DE69828603T2

DE69828603T2 - Verwendung von a-Glycosylceramiden zur Herstellung eines therapeutischen Mittels zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten

Info

Publication number: DE69828603T2
Application number: DE69828603T
Authority: DE
Inventors: Masaru Chiba-shi TANIGUCHI; Tetsu Chuo-ku KAWANO; Yasuhiko Takasaki-shi KOEZUKA
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date: 1997-04-10
Filing date: 1998-04-10
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2018-04-11
Also published as: DE69840528D1; EP1520583B1; ES2235324T3; JP3495740B2; WO1998044928A1; US6531453B1; ES2318236T3; KR100527950B1; EP0988860A4; TW592703B; CN1259872A; ATE421881T1; AU6748598A; KR20010006174A; CA2286482C; CN1222293C; CA2286482A1; ID23495A; EP0988860A1; US6747010B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf NKT-Zellen-aktivierende therapeutische Mittel für Autoimmunkrankheiten.
Stand der Technik
Es wurde offenbart, daß intermediäre TCR-Zellen (TCR^int-Zellen), die T-Zellrezeptoren (TCRn) intermediär exprimieren, mit natürlichen Killerzellen (NK, "natural killer cells") hinsichtlich ihrer Merkmale verwandt sind, beispielsweise zeigen sie eine große granuläre Lymphozyten(LGL)-artige Morphologie, exprimieren konstant IL-2Rβ-Ketten und haben Perforingranula, aber sie unterscheiden sich eindeutig von NK-Zellen, da sie TCRn aufweisen (H. Watanabe et al., J. Immunol., 155, 2972 (1995)). Überdies wurde gezeigt, daß unter den durch Interleukin 12 (IL-12) aktivierten TCR^int-Zellen 1.1-exprimierende NK 1.1⁺TCR^int-Zellen (NKT) wichtige Effektorzellen bei der Kontrolle von hämatogenen Metastasen von Tumoren der Leber und Lungen in Mäusen sind (W. Hashimoto et al., J. Immunol., 154, 4333 (1995); R. Anzai et al., Immunol., 88, 82 (1996)). Diese Daten lassen vermuten, daß die NKT-Zellen bei der Vernichtung von Krebszellen, Parasiten, Protozonen und intrazellulären infektiösen Bakterien, wie etwa Listeria monocytogenes und Mycobacterium tuberculosis (S. Seki et al., Clin. Immunol., 28, 1069 (1996)) eine wichtige Rolle spielen können.
Die NKT-Zellen sind auch bekannt dafür, daß sie eng verknüpft sind mit der akuten Abstoßung bei Knochenmarktransplantationen (B. Yankelevich et al., J. Immunol., 142, 3423 (1989)) und mit der Kontrolle der IgE-Antikörperproduktion bei der Kontrolle der Th1/Th2-Differenzierung von T-Helferzellen (T. Yoshimoto et al., J. Exp. Med., 179, 1285 (1994)). Somit sind die NKT-Zellen eine Gruppe neuer Zellen, die derzeit eine enorme Aufmerksamkeit erregen.
Vα14⁺-NKT-Zellen bilden eine Untergruppe der oben genannten NKT-Zellen. Viele Vα14⁺-NKT-Zellen exprimieren Vα14Jα281 mRNA und setzen dies als eine TCR-α-Kette ein. Kürzlich wurde gezeigt, daß die Vα14⁺-NKT-Zellen eng verknüpft sind mit dem Ausbrechen von Autoimmunkrankheiten. Es wurde offenbart, daß die Anzahl an Vα14⁺-NKT-Zellen vor dem Ausbruch einer Autoimmunkrankheit in MRL lpr/lpr Mäusen selektiv abnimmt, Modellmäusen für eine Autoimmunkrankheit (menschlicher systemischer Lupus erythematosus), bei denen sich abnormale Lymphozyten in einem Alter von 17-20 Wochen akkumulieren (M.A. Mieza et al., J. Immunol., 156, 4035 (1996)).
Ähnliche Phänomene wurden auch bei Modellmäusen für andere Autoimmunkrankheiten beobachtet, wie etwa gld Mäuse und (NZBxNZW) F1 Mäuse, was zeigt, daß die Vα14⁺-NKT-Zellen mit dem Ausbruch von Autoimmunkrankheiten eng verknüpft sind (Y. Makino et al., Clin. Immunol., 28, 1487 (1996)).
Noch interessanter ist, daß ähnliche Phänomene auch bei Menschen beobachtet wurden. Die Vα24JαQα-Kette, ein humanes Homolog der Maus Vα14Jα281-Kette, wurde in peripheren CD4^–/CD8^–T-Zellen des Bluts in einer Konzentration von 20-50 % in gesunden Menschen, jedoch überhaupt nicht in Sklerosepatienten gefunden (T. Sumida et al., J. Exp. Med., 182, 1163 (1995)).
