT-iPS de la presente invención pueden ser células que tienen la región de la cadena a del gen de TCR (TCRa) redistribuida para Va-Ja uniforme en una manera específica del receptor de células NKT, y que posee propiedades características de células iPS, tales como competencia de autorrenovación, pluripotencia y un patrón de expresión génica similar a las células ES. La expresión "una manera específica del receptor de células NKT" se describirá a continuación.

La célula NKT-iPS de la presente invención puede establecerse poniendo en contacto células somáticas que tienen la región de la cadena a del gen TCR (TCRa) redistribuida a Va-Ja uniforme en una manera específica del receptor de las células NKT, tal como células NKT, con factores de reprogramación nucleares. Aquí, la "célula NKT" no está particularmente limitada, en cuanto a que cualquiera de las regiones TCRa se redistribuye a Va-Ja uniforme, y se utiliza con un significado que abarca no solo células NKT maduras (caracterizadas, por ejemplo, por NK1.1+/CD3e+), sino también sus células progenitoras (células caracterizadas, por ejemplo, por CD4+/CD8+ y similares). Las células NKT se pueden aislar del bazo, ganglios linfáticos, sangre periférica, sangre de cordón umbilical y similares, por un método conocido per se, por ejemplo, citometría de flujo usando un anticuerpo contra los marcadores de superficie celular descritos anteriormente o multímero CD1d (dímero, tetrámero). etc.) pulsado con a-galactosilceramida y un clasificador de células. En el caso de los ratones, es preferible recolectar células NKT del bazo o de los ganglios linfáticos, en donde la relación de abundancia de células NKT es alta; sin embargo, en el caso de seres humanos, es deseable, desde el punto de vista de la baja invasividad y de la facilidad de preparación, que las células NKT se preparen a partir de sangre periférica, sangre del cordón umbilical y similares.

La célula NKT utilizada para la producción de una célula NKT-iPS en la presente invención puede derivarse de cualquier especie animal que permita el establecimiento de células NKT-iPS poniendo en contacto factores de reprogramación nuclear con la célula NKT; específicamente, pueden mencionarse las de derivación humana o de ratón, y se prefieren las células NKT derivadas de seres humanos. Un ser humano o un ratón, que es una fuente de recolección de células NKT, es un individuo alogénico en el que al menos uno de los principales loci génicos en MHC tiene un genotipo diferente del de una diana de terapia de inmunocitos, preferiblemente un individuo alogénico en el que todos los loci tienen genotipos diferentes de los de la diana. Así pues, dado que al menos uno de los locus del gen MHC no coincide en el genotipo entre los dos, las células NKT administradas son reconocidas por el sistema inmunitario del receptor, y finalmente excluidas. Como loci del gen MHC en el caso del trasplante de órganos humanos en general, la coincidencia o la no coincidencia de 3 loci génicos de HLA-A, HLA-B y HLA-C es el criterio de la compatibilidad. En consecuencia, un individuo en el que al menos un locus de estos 3 loci génicos es diferente del receptor, se selecciona generalmente como donante. En el ratón, de forma similar, los loci del gen H-2K, H-2D y H-2L en la región de clase I se pueden mencionar como los principales loci génicos en la presente invención.

En una forma de realización, se usan las células NKT derivadas de un individuo que tiene un genotipo diferente de al menos 1 locus (preferiblemente 2 loci, más preferiblemente 3 loci), entre los 3 loci genéticos mencionados antes, del individuo diana de la terapia con inmunocitos. En esta realización, dado que las células NKT administradas se excluyen mediante una inmunorreacción contra células alo del receptor debido a la falta de coincidencia del locus del gen MHC, se espera la exclusión de las células después del esfuerzo efectivo de acciones tales como el efecto coadyuvante. En particular, para excluir las células NKT transferidas por el receptor alo, se usan preferiblemente las células NKT derivadas de un individuo que tiene genotipos de los loci génicos mencionados anteriormente diferentes de los del individuo diana de la terapia de inmunocitos.

Las células NKT preparadas a partir de la sangre periférica, sangre del cordón umbilical, bazo, ganglios linfáticos y similares, mediante el método descrito anteriormente, pueden ponerse en contacto inmediatamente con factores de redistribución nuclear para inducir células NKT-iPS, o también pueden conservarse bajo congelación mediante un método convencional, descongelarse justo antes del uso, y cultivarlas, y después ponerlas en contacto con factores de reprogramación nuclear para inducir células NKT-iPS.

Las células NKT son presumiblemente células inmunocompetentes funcionalmente uniformes caracterizadas por la redistribución de cualquiera de las regiones TCRa a Va-Ja uniforme (Va24-Ja18 en humanos, Va14-Jal8 en ratones). En la célula NKT-iPS de la presente invención, se conserva la redistribución a NKT-TCR.

Teóricamente, las células NKT-iPS de la presente invención se pueden establecer poniendo en contacto células somáticas con factores de reprogramación nuclear, incluso si la célula somática es distinta de una célula NKT, seleccionando células derivadas de células iPS obtenidas a partir de dichas células somáticas, en donde la región de la cadena a del gen del receptor de la célula T se reordena a Va-Ja uniforme de una manera específica del receptor de la célula NKT. Sin embargo, dado que la frecuencia de emergencia del receptor específico de la célula NKT (Va24-Ja18) obtenido por redistribución génica es aproximadamente 1/106, la inducción directa de una célula iPS a partir de una célula NKT es el método para una producción eficiente de una célula NKT-iPS. Aquí, el receptor de la célula NKT es un receptor de células T que se expresa específicamente en células NKT, y que reconoce específicamente la a-galactosilceramida (a-GalCer) presentada en CD1d. La cadena a del receptor de la célula NKT

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se redistribuye normalmente a Va24-Ja18 en seres humanos, y a Va14-Ja18 en ratones. Por consiguiente, la redistribución en una manera específica del receptor de la célula NKT significa redistribución génica en la región de la cadena a tal que la combinación V-J en la región de cadena a del receptor de células T es Va24-Ja18 en seres humanos y Va14-Ja18 en ratones, y que el TCRa obtenido es capaz de constituir el receptor de la célula NKT. Tal célula somática puede prepararse por un método conocido per se. Por ejemplo, tal célula somática puede ser una célula somática recolectada de un animal clon de células nKt preparado trasplantando el núcleo de células NKT a una célula enucleada (por ejemplo, un ovocito) y sometiendo la célula a una operación específica. La generación de un animal clon se describe, por ejemplo, en el documento WO2006/018998 y similares. En el caso de seres humanos, no puede producirse un ser humano clonado. Sin embargo, es teóricamente posible producir un embrión de clon humano mediante trasplante de núcleo de células NKT e inducir la diferenciación en cualquier célula somática in vitro.

En la presente invención, "un factor de reprogramación nuclear" puede estar compuesto de cualquier sustancia tal como un factor o factores proteínicos o un ácido nucleico que codifica el mismo (incluyendo formas incorporadas en un vector) o un compuesto de peso molecular bajo, siempre y cuando sea una sustancia (un grupo de sustancias) capaz de inducir células que poseen pluripotencia y competencia de autorrenovación a partir de una célula somática tal como una célula NKT. Cuando el factor de reprogramación nuclear es un factor proteínico o un ácido nucleico que codifica el mismo, las combinaciones que siguen, por ejemplo, son preferibles (en lo sucesivo, solo se muestran los nombres de los factores proteínicos).

(1) Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc (Sox2 es reemplazable por Sox1, Sox3, Sox15, Sox17 o Sox18; Klf4 es reemplazable por Klf1, Klf2 o Klf5; c-Myc es reemplazable por T58A (mutante activo), N-Myc o L-Myc)

(2) Oct3/4, Klf4, Sox2

(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc

(4) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28

(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28

(6) Oct3/4, Klf4, Sox2, bFGF

(7) Oct3/4, Klf4, Sox2, SCF

(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, bFGF

(9) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SCF.

Dado que las células iPS-NKT obtenidas por inducción de rediferenciación de las células NKT-iPS se usan para una terapia de inmunocitos en la presente invención, es más preferible entre las combinaciones anteriores una combinación de 3 factores de Oct3/4, Sox2 y Klf4. Sin embargo, la presente invención tiende también a la desaparición de las células NKT transferidas a partir del cuerpo del hospedador después de un período de tiempo dado, sin permitir el injerto de las células. Por consiguiente, siempre y cuando las células NKT no ejerzan una influencia adversa tal como una tumorigénesis y similares en el hospedador durante el período en que las células permanecen en el cuerpo, se pueden también utilizar otros factores de reprogramación (p. ej., C-Myc) que pueden ser un factor de riesgo en un trasplante de órganos normal. Por tanto, 4 factores de Oct3/4, Klf4, Sox2 y c-Myc o N- Myc, y 5 factores que incluyen Lin28 o Nanog en los mismos, son también preferibles como factores de reprogramación nuclear.

En la presente invención, las células NKT-iPS puede adquirirse solamente con los factores de reprogramación nuclear descritos anteriormente en uso común para la reprogramación de fibroblastos y similares, convencionalmente, obviando así el uso de otros factores como se publica en el caso de las células T y las células B. Esto hace posible reducir la tumorigénesis potencial en las células y tejidos inducidos por diferenciación a partir de una célula NKT-iPS.

La información acerca de las secuencias de ADNc de ratón y humano de los factores proteicos mencionados anteriormente está disponible con referencia a los números de acceso de NCBI mencionados en el documento WO 2007/069666 (en la publicación, Nanog se describe como ECAT4; la información de secuencia de cDNA de ratón y humano en Lin28 puede adquirirse consultando los números de acceso NCBI NM_145833 y NM_024674, y la información de secuencia de cDNA de ratón y humano en L-Myc se puede adquirir consultando los números de acceso de NCBI NM_008506 y NM_001033081, respectivamente). Los expertos en la técnica pueden aislar fácilmente estos ADNc. Se puede preparar un factor proteico para usar como factor de reprogramación nuclear insertando el ADNc obtenido en un vector de expresión apropiado, transfiriendo el vector a una célula hospedadora, cultivando la célula y recuperando del cultivo obtenido el factor proteínico recombinante. Por otra parte, cuando el factor de reprogramación nuclear utilizado es un ácido nucleico que codifica un factor proteínico, el ADNc obtenido se inserta en un vector vírico, episomal o plasmídico, o similar, para construir un vector de expresión, y el vector se somete a la etapa de reprogramación de un factor nuclear.

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El contacto de un factor de reprogramación nuclear con una célula somática tal como una célula NKT se puede lograr usando un método conocido per se para la transferencia de proteínas a las células cuando la sustancia es un factor proteínico. Tales métodos incluyen, por ejemplo, el método que usa un reactivo de transferencia de proteína, el método que usa un dominio de transferencia de proteína (PTD) o una proteína de fusión de péptido de penetración celular (CPP), el método de microinyección y similares.

Los reactivos de transferencia de proteína son disponibles comercialmente, incluyendo los basados en un lípido catiónico tal como BioPOTER Protein Delivery Reagent (Gene Therapy Systems), Pro-Ject™ Protein Transfection Reagent (PIERCE) y ProVectin (IMGENEX); los basados en un lípido, como Profect-1 (Targeting Systems); los basados en un péptido permeable a la membrana, como Penetrain Peptide (Q biogene) y Chariot Kit (Active Motif), y similares. La transferencia se puede lograr de acuerdo con los protocolos adjuntos a estos reactivos, siendo un procedimiento común como se describe a continuación. Un factor de reprogramación nuclear se diluye en un disolvente apropiado (por ejemplo, una solución tampón tal como PBS o HEPES), se añade un reactivo de transferencia, se incuba la mezcla a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 a 15 minutos para formar un complejo, este complejo se añade a las células después de reemplazar el medio con un medio libre de suero, y se incuban las células a 37°C durante una a varias horas. A continuación, el medio se elimina y se reemplaza con un medio que contiene suero.

Los PTD desarrollados incluyen aquellos que usan dominios transcelulares de proteínas tales como AntP derivado de drosofila, TAT derivado de VIH y VP22 derivado de HSV. Se prepara un vector de expresión de proteína de fusión incorporando un ADNc de un factor de reprogramación nuclear y una secuencia de PTD para permitir la expresión recombinante de la proteína de fusión, y la proteína de fusión se recupera para su uso en la transferencia. Esta transferencia se puede lograr como se describió anteriormente, excepto que no se añade reactivo de transferencia de proteína.

Los ejemplos de CPP derivados de PTD incluyen poliarginina tal como 11R (Cell Stem Cell, 4: 381 - 384 (2009)), 9R (Cell Stem Cell, 4: 472 - 476 (2009)) y similares.

La microinyección, un método para poner una solución de proteína en una aguja de vidrio que tiene un diámetro de punta de aproximadamente 1 pm, e inyectar la solución en una célula, asegura la transferencia de la proteína a la célula.

Una operación de introducción de proteínas puede realizarse una o más veces opcionales (p. ej. no menos de una vez y no más de 10 veces, o no menos de una vez y no más de 5 veces, etc.), y la operación de introducción puede repetirse preferiblemente no menos de dos veces (p. ej., 3 o 4 veces). Un ejemplo de intervalo cuando se repite la operación de introducción es 6-48 h, preferiblemente 12-24 h.

Cuando la eficacia del establecimiento de la célula iPS es importante, el factor de reprogramación nuclear se usa preferiblemente no como una proteína sino en forma de un ácido nucleico que codifica la misma. El ácido nucleico puede ser un ADN o un ARN, o una quimera de ADN/ARN, y puede ser de doble cadena o monocatenario. Preferiblemente, el ácido nucleico es un ADN bicatenario, particularmente un ADNc.

Un ADNc de un factor de reprogramación nuclear se inserta en un vector de expresión apropiado que comprende un promotor capaz de funcionar en una célula somática del hospedador tal como una célula NKT. Los vectores de expresión útiles incluyen, por ejemplo, vectores virales tales como retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adenoasociado, virus del herpes y virus hemaglutinante de Japón, plásmidos para la expresión en células animales (p. ej., PA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo), y similares.

Un tipo de vector utilizado como apropiado puede elegirse de acuerdo con el uso previsto de las células NKT-iPS obtenidas. Por ejemplo, pueden usarse vectores de adenovirus, vectores de plásmidos, vectores de virus adenoasociados, vectores de retrovirus, vectores de lentivirus, vectores de virus hemaglutinante de Japón y similares.

Los ejemplos de promotores usados en vectores de expresión incluyen el promotor EF1a, el promotor CAG, el promotor SRa, el promotor SV40, el promotor LTR, el promotor CMV (citomegalovirus), el promotor RSV (virus del sarcoma de Rous), la LTR de MoMuLV (virus de la leucemia murina de Moloney), el promotor HSV-TK (timidina quinasa del virus herpes simplex) y similares, dándose la preferencia al promotor EF1a, promotor CAG, LTR de MoMuLV, el promotor CMV, el promotor SRa y similares.