Somit ist es bekannt, daß die Maus Vα14⁺-NKT-Zellen und humanen Vα24JαQα-T-Zellen in einer Vielzahl von Autoimmunkrankheiten involviert sind, die durch verschiedene verursachende Gene oder genetische Hintergründe verursacht werden. Folglich wurde erwartet, daß IL-12 mit einer NKT-Zellen-aktivierenden Aktivität, wie oben erwähnt, ein therapeutisches Mittel für Autoimmunkrankheiten, wie etwa menschlicher systemischer Lupus erythematosus (SLE) und systemische Sklerose (SSc) ist. Ein merkliches Ansteigen in der Anzahl an abnormalen Lymphozyten (CD3⁺B220⁺ doppelt negative T-Zellen) in der Milz und den Lymphknoten wurde jedoch in MRL lpr/lpr Mäusen beobachtet, denen IL-12 verabreicht worden war, im Vergleich zu Kontrollmäusen (Takenori Tsutsui et al., Proceedings of Annual Meeting of the Japanese Society for Immunology, 347 (1996)).
β-Galactosylceramide oder β-Glucosylceramide, in denen eine Vielzahl von Zuckern an Ceramide in einer β-Konfiguration gebunden sind, liegen im Säugetierkörper vor (L. Svennerholm et al., Biochim. Biophys. Acta, 280, 626 (1972); K.-A. Karlsson et al., Biochim. Biophys. Acta, 316, 317 (1973)). Andererseits ist es bekannt, daß β-Galactosylceramide eine ausgesprochene immunostimulatorische Wirkung und Antitumoraktivität aufweisen (M. Morita et al., J. Med. Chem., 38, 2176 (1995)) und solche Aktivitäten von α-Galactosylceramiden oder α-Glucosylceramiden sind bekanntlich viel stärker als jene der β-Galactosylceramide oder β-Glucosylceramide (K. Motoki et al., Biol. Pharm. Bull., 18, 1487 (1995)). Es ist auch bekannt, daß die Verabreichung von Verbindungen mit einer α-Glucosylceramid-Struktur den Körper vor Strahlung schützt (K. Motoki et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 5, 2413 (1995)), die Metastase von Maus-Melanom B16 zur Lunge unterdrückt (E. Kobayashi et al., Oncology Res., 7, 529 (1995)) sowie die Metastase von Maus-Darm-Adenokarzinom, Colon 26, und Maus-T-Lymphom EL-4 zur Leber (Kazuhiro Motoki et al., Proceedings of Annual Meeting of the Japanese Cancer Association, 523 (1996)) und die Anzahl an Blutplättchen und Leukozyten erhöht (K. Motoki et al., Biol. Pharm. Bull., 19, 952 (1996)).
JP 10045603 A lehrt die Verwendung eines Sulfatids als TNF-α-Inhibitors. WO 92/19633 schlägt vor, daß ein ähnliches Sulfatid als Antigen von pathogener Bedeutung in Autoimmunkrankheiten wirken kann.
Es gibt jedoch bis heute keine Berichte, daß Verbindungen mit einer α-Glucosylceramid-Struktur bei Autoimmunkrankheiten effektiv sind oder daß derartige Verbindungen überhaupt NKT-Zellen beeinflussen könnten.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegenden Erfinder haben nun gefunden, daß α-Glycosylceramide die Antitumor zytotoxische Aktivität gegen Tumorzellen von NKT-Zellen von RAG-1KO/Vα14tg/Vβ8.2tg Mäusen (Mäuse mit einer großen Anzahl an NKT-Zellen aber weder B-Zellen, T-Zellen noch NK-Zellen in der Lymphozytenfraktion) erhöhen, die Anzahl an NKT-Zellen deutlich erhöhen, insbesondere Maus Vα14⁺-NKT-Zellen und menschliche Vα24⁺-NKT-Zellen, abnormale Schwellungen von axiliären und inguinalen Lymphknoten (Akkumulierung von abnormalen Lymphozyten) in MRL lpr/lpr Mäusen unterdrücken, die als Modellmäuse für menschlichen systemischen Lupus erythematosus angesehen werden, und die Progression von durch 4 % DSS induzierter Maus-Colitis kontrollieren.
Die vorliegenden Erfinder haben auch gefunden, daß α-Glycosylceramide den Ausbruch von experimenteller Autoimmun-Encephalomyelitis unterdrücken. Diese experimentelle Autoimmun-Encephalomyelitis in Mäusen ist ein Modell für menschliche Multiple Sklerose. Die vorliegenden Erfinder haben auch gefunden, daß α-Glycosylceramide den spontanen Ausbruch von Diabetes in NOD Mäusen, die Modelltiere für menschliche Typ I-Diabetes darstellen, unterdrücken.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines therapeutischen Mittels für Autoimmunkrankheiten, wie etwa systemischer Lupus erythematosus, systemische Sklerose, Colitis ulcerosa, Encephalomyelitis, Multiple Sklerose oder Typ I-Diabetes.
Das therapeutische Mittel für Autoimmunkrankheiten gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt eine Verbindung, die in angefügtem Anspruch 1 definiert ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die verstärkende Wirkung von KRN7000 auf die zytotoxische Aktivität von NKT-Zellen gegen Tumorzellen. Das E/T-Verhältnis deutet die Anzahl von Effektorzellen (Milzzellenanzahl)/Anzahl von Zielzellen (YAC-1-Zellanzahl) an.
2 zeigt die Stimulierung der NKT-Zellproliferation durch KRN7000 in der Milz.

A: Ergebnisse der FRCS-Analyse der Lymphozytenfraktion der Milz. Die horizontale Achse zeigt die Fluoreszenz von FITC-markiertem anti-TCRαβ monoklonalem Antikörper an, und die vertikale Achse zeigt die Fluoreszenz von Zytochrommarkiertem anti-NK1.1 monoklonalem Antikörper an.
B: Resultate der FACS-Analyse der Lymphozytenfraktion der Milz. Die vertikale Achse zeigt die relative Anzahl an Zellen an, und die horizontale Achse zeigt die Fluoreszenz von PE-markiertem Vα14 monoklonalem Antikörper an. Die weiße Fläche zeigt die Fluoreszenz nach dem Färben mit dem PE-markierten Vα14 monoklonalen Antikörper nach der Vorbehandlung mit einem unmarkierten Vα14 monoklonalen Antikörper (kaltes Blockieren). Die schraffierte Fläche zeigt die Fluoreszenzverteilung der PE-markierten Vα14 monoklonalen Antikörper zu Vα14⁺-Zellen nach der Verabreichung des Vehikels oder von KRN7000.
C: Veränderung in der Anzahl an Zellen insgesamt, T-Zellen, NK-Zellen und Vα14+-NKT-Zellen in der Lymphozytenfraktion der Milz durch die Verabreichung von KRN7000. •: Vα14⁺-NKT-Zellen, O: Gesamtzahl an Zellen, ♢: T-Zellen, ⎕: NK-Zellen.

3 zeigt die Ergebnisse hinsichtlich der Progression der lymphatischen Schwellung über die Zeit in lpr/lpr Mäusen, denen KRN7000 verabreicht wurde. Die Lymphknoten wurden in 4 Stufen eingeteilt, d.h. –(0), +(1), ++(2) und +++(3), abhängig von der Größe. Aufsummierte Bewertungen der rechten und der linken Seite der axiliären Lymphknoten (A) oder inguinalen Lymphknoten (B) sind als Lymphknoten-Schwellungsindices dargestellt.
4 zeigt die Überlebensraten von MRL lpr/lpr Mäusen, denen KRN7000 verabreicht wurde.
5 zeigt die Aktivität von KRN7000 bei der Unterdrückung von durch 4 %iges DSS induzierter Colitis in Mäusen. 4 %iges DSS wurde während des Experiments den Mäusen kontinuierlich über das Trinkwasser verabreicht.

A: Veränderung im Körpergewicht der Mäuse der verschiedenen Gruppen.
B: Überlebensraten der Mäuse der verschiedenen Gruppen.

6 zeigt den Effekt von KRN7000 auf experimentelle Autoimmun-Encephalomyelitis (EAE), die in C57BL/6 Mäusen beispielsweise durch Myelinoligodendrogliaprotein (MOG) induziert wird. A: Gruppe, der das Vehikel verabreicht wurde. B: Gruppe, der KRN7000 (20 μg/kg) verabreicht wurde.
EAE-Symptome wurden wie folgt bewertet: Klinische Bewertungen: 0: normal, 1: Paralyse im Schwanz, 2: statische Reflexinsuffizienz, 3: Paralyse in den Hinterpfoten, 4: Paralyse in den Vorder- und Hinterpfoten, 5: Tod.
7 zeigt die Wirkung von KRN7000 auf spontane Diabetes in NOD Mäusen.
8 zeigt die stimulatorische Aktivität von KRN7000 bei der Proliferation von Vα24⁺-NKT-Zellen. Nach einer autologen gemischten Lymphozytenreaktion unter Verwendung peripherer mononuklearer Blutzellen als Responderzellen wurden CD4^–CF8^–-Zellen wiedergewonnen, um unter Verwendung markierter Antikörper den Phänotyp zu spezifizieren. Gepunktete Linien zeigen die Fluoreszenzverteilung an bei Markierung mit Kontrollantikörpern (Maus IgG oder Ratte IgM), und durchgezogene Linien zeigen die Fluoreszenzverteilung an bei Markierung mit anti-CD3, CD4, CD8 und Va24, Vβ11 Antikörpern (Immunotech) und anti-NKRP1A Antikörpern (Becton Dickinson).
9 zeigt die stimulatorische Aktivität von KRN7000 in der Vα24⁺-NKT-Zellproliferation. Bei der Behandlung von Antigen-präsentierenden Zellen mit KRN7000 wurde die Proliferation von Vα24⁺-NKT-Zellen in einer von der Anzahl der Antigen-präsentierenden Zellen abhängigen Weise beobachtet.
10 zeigt das Schema der Reaktionen zur Synthese von KRN7000, der repräsentativen α-Glycosylceramidverbindung, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird. In der Zeichnung repräsentiert pyr Pyridin, BrPPh₃(CH₂)₁₂CH₃ repräsentiert Tridecantriphenylphospnoiumbromid, n-BuLi repräsentiert n-Butyllithium, MsCl repräsentiert Methansulfonylchlorid, BnBr repräsentiert Benzylbromid und 1-PrOH repräsentiert Propylalkohol.
11 ist die Fortführung der in 10 dargestellten Synthesereaktionen. WSC-HCl repräsentiert 1-Ethyl-3-(3'-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid, MS4A repräsentiert Molekularsiebe mit 4Å und Hex4NBr repräsentiert Tetrahexylammoniumbromid.
12 stellt die chemischen Formeln der Verbindungen in Beispielen 1 bis 3 dar.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Verbindungen der Formel (I)
In den Verbindungen der Formel (I) repräsentiert X in der Ceramidgruppe vorzugsweise eine ganze Zahl zwischen 11 und 25.