El vector de expresión puede contener, como se desee, además de un promotor, un potenciador, una señal de adición de poliA, un gen marcador de selección, un origen de replicación de SV40 y similares. Los ejemplos de genes marcadores de selección útiles incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa y el gen de resistencia a la neomicina.

Un vector de expresión que alberga un ácido nucleico como factor de reprogramación nuclear puede transferirse a una célula mediante una técnica conocida per se según la elección del vector. En el caso de un vector viral, p. ej., se introduce un plásmido que contiene el ácido nucleico en una célula de empaquetamiento apropiada (p. ej. células Plat-E) o una línea celular complementaria (p. ej., células 293), se recupera el vector viral producido en el

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sobrenadante del cultivo, y el vector se infecta a la célula por un método adecuado para el vector viral. Por otra parte, un vector plasmídico puede transferirse a una célula usando el método de lipofección, el método del liposoma, el método de electroporación, el método de coprecipitación de fosfato de calcio, el método de DEAE dextrano, el método de microinyección, el método de la pistola de genes y similares.

Cuando el factor de reprogramación nuclear es un compuesto de bajo peso molecular, el contacto del compuesto con células somáticas tales como células NKT se puede conseguir disolviendo el compuesto a una concentración apropiada en un disolvente acuoso o no acuoso, añadiendo la solución del compuesto a un medio adecuado para el cultivo de células somáticas tales como células NKT aisladas de un ser humano o de un ratón (p. ej., un medio esencial mínimo (MEM), medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio RPMI1640, medio 199 y medio F12 que contiene citocinas tales como IL-2, ligandos IL-7, SCF y Flt3, y aproximadamente 5 a 20% de suero bovino fetal, y similares) para que la concentración del factor de reprogramación nuclear caiga en un intervalo que sea suficiente para causar la reprogramación nuclear en células somáticas tales como células NKT y no causar citotoxicidad, y cultivar las células durante un período dado. La concentración del factor de reprogramación nuclear varía dependiendo del tipo de factor de reprogramación nuclear utilizado, y se elige según lo apropiado en el intervalo de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 100 nM. La duración del contacto no está particularmente limitada, siempre y cuando sea suficiente para lograr la reprogramación nuclear de las células; normalmente, el factor de reprogramación nuclear puede estar co-presente en el medio hasta que emerge una colonia positiva.

Cuando se genera la célula NKT-iPS de la presente invención poniendo en contacto factores de reprogramación nuclear con una célula NKT, la célula NKT que se ha de contactar con los factores de reprogramación nuclear puede haberse estimulado con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28 en presencia de IL-2 e IL-12. La estimulación de la célula NKT puede conseguirse, por ejemplo, añadiendo IL-2 e IL-12 a un medio adecuado para cultivar células NKT como se describe anteriormente, y cultivando la célula NKT en un plato de cultivo con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28 unido a la superficie del mismo durante un tiempo dado. El anticuerpo anti-CD3 y el anticuerpo anti-CD28 pueden usarse en modo disuelto en el medio, siempre que sean capaces de estimular la célula NKT. La concentración de cada anticuerpo como se une a la placa es de 0,1 - 100 |jg/ml; la concentración de cada anticuerpo como se usa en modo disuelto en el medio es de 0,1-100 jg/ml. La concentración de cada uno de IL-2 e IL-12 añadidos se puede elegir según corresponda en el intervalo de, por ejemplo, 0,1 - 100 ng/ml. La duración del cultivo no está particularmente limitada, siempre que sea un tiempo suficiente para asegurar la proliferación de la célula NKT y la estimulación con el anticuerpo anti-CD3 y el anticuerpo anti-CD28; la duración es normalmente de 3 días a 1 mes, por ejemplo 1 semana. La célula NKT estimulada a través de esta etapa se pone en contacto con los factores de reprogramación nuclear.

En los últimos años, varias sustancias que mejoran la eficacia del establecimiento de células iPS, que tradicionalmente ha sido baja, han sido propuestas una tras otra. Cuando se ponen en contacto con células somáticas tales como las células NKT junto con los factores de reprogramación nuclear antes mencionados, se espera que estos mejoradores del rendimiento del establecimiento aumenten aún más la eficacia del establecimiento de las células NKT-iPS.

Los ejemplos de mejoradores de la eficacia del establecimiento de células iPS incluyen, pero sin limitarse a ellos, inhibidores de la histona desacetilasa (HDAC) [por ejemplo, inhibidores de bajo peso molecular tales como ácido valproico (VPA) (Nat. Biotechnol., 26 (7): 795 - 797 (2008)), tricostatina A, butirato sódico, MC 1293 y M344; agentes inhibidores de la expresión basados en ácido nucleico tales como siRNAs y shRNAs contra HDAc (por ejemplo, HDAC1 siRNA Smartpool0 (marca registrada) (Millipore), HuSH 29mero shRNA Constructs contra HDAC1 (OriGene) y similares); y similares], inhibidores de histona metiltransferasa G9a [por ejemplo, inhibidores de bajo peso molecular tales como BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525 - 528 (2008)]; inhibidores de expresión basados en ácido nucleico tales como siRNAs y shRNAs contra G9a (por ejemplo, G9a siRNA (humano) (Santa Cruz Biotechnology) y similares; y similares]. Los inhibidores de la expresión basados en ácido nucleico pueden estar en forma de vectores de expresión que albergan un ADN que codifica un ARNsi o ARNhc.

El contacto de un mejorador de la eficiencia del establecimiento de células iPS con células somáticas tales como células NKT se puede lograr como se describió anteriormente para cada uno de los tres casos: (a) el mejorador es un factor proteico, (b) el mejorador es un ácido nucleico que codifica el factor proteico, y (c) el mejorador es un compuesto de bajo peso molecular.

Un mejorador de la eficiencia del establecimiento de las células iPS puede ponerse en contacto con células somáticas tales como células NKT al mismo tiempo que con un factor de reprogramación nuclear, o cualquiera de ellas puede contactarse por adelantado, en la medida en que la eficiencia del establecimiento de las células NKT- iPS de las células somáticas como las células NKT mejora significativamente, en comparación con la ausencia del mejorador. En una realización, por ejemplo, cuando la sustancia de reprogramación nuclear es un ácido nucleico que codifica un factor proteínico y el mejorador de eficacia del establecimiento de células iPS es un inhibidor químico, el mejorador de la eficacia del establecimiento de células iPS puede añadirse al medio después de cultivar la célula durante un período de tiempo dado después del tratamiento de transferencia génica, porque la sustancia de reprogramación nuclear implica un retraso de tiempo dado del tratamiento de transferencia génica a la expresión en masa del factor proteínico, mientras que el mejorador de eficiencia del establecimiento de células iPS es capaz de actuar rápidamente en la célula. En otra realización, cuando se usan un factor de reprogramación nuclear y un

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mejorador de la eficiencia del establecimiento de células iPS en forma de vector viral o vector plasmídico, por ejemplo, ambos pueden transferirse simultáneamente a la célula.

Las células somáticas tales como las células NKT separadas de un ser humano o un ratón también se pueden precultivar usando un medio conocido per se que es adecuado para su cultivo (por ejemplo, un medio esencial mínimo (MEM), medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio RPMI1640, medio 199, y medio F12 que contiene citocinas tales como IL-2, IL-7, IL-15, SCF y ligandos de Flt3, y de aproximadamente 5 a aproximadamente 20% de suero bovino fetal, y similares).

Cuando un reactivo de transfección tal como un liposoma catiónico, por ejemplo, se usa para contactar con factores de reprogramación nuclear (y un mejorador de eficiencia del establecimiento de células iPS), es a veces preferible reemplazar el medio con un medio libre de suero para evitar una reducción de la eficiencia de transferencia. Después de ponerse en contacto los factores de reprogramación nuclear (y el mejorador de la eficiencia del establecimiento de células iPS), las células se pueden cultivar en condiciones adecuadas para el cultivo, por ejemplo, de células ES. En el caso de las células humanas, es preferible llevar a cabo el cultivo con la adición del factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) como supresor de la diferenciación en un medio ordinario. Por otra parte, en el caso de las células de ratón, es deseable agregar Factor Inhibidor de Leucemia (LIF) en vez de bFGF. Normalmente, las células se cultivan en presencia conjunta de fibroblastos derivados de ratón fetal (MEF) tratados con radiación o un antibiótico para terminar la división celular de los mismos, como células alimentadoras. Normalmente, las células STO y similares se usan comúnmente como MEFs, pero para inducir células iPS, se usan comúnmente las células SNL [McMahon, AP y Bradley, A. Cell 62, 1073 - 1085 (1990)] y similares.

Puede seleccionarse una colonia candidata de células NKT-iPS mediante un método con resistencia a fármaco y actividad informadora como indicadores, y también mediante un método basado en el examen visual de la morfología. Como ejemplo de lo primero, se selecciona una colonia positiva para la resistencia a los fármacos y/o actividad informadora utilizando una célula somática recombinante tal como una célula NKT recombinante en la que un gen de resistencia a fármacos y/o un gen informador se dirigen al locus de un gen altamente expresado específicamente en células pluripotentes (por ejemplo, Fbx15, Nanog, Oct3/4 y similares, preferiblemente Nanog u Oct3/4). Por otra parte, los ejemplos del último método basado en el examen visual de la morfología incluyen el método descrito por Takahashi et al. en Cell, 131, 861 - 872 (2007). Aunque el método que usa células informadoras es conveniente y eficiente, es deseable, desde el punto de vista de la seguridad, que las colonias se seleccionen por examen visual, ya que la presente invención tiende a aplicarse al tratamiento humano; incluso por examen morfológico visual, una colonia candidata de células NKT-iPS puede seleccionarse bien eficientemente.

La confirmación de la identidad de las células de la colonia seleccionada como células NKT-iPS puede lograrse mediante diversos métodos de prueba conocidos per se, por ejemplo midiendo la expresión de un grupo de genes que incluyen un gen específico de células ES (por ejemplo, Oct3/4, Sox2, Nanog, Cripto, Dax1, ERas, Fgf4, Esg1, Rex1, Zfp296 y similares) usando RT- PCR o un microarray de ADN y similares, y comparando el perfil de expresión del mismo con el perfil de expresión génica en células ES (por ejemplo, células ES fertilizadas derivadas de huevo, células ES derivadas de un embrión clonado obtenido mediante trasplante nuclear de células somáticas de una célula NKT, y similares). Para asegurar una mayor precisión, es posible inducir la diferenciación y confirmar la formación de un cuerpo embrioide o trasplantar las células seleccionadas a un ratón y confirmar la formación de teratomas.

La confirmación del hecho de que las células NKT-iPS se derivan de una célula somática, tal como una célula NKT, que tiene la región de la cadena a del gen TCR (TCRa) se redistribuye a Va-Ja uniforme en una vía específica del receptor de células NKT, se puede lograr examinando la presencia o ausencia de redistribución de genes a NKT- TCR mediante PCR genómica.

El detalle del método de producción de la célula NKT-iPS se describe en el documento WO 2010/027094.

Células madre pluripotentes en las que la región de la cadena a (TCRa) de un gen TCR se ha redistribuido a Va-Ja uniforme en una manera específica del receptor de células NKT o en donde Va-Ja uniforme de una manera específica del receptor de células NKT ha sido insertado en una región particular en el genoma para permitir su expresión, insertando un gen en células madre pluripotentes para permitir la expresión de la cadena a y de la cadena p de un gen TCR específico de la célula NKT, pueden producirse, por ejemplo, de acuerdo con el método descrito en el documento JP-B-3030092, produciendo, a partir de células NKT, una microcélula que contiene un fragmento cromosómico que contiene la región de la cadena a (TCRa) del gen TCR redistribuido a Va-Ja uniforme en un receptor de células NKT de manera específica, y transfiriendo el fragmento de cromosoma antes mencionado a células madre pluripotentes por fusión con la microcélula, o a una región del genoma capaz de expresión estable (región AAVS1 humana y similares). La realización de células NKT utilizables para la preparación de un fragmento de cromosoma es, como se describió anteriormente, como las células NKT utilizables para la producción de células NKT-iPS.

La célula madre pluripotente establecida a partir del embrión transferido nuclearmente de una célula NKT puede ser obtenida trasplantando el núcleo de una célula NKT a una célula enucleada (p. ej. un ovocito), sometiendo a la célula a una operación predeterminada para producir un animal clonado de células NKT, y cultivando una masa

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celular interna de un embrión temprano obtenido apareando dichos animales clonados en una célula alimentadora para establecer una célula ES. La producción de un animal clonado se describe, por ejemplo, en el documento WO2006/018998 y similares. En el caso de seres humanos, no puede ser producido un humano clonado. Sin embargo, es posible teóricamente producir una célula ES produciendo un embrión clon humano mediante trasplante nuclear de células NKT y cultivando la masa celular interna en una célula alimentadora in vitro.

Una célula establecida a partir de una célula NKT después de completarse la redistribución y que tiene al menos capacidad de rediferenciación en una célula NKT puede establecerse mediante reprogramación directa. La reprogramación directa significa el establecimiento de una célula que puede mantenerse y crecer más fácilmente y similares que la célula NKT, y puede rediferenciarse en una célula NKT, introduciendo un gen tal como un factor de transcripción y similares en una célula NKT, añadiendo una sustancia química que induce la diferenciación a un medio de cultivo y similares. Como ejemplo de la reprogramación directa, hay un informe sobre la obtención de una célula madre neural mediante la transferencia de Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc en un fibroblasto y cultivando la misma bajo condiciones de cultivo adecuadas para la inducción de una célula nerviosa (Kim y col., Proc Natl Acad Sci USA, 108, 7838 - 7843 (2011)). Además, hay una publicación en la que la célula NKT se somete a una reprogramación directa similar y, cuando una célula obtenida por reprogramación directa y que tiene al menos la capacidad de rediferenciación en una célula NKT tiene pluripotencia, la célula se cultiva en condiciones adecuadas para la inducción de una célula T/NKT, con lo que la célula NKT también puede obtenerse en una gran cantidad (Watarai y col., J Clin Invest, 120, 2610 -2618, 2010)).

Además, los ejemplos de las células que tienen la región de la cadena a (TCRa) de un gen TCR redistribuida a Va- Ja uniforme en una manera específica del receptor, y que tiene capacidad de auto renovación y capacidad de diferenciación en células NKT incluye células madre hematopoyéticas que tienen la región de la cadena a (TCRa) de un gen de TCR reorganizado a Va-Ja uniforme en una manera específica del receptor de la célula NKT. Las células madre hematopoyéticas pueden obtenerse, por ejemplo, cultivando las células NKT-iPS antes mencionadas o células NKT-PS bajo las condiciones para la diferenciación en células madre hematopoyéticas, o reprogramando directamente las células NKT en células madre hematopoyéticas. Los ejemplos de las condiciones para la diferenciación de las células NKT-iPS o las células NKT-PS en células madre hematopoyéticas incluyen la expresión forzada de Lhx2 (Kitajima et al., Blood, 117 (14), (3748 - 3758 (2011)), inducción de diferenciación in vivo (in vivo evaluation of putative hematopoietic stem cells derived from human pluripotent stem cells. Hexum MK, Tian X, Kaufman DS. Methods Mol. Biol. 2011; 767: 433 - 447) y similares.