Y in R² repräsentiert vorzugsweise eine ganze Zahl zwischen 9 und 17, stärker bevorzugt zwischen 11 und 15.
Bevorzugte Kombinationen von X und R² in der Ceramidgruppe der Formel (I) sind Verbindungen, in denen X eine ganze Zahl zwischen 21 und 25 und R² der Substituent (b) ist (worin Y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 ist) und Verbindungen, in denen X eine ganze Zahl zwischen 9 und 13 ist und R² der Substituent (a) ist (worin Y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 ist).
Bevorzugte Kombinationen für R³ bis R⁹ in dem Zuckerrest von Formel (I) sind Verbindungen, in denen R³ und R⁶ H sind, R⁴ ist OH oder irgendeiner der Substituenten der Gruppen (A) bis (D), R⁵ ist OH oder irgendeiner der Substituenten der Gruppen (E) oder (F), R⁷ und R⁸ sind jeweils H oder OH (aber R⁷ und R⁸ unterscheiden sich voneinander) und R⁹ ist CH₂OH, CH₃, H oder irgendein Substituent der Gruppen (A') bis (D').
Stärker bevorzugte Kombinationen umfassen Verbindungen, in denen R³ und R⁶ H sind, R⁴ und R⁵ sind OH, R⁷ und R⁸ sind jeweils H oder OH (aber R⁷ und R⁸ unterscheiden sich voneinander) und R⁹ ist CH₂OH oder irgendein Substituent der Gruppen (A') bis (D'), und Verbindungen, in denen R³, R⁶ und R⁸ H sind, R⁴, R⁵ und R⁷ OH sind und R⁹ CH₂OH ist.
Bevorzugte Beispiele der Verbindungen nach Formel (I) umfassen Verbindungen, in denen
X eine ganze Zahl zwischen 21 und 25 ist,
R² Substituent (b) ist (worin Y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 ist),
R³ und R⁶ H sind,
R⁴ OH ist oder eine Gruppe, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gruppen (A) bis (D),
R⁵ ist OH oder eine Gruppe, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gruppen (E) und (F),
R⁷ und R⁸ sind jeweils H oder OH (aber R⁷ und R⁸ sind nicht beide derselbe Substituent) und
R⁹ ist CH₂OH oder eine Gruppe, die ausgewählt ist der Gruppe bestehend aus Gruppen (A') bis (D');
Verbindungen, in denen
X eine ganze Zahl zwischen 9 und 13 ist,
R² Substituent (a) ist (worin Y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 ist),
R³ und R⁶ H sind,
R⁴ und R⁵ OH sind,
R⁷ und R⁸ sind jeweils H oder OH (aber R⁷ und R⁸ sind nicht beide derselbe Substituent) und
R⁹ ist H, CH₃ oder CH₂OH;
Verbindungen, in denen
X eine ganze Zahl zwischen 21 und 25 ist,
R² Substituent (b) ist (worin Y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 ist),
R³ und R⁶ H sind,
R⁴ und R⁵ OH sind,
R⁷ und R⁸ sind jeweils H oder OH (aber R⁷ und R⁸ sind nicht beide derselbe Substituent) und
R⁹ ist CH₂OH oder eine Gruppe, die ausgewählt ist der Gruppe bestehend aus Gruppen (A') bis (D'); und Verbindungen, in denen
X eine ganze Zahl zwischen 21 und 25 ist,
R² Substituent (b) ist (worin Y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 ist),
R³, R⁶ und R⁸ H sind,
R⁴, R⁵ und R⁷ OH sind und
R⁹ ist CH₂OH.
Bevorzugte Verbindungen als effektive Komponenten von therapeutischen Mitteln gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen:
(2S,3S,4R)-1-(α-D-Galactopyranosyloxy)-2-hexacosanoylamino-3,4-octadecandiol (KRN7000),
(2S,3R)-1-(α-D-Galactopyranosyloxy)-2-tetradecanoylamino-3-octadecanol (AGL-517),
(2S,3R)-1-(α-D-Glucopyranosyloxy)-2-tetradecanoylamino-3-octadecanol (AGL-563),
(2S,3R)-1-(6'-Deoxy-α-D-galactopyranosyloxy)-2-tetradecanoylamino-3-octadecanol (AGL-571),
(2S,3R)-1-(β-L-Arabinopyranosyloxy)-2-tetradecanoylamino-3-octadecanol (AGL-577),
O-α-D-Galactopyranosyl-(1→6)-O-α-D-galactopyranosyl-(1→1)-(2S,3S,4R)-2-amino-N-hexacosanoyl-1,3,4-octadecantriol (AGL-586),
O-α-D-Galactopyranosyl-(1→6)-O-α-D-glucopyranosyl-(1→1)-(2S,3S,4R)-2-amino-N-hexacosanoyl-1,3,4-octadecantriol (AGL-584),
O-α-D-Galactopyranosyl-(→2)-O-α-D-galactopyranosyl-(1→1)-(2S,3S,4R)-2-amino-N-[(R)-2-hydroxytetracosanoyl]-1,3,4-octadecantriol (S1140B-9),
O-β-D-Galactofuranosyl-(1→3)-O-α-D-galactopyranosyl-(1→1)-(2S,3S,4R)-2-amino-N-[(R)-2-hydroxytetracosanoyl]-1,3,4-octadecantriol (719-7) und
O-(N-Acetyl-2-amino-2-deoxy-α-D-galactopyranosyl-(1→3)-O-[α-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-α-D-galactopyranosyl-(1→1)-(2S,3S,4R)-2-amino-N-[(R)-2-hydroxytetracosanoyl]-1,3,4-octadecantriol (STL-8).
Eine besonders bevorzugte Verbindung, die als aktiver Bestandteil in therapeutischen Mitteln gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, ist (2S,3S,4R)-1-(α-D-Galactopyranosyloxy)-2-hexacosanoylamino-3,4-octadecandiol (KRN7000).
Die Verbindungen der Formel (I) können in Form von pharmazeutisch akzeptablen nichttoxischen Salzen davon sein. Salze von Formel (I) umfassen Säureadditionssalze wie etwa Salze mit anorganischen Säuren (z.B. Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure und Phosphorsäure) oder mit organischen Säuren (z.B. Essigsäure, Propionsäure, Maleinsäure, Ölsäure, Palmitinsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Fumarsäure, Glutaminsäure, Pantothensäure, Laurylsulfonsäure, Methansulfonsäure und Phthalsäure).
Die Verbindungen der Formel (I) können in Form von Solvaten davon (z.B. Hydraten) sein.
Die Verbindungen der Formel (I) können durch irgendeine zielgerichtete Methode zur Synthetisierung von α-Glycosylceramiden hergestellt werden.
Zunächst wird eine Ceramidgruppe synthetisiert unter Verwendung von D-Lyxose als Ausgangsmaterial, anschließend wird ein Zucker in dieses Ceramid eingeführt unter Herstellung von Verbindungen nach Formel (I). Ein allgemeines Verfahren zur Synthetisierung derartiger α-Glycosylceramide kann beispielsweise in WO 93/5055, WO 94/2168, WO 94/9020 und WO 94/24142 gefunden werden.
Die Verbindungen der Formel (I) können auch aus natürlichen Produkten (z.B. biologischen Organismen) isoliert werden und mittels Säulenchromatografie oder dergleichen gereinigt werden.
Verwendung der Verbindungen nach Formel (I)
Die vorliegenden Erfinder haben gefunden, daß die Antitumor zytotoxische Aktivität von NKT-Zellen gegen Tumorzellen verstärkt wurde, wenn KRN7000, eine repräsentative Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung, an RAG-1KO/Vα14tg/Vβ8.2tg Mäuse verabreicht wurde (Pharmakologisches Testbeispiel 1).
Die vorliegenden Erfinder haben gefunden, daß α-Glycosylceramide die Anzahl von NKT-Zellen merklich erhöhen, insbesondere Vα14⁺-NKT-Zellen und Vα24⁺-NKT-Zellen (Pharmakologische Testbeispiele 2, 6 und 9). Es konnte gezeigt werden, daß Maus Vα14⁺-NKT-Zellen und menschliche Vα24⁺-NKT-Zellen an einer Vielzahl von durch verschiedene ursächliche Gene und genetische Hintergründe verursachte Autoimmunkrankheiten involviert sind, was nahegelegt wird durch Befunde, daß Vα14⁺-NKT-Zellen in Autoimmunkrankheits-Modellmäusen abnehmen, daß Vα24⁺JαQα-T-Zellen bei Sklerosepatienten verschwinden und daß Vα24⁺-NKT-Zellen in Patienten mit fortgeschrittener Typ I-Diabetes stark abnehmen (M.A. Mieza et al., J. Immunol., 156, 4035 (1996); Y. Makino et al., Clin. Immunol., 28, 1487 (1996); T. Sumida et al., J. Exp. Med., 182, 1163 (1995); Wilson et al., Nature, 391, 177 (1998)). Die vorliegenden Erfinder haben auch gefunden, daß wenn KRN7000 an MRL lpr/lpr Mäuse, die als Modellmäuse für menschlichen systemischen Lupus erythematosus angesehen werden (Sakamoto, A. Clin. Immunol., 28, 1558 (1996)), verabreicht wird, abnormale Schwellungen der axiliären und inguinalen Lymphknoten (Akkumulierung von abnormalen Lymphozyten) unterdrückt wurde (Pharmakologisches Testbeispiel 3). Die abnormale Schwellung von Lymphknoten ist ein charakteristisches Symptom, das beim Altern von MRL lpr/lpr Mäusen beobachtet wird.