Entre las células así establecidas que tienen la región de la cadena a de un gen de TCR redistribuido a Va-Ja uniforme en una manera específica del receptor de células NKT (en adelante abreviado como células derivadas de NKT), las células definidas como células madre pluripotentes (en adelante abreviado como células NKT-PS, p. ej. células NKT-iPS) se pueden diferenciar en células NKT CD4/CD8-doble positivas cultivando en presencia de citocinas tales como IL-7 y un ligando Flt3, con células estromales que expresan un ligando de Notch como células alimentadoras, basándose en una publicación sobre células ES. Además, las células NKT-iPS se pueden diferenciar en células NKT maduras funcionales in vitro usando el método descrito más adelante.

En una realización preferida, las células derivadas de NKT (p. ej., células NKT-iPS) se diferencian en células NKT maduras o inmaduras funcionales, que se activan por estimulación con un ligando de receptor de células NKT tal como a-GalCer y similares, ex vivo para su utilización como, por ejemplo, fuente de agente de inmunoterapia de células NKT.

Por ejemplo, cuando se usan células NKT-PS (p. ej. células NKT-iPS) como células derivadas de NKT, primero se pueden generar células NKT CD4/CD8-doble positivas (en lo sucesivo también denominadas "células DP-NKT") cultivando conjuntamente células NKT-PS (p. ej. células NKT-iPS) con células estromales que expresan un ligando de Notch. Las células estromales incluyen, pero sin limitarse a ellas, células OP9, células S17 y similares, en las que un ligando de Notch (por ejemplo, similar a Delta 1, en adelante denominado también "Dll-1") se ha expresado forzadamente. Los ejemplos del medio para inducción de la diferenciación incluyen, pero sin limitarse a ellos, un medio esencial mínimo (MEM), medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio RPMI1640, medio 199 y medio F12 que contiene citocinas tales como interleucina-2 (IL- 2), IL-7, IL-15, factor de células madre (SCF) y un ligando Flt3 (FL) (0,1 - 10 ng/mL cada uno, preferiblemente 1 - 5 ng/mL) y aproximadamente 5 a 20% de suero bovino fetal y similares. Las células NKT-iPS se siembran para obtener una densidad celular de, por ejemplo, aproximadamente 1,0 x 106 a aproximadamente 1,0 x 107 células/mL, se cultivan en un recipiente de cultivo conocido per se en una atmósfera de 5% de CO2/95% de aire a aproximadamente entre 30 y 40 °C, preferiblemente a aproximadamente 37 °C, durante aproximadamente 1 a aproximadamente 4 semanas, preferiblemente durante aproximadamente 2 a aproximadamente 3 semanas. La confirmación de su diferenciación en células DP-NKT se puede lograr, por ejemplo, analizando el fenotipo de un antígeno de superficie celular usando un anticuerpo contra un marcador de superficie celular (por ejemplo, cada anticuerpo contra CD4 y CD8, anticuerpo contra CD3, TCRb y similares), un multímero CD1d (dímero, tetrámero, etc.) pulsado con a-galactosilceramida, y un clasificador de células. Según se requiera, también es posible examinar la expresión de otros diversos antígenos de superficie celular más y comparar el fenotipo de los mismos con los de, por ejemplo, células CD4+/CD8+ que están presentes en el timo.

Co-cultivando las células DP-NKT obtenidas como se describió anteriormente con células estromales en presencia

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de varios tipos de citocinas seleccionadas entre IL-2, IL-7, IL-15, IL-15 Ralpha y FL, las células NKT se pueden expandir en grandes cantidades. Aunque las células estromales usadas en esta operación incluyen, por ejemplo, las mismas que las anteriores, tales como las células OP9 y las células S17, las células pueden expresar o no un ligando de Notch. Los medios preferidos son los mismos que los mostrados anteriormente, excepto por las combinaciones de citocinas. Las combinaciones específicas de citocinas incluyen IL-7/FL, IL-2/IL-7/IL-15, IL-2/IL- 7/IL-15/IL-15 Ralpha, IL-2/IL-7/FL, IL-2/IL-15/FL, IL-2/IL-15/IL-15 Ralpha/FL, IL-7/IL-15/FL, IL-7/IL-15/IL-15

Ralpha/FL, IL-2/IL-7/IL-15/FL e IL-2/IL-7/IL-15/IL-15 Ralpha/FL, particularmente preferiblemente una combinación de IL-7/FL, IL-2/IL -15/IL-15 Ralpha/FL e IL-2/IL-7/IL-15/IL-15 Ralpha/FL. La concentración de cada citocina se puede elegir según lo apropiado en el intervalo de 0,1 - 10 ng/mL, preferiblemente 1 - 5 ng/mL. Todavía puede añadirse al medio otra citocina (p. ej. SCF y similares). Aunque el cultivo puede ajustarse según sea apropiado de acuerdo con la especie animal de la que se deriva la célula, se realiza, por ejemplo, en atmósfera de 5% de CO2 /95%, a una temperatura entre aproximadamente 30 y aproximadamente 40°C, preferiblemente aproximadamente 37°C, durante un tiempo de aproximadamente 3 días a aproximadamente 6 semanas, preferiblemente de aproximadamente 3 días a aproximadamente 4 semanas, más preferiblemente de aproximadamente 5 días a aproximadamente 3 semanas. Este cultivo permite que la cantidad de células aumente entre 20 y 30 veces o más en 5 días.

Las células NKT obtenidas por estimulación de la combinación de citoquinas antes mencionada, tienen un efecto coadyuvante ya que produce IFN-y mediante la estimulación con un ligando del receptor de células NKT (por ejemplo, a-galactosilceramida). Para potenciar el efecto adyuvante, una combinación preferible de citocinas es IL- 7/FL o IL-7/IL-15/IL-15Ralpha/FL. El perfil de la citoquina producida por las células NKT inducidas por la combinación de estas citocinas está comparativamente inclinado hacia el tipo Th1.

Por otra parte, al cultivar conjuntamente las células DP-NKT obtenidas como se describió anteriormente con células estromales que no expresan un ligando de Notch, pueden generarse células NKT que son muy similares a las células NKT periféricas. Estas células NKT se caracterizan por el marcador NK (CD161 en humanos, NK1.1 en ratones B6)-positivo, y además por fenotipos tales como CD3e+, Sca1+, CD44+, CD69+, CD34- y Flt3-, con la expresión de TCRa (Va24 en seres humanos, Va14 en ratones) disminuida en comparación con las células DP-NKT, y mostrando niveles de expresión equivalentes a los de las células NKT periféricas. En otras palabras, al cambiar las células alimentadoras de las células estromales que expresan un ligando de Notch a las células estromales que no expresan el ligando, en medio del cultivo para la inducción de la diferenciación a partir de las células NKT-PS (p. ej. células NKT-iPS) a células DP-NKT, las células NKT-iPS pueden ser diferenciadas y maduradas en células NKT que son equivalentes a las células NKT periféricas. Los ejemplos de células estromales que no expresan un ligando de Notch incluyen, pero no se limitan a ellas, células OP9, células S17 y similares. Aunque igualmente se puede utilizar un medio para su uso para la inducción de la diferenciación de células NKT-PS (por ejemplo, células NKT-iPS) a células DP-NKT, es preferible que el medio contenga dos o más citocinas seleccionadas entre IL-2, IL-7, IL-15 y FL, más preferiblemente conteniendo IL-15. El momento de cambiar las células alimentadoras de las células estromales que expresan un ligando de Notch a células estromales que no expresan el ligando, no está limitado en particular, siempre y cuando se obtengan finalmente células NKT equivalentes a las células NKT periféricas (p. ej. células NK1.1- positivas); por ejemplo, de aproximadamente 12 a aproximadamente 20 días después, preferiblemente de aproximadamente 14 a aproximadamente 18 días después de comenzar el cultivo conjunto de células NKT-PS (por ejemplo, células NKT-iPS) y células estromales que expresan un ligando de Notch, las células alimentadoras se cambian a células estromales que no expresan el ligando. La duración del cultivo conjunto con las células estromales que no expresan el ligando de Notch tampoco está limitada de un modo particular; por ejemplo, la duración es de aproximadamente 3 días a aproximadamente 4 semanas, preferiblemente de aproximadamente 5 días a aproximadamente 3 semanas. Al realizar este cultivo utilizando un medio que contiene tres o más citocinas seleccionadas entre IL-2, IL-7, IL-15 y FL (preferiblemente una de ellas es IL-15), se pueden obtener en grandes cantidades células NKT que se han diferenciado y madurado en la misma medida que con células NKT periféricas. Además, una célula NKT que produce IFN-y en gran cantidad puede producirse cultivando en presencia de varios tipos de citocinas tales como IL-7/FL y similares durante 4 semanas o más.

En una célula NKT-PS (por ejemplo, una célula NKT-iPS), la región de la cadena TCRa en el cromosoma se ha redistribuido de una manera específica de la célula NKT (Va24-Ja18 en seres humanos, Va14-Ja18 en ratones). Por tanto, cuando se induce a las células a diferenciarse bajo las condiciones mencionadas anteriormente, casi todas las células se diferencian en células NKT, y no se produce sustancialmente la diferenciación en células T convencionales. En la presente invención, por tanto, cuando el sujeto de la administración es un individuo alogénico a las células NKT, la posibilidad de contaminación de las células T convencionales alo se puede evitar y se puede suprimir el riesgo de desarrollar una reacción severa de GVH debido a las células T convencionales usando células NKT inducidas a partir de células NKT-PS (por ejemplo, células NKT-iPS) como salsa de las células NKT. Por lo tanto, a partir de los aspectos mencionados anteriormente, es ventajoso el uso de células NKT inducidas a partir de células NKT-PS (por ejemplo, células NKT-iPS).

Dado que las células NKT derivadas de células derivadas de NKT (p. ej. las células NKT-iPS) obtenidas como se mencionó anteriormente (en lo sucesivo, la célula NKT derivada de una célula derivada de NKT también se denominará "célula NKT rediferenciada", una célula NKT derivada de una célula derivada de NKT-PS como "célula PS-NKT" y una célula NKT derivada de una célula NKT-iPS como "célula iPS-NKT") son células NKT rediferenciadas y restringidas a CD1d (p. ej. células PS-NKT, células iPS-NKT) pueden activarse por contacto con células dendríticas (DCs) que presentan un ligando del receptor de células NKT tal como a-GalCer y similares. Mientras DC

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se deriva preferiblemente de una especie idéntica a la de una derivación de células rediferenciadas (p. ej. células PS-NKT, células iPS-NKT), se pueden usar DCs de diferentes especies (por ejemplo, las DCs de ratón se ponen en contacto con células NKT rediferenciadas humanas (p. ej. células PS-NKT humanas, células iPS-NKT humanas)) siempre y cuando puedan activar células rediferenciadas (por ejemplo, células PS-NKT, células iPS-NKT). Las DCs no están particularmente limitadas siempre y cuando puedan activar células NKT rediferenciadas (por ejemplo, células PS-NKT, células iPS-NKT) a través de un ligando del receptor de células NKT, y pueden ser células dendríticas de linaje mieloide (DC1) o células dendríticas linfoides (DC2), dándose la preferencia a DC1. Las DCs pueden generarse por cualquier método conocido per se, y pueden separarse de la médula ósea, el tejido periférico no linfático, la región de células T del tejido linfático, la linfa aferente, la epidermis, la dermis y similares; preferiblemente, las DC pueden generarse separando monocitos, mielocitos y similares de las células de la médula ósea, sangre periférica y similares, por ejemplo, mediante centrifugación en gradiente de densidad y similares, y cultivando las células en presencia de gM-CSF (e IL-4) durante aproximadamente 7 a aproximadamente 10 días (Nature, 408, p. 740 - 745, 2000).

En la presente invención, un ligando del receptor de las células NKT usado para pulsar DC se refiere a un compuesto específicamente reconocido por un receptor de células T en la célula NKT cuando es presentado en una molécula CD1d, que puede activar específicamente la célula NKT. Los ejemplos de ligando del receptor de células NKT usado en la presente invención incluyen a-glicosilceramida, isoglobotrihexosilceramida (Science, 306, p. 1786 - 1789, 2004), OCH (Nature 413: 531, 2001) y similares. La a-glicosilceramida es un esfingoglicolípido en el que un sacárido, tal como la galactosa, glucosa y similares, está unido a ceramida en la configuración a, y los ejemplos de los mismos incluyen los descritos en los documentos WO93/05055, WO94/02168, WO94/09020, WO94/24142, WO98/44928, Science, 278, p. 1626 - 1629, 1997 y similares. De ellos, es preferible (2S, 3S, 4R) -1-O-(a-D- galactopiranosil)-2-hexacosanoilamino-1,3,4-octadecanotriol (a los que se hará referencia como a-galactosilceramida o a-GalCer).

En la presente memoria, el ligando del receptor de células NKT se usa en un sentido que incluye incluso una sal del mismo. Como sal del ligando del receptor de células NKT, se usa una sal con un ácido fisiológicamente aceptable (por ejemplo, ácido inorgánico, ácido orgánico), base (por ejemplo, sal de metal alcalino) y similares, y es particularmente preferible una sal de adición de ácido fisiológicamente aceptable. Los ejemplos de dicha sal incluyen una sal con un ácido inorgánico (por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico), una sal con un ácido orgánico (por ejemplo, ácido acético, ácido fórmico, ácido propiónico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido málico, ácido oxálico, ácido benzoico, ácido metanosulfónico, ácido bencenosulfónico), y similares.

En la presente memoria descriptiva, además, el ligando del receptor de células NKT se usa en un sentido que incluye el solvato del mismo (hidrato, etc.).

Dado que la célula NKT rediferenciada de la presente invención (por ejemplo, célula PS-NKT, célula iPS-NKT) apunta a la administración a seres humanos, el ligando del receptor de células NKT usado para pulsar la DC es deseablemente de calidad GMP.

La pulsación de DCs con un ligando del receptor de la célula NKT puede realizarse mediante una técnica de uso común; por ejemplo, la pulsación puede realizarse cultivando las DC en un medio que contiene suero (p. ej. medio RPMI-1640 que contiene FCS al 10% y similares) que contiene ligando del receptor de células NKT a una concentración de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 200 ng/mL durante aproximadamente 12 a aproximadamente 48 horas. La pulsación con un ligando del receptor de células NKT puede realizarse añadiendo a- GalCer al medio en el proceso de cultivo y maduración de las CDs inmaduras en presencia de GM-CSF (e IL-4). Alternativamente, la pulsación puede realizarse añadiendo un ligando del receptor de células NKT al medio en la etapa de cocultivo de las DCs maduras como se describe a continuación con células NKT rediferenciadas (p. ej. células PS-NKT, células iPS-NKT).