"NKT-Zellen", wie hierin verwendet, umfassen menschliche Vα24⁺-NKT-Zellen und Maus Vα14⁺-NKT-Zellen. Menschliche Vα24⁺-NKT-Zellen sind eine Untergruppe menschlicher Vα24JαQα-T-Zellen und bedeuten Vα24⁺ doppelt negative (CD4^–CD8^–) T-Zellen (P. Dellabona et al., J. Exp. Med., 180, 1171 (1994)). Weiterhin umfassen die Begriffe "NKT-Zellaktivierung" oder "Aktivierung von NKT-Zellen" die Verstärkung der zytotoxischen Aktivität und Stimulierung von NKT-Zellproliferation.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Verbindung nach Formel (I) oder ein Salz oder Solvat davon eingesetzt werden zur Herstellung eines therapeutischen Mittels für Autoimmunkrankheiten. Der Begriff "Autoimmunkrankheiten" wie hierin verwendet umfaßt systemischen Lupus erythematosus, systemische Sklerose, Colitis ulcerosa, Multiple Sklerose, Encephalomyelitis, Typ I-Diabetes, chronischen artikulären Rheumatismus, Sjoegren-Syndrom, primäre biliäre Zirrhose, idiopathische thrombocytopenische Purpura, Autoimmunhämolytische Anämie, Myastenia gravis, sympathetische Ophthalmie, Goodpasture-Syndrom (z.B. glomeruläre Nephritis), perniziöse Anämie und Hashimoto-Syndrom. Der Begriff "Behandlung" oder "Therapie" wie hier hierin verwendet umfaßt "Prävention".
Die Verbindung der Formel (I) oder ein Salz oder Solvat davon und IL-12 können in geeignete Dosierungsformen formuliert werden, abhängig von der medizinischen Behandlung, Verabreichungsroute und Zweck der Verabreichung, z.B. injizierbare Mittel, Suspensionen, Emulsionen, Salben, Cremes, Tabletten, Kapseln, Granulate, Pulver, Pillen, Körner, Pastillen, Formulierungen zur rektalen Verabreichung, ölige Suppositorien und wasserlösliche Suppositorien.
Diese verschiedenen pharmazeutischen Formulierungen können mittels konventioneller Verfahren unter Verwendung der folgenden pharmazeutisch akzeptablen Träger oder dergleichen hergestellt werden: Auszugsmittel wie etwa Lösungsmittel (z.B. Wasser, physiologische Salzlösung), Massemittel und Füllmittel (z.B. Lactose, Stärke, kristalline Cellulose, Mannit, Maltose, Kalziumhydrogenphosphat, Weichkieselsäureanhydrid und Kalziumcarbonat), Hilfsmittel wie etwa Löslichmacher (z.B. Ethanol und Polysolvate), Bindemittel (z.B. Stärke, Polyvinylpyrrolidin, Hydroxypropylcellulose, Ethylcellulose, Carboxymethylcellulose und Gummi arabikum), Desintegrationsmittel (z.B. Stärke und Carobxymethylcellulosekalzium), Gleitmittel (z.B. Magnesiumstearat, Talk und hydriertes Öl), Stabilisatoren (z.B. Lactose, Mannit, Maltose, Polysolvate, Macrogol und Polyoxyethylen-hydriertes Castoröl), isotonische Mittel, Benetzungsmittel, Gleitmittel, Dispersionsmittel, Puffer und Löslichmacher, und Additive wie Antioxidantien, Konservierungsmittel, Geschmacksstoffe und Aromastoffe, Analgetika, Stabilisatoren, Färbemittel und Süßmittel.
Falls nötig können auch Glycerin, Dimethylacetamid, 70 %iges Natriumlactat, Tenside und alkalische Substanzen (z.B. Ethylendiamin, Ethanolamin, Natriumcarbonat, Arginin, Meglumin und Trisaminomethan) den verschiedenen pharmazeutischen Formulierungen ebenfalls zugefügt werden.
In der vorliegenden Erfindung können die Verbindung der Formel (I) und IL-12 über jeden denkbaren Weg verabreicht werden, zum Beispiel im Fall von Tieren durch intraperitoneale oder subkutane Verabreichung, durch intravenöse oder intra-arterielle Verabreichung und lokale Verabreichung durch Injektion. Weiterhin kann im Fall von Menschen eine intravenöse oder intra-arterielle Verabreichung, eine lokale Verabreichung durch Injektion, eine intraperitoneale oder Intrathorax-Verabreichung, eine subkutane Verabreichung, eine intramuskuläre Verabreichung, eine sublinguale Verabreichung, eine perkutane Absorption oder rektale Verabreichung verwendet werden. Die intravenöse Verabreichung wird besonders bevorzugt.
Individuelle effektive Bestandteile in Therapeutika der vorliegenden Erfindung können kontinuierlich oder beabstandet, abhängig von den individuellen Situationen, verabreicht werden. Tatsächliche Dosierungen werden abhängig von einer Vielzahl von Faktoren, wie z.B. dem Verabreichungsweg, bestimmt, den Bedingungen des Patienten, wie z.B. Alter, Körpergewicht, Geschlecht und Empfindlichkeit, Zeitpunkt der Verabreichung und anderen Medikamenten, die zusätzlich genommen werden. Eine tägliche Dosis der Verbindungen der Formel (I) und IL-12 für einen erwachsenen Menschen für z.B. eine intravenöse Verabreichung liegt allgemein zwischen 0,001 und 10 mg, vorzugsweise zwischen 0,01 und 1 mg. Die Verbindung der Formel (I) wird vorzugsweise in gefriergetrocknete Präparationen formuliert, die vorzugsweise mit Injektionsgrad destilliertem Wasser direkt vor der Verabreichung an den Patienten gelöst werden.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele illustriert.
Synthese, Isolierung und Reinigung der Verbindungen
Beispiel 1: Synthese von (2S,3S,4R)-1-(α-D-Galactopyranosyloxy)-2-hexacosanoylamino-3,4-octadecandiol (KRN7000)
Die Synthetisierungsschritte sind in 10 und 11 dargestellt.