El contacto de las DCs y las células NKT rediferenciadas (p. ej. células PS-NKT, células iPS-NKT) se puede lograr, por ejemplo, cocultivando ambas en el medio descrito anteriormente en la inducción de diferenciación a partir de células derivadas de NKT (por ejemplo, células NKT-PS, células NKT-iPS) a células NKT rediferenciadas (por ejemplo, células PS-NKT, células iPS-NKT) que exhiben fenotipos equivalentes a los de células NKT periféricas.

Aquí, la "célula NKT activada" significa una célula NKT rediferenciada (por ejemplo, célula PS-NKT, célula iPS-NKT) que al menos produce una citocina Th1 tal como IFN-y en respuesta a DC presentadora de a-GalCer. La célula puede poseer además productividad para una citoquina Th2 tal como IL-4, y puede poseer un potencial de proliferación. Para que las células NKT rediferenciadas (p. ej. células PS-NKT, células iPS-NKT) adquieran un potencial de proliferación y productividad de citoquina Th2 así como estimulación con CDs presentadoras de a- GalCer, las células han de continuar cultivadas conjuntamente con células estromales que expresan un ligando de Notch en el proceso de inducción de la diferenciación a partir de células derivadas de NKT (p. ej. células NKT-PS, células NKT-iPS) a células NKT rediferenciadas (por ejemplo, células PS-NKT, células iPS-NKT); en este caso, la productividad de IFN-y aumenta también en comparación con las células NKT rediferenciadas (por ejemplo, células PS-NKT, células iPS-NKT) obtenidas al cambiar a células estromales que no expresan un ligando de Notch. Al elegir la combinación IL-7/FL o IL-15/IL-15R alfa/IL-7/FL como citocinas en la etapa de cultivo a células NKT

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rediferenciadas de expansión en masa (p. ej. células PS-NKT, células iPS-NKT) a partir de células DP-NKT, el balance de la producción de citocina Th1/Th2 en células NKT activadas, en particular, muestra dominancia de Th1.

La presente invención proporciona un agente para una terapia de inmunocitos que contiene células NKT rediferenciadas (por ejemplo, células PS-NKT, células iPS-NKT) obtenidas como se mencionó anteriormente. La célula NKT rediferenciada (por ejemplo, célula PS-NKT, célula iPS-NKT) es preferiblemente una célula NKT activada. La célula NKT rediferenciada (por ejemplo, célula PS-NKT, célula iPS-NKT) proporcionada por la presente invención tiene capacidad proliferativa y capacidad de producción de citocina dominante Th1 y un efecto coadyuvante, al ingual que una célula NKT endógena. Por tanto, por ejemplo, es útil para la profilaxis o el tratamiento de diversas enfermedades tales como cáncer, infecciones, enfermedades alérgicas, enfermedades autoinmunitarias y similares. Como cáncer, cabe mencionar todo tipo de cánceres primarios y se pueden mencionar todas las afecciones de cánceres, incluidos los cánceres tempranos y los cánceres avanzados con potencial metastásico/infiltrante. Los ejemplos específicos de cáncer incluyen, pero sin limitarse a ellos, cáncer de pulmón (células pequeñas y/o no pequeñas), tumor cerebral, cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de útero, cáncer de testículo, cáncer de piel, osteosarcoma, cáncer de colo-rectal, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfocítica aguda, leucemia no linfocítica aguda, leucemia mieloide crónica, tumor productor de ACTH, cáncer de la corteza suprarrenal, linfoma de células T de la piel, carcinoma de endometrio, sarcoma de Ewing, cáncer de vesícula biliar, cáncer de cuello uterino, linfoma de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de ovario (células germinales), cáncer de pene, cáncer de próstata, retinoblastoma, sarcoma de tejido blando, cáncer de células epiteliales planas, cáncer de tiroides, neoplasia trofoblástica, cáncer de vagina, cáncer de vulva, tumor de Wilms y similares. Los ejemplos de enfermedades autoinmunitarias incluyen, pero sin limitarse ellas, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn, vitíligo vulgaris, enfermedad de Behcet, enfermedad del colágeno, diabetes mellitus tipo I, uveítis, síndrome de Sjogren, miocarditis autoinmunitaria, enfermedades hepáticas autoinmunitarias, gastritis autoinmunitaria, pénfigo, síndrome de Guillain-Barre, mielopatía asociada al HTLV-1 y similares. Los ejemplos de enfermedad alérgica incluyen, pero no se limitan a ellas, asma, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, dermatitis atópica, enteritis estomacal alérgica y similares. Los ejemplos de infecciones incluyen, pero no se limitan a ellas, infecciones por virus con CMV (por ejemplo, HCMV, MCMV y similares), virus del herpes simple, virus EB, virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la influenza, virus SARS y similares.

El sujeto de administración del agente para una terapia inmunocítica de la presente invención es un individuo alogénico en el que al menos uno de los locus del gen MHC tiene un genotipo diferente del de las células NKT rediferenciadas (por ejemplo, células PS-NKT, células iPS-NKT) como ingrediente activo de la misma. Este es un "medicamento" innovador que tiene un concepto de tratamiento completamente diferente del agente de terapia de inmunocitos previamente informado por los autores de la presente invención, en el que el sujeto de la administración es un individuo del que derivan las células NKT o un individuo alogénico que tiene el tipo de MHC idéntico (es decir, el genotipo del locus génico principal del MHC es en esencia completamente idéntico). Para ser concreto, mientras que este último presupone que las células NKT transferidas se injertan en el cuerpo del huésped y continúan funcionando, ya que al menos una parte del locus del gen MHC de las células NKT transferidas no coincide en el agente de terapia de inmunocitos de la presente invención, las células NKT transferidas son reconocidas por el sistema inmunitario del receptor y finalmente son excluidas sin injerto. Sin embargo, dado que el efecto coadyuvante de las células NKT se consigue en un corto período de tiempo, pueden activar células inmunes (por ejemplo, células T CD8, células NK) distintas de las células NKT. Por lo tanto, en el agente de terapia de inmunocitos de la presente invención, las células NKT juegan el mismo papel que los "productos farmacéuticos generales" que se excluyen rápidamente del cuerpo después de ejercer su eficacia durante el período necesario.

El locus del gen MHC es como se definió anteriormente, y se pueden mencionar 3 loci génicos de HLA-A, HLA-B y HLA-C para MHC humano (HLA). De forma similar, los loci del gen H-2K, H-2D y H-2L de la región de clase I se pueden mencionar para el ratón como los principales loci génicos en la presente invención.

En una realización, un individuo alogénico que tiene un genotipo de al menos 1 locus (preferiblemente 2 loci, más preferiblemente 3 loci), entre los 3 loci génicos mencionados anteriormente, diferente del de las células NKT a transferir, es el individuo objetivo de la terapia de inmunocitos. En esta realización, dado que las células NKT administradas se excluyen mediante una inmunoreacción contra las células alo del receptor debido a la falta de coincidencia del locus del gen MHC, se espera la exclusión de las células después del ejercicio efectivo de las acciones de efecto coadyuvante y similares. Particularmente, para excluir las células NKT transferidas por el receptor alo, se usa preferiblemente células NKT derivadas de un individuo que muestran genotipos de los 3 loci génicos antes mencionados diferentes de los del individuo diana de la terapia con inmunocitos.

Las células NKT rediferenciadas (por ejemplo, células PS-NKT, células iPS-NKT) se producen como una preparación oral/parenteral, preferiblemente como inyección, suspensión o infusión por goteo, mezclándose con un vehículo farmacéuticamente aceptable por un medio convencional o de otro modo. Los vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden estar contenidos en el preparado parenteral incluyen, por ejemplo, soluciones acuosas para inyección, tales como solución salina fisiológica y soluciones isotónicas que contienen glucosa u otro fármaco auxiliar (por ejemplo, D-sorbitol, D-manitol, cloruro de sodio y similares). El agente de la presente invención se puede formular, por ejemplo, con un agente tamponante (por ejemplo, solución tampón de fosfato, solución tampón

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de acetato de sodio), un agente suavizante (por ejemplo, cloruro de benzalconio, hidrocloruro de procaína y similares), un estabilizador (por ej. albúmina de suero humano, polietilenglicol y similares), un conservante, un antioxidante y similares.

Cuando el agente de la presente invención se prepara como suspensión acuosa, las células NKT rediferenciadas (p. ej. células PS-NKT, células iPS-NKT) se suspenden en el líquido acuoso descrito anteriormente a, por ejemplo, aproximadamente 1,0 x 106 a 1,0 x 107 células/ml.

Dado que el preparado así obtenido es estable y de baja toxicidad, puede administrarse con seguridad a mamíferos como los seres humanos. Aunque el método de administración no está particularmente limitado, la preparación puede administrarse parenteralmente, preferiblemente mediante inyección o infusión por goteo; los ejemplos incluyen administración intravenosa, administración subcutánea, administración intradérmica, administración intramuscular, administración intraperitoneal, administración directa al sitio afectado y similares. La dosis del agente de terapia de inmunocitos varía dependiendo del receptor de la administración, el órgano diana, los síntomas, el método de administración y similares; en el caso de la administración parenteral, por ejemplo, es normalmente conveniente administrar de aproximadamente 1,0 x 107 a aproximadamente 1,0 x 109 células, basándose en el número de células NKT por dosis, a intervalos de aproximadamente 1 a 2 semanas, de aproximadamente 4 a aproximadamente 8 veces, para un paciente adulto (suponiendo un peso corporal de 60 kg).

Para promover la activación de las células NKT rediferenciadas (por ejemplo, células PS-NKT, células iPS-NKT) para ser transferidas en el cuerpo, el agente de terapia de inmunocitos de la presente invención puede usar una combinación de las células NKT rediferenciadas (por ejemplo, células PS-NKT, células iPS-NKT) como ingrediente activo de las mismas y un ligando del receptor de células NKT.

Como ligando del receptor de células NKT a usar en combinación con las células NKT rediferenciadas (p. ej. células PS-NKT, células iPS-NKT), las mencionadas anteriormente para la producción de las células NKT activadas pueden usarse de la misma manera, dándose preferencia a a-GalCer. Cuando el sujeto de la administración es un ser humano, se usa un ligando de receptor de células NKT de grado GMP. En pacientes que padecen una enfermedad que requiere citología de células nKt, como un cáncer, que a veces tienen un menor número o carecen de función de DCs endógenas, se puede usar pulso de DCs con un ligando del receptor de células NKT en lugar del ligando del receptor de células NKT para promover activación in vivo de las células NKT rediferenciadas (p. ej. células PS-NKT, células iPS-NKT). En este caso, la fuente de DCs recolectadas es preferiblemente el paciente que es el receptor de la administración (es decir, autotrasplante autólogo); sin embargo, esto no debe considerarse limitante, en la medida en que la fuente es un individuo alogénico de la misma especie que se estima que es compatible con el paciente.

El ligando del receptor de las células NKT se produce normalmente, junto con un vehículo aceptable farmacéuticamente, como un preparado parenteral tal como una inyección, suspensión o infusión por goteo. Los vehículos aceptables farmacéuticamente que pueden estar contenidos en el preparado parenteral incluyen, por ejemplo, soluciones acuosas para inyección, tales como solución salina fisiológica y soluciones isotónicas que contienen glucosa u otro fármaco auxiliar (p. ej. D-sorbitol, D-manitol, cloruro de sodio y similares). El agente de la presente invención puede formularse, por ejemplo, con un agente tampón (por ejemplo, una solución tampón de fosfato, solución tampón de acetato de sodio), un agente tranquilizante (por ejemplo, cloruro de benzalconio, hidrocloruro de procaína y similares), un estabilizante (p. ej. albúmina sérica humana, polietilenglicol y similares), un conservante, un antioxidante y similares. Cuando el ligando del receptor de células NKT se elabora como preparado acuoso, el ligando del receptor de células NKT se disuelve en un disolvente orgánico apropiado (por ejemplo, DMSO y similares) y se disuelve en el líquido acuoso descrito anteriormente para obtener, por ejemplo, una concentración de aproximadamente 100 |jg a aproximadamente 1 mg/mL.

Por otra parte, cuando se utilizan DCs pulsadas por el ligando del receptor de células NKT en vez del ligando del receptor de células NKT, las DCs pulsadas por ligandos del receptor de células NKT preparadas por la técnica descrita anteriormente con respecto a la generación de células NKT activadas puede suspenderse en el líquido acuoso anteriormente mencionado a razón, por ejemplo, de aproximadamente 1,0 x 106 a aproximadamente 1,0 x 107 células/mL.

El ligando del receptor de células NKT elaborado como preparado como se describió anteriormente se puede administrar por vía oral o parenteral, preferiblemente mediante inyección o infusión por goteo; los ejemplos incluyen administración intravenosa, administración subcutánea, administración intradérmica, administración intramuscular, administración intraperitoneal, administración directa al sitio afectado y similares. La dosis del ligando del receptor de células NKT varía dependiendo del receptor de la administración, el órgano diana, los síntomas, el método de administración y similares; normalmente, en el caso de la administración parenteral, por ejemplo, la dosis es normalmente de aproximadamente 0,6 a aproximadamente 6,0 mg, basándose en una dosis única, para un paciente adulto (suponiendo un peso corporal de 60 kg). Por otra parte, cuando se usa DC pulsada con ligando de receptor de células NKT en lugar de ligando de receptor de células NKT, la dosis de la misma es normalmente de aproximadamente 1,0 x 107 a aproximadamente 1,0 x 109 células por dosis. Estas cantidades pueden administrarse de acuerdo con el protocolo de administración para el preparado que contiene células iPS-NKT.

Un preparado que contiene células NKT rediferenciadas (p. ej. células PS-NKT, células iPS-NKT) y un preparado

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que contiene un ligando del receptor de células NKT pueden administrarse por separado o al mismo tiempo mediante mezcla cuando se usa, y puede administrarse secuencialmente por el orden de las células nKt rediferenciadas (p. ej. células PS-NKT, células iPS-NKT) que contienen el preparado que contiene ligando del receptor de células NKT.