(1) Synthese von Verbindung G1
Schwefelsäure (0,5 ml) wurde zu einer Lösung aus D-Lyxose (200 g, 1,33 mol) in Aceton (3,0 l), die mit Kalziumchlorid getrocknet worden war, zugefügt und die Mischung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Molekularsiebe 4A Pulver (100 g) wurde zugefügt, die Reaktionsmischung wurde neutralisiert, dann mit Celite gefiltert, und der resultierende Rest wurde mit Aceton gewaschen. Das Filtrat und die Waschung wurden kombiniert und unter Vakuum konzentriert, um ein Rohprodukt von G1 zu erhalten. Ertrag 240 g (95 %). Das Produkt wurde für den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet. Eine Probe für einen Assay wurde durch Silicagelchromatografie unter Verwendung von Hexan:Aceton (9:1) als Elutionslösungsmittel gereinigt.
Smp. 76–78°C; FDMS m/z 191(M+1)⁺; ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 5,45 (1H, d, J=1, 8Hz), 4,83 (1H, dd, J=3,7, 5,5Hz), 4,64 (1H, d, J=6,1Hz), 4,27–4,30 (1H, m), 3,90–3,99 (2H, m), 1,48 (3H, s), 1,32 (3H, s)
(2) Synthese von Verbindung G2
Pyridin (10 ml) und Tritylchlorid (39,0 g) wurden zu einer Methylenchloridlösung (168 ml) der Verbindung G1 (239 g, ungefähr 1,26 mmol) zugefügt und die Mischung wurde 4 Stunden bei 32°C gerührt. Ethanol (8 ml) wurde tropfenweise zugefügt und die Mischung wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach einem Waschen mit einer wäßrigen gesättigten Ammoniumchloridlösung, einer wäßrigen gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung und einer Salzlösung wurde eine Konzentration unter Vakuum durchgeführt. Der resultierende Rest wurde in Ethylacetat gelöst, auf 0°C abgekühlt und dann kristallisiert. Ertrag 501 g (87 % von D-Lyxose).
Smp. 174–176°C; FDMS m/z 432M⁺; ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7,21–7,49 (15H, m), 5,38 (1H, d, J=2,4Hz), 4,75 (1H, dd, J=3,7, 6,1Hz), 4,59 (1H, d, J=6,1Hz), 4,31–4,35 (1H, m), 3,43 (1H, dd, J=4,9, 9,8Hz), 3,39 (1H, dd, J=6,7, 9,8Hz), 1,29 (3H, s), 1,28 (3H, s)
(3) Synthese von Verbindung G3
Zu einer THF-Lösung (1.500 ml) von Tridecantriphenylphosphoniumbromid (962 g, 1,16 mol; hergestellt durch Erwärmen von 1-Bromtridecan und Triphenylphosphin für 4,5 Stunden bei 140°C) wurde eine 2,5 M Hexanlösung von n-Butyllithium (462 ml, 366 mmol) tropfenweise bei 0°C unter einer Argonatmosphäre zugefügt. Die Mischung wurde 15 Minuten gerührt, dann wurde eine THF-Lösung (450 ml) der Verbindung G2 (250 g, 579 mmol) tropfenweise zugefügt. Diese Mischung wurde 18 Stunden gerührt, während die Temperatur graduell auf Raumtemperatur erhöht wurde. Die Reaktionslösung wurde im Vakuum konzentriert, eine Mischung aus Hexan:Methanol:Wasser (10:7:3, 1.000 ml) wurde dem Rest zugefügt, und die Mischung wurde mit einer wäßrigen gesättigten Ammoniumchloridlösung gewaschen. Die Wasserschicht wurde mit Hexan extrahiert (500 ml). Alle organischen Schichten wurden kombiniert, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert, um ein Rohprodukt der Verbindung G3 zu erhalten. Das Produkt wurde für den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet. Ertrag 339 g (98 %). Eine Probe für den Assay wurde durch Silicagelchromatografie unter Verwendung von Hexan:Ethylacetat (9:1) als Elutionslösungsmittel gereinigt.
FDMS m/z 598M⁺; ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7,21–7,45 (15H, m), 5,48–5, 59 (2H, m), 4,91 (0,7H, t, J=7, 3Hz), 4,44 (0, 3H, t, J=7,3Hz), 4,26 (0,3H, dd, J=4,3, 7,3Hz), 4,21 (0,7H, dd, J=4,3, 6,7Hz), 3,75 (0,7H, m), 3,69 (0,3H, m), 3,24 (0,3H, dd, J=4,9, 9,8Hz), 3,17 (0,7H, dd, J=4,9, 9,8Hz), 3,09–3,14 [1H, (3,11, dd, J=4,9, 9,2Hz) H1bEüberlappend], 1,75–2,03 (2H, m), 1,49 (3H, s), 1,39 und 1,38 (3H, jeweils s), 1,21–1,34 (20H, m), 0,88 (3H, t, J=6,7Hz)
(4) Synthese von Verbindung G4
Zu einer Methylenchloridlösung (1.500 ml) von Verbindung G3 (338 g, ungefähr 565 mol) wurde Pyridin (500 ml) zugefügt und Methansulfonylchlorid (49 ml, 633 mmol) wurde tropfenweise zugefügt. Die Mischung wurde 24 Stunden bei 31°C gerührt. Ethanol (40 ml) wurde tropfenweise zugefügt und die Mischung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Nach Konzentration im Vakuum wurde eine Mischung aus Hexan:Methanol:Wasser (10:7:3, 1.000 ml) zu dem Rest für eine Abtrennung zugefügt. Die Wasserschicht wurde 3-mal mit Hexan (200 ml) extrahiert. Alle organischen Schichten wurden kombiniert, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert, um ein Rohprodukt der Verbindung G4 zu erhalten. Das Produkt wurde für den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet. Ertrag 363 g (95 %). Eine Probe für den Assay wurde durch Silicagelchromatografie unter Verwendung von Hexan:Ethylacetat (9:1) als Elutionslösungsmittel gereinigt.