Un banco de células derivadas de NKT humanas (por ejemplo, células NKT-PS, células NKT-iPS) o de células NKT derivadas de dichas células derivadas de NKT (células nKt rediferenciadas) (p. ej. células NKT derivadas de PS (células PS-NKT), células NKT derivadas de iPS (células iPS-NKT)), permite la provisión de una terapia de inmunocitos usando la célula NKT rediferenciada humana mencionada anteriormente (p. ej. célula PS-NKT humana, célula iPS-NKT humana), bajo condiciones universales más rápidas superiores en control de calidad. Existen muchos conceptos de bancos de células iPS que apuntan a la terapia de trasplantes. Sin embargo, el banco de células derivadas de células NKT humanas (p. ej. células PS, células iPS) o el banco de células NKT derivadas de células derivadas de NKT (p. ej. células PS, células iPS) se caracteriza por la fácil inducción de la diferenciación de una célula NKT funcional, ya que está constituido únicamente por células derivadas de células NKT (por ejemplo, células PS, células iPS) (o las células derivadas de NKT (por ejemplo, células PS, células iPS) derivadas de células NKT) que ya se han sometido a la redistribución génica. El banco de células iPS humanas propuesto convencionalmente apunta a preparar un repertorio de células iPS humanas que permita la provisión de células u órganos que puedan ser injertados en el cuerpo de cualquier paciente, de manera que el banco pueda ser aplicable a cualquier paciente, es decir, un repertorio de células iPS humanas que tienen genotipos que coinciden con todos los principales loci génicos de HLA (HLA-A, HLA-B, HLA-C y HLA-DRB1). La presente invención es marcadamente diferente de la misma, en que apunta a recoger células derivadas de NKT (por ejemplo, células NKT-PS, células NKT-iPS) o células NKT rediferenciadas (por ejemplo, células PS-NKT, células iPS-NKT) que permiten la provisión, a cualquier paciente, de células NKT humanas que permanecen en el cuerpo de un paciente durante un cierto período para ejercer eficacia, y luego se excluyen del cuerpo del paciente.

En la terapia de inmunocitos de la presente invención, un individuo alogénico en el que al menos uno de los loci del gen MHC tiene un genotipo que no coincide con el de la célulaNKT, es el sujeto de la administración. Dado que es raro que todos los genotipos de loci del gen MHC coincidan completamente entre la célula NKT y el paciente, teóricamente, un tipo de célula derivada de células NKT (por ejemplo, células NKT-PS, células NKT-iPS) con seguridad confirmada y capacidad de diferenciación en una célula NKT puede cubrir a casi todos los pacientes. En la presente invención, cuando al menos uno de los loci del gen HLA (p. ej. al menos un locus del gen seleccionado entre el grupo que consiste en HLA-A, HLA-B y HLA-C) no coincide, la célula puede usarse para trasplante. Por consiguiente, el banco de células derivadas de NKT humanas (por ejemplo, células NKT-PS humanas, células NKT- iPS humanas) que cumple el objetivo de la presente invención debe ser comparativamente alcanzable fácilmente siempre que pueda cubrir la mayor parte de la población de pacientes.

El banco de células derivadas de células NKT humanas (por ejemplo, células NKT-PS, células NKT-iPS) o células NKT derivadas de dichas células derivadas de NKT (p. ej. células PS-NKT, células iPS-NKT), puede tener un repertorio de genotipos en el que la frecuencia total del genotipo de un locus del gen HLA particular (por ejemplo, al menos un locus del gen (preferiblemente 2, más preferiblemente 3) seleccionado del grupo que consiste en HLA-A, HLA- B y HLA-C) en una cierta población cubre no menos del 50% (p. ej. no menos del 60%, preferiblemente no menos del 70%, más preferiblemente no menos del 80%, aún más preferiblemente no menos del 90%) de toda la población. Usando el banco de células derivadas de células NKT humanas (o banco de células NKT derivadas de dicha célula derivada de NKT), células derivadas de la célula NKT humana (p. ej. células NKT-PS, células NKT-iPS) y células NKT derivadas de dicha célula de NKT (p. ej. células PS-NKT, células iPS-NKT), en donde el genotipo de un locus del gen HLA particular (p. ej. al menos un locus del gen (preferiblemente 2, más preferiblemente 3) seleccionado entre el grupo que consiste en los loci génicos HLA-A, HLA-B y HLA-C) no coincide con el de un paciente en particular, puede suministrarse fácilmente a casi todos los pacientes contenidos en la población, determinando, con respecto al paciente particular, solamente el genotipo de un locus del gen HLA particular (denominado en lo sucesivo "HLA diana"), en donde el banco celular cubre no menos del 50% (por ejemplo, no menos del 60%, preferiblemente no menos del 70%, más preferiblemente no menos del 80%, aún más preferiblemente no menos del 90%) del locus del gen HLA particular en la población completa, y seleccionando células iPS derivadas de células NKT que tienen dicho HLA con un genotipo diferente del genotipo del paciente del banco. Alternativamente, proporcionando repertorios de tal variedad en el banco, células derivadas de células NKT humanas (p. ej. células NKT-PS, células NKT-iPS) o células NKT derivadas de dichas células derivadas de NKT (p. ej. células NKT- PS, células NKT- iPS) que tienen los genotipos de loci génicos plurales (por ejemplo, todos los loci génicos de HLA-A, HLA-B y HLA-C) no coincidentes con los del sujeto de administración, se pueden suministrar fácilmente.

El HLA objetivo es preferiblemente HLA-A, HLA-B o HLA-C, preferiblemente de un modo particular HLA-A, ya que el locus del gen HLA-A contiene menos tipos de alelo y tiene un tipo de suero (nivel de 2 dígitos) que cubre el 92% de los japoneses con 6 tipos de A24, A2, A11, A26, A31 y A33, y la selección del genotipo del locus del gen HLA-A facilita la obtención de un genotipo HLA que cumple el objeto de la presente invención.

Aquí, "cierta población" puede ser, por ejemplo, la unidad nacional, tal como el pueblo japonés en su conjunto, el pueblo estadounidense en su conjunto y similares; unidad étnica; unidad racial tal como la raza blanca como un todo, la raza amarilla como un todo, la raza negra como un todo y similares; o la humanidad como un todo.

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El banco de células derivado de NKT humano o banco de células NKT rediferenciadas humanas se puede construir mediante las siguientes etapas (1) - (4):

(1) determinar el genotipo de un locus del gen HLA particular (p. ej. al menos un locus del gen HLA seleccionado entre el grupo que consiste en HLA-A, HLA-B y HLA-C) de un donante inscrito;

(2) recolectar las células NKT del donante inscrito;

(3) establecer células derivadas de NKT humanas a partir de las células NKT, y establecer, si es necesario, células NKT humanas rediferenciadas a partir de dichas células derivadas de NKT humanas establecidas; y

(4) determinar la potencia de diferenciación de las células iPS humanas establecidas en células NKT, y la tumorigenicidad después de la diferenciación, y sucesivamente almacenar bancos de células que satisfacen los criterios.

El banco de células NKT-iPS humanas o banco de células iPS-NKT humanas se puede construir mediante las siguientes etapas (1) - (4):

(2) recolectar las células NKT del donante inscrito;

(3) establecer células iPS humanas poniendo en contacto las células NKT con un factor de reprogramación nuclear, y establecer, si es necesario, células NKT humanas a partir de las células iPS humanas establecidas; y

Cuando se ha de construir el banco de las células derivadas de células NKT humanas (p. ej. células NKT-PS, células NKT-iPS) o células NKT derivadas de dichas células derivadas de NKT (p. ej. células PS-NKT, células iPS- NKT) en la realización particular mencionada anteriormente, la operación se repite hasta que el banco construido de las células derivadas de NKT humanas (p. ej. células NKT-PS, células NKT-iPS) o células NKT derivadas de dichas células derivadas de NKT (p. ej. células iPS-NKT) muestra un repertorio de genotipos de un locus del gen HLA particular (por ejemplo al menos un locus del gen (preferiblemente 2, más preferiblemente 3) seleccionado entre el grupo que consiste en HLA-A, HLA-B y HLA-C) de las células derivadas de células NKT humanas almacenadas en banco (p. ej. células NKT-PS, células NKT-iPS) o células NKT derivadas de dicha célula derivada de NKT (p. ej. células PS-NKT, células iPS-NKT), que cubre no menos del 50% (por ejemplo, no menos del 60%, preferiblemente no menos del 70%, más preferiblemente no menos del 80%, aún más preferiblemente no menos del 90%) en el total de la frecuencia en la población completa.

Es de esperar que el registro del donante reciba la entrada con facilidad, por ejemplo, obteniendo de antemano un consentimiento informado por escrito sobre la sangre periférica recogida mediante donación general de sangre (o linfocito recogido por donación de sangre componente) o sangre de cordón umbilical recogida en el momento del parto, y similares. En cuanto a la tipificación de HLA, el genotipo de HLA-A, HLA-B y HLA-C puede determinarse por el método SBT utilizado generalmente para la búsqueda de donantes para el trasplante de médula ósea, o puede predecirse el alelo de alta frecuencia mediante el método de las perlas de fluorescencia. Las células NKT humanas también se pueden recolectar fácilmente solicitando a una persona que ya ha completado el tipaje de HLA a través del registro de donantes para trasplante de órganos o trasplante de médula ósea que proporcione sangre periférica o de cordón umbilical.

El método antes mencionado de producir células derivadas de NKT (p. ej. células NKT-PS, células NKT-iPS) puede aplicarse directamente a la etapa (3) anteriormente mencionada.

Además, la capacidad de diferenciación de las células derivadas de NKT humanas (p. ej. células NKT-PS, células NKT-iPS) establecida en la etapa (4) mencionada anteriormente en células NKT, puede determinarse aplicando el método de producción antes mencionado de las células NKT rediferenciadas (p. ej. células PS-NKT, células iPS- NKT) y evaluando si puede conseguirse la inducción de la diferenciación en células NKT. Por otra parte, la tumorigenicidad después de la diferenciación puede determinarse por métodos tales como el análisis del cariotipo (la muestra cromosómica se tiñe con la tinción de Giemsa y se analiza el número de cromosomas con un microscopio y la anomalía estructural cromosómica), evaluación de la célula con un número de pasajes elevado (se confirma la ausencia de cambio en la propiedad celular), el método de medio de agar blando (utilizando que una célula que tiene tumorigenicidad no requiere anclaje para la adhesión celular para el crecimiento), transplante a un animal inmunodeficitario (inyección intramuscular o subcutánea de células humanas derivadas de NKT (p. ej., células NKT - PS, células NKT-iPS) a ratones atímicos y similares, seguido de la determinación de la presencia o ausencia de formación de tumores) y similares.

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Como consecuencia de la determinación mencionada anteriormente, células derivadas de la célula NKT humana (por ejemplo, células NKT-PS, células NKT-iPS) o células NKT derivadas de las células derivadas de NKT (p. ej. células PS-NKT, células iPS-NKT) que se determina que tienen capacidad de diferenciación en una célula nKt, y que sustancialmente no tienen tumorigenicidad después de la diferenciación, son almacenadas en banco. Las células conservadas en banco se crioconservan en un estado dispensado de acuerdo con un método usado convencionalmente, y las células NKT rediferenciadas humanas (por ejemplo, células PS-NKT, células iPS-NKT) pueden prepararse cuando se usan descongelando una parte del stock, expandiéndose a una cantidad suficiente según sea necesario con un medio adecuado (p. ej. medio para cultivo de células ES humanas y similares), y a continuación siguiendo el método de inducción de la diferenciación mencionado anteriormente a partir de células derivadas de NKT (p. ej. células NKT-PS, NKT- células iPS) en células NKT.

También puede realizarse la inducción de expansión y diferenciación en células NKT de células derivadas de NKT humanas (por ejemplo, células NKT-PS, células NKT-iPS), después de suministrar células de interés del banco de+ células, por una institución médica a aprovisionar con las células. Sin embargo, esto no es razonable ya que deben cumplirse requisitos regulatorios estrictos para la gestión de la calidad de la propia célula y del medio (infección con micoplasma y similares, prueba de células restantes no diferenciadas y similares), la gestión del aparato y similares necesita cumplirse. Por lo tanto, es deseable realizar uniformemente la expansión de una célula derivada de NKT (por ejemplo, célula NKT-PS, célula NKT-iPS) e inducción de diferenciación en células NKT rediferenciadas (por ejemplo, células PS-NKT, células iPS-NKT) de acuerdo con el protocolo estandarizado en las instalaciones del banco de células, y suministrar a la institución médica para que se le proporcionen las células con las células NKT rediferenciadas (por ejemplo, células PS-NKT, células iPS-NKT).

Una institución médica deseosa del suministro de células NKT rediferenciadas humanas (p. ej., células PS-NKT, células iPS-NKT) realiza la tipificación de HLA del paciente diana y lo notifican al banco de células. En este caso, la institución médica confirma que el genotipo de al menos un locus del gen HLA (p. ej. al menos un locus del gen (preferiblemente 2, más preferiblemente 3) seleccionado del grupo que consiste en hLA-A, HLA-B y HLA- C) de la lista de células NKT almacenadas, no coincide, y utiliza la célula para fines de tratamiento. La institución médica solo necesita informar del genotipo del locus del gen HLA del paciente, y el banco de células confirma, basándose en los datos acumulados hasta entonces, que el genotipo es diferente en al menos uno (p. ej. al menos un locus génico (preferiblemente 2, más preferiblemente 3) seleccionado del grupo que consiste en el locus del gen HLA-A, HLA-B y HLA-C) del locus del gen HLA del paciente, y suministra células derivadas de la célula NKT (p. ej. células NKT-PS, células NKT-iPS) o células NKT derivadas de dicha célula (por ejemplo, células PS-NKT, células iPS-NKT). Para este propósito es deseable que cada institución médica provista de células haga llegar al banco de células información de datos clínicos relacionados con el método de administración, protocolo de tratamiento, efecto del tratamiento, efectos secundarios y similares, de las células NKT rediferenciadas (p. ej. células PS-NKT, células iPS- NKT), y el banco de células no solo trabaja en la optimización del método de preservación de la célula, y en las condiciones para la expansión, inducción de diferenciación y purificación de la célula, sino que también construye un sistema para compartir y reducir la base de datos de la información clínica recogida de cada institución médica.

La presente invención se describe a continuación con más detalle por medio de los ejemplos que siguen, a los cuales, sin embargo, no está limitada la invención en modo alguno.

Ejemplos

Ejemplo 1

(1) Establecimiento de células iPS a partir de células NKT derivadas de esplenocitos de ratón

Se prepararon células NKT a partir de esplenocitos de un ratón C57BL/6 que tenía la región de la cadena a del receptor de células T (TCRa) ya redistribuida a TCR usada en las células NKT (NKT-TCR). Dado que las células NKT están caracterizadas por reconocer antígenos de glicolípidos presentados a la molécula similar a MHC de clase I CD1d, las células se concentraron seleccionando positivamente células reactivas a un anticuerpo IgG1 anti-ratón preparado marcando con APC un recombinante de IgG1 de ratón CD1d solubilizado que tenía el antígeno glicolípido a-GalCer insertado en él (producido por BD Bioscience Company), usando un método MACS que utiliza perlas magnéticas anti-APC (producido por Miltenyi Biotech Company). Esta operación hizo que las células NKT, como se definen como células dímero CD1d cargado con a-GalCer-positivas/TCRp-positivas tengan una pureza del 90% o más. Las células NKT concentradas se cultivaron en presencia de IL-2 (l0 ng/ml) a una densidad celular de 106 células/ml, usando un medio RPMI que contiene FCS al 10%, durante 24 horas, después de lo cual las células fueron infectadas con un retrovirus que contiene cuatro factores derivados del ratón (ácidos nucleicos que codifican Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc) (106 pfu/ml: unidad formadora de placa) de acuerdo con el método descrito en Cell, 126: 663 - 676 (2006) durante 24 horas. De tres a siete días después de la infección viral, las células se recuperaron, se volvieron a sembrar en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) y se cultivaron conjuntamente en presencia de LIF usando un medio de cultivo de células ES. Las colonias emergentes se evaluaron morfológicamente, y las colonias que adoptaban una morfología similar a ES se recogieron y se siguieron cultivando en presencia de LIF en MEF, con lo que se establecieron 4 clones de células iPS derivadas de la célula NKT (células NKT-iPS) (nombres de código de clonación: 2a, 5b, 5d, 5g).

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(2) Caracterización de células NKT-iPS

Para demostrar que los cuatro clones de células NKT-iPS establecidas en el párrafo (1) anteriormente citado se derivaban de células NKT, se determinó mediante una PCR genómica si se había producido la redistribución a NKT- TCR. En las células que tienen NKT-TCR, la región TCRa ya se había redistribuido a Va14 - Ja18 (Fig. 1); por tanto, la presencia o ausencia de transposición se verificó realizando una PCR usando los cebadores que se muestran a continuación con el genoma de cada clon NKT-iPS como plantilla.

SEQ ID NO: 1: Cebador 1: 5'-gacccaagtggagcagagtcct-3'

SEQ ID NO: 2: Cebador 2: 5'-tcacctatgtctcctggaagcctc-3'

SEQ ID NO: 3: Cebador 3: 5'-cagctccaaaatgcagcctccctaa-3'

[En caso de que la redistribución de Va14-Ja18 no haya ocurrido (silvestre), se amplifica una banda de 349 pb mediante una PCR usando el cebador 1 y el cebador 2; por otra parte, en caso de haberse producido la redistribución de Va14-Ja18 (NKT-TCR), se amplifica una banda de 317 pb mediante una PCR utilizando el cebador 1 y el cebador 3.]

Como resultado, se encontró que los cuatro clones establecidos tenían el genoma redistribuido a NKT-TCR (Fig. 2), confirmando que las células iPS establecidas eran de derivación de células NKT.

(3) Análisis de la expresión genética de células NKT-iPS

Para determinar si las células NKT-iPS identificadas en el párrafo (2) mencionado anteriormente habían sido reprogramadas a células similares a iPS, se realizó el perfil de expresión génica. Se preparó el ARN total a partir de cada una de las células NKT-iPS, células ES derivadas de embriones de trasplante nuclear de células NKT (células NKT-ES) y células NKT periféricas por el método del fenol-cloroformo, la expresión de una serie de grupos de genes cuya expresión en células ES es conocida, fue analizada mediante el método de RT-PCR de una etapa (producido por Invitrogen Company). Los genes analizados y las secuencias de los cebadores utilizados se muestran a continuación.

Oct3/4 endógeno: 5'-tctttccaccaggcccccggctc-3' (SEQ ID NO: 4)

5'-tgcgggcggacatggggagatcc-3' (SEQ ID NO: 5)

Sox2 endógeno:

5'-tagagctagactccgggcgatga-3' (SEQ ID NO: 6) 5'-ttgccttaaacaagaccacgaaa-3' (SEQ ID NO: 7) 5'-gcgaactcacacaggcgagaaacc-3' (SEQ ID NO: 8) 5'-tcgcttcctcttcctccgacaca-3' (SEQ ID NO: 9) 5'-tgacctaactcgaggaggagctggaatc-3' (SEQ ID NO: 10) 5'-aagtttgaggcagttaaaattatggctgaagc-3' (SEQ ID NO: 11) 5'-tgtggggccctgaaaggcgagctgagat-3' (SEQ ID NO: 12) 5'-atgggccgccatacgacgacgctcaact-3' (SEQ ID NO: 13)

Klf4 endógeno:

c-Myc endógeno:

Ecat1:

Nanog:

5'-caggtgtttgagggtagctc-3' (SEQ ID NO: 14) 5'-cggttcatcatggtacagtc-3' (SEQ ID NO: 15)

Gdf3:

5'-gttccaacctgtgcctcgcgtctt-3' (SEQ ID NO: 16) 5'-agcgaggcatggagagagcggagcag-3' (SEQ ID NO: 17)

Rex1:

5'-acgagtggcagtttcttcttggga-3' (SEQ ID NO: 18) 5'-tatgactcacttccagggggcact-3' (SEQ ID NO: 19) 5'-ccattaggggccatcatcgctttc-3' (SEQ ID NO: 20) 5'-cactgctcactggagggggcttgc-3' (SEQ ID NO: 21)

Zfp296:

HPRT:

5'-ctgtgtgctcaaggggggct-3' (SEQ ID NO: 22) 5'-ggactcctcgtatttgcagattcaacttg-3' (SEQ ID NO: 23).

Como resultado, la expresión de todos los genes analizados se confirmó en células NKT-iPS y células NKT-ES, pero no se confirmó ninguna expresión en células NKT periféricas (Fig. 3). Este resultado sugiere que las células NKT- iPS establecidas pueden poseer una función similar a la de la célula iPS.

Además, usando un microarray de ADN (producido por Affimetrix Company), se comprobaron las correlaciones del 5 perfil de expresión génica entre células NKT-iPS, células NKT-ES, células ES y células NKT periféricas; se descubrió que las células NKT-iPS tenían un patrón de expresión génica muy similar al de las células NKT-ES o las células ES, siendo distinto de las células NKT periféricas (Fig. 4).

(4) Examen morfológico de células NKT-iPS

La morfología de las células NKT-iPS establecidas en el párrafo (2) anteriormente mencionado, se examinó al 10 microscopio. Como resultado, se demostró que la expresión localizada de SSEA1 y Oct3/4 y la morfología de las células NKT-iPS eran muy similares a las de las células ES (Fig. 5).

(5) Establecimiento y análisis del ratón quimérico NKT-iPS

Se generó un ratón quimérico a partir de una célula NKT-iPS derivada del clon NKT de ratón C57BL/6 establecido en el párrafo (2) antes mencionado y una célula derivada de Balb/c mediante el método de agregación. Los 15 esplenocitos del ratón quimérico obtenido fueron analizados en relación con los antígenos de la superficie celular. Las células derivadas de C57BL/6 y las células derivadas de Balb/c se programaron por distinción por MHC clase I (I-Ab e I-Ad, respectivamente), y se analizaron las relaciones de contenido de las células NKT. Como resultado, casi todas las células derivadas de C57BL/6 tenían un antígeno de superficie similar al de las células NKT dímero CD1d- positivas/TCRp-positivas cargadas con a-GalCer, mientras que las células derivadas de Balb/c contenían células 20 T/NKT con una frecuencia ordinaria (Fig. 6).

Ejemplo de Referencia 1. Establecimiento y caracterización de células iPS a partir de células T humanas

Se expresaron forzadamente células T de sangre periférica humana, por infección con vector de virus que contiene KSOM, y se cultivaron conjuntamente con fibroblasos embrionarios de ratón durante 21-35 días para establecer células iPS (Cell Stem Cell 7: 1-14, 15-19, 20-24 (2010)). Se confirmó que las células iPS así establecidas muestran 25 un perfil de expresión génica completa y un estado de epigenoma de gen relacionado con ES, que están muy correlacionados con los de la célula ES humana, y tienen una región de receptor de células T después de la redistribución génica.

Ejemplo 2. Establecimiento y caracterización de células iPS a partir de células NKT humanas

Las células NKT restringidas por CD1d presentes en la sangre periférica humana o la sangre del cordón umbilical 30 son células que expresan tanto Va24 como Vp11, y dan cuenta de aproximadamente 0,001% a 0,1% de las células mononucleares. Después de preparar las células mononucleares, las células positivas se separan con alta pureza por clasificación usando un anticuerpo Va24 anti-humano, un anticuerpo Vp11 anti-humano y CD1d humano soluble recombinante pulsado con ligando de glicolípido (a-GalCer etc.) o, de acuerdo con el método descrito en Nature Protoc, 3: 70 - 78 (2008), añadiendo ligando de glicolípido a las células mononucleares y cultivando las células 35 durante aproximadamente 3 días a 1 mes, para aumentar las células NKT in vitro, y preparando las células con alta pureza mediante clasificación. Las células NKT purificadas se siembran en placas que tienen anticuerpo CD3 antihumano y anticuerpo CD28 anti-humano inmovilizados en ellas, se cultivan en presencia de citocina tal como IL-2, IL-12, IL-23, IL-25 y similares, se infectan con KSOM incorporado a un vector de virus tal como lentivirus, virus hemaglutinante de Japón, y similares, para expresión forzosa, y se co-cultivan con fibroblastos embrionarios de 40 ratón y similares durante 1 - 2 meses para establecer células iPS derivadas de células NKT (células NKT-iPS).

Ejemplo 3.

(1) Inducción de la diferenciación in vitro a partir de células NKT-iPS de ratón

Las células ES pueden ser inducidas a la diferenciación en células T CD4/CD8-doble positivas (DP) siendo cocultivadas con células estromales OP9 que expresan forzadamente el ligando de Notch similar a Delta 1 (D11-1) 45 (OP9/D11-1) en presencia de IL-7 y ligando Flt3 (FL) (Schmitt TM, de Pooter RF, Gronski MA, Cho SK, Ohashi PS,

Zuniga-Pflucker Jc. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat. Immunol. abril 2004; 5 (4) : 410 - 417). Sobre la base de este hallazgo, células NKT- iPS fueron cultivadas conjuntamente con células OP9/D11-1 en presencia de IL-7 (1 ng/ml) y FL (5 ng/ml) durante 20 días; se demostró que se inducían células similares a NKT CD1d-dímero positivas/TCRp-positivas cargadas con a- 50 Galcer CD4/CD8 DP (Fig. 7). Se llevó a cabo con más detalle un análisis de expresión del antígeno de superficie de la célula, que demuestra que el fenotipo de las células DP-NKT es muy similar al de las células CD4/CD8 DP en el timo (Fig. 8). Este resultado sugiere que las células NKT-iPS, bajo la influencia de la redistribución génica de la región TCRa, experimentan probablemente la inducción a la diferenciación a células similares a NKT, y también muestra que introduciendo un nuevo concepto que hace el mejor uso de la redistribución de genes en los 55 inmunocitos, es posible asegurar una tecnología para generar los inmunocitos deseados (en partículas células NKT, células T, células B) en grandes cantidades.

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(2) Inducción de la diferenciación in vitro de células NKT maduras a partir de células NKT-iPS de ratón

Se llevó a cabo un análisis para determinar si las células NKT se inducirían mediante el co-cultivo de células NKT- iPS con OP9/D11-1 hasta el día 14 de cultivo, y después con OP9 desde el día 14 al día 20 de cultivo. Como resultado, se encontró que las células NKT emergerían incluso en una fase de diferenciación temprana en la que solamente había emergido lo que se denomina DN1, que es Lin-negativa/CD44-positiva/CD25-negativa (Fig. 9) y que los marcadores de superficie de las células NKT inducidas a la diferenciación eran muy similares a los de las células NKT periféricas (Fig. 9). Este resultado indica que las células NKT son capaces de diferenciarse en células NKT maduras incluso si se omite la señal de Notch en una fase de diferenciación temprana.

(3) Inducción de la diferenciación in vitro de células NKT maduras a partir de células DP-NKT derivadas de la célula NKT-iPS de ratón

Con el fin de expandir y madurar más las células DP-NKT derivadas de la célula NKT-iPS, cuya inducción fue confirmada en el párrafo (1) anteriormente mencionado, in vitro, las células se cultivaron usando varias combinaciones de citosinas con o sin células alimentadoras durante 5 días. Como resultado, se demostró que mediante el co-cultivo con OP9/Dll-1 en presencia de la combinación de citocinas IL-2/IL-15/FL o IL-2/IL-7/IL-15/FL, las células podían seguir expandiéndose más de 10 veces (Fig. 10). Además, se estimó que las células cultivadas bajo estas condiciones habían experimentado más inducción de diferenciación, con la expresión de NK1.1 inducida en ellas (Fig. 11). Por ello, las células NKT obtenidas mediante inducción por co-cultivo con OP9 o OP9/Dll-1 en presencia de la combinación de citocinas IL-2/IL-15/FL o IL-2/IL-7/IL-15/FL, fueron co-cultivadas con células dendríticas derivadas de células de la médula ósea (inducidas con GM-CSF) en presencia de a-GalCer, con lo que se comprobaron el potencial de proliferación y la productividad de citosina de las mismas. Como resultado, se confirmó que se había observado un potencial de proliferación cuando las células se siguieron cultivando con OP9/Dll-1 (Fig. 12), y que existía un sesgo a Th1, particularmente cuando se cultivaban con IL-2/IL-15/FL (Fig. 12).

Ejemplo 4. Inducción de la diferenciación in vitro de células NKT-iPS humanas a células NKT maduras

Células NKT-iPS humanas se co-cultivan con la línea de células estromales de la médula ósea de ratón OP9 y la línea de células OP9/Dll-1 obtenida por expresión forzada de Dll-1 (ligando de Notch), con lo que las células NKT- iPS humanas son diferenciadas en células NKT humanas. Esto es, las células humanas NKT-iPS se cultivan con OP9 durante 12 a 14 días, las células diferenciadas se recuperan, y se siguen co-cultivando con células OP9/Dll-1 en presencia de citosina tal como IL-7, Flt-3L, SCF y similares durante 15 - 30 días, con lo que las células NKT restringidas por CD1d pueden ser inducidas a diferenciarse.

Ejemplo 5. Efecto coadyuvante de las células NKT maduras derivadas de células NKT-iPS de ratón in vivo

Se llevó a cabo una evaluación para determinar si las células NKT maduras derivadas de la célula NKT-iPS inducidas en el Ejemplo 3 (3) (co-cultivadas con OP9/Dll-1 en presencia de IL-7/FL durante 20 días, después con OP9/Dll-1 en presencia de IL-2/IL-15/FL durante 5 días) eran funcionales in vivo. Esplenocitos derivados de ratones con un gen desactivado TAP (knockout) se cultivaron con 10 mg/ml de ovoalbúmina (OVA) en una solución hipertónica, después de lo cual se indujo la apoptosis, y 2 x 107 células apoptóticas, junto con 2 |jg de aGalCer, fueron transferidas a un ratón knockout Ja18 (ratón deficitario de células nKt) que tiene 105 o 10° células NKT maduras derivadas de la célula NKT-iPS transferidas de antemano 1 hora antes. Siete días después, se recolectaron los esplenocitos del ratón, se estimularon con péptido OVA (257 - 264) in vitro, y se analizó la producción de IFN-y mediante tinción intracelular. Como resultado, se confirmó que células T CD8-positivas específicas del antígeno OVA que poseen productividad de IFN-y habían sido inducidas dependiendo del número de células transferidas, lo que demuestra que las células NKT maduras derivadas de la célula NKT-iPS funcionan in vivo y tienen un potente efecto coadyuvante (Fig. 13).

Ejemplo 6. Efecto coadyuvante de células NKT maduras derivadas de la célula MKT-iPS de ratón in alo vivo

Cuando MHC es no coincidente en la transferencia de células o el trasplante de órganos, se sabe que las células transferidas y los órganos trasplantados son rechazados. Por ejemplo, cuando las células NKT (fondo de C57BL/6) inducidas a diferenciarse a partir de células NKT-iPS establecidas a partir del ratón C57BL/6, son trasplantadas al ratón BALB/c, las células nKt transferidas son rechazadas por el ratón BALB/c hospedador. Sin embargo, activando las células NKT inmediatamente después de la transferencia, puede activarse tanto el sistema inmunitario innato como el sistema inmunitario adquirido. El sistema inmunitario es activado transfiriendo, de forma simultánea con la transferencia de células NKT, células dendríticas pulsadas con un medicamento tal como a-GalCer y similares, que activa específicamente las células NKT.

Ejemplo 7. Efecto coadyuvante de células NKT maduras derivadas de la célula NKT-iPS humana in vivo

Células NKT inducidas a diferenciarse a partir de células NKT-iPS humanas se transfieren a un ratón humanizado en su sistema inmunitario (completamente diferente de HLA) producido transfiriendo células madre hematopoyéticas a un ratón NOD/SCID/Common Y-knockout, que es un ratón con inmunodeficiencia severa. Como en el caso del ratón, como las células NKT derivadas de la célula NKT-iPS humana son también rechazadas rápidamente, necesita activarse simultáneamente con la transferencia o inmediatamente después de ella. En este caso, cuando las células

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dendríticas (células dendríticas derivadas de monocitos inducidas a partir de monocitos por GM-CSF e IL-4, o células dendríticas mieloides linaje-negativas CD11c-positivas CD123-negativas, etc.) pulsadas con un ligando de células NKT tal como a-GalCer y similares, o a-GalCer se transfiere simultáneamente con las células NKT, las células NKT son activadas antes del rechazo in vivo, y pueden mostrar efecto antitumoral y efecto coadyuvante.

Ejemplo 8. Establecimiento de células iPS a partir de células NKT derivadas de esplenocitos de ratón silvestre

En los Ejemplos 1, 3 y 5, se demostraron el establecimiento de células NKT-iPS a partir de una población de células NKT de ratón purificadas, la inducción de diferenciación a partir de las células NKT-iPS a células NKT, la posesión por las células de una función como células NKT, y similares. Por ello, por el mismo procedimiento como en el Ejemplo 1, se prepararon células NKT a partir de esplenocitos de un ratón C57BL/6 sin una operación de concentración, con lo que se obtuvo una población de células NKT de aproximadamente 30 - 50% de pureza. Estas células fueron cultivadas en presencia de IL-2 (10 ng/ml) a una densidad celular de 106 células/ml durante 24 horas de la misma manera que en el Ejemplo 1, después de lo cual las células fueron infectadas con un retrovirus que contiene cuatro factores derivados del ratón (ácidos nucleicos que codifican Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc) (106 pfu/ml (unidades formadoras de placas)) durante 24 horas. De tres a siete días después de la infección viral, las células se recuperaron, se volvieron a sembrar en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF), y se co-cultivaron en presencia de LIF usando un medio de cultivo de células ES. Las colonias emergentes fueron evaluadas morfológicamente, y las colonias que adoptan una morfología similar a ES se recogieron y se siguieron cultivando en presencia de LIF en MEF, con lo que 5 clones de células NKT-iPS fueron establecidos con éxito (nombre de código del clon: i12c, i12d, i13g, i13h, i13i) (Fig. 14).

Ejemplo de Referencia 2. Generación de un ratón clon de NKT con fondo de C57BL/9

Como se muestra en la Fig. 15, con el propósito de realizar un experimento de transferencia celular, se generó un ratón clon de NKT con fondo de C57BL/9. Esto es, el núcleo de una célula NKT derivada del bazo de ratón C57BL/9, fue transferido a un ovocito enucleado de un ratón BDF1. Esta célula fue fusionada con una célula ES de BDF1 x ICR, transferida al útero de una madre de crianza, y se obtuvo una progenie de ratones quiméricos. El ratón quimérico (macho) obtenido fue cruzado con un ratón C57BL/6 (hembra), y la progenie obtenida se usó como ratón clon de NKT con fondo de C57BL/6.

En el ratón clon de células NKT establecido usando este método, el núcleo de partida derivaba en un 100 % de una célula NKT derivada del bazo del ratón C57BL/6; por tanto, el ratón clon es un C57BL/6 completo y no experimenta una reacción alogénica o semialogénica con el ratón C57BL/6. La única diferencia genómica entre el ratón clon de células NKT con fondo de C57BL/6 y el ratón C57BL/6 parece ser la diferencia en secuencia debida a la redistribución de la región del receptor de células T como resultado de la diferenciación en células NKT. La secuencia de bases de la región de un receptor de células T de un ratón clon de células NKT con fondo de C57BL/6 en la que se ha completado la redistribución, se muestra en la Fig. 16.

Ejemplo 9: Establecimiento de células iPS derivadas de fibroblastos embrionarios derivados del ratón clon de

células NKT

El método convencional de establecimiento de una célula iPS de ratón establecido por Yamanaka et al., está basado en la introducción de Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc en un fibroblasto embrionario (MEF). Por ello, se hizo un intento de establecer una célula iPS a partir de MEF de un ratón clon de células NKT creado en el Ejemplo de Referencia 2, y se establecieron con éxito las células NKT-iPS 7a y 7g. Se confirmó que las 7a y 7g establecidas habían experimentado redistribución de la región del receptor de linfocitos T, a receptor de linfocitos T de las células NKT (Fig. 17), y se confirmó también por un método de PCR-TI que eran equivalentes a células ES en términos de expresión de un grupo de genes que pueden ser marcadores de células ES (Fig. 18). También, un análisis de la expresión génica completa usando un microarray de ADN y un análisis de agrupamiento de la misma proporcionaron resultados que muestran que las 7a y 7g establecidas eran próximas a las células ES y distantes de los MEF de partida del ratón clon de células NKT (Fig. 19). Además, se efectuó el examen morfológico de los mismos; se confirmó también que 7a y 7g eran morfológicamente muy similares a las células ES, y que se expresaban los marcadores de células ES SSEA1, Oct3/4 y Nanog (Fig. 20). Además, se analizó la tendencia a la metilación del genoma de las regiones reguladoras de la expresión génica de Oct3/4 y Nanog, demostrando suficiente reprogramación en 7a y 7g, en donde los genomas estaban no metilados en la misma cuantía que con ES (Fig. 21). También nacieron diversos ratones quiméricos a partir de 7a y 7g, y toda la progenie obtenida por cruce con un ratón C57BL/6 exhibía redistribución génica al receptor de células T de células NKT, confirmando la transmisión a la progenie y demostrando que 7a y 7g poseen pluripotencia (Fig. 22). A partir de lo anterior, se sacó la conclusión de que 7a y 7g satisfacían los criterios para las células iPS.

Ejemplo 10: Inducción de la diferenciación in vitro a partir de la célula iPS derivada de MEF de ratón clon NKT

en células NKT

A continuación, se realizó una investigación para determinar si era posible inducir por diferenciación células NKT a partir de derivados de MEF 7a y 7g in vitro. Se co-cultivaron 7a y 7g con OP9/DII-1, una línea de células preparada forzando a la célula estromal derivada de la médula ósea OP9 a expresar el ligando de Notch DII-1, por el protocolo

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mostrado en la Fig. 23 durante 25 días. Como resultado, como se muestra en la Fig. 24, se demostró que 7a y 7g eran inducidas a la diferenciación a células similares a células NKT dímero a-GaICer/CD1d-positivas TCRp-positivas (7a dif. y 7g dif ). Además, 7a dif. y 7g dif. eran muy similares a lo que se denominan células DP, que son células CD4-positivas y CD8-positivas presentes en el timo, en términos de expresión de marcadores de superficie celular. También, un análisis de expresión génica completa usando un microarray de ADN y un análisis de agrupamiento del mismo proporcionó resultados que muestran que 7a dif. y 7g dif. son distantes de 7a y 7g antes de la inducción de la diferenciación y próximos a células NKT derivadas del bazo, presentes en la periferia (Fig. 25). Por ello, para determinar si 7a dif. y 7g dif. son funcionalmente equivalentes a las células nKt, se estimularon con el ligando glicolipídico a-GalCer mientras se co-cultivaban con células dendríticas, y se examinaron en relación con el potencial de proliferación y la productividad de citocinas. Como resultado, se confirmó que 7a dif. y 7g dif., al igual que las células NKT periféricas, poseen un potencial de proliferación notable y la capacidad de producir grandes cantidades de IFN-y e IL-4 (Fig. 26).

Ejemplo 11: Análisis funcional in vivo de 7a dif. y 7g dif-

Dado que 7a dif. y 7g dif. son funcionalmente equivalentes a células NKT periféricas, como se describe en el Ejemplo 10, se efectuó un análisis para determinar si el mismo efecto está presente in vivo usando un ratón deficitario en células NKT. Después de transferir 7a dif. y 7g dif. al ratón deficitario en células NKT, se verficó la presencia de células transfectadas al cabo de 1 semana y de 2 semanas; se demostró que estaban presentes en el hígado 7a dif. y 7g dif. dímero a-GaICer/CD1d positivas, TCRp-positivas (Fig. 27). Por ello, basándose en el protocolo mostrado en la Fig. 28, se comprobó la inducción de células T CD8-positivas específicas del antígeno, y su efecto antitumoral asociado. Esplenocitos derivados de ratón knockout con desactivación génica de TAP se cultivaron con 10 mg/ml de ovoalbúmina (OVA) en una disolución hipertónica, después de lo cual se indujo la apoptosis, y 2 x 107 células apoptóticas, junto con 2 |jg de a-GalCer, se transfirieron al ratón deficitario en células NKT al que se han transferido 7a dif. y 7g dif. una semana antes (inmunización TOG). Después de 7 días, se recogieron esplenocitos del ratón, se estimularon con péptido OVA (257 - 264) in vitro, y se analizó la producción de IFN-y mediante tinción intracelular. Como resultado, se confirmó que células T CD8-positivas específicas del antígeno OVA que poseen productividad de IFN-y habían sido inducidas de forma equivalente a un ratón de tipo silvestre, demostrando que 7a dif. y 7g dif. funcionan in vivo y tienen un potente efecto coadyuvante (Fig. 29). Por lo tanto, se evaluó el ratón usando un modelo de rechazo de tumor maligno que usa la línea de células de timoma de ratón C57BL/6 EL4 o EG7 (transfectante de EL4 OVA). Como resultado, con EG7, que es una línea celular que expresa forzadamente OVA, el ratón de tipo silvestre no inmunizado con TOG exhibía una progresión del tumor maligno, mientras que, en el ratón deficitario en células NKT transferido con 7a dif. y 7g dif. inmunizado con TOG, no se observaba progresión como en el ratón de tipo silvestre inmunizado con TOG. Con EL4, se observó una progresión similar en el ratón de tipo silvestre inmunizado con TOG y el ratón deficitario en células NKT; por consiguiente, se concluyó que la progresión era atribuida al efecto coadyuvante específico del antígeno de los 7a dif. y 7g dif. transferidos (Fig. 30).

Los resultados anteriores muestran que cualquier célula que tenga un receptor de células T redistribuido en la misma puede ser inducida a la diferenciación a células inmunocompetentes funcionales redistribuidas al receptor de células T.

Ejemplo 12. Análisis funcional de células NKT maduras derivadas de células NKT-iPS humanas in vivo

En referencia al sistema de inducción de la diferenciación de células ES humanas en células similares a las células T CD4-positivas CD8-positivas (J Immunol, 183: 4859 - 4870 (2009)), células NKT-iPS humanas fueron inducidas a diferenciarse en células NKT in vitro. Las células NKT-iPS son co-cultivadas con células OP9 durante 12 -14 días. A continuación se recuperan las células progenitoras de la célula NKT, y se co-cultivan con células OP9/Dll-1 en presencia de IL-7, Flt3L y SCF durante 14 - 35 días para permitir que aparezcan células NKT Va24-positivas Vp11- positivas restringidas a CD1d.

Ejemplo 13. Rechazo de células alo-iPS-NKT transferidas a un ratón

El rechazo ocurre rápidamente en la transferencia de células alo-NKT a un ratón normal, y las células NKT transferidas son excluidas sin desarrollar GvH (enfermedad del injerto contra el huésped). Cuando una célula dendrítica pulsada con ligando de a-GalCer o a-GalCer de células NKT es transferida simultáneamente bajo esta condición, las células NKT se activan antes del rechazo in vivo, y pueden manifestarse el efecto antitumoral y el efecto coadyuvante.

Ejemplo 14. Cómo establecer células iPS a partir de células NKT de tipo silvestre eficazmente

Aunque los autores de la presente invención tuvieron éxito al establecer iPS a partir de una célula NKT derivada de un esplenocito de ratón de tipo silvestre, como se muestra en el Ejemplo 8, se aseguró un método más eficaz de establecimiento de células iPS.

Es decir, células NKT restringidas por CD1d se concentran a partir de esplenocitos usando perlas MACS, después de lo cual se obtienen células NKT de 99,9 % de pureza por clasificación por FACS. Las células NKT pueden ser

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forzadas a entrar en un ciclo de proliferación añadiendo IL-2 (10 ng/ml) e IL-12 (10 ng/ml) bajo estimulación con un anticuerpo anti-CD3 (10 |jg/ml) y un anticuerpo anti-CD28 (10 |jg/ml). Se hizo evidente que, infectando las células NKT con un retrovirus que alberga ácidos nucleicos que codifican Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc bajo estas condiciones, las células iPS podían establecerse más de 10 veces más eficazmente que en el Ejemplo 8, con lo que los autores de la presente invención tuvieron éxito en el establecimiento del clon 14k de NKT-iPS (Fig. 31). Como se muestra en la Fig. 32, 14k exhibe una morfología similar a la de las células ES, la expresión de marcadores de células ES y la redistribución del receptor de células T de células NKT en la región de receptor de células T. También, como se examinó por el método descrito en el Ejemplo 9, se observó diferenciación en células similares a la célula NKT, que proliferaban con estimulación de glicolípido in vitro y se hicieron células funcionales productoras de citocinas (Fig. 33).

Ejemplo 15. Maduración de la célula iPS-NKT

Para expandir y madurar más las células DP-NKT derivadas de la célula NKT-iPS cuya inducción fue confirmada en el Ejemplo 3 (1), in vitro, las células se cultivaron usando varias combinaciones de citosinas con o sin células alimentadoras durante 5 días. Como resultado, se demostró que mediante el co-cultivo con OP9/Dll-1 en presencia de la combinación de citocinas IL-7/Flt3-L, IL-7/IL-15/Flt3-L, IL-7/Flt3/IL-2 o IL-2/IL-7/IL-15/Flt3-L, las células podían seguir expandiéndose más de 10 veces (Fig. 34). Además, se estimó que las células cultivadas bajo estas condiciones habían experimentado más inducción de diferenciación, con la expresión de NK1.1 inducida en ellas (Fig. 35). Por ello, las células NKT obtenidas por inducción por co-cultivo con OP9 o OP9/Dll-1 en presencia de la combinación de citocinas IL-2/IL-15/FL o IL-2/IL-7/IL-15/FL, fueron co-cultivadas con células dendríticas derivadas de células de la médula ósea (inducidas con GM-CSF) en presencia de a-GalCer, con lo que se comprobaron el potencial de proliferación y la productividad de citosina de las mismas. Como resultado, se confirmó que se observaba un potencial de proliferación cuando las células se siguieron cultivando con OP9/Dll-1 (Fig. 36), y que existía un sesgo a Th1 particularmente cuando se cultivaban con IL-7/Flt3-L (Fig. 36).

Ejemplo de Referencia 3. Comienzo de GVHD aguda debido a la transferencia de alo células T o células NKT

Para confirmar el efecto del comienzo de GVHD por la transferencia de alo-células T células NKT, células T colaboradoras CD4-positivas derivadas de bazo de ratón de tipo silvestre (fondo de C57BL/6) o células NKT derivadas de bazo de ratón clon NKT (fondo de C57BL/6) se transfirieron a un ratón RAG KO deficitario en células T, células B y células NKT (fondo de BALC/c), dispersando al mismo tiempo la dosis del número de células. En el caso de células T colaboradoras CD4-positivas, la transferencia de 1 x 107 a 3 x 106 células causó la pérdida de peso corporal con diarrea severa (Fig. 37), cuando se observó la aparición de GVHD aguda. Por otra parte, cuando se transfirieron células NKT derivadas de bazo de ratón clon, no se encontró diarrea ni pérdida de peso corporal, ni siquiera cuando las células fueron transferidas en el mismo número que las células T colaboradoras CD4-positivas (Fig. 38), y por consiguiente se consideró que no se había inducido GVHD. Incluso cuando células NKT obtenidas cultivando una célula iPS establecida a partir de células NKT derivadas de bazo con fondo de C57BL/6 por expresión forzada de Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc, en presencia de células OP9/Dll-1, IL-7 (1 ng/mL) y ligando Flt3 (10 ng/mL) durante 25 días fueron transferidas en el mismo número que antes, no se encontró diarrea ni pérdida de peso corporal (Fig. 37), y por consiguiente se consideró que no se había inducido GVHD. Estos resultados sugieren que las células alo-NKT o las células NKT derivadas de células alo-iPS no desarrollan GVHD por trasplante, a diferencia de las células T colaboradoras CD4-positivas.

Ejemplo 16. Efecto coadyuvante de la célula alo-NKT sobre la célula T

Células NKT fueron transfundidas en un ratón KO NKT (ratón Ja18-KO), y el efecto coadyuvante se evaluó en el sistema de coadministración del antígeno de proteína OVA y a-GalCer.

Se administraron OVA y a-GalCer a un ratón de tipo silvestre (fondo de C57BL/6), se aislaron las células esplénicas una semana más tarde, se re-estimularon con péptido OVA restringido a clase I, que es epítopo de la célula CD8T, y se analizó mediante tinción intracelular. Como resultado, se encontró la producción de iFN-y por células CD8T específicas del antígeno (Fig. 39, izquierda). Sin embargo, cuando se administraron OVA y a-GalCer a un ratón JA18-KO (fondo de C57BL/6), no se pudo exhibir el efecto coadyuvante (Fig. 39, centro). Los dos resultados significan que la célula NKT muestra un efecto coadyuvante.

Por otra parte, cuando unas células NKT diferenciadas de células ES derivadas de B6/129, células semi alo, fueron administradas a un ratón Ja18-KO, se encontró una respuesta inmunitaria de la célula CD8T (Fig. 39, derecha). Este resultado significa que las células NKT derivadas de la célula ES muestran un efecto coadyuvante aunque sea alo.

Ejemplo 17. Efecto antitumoral de la célula NKT alo

Como se ha aclarado antes que la célula NKT alo muestra un efecto coadyuvante en la célula T CD8-positiva específica del antígeno OVA, el efecto de la célula alo-NKT sobre la eliminación de la célula tumoral fue confirmado usando OVA como antígeno simulado. EL4, que es una línea de células de linfoma de ratón, y EG7, que es una línea de células obtenida por expresión forzada de OVA en EL4, fueron inoculados en un ratón. Los tres grupos siguientes fueron medidos en cuanto al diámetro del tumor después de la administración de la célula tumoral: (i) ratón de tipo silvestre C57BL/6, (ii) ratón de tipo silvestre C57BL/6 al que se ha administrado OVA y a-GalCer 1

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

semana antes de la inoculación de las células tumorales, y (iii) ratón Ja18 KO (fondo de C57BL/6) al que se ha administrado células NKT diferenciadas a partir de células ES derivadas de célula semi-alo B6/129, OVA y a-GalCer una semana antes de la inoculación de las células tumorales. Dado que se confirmó un crecimiento tumoral similar a lo largo del tiempo en los tres grupos de inoculación de EL4 (Fig. 40, gráfica derecha), se confirmó que este sistema de experimento había estado trabajando. Bajo esta condición, no se pudo observar crecimiento tumoral en los grupos (ii) y (iii) en el grupo de transferencia de EG7 (Fig. 40, gráfico izquierdo). El resultado indica que se induce un efecto coadyuvante específico del antígeno de una manera dependiente de la célula NKT (sistema de (ii)), y se induce un efecto coadyuvante específico del antígeno por transferencia, incluso en la célula semi-alo-NKT (sistema de (iii)).

Aplicabilidad industrial

La provisión de la terapia de células NKT de la presente invención y una célula derivada de NKT humana o dicho banco de células NKT para la misma, es extraordinariamente útil para un tratamiento de inmunocitos que ha sido realizado hasta ahora de una manera de tipo industrial manual, dado que puede proporcionar una técnica universal más rápida superior en manejo de la calidad.

Por el logro en la comercialización del presente sistema de banco, la base de la medicina cooperativa entre el desarrollo de una técnica fundamental de inmunocitos humanos iPS que soporta la practicidad y el desarrollo de una técnica de aplicación con un tratamiento claro de la enfermedad objetivo, y se construye el cabecero, y es de esperar que el establecimiento de este conducto sea utilizado como base prototipo de una técnica de inmunoterapia avanzada utilizando la técnica de iPS para otras áreas de la enfermedad, y proporcione un gran efecto rizo sobre la atención sanitaria y no sólo en el país de los autores de la presente invención sino también en todos los países del mundo.

Listado de secuencias

<110> RIKEN

<120> INMUNOTERAPIA UTILIZANDO CÉLULAS ALO-NKT, CÉLULAS PARA INMUNOTERAPIA EN LAS QUE LA CADENA ALFA DEL GEN DEL RECEPTOR DE LAS CÉLULAS T (TCR) HA SIDO REDISTRIBUIDA A Va -Ja UNIFORME, Y BANCO DE CÉLULAS NKT DERIVADAS DE DICHAS CÉLULAS

<130> N400543EP

<140> EP 11844377.9 <141> 2011-12-02

<150> US 61/419,064 <151> 2010-12-02

<160> 27

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador para TCR alfa de ratón <400> 1

gacccaagtg gagcagagtc ct 22

<210> 2 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador para TCR alfa humano <400> 2

tcacctatgt ctcctggaag cctc 24

<210> 3 <211> 25

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

<212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador para TCR alfa de ratón <400> 3

cagctccaaa atgcagcctc cctaa 25

<210>4 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador para Oct3/4 de ratón <400> 4

tctttccacc aggcccccgg ctc 23

<210> 5 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador para Oct3/4 de ratón <400> 5

tgcgggcgga catggggaga tcc 23

<210>6 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador para Sox2 de ratón <400> 6

tagagctaga ctccgggcga tga 23

<210>7 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador para Sox2 de ratón <400> 7

ttgccttaaa caagaccacg aaa 23

<210>8 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador para Klf4 de ratón <400> 8

gcgaactcac acaggcgaga aacc 24

<210>9 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

<220>

<223> cebador para Klf4 de ratón <400>9

tcgcttcctc ttcctccgac aca 23

<210> 10 <211> 28 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador para c-Myc de ratón <400> 10

tgacctaact cgaggaggag ctggaatc 28

<210> 11 <211> 32 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador para c-Myc de ratón <400> 11

aagtttgagg cagttaaaat tatggctgaa gc 32

<210> 12 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador para Ecat1 de ratón <400> 12

tgtggggccc tgaaaggcga gctgagat 28

<210> 13 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador para Ecat1 de ratón <400> 13

atgggccgcc atacgacgac gctcaact 28

<210> 14 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador para Nanog de ratón <400> 14

caggtgtttg agggtagctc 20

<210> 15 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador para Nanog de ratón

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

<400> 15

cggttcatca tggtacagtc 20

<210> 16 <211> 24 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador para Gdf3 de ratón <400> 16

gttccaacct gtgcctcgcg tctt 24

<210> 17 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador para Gdf3 de ratón <400> 17

agcgaggcat ggagagagcg gagcag 6

<210> 18 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador para Rex1 de ratón <400> 18

acgagtggca gtttcttctt ggga 24

<210> 19 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador para Rex1 de ratón <400> 19

tatgactcac ttccaggggg cact 24

<210> 20 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador para Zfp296 de ratón <400> 20

ccattagggg ccatcatcgc tttc 24

<210> 21 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador para Zfp296 de ratón <400> 21

cactgctcac tggagggggc ttgc 24

5

10

15

20

25

30

35

40

<210> 22 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador para HPRT de ratón <400> 22

ctgtgtgctc aaggggggct 20

<210> 23 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador para HPRT de ratón <400> 23

ggactcctcg tatttgcaga ttcaacttg 29

<210> 24 <211> 75 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 24

gtgggggata gaggttcagc cttagggagg ctgcattttg gagctgggac tcagctgatt

gtcatacctg acate

<210> 25 <211> 25 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 25

Val 1: Gly Asp Arg Gly 5

Thr: Gln Leu lie Val

Ser Ala Leu Gly

Arg

10

Leu His Fhe Gly

Ala

15

Gly

20

<210> 26 <211> 69 <212> ADN <213> Mus musculus

lie Pro Asp

He

25

<400> 26

agcagtgagc cagcaaactc cgactacacc ttcggctcag ggaccaggct tttggtaata 60

gaggatctg 69

<210> 27 <211> 23 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 27

Ser
Ser: Glu Pro Ala

1: 5

Leu
Leu: Val lie Glu

Asn Ser Asp Tyr

Asp Leu

Thr

10

Phe Gly Ser Gly

Thr

15

Arg

60

75

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

REIVINDICACIONES

1. Células NKT para uso en la prevención y/o el tratamiento del cáncer,

en donde las células NKT han sido obtenidas diferenciando in vitro células que tienen la región de la cadena a del gen del receptor antigénico de las células T redistribuido a Va-Ja uniforme en una manera específica del receptor de células NKT,

en donde las células NKT se administran a un sujeto alogénico que tiene al menos un genotipo de un locus diferente del de las células NKT en loci del gen de MHC, y

en donde el receptor de células NKT es un receptor de células T que reconoce específicamente a- galactosilceramida presentada en CD1d.
2. Las células NKT para su uso según la reivindicación 1, en donde dichas células que tienen la región de la cadena a del gen del receptor antigénico de las células T redistribuida a Va-Ja uniforme en una manera específica del receptor de las células NKT, son células madre pluripotentes.
3. Las células NKT para su uso según la reivindicación 2, en las que las células madre pluripotentes son (i) células ES o (ii) células iPS.
4. Las células NKT para su uso según la reivindicación 3, en las que las células madre pluripotentes son (i) células ES humanas o (ii) células iPS humanas.
5. Las células NKT para su uso según la reivindicación 4 (i), en las que el sujeto alogénico tiene al menos un genotipo de locus diferente del de las células ES humanas en loci del gen HLA.
6. Las células NKT para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en las que las células madre pluripotentes se derivan de una célula NKT.
7. Las células NKT para su uso según la reivindicación 6, en las que la célula NKT es una célula NKT humana.
8. Las células NKT para su uso según la reivindicación 7, en las que un sujeto alogénico tiene al menos un genotipo de locus diferente del de la célula NKT humana en loci del gen HLA.
9. Las células NKT para su uso según la reivindicación 5 u 8, en las que los loci del gen HLA incluyen HLA-A, HLA-B y HLA-C.
10. Las células NKT para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que se administran en combinación con un ligando del receptor de las células NKT, o células dendríticas pulsadas con el ligando del receptor de las células NKT.
11. Las células NKT para su uso según la reivindicación 10, en donde el ligando del receptor de células NKT es a-galactosilceramida.
12. Células NKT humanas para su uso en la prevención y/o el tratamiento del cáncer, en las que se administra una cantidad efectiva de las células NKT humanas a un paciente en necesidad de la administración de células NKT humanas, en donde las células NKT son

(1) proporcionadas a partir de un banco de células derivadas de células NKT humanas en las que la región de la cadena a del gen del receptor de las células T ha sido redistribuida a Va-Ja uniforme de una manera específica del receptor de células NKT, o de células NKT obtenidas diferenciando dichas células in vitro, y derivadas de células que tienen la región de la cadena a de un gen del receptor de células T redistribuida a Va-Ja uniforme en una manera específica del receptor de células NKT, que se han establecido a partir de un célula NKT humana en la que al menos uno de los loci del gen de hLa tiene un genotipo diferente del genotipo del paciente, o

(2) células NKT maduradas inducidas a diferenciación a partir de células suministradas a partir de dicho banco, en donde las células suministradas tienen la región de la cadena a de un gen del receptor de las células T redistribuida a un Va-Ja uniforme de una manera específica del receptor de células NKT y han sido establecidas a partir de una célula NKT humana en la que al menos uno de los loci del gen de HLA tiene un genotipo diferente del genotipo del paciente, y

donde el receptor de células NKT es un receptor de células T que reconoce específicamente a- galactosilceramida presentada en CD1d.
13. Las células NKT humanas para su uso según la reivindicación 12, que se administran en combinación con una cantidad efectiva de un ligando del receptor de las células NKT, o células dendríticas pulsadas con el ligando del receptor de las células NKT, al paciente mencionado anteriormente.
14. Las células NKT humanas para su uso según la reivindicación 13, en donde el ligando del receptor de la célula NKT es a-galactosilceramida.