FDMS m/z 676M⁺; ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7,21–7,47 (15H, m), 5,41 (0,7H, ddd, J=5,5, 9,2, 11,0Hz), 5,32 (0,7H, bt, J=11,0Hz), 5,22 (0,3H, bdd, J=9,2, 15,0Hz), 5,02 (0,3H, dt, Jt=7,3Hz, Jd=15,0Hz), 4,8 (0,7H, ddd, J=3,1, 5,5, 7,9Hz), 4,73 (0,7H, dd, J=5,5, 9,8Hz), 4,64–4,67 (0,3H, m), 4,61 (0,3H, dd, J=5,5, 9,2Hz), 4,48 (0,7H, dd, J=5,5, 7,9Hz), 4,22 (0,3H, dd, J=5,5, 9,2Hz), 3,55 (0,3H, dd, J=2,4, 11,6Hz), 3, 45 (0,7H, dd, J=3, 2, 11,0Hz), 3,06–3,12 [4H, (3,12, s), (3,11, s), (3,09, dd, J=3, 1, 11,0Hz)], 1,66–1,82 (2H, m), 1,47 und 1,46 (3H, jeweils s), 1,39 (3H, s), 1,13–1,35 (20H, m), 0,88 (3H, t, J=6,8Hz)
(5) Synthese von Verbindung G5
Zu einer Methylenchoridlösung (1.500 ml) der Verbindung G4 (362, ungefähr 563 mol) wurde Methanol (350 ml) zugefügt, dann wurde konzentrierte Salzsäure (200 ml) tropfenweise zugefügt. Die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde durch Zugabe von Natriumhydrogencarbonat neutralisiert, dann gefiltert. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert und Ethylacetat wurde dem resultierenden Rest zugefügt und ein Waschschritt wurde mit einer Salzlösung durchgeführt. Die Wasserschicht wurde mit Ethylacetat extrahiert, alle organischen Schichten wurden kombiniert, über wasserfreien Magnesiumsulfat getrocknet, dann im Vakuum konzentriert. Die Kristallisierung wurde mit Hexan durchgeführt. Ertrag 161 g (70 % von G2).
Smp. 66–67°C; FDMS m/z 377(M-H₂O)⁺; ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃+D₂O) δ 5,86 (0,3H, dt, Jt=7,3Hz, Jd=14,7Hz), 5,77 (0,7H, dt, Jt=7,3, Jd=10,4Hz), 5,55 (0,3H, br.dd, J=7,3, 14,7Hz), 5,49 (0,7H, bt, J=9,8Hz), 4,91–4,97 (1H, m), 4,51 (0,7H, bt, J=9,8Hz), 4,11 (0,3H, bt, J=7,3Hz), 3,94–4,03 (2H, m), 3,67–3,73 [1H, (3,70, dd, J=3,1, 6,7Hz), (3,69, dd, J=3,1, 7,3Hz)], 3,20 und 3,19 (3H, jeweils s), 2,05–2,22 (2H, m), 1,22–1,43 (20H, m), 0,88 (3H, t, J=6,7Hz)
(6) Synthese von Verbindung G6
Zu einer THF-Lösung (780 ml) der Verbindung G5 (160 g, ungefähr 405 mol) wurde 5 % Palladiumbariumsulfat (16 g) zugefügt. Nach Ersatz der Luft in einer Reaktionskammer mit Wasserstoffgas wurde die Mischung 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde unter Verwendung von Celite gefiltert, dann mit einer Mischung aus Chloroform:Methanol (1:1) gewaschen. Das Filtrat und die Waschung wurden kombiniert und im Vakuum konzentriert. Der resultierende Rest wurde mit Ethylacetat kristallisiert. Ertrag 146 g (91 %).
[α]²³ _D+12° (c1, CHCl₃/MeOH=1:1); Smp. 124–126°C; FDMS m/z 397(M+1)⁺; ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃/CD₃OD=1:1) δ 4,93–4,96 (1H, m, H2), 3,91 (1H, dd, J=6,7, 12,2Hz), 3,85 (1H, dd, J=4, 9, 12,2Hz), 3,54–3,60 (1H, m), 3,50 (1H, dd, J=1,8, 8,5Hz), 3,19 (3H, s), 1,75–1,83 (1H, m), 1,53–1,62 (1H, m), 1,21–1,45 (24H, m), 0,89 (3H, t, J=6,7Hz)
(7) Synthese von Verbindung G7
Zu einer DMF-Lösung (1.000 ml) der Verbindung G6 (145 g, 365 mol) wurde Natriumazid (47 g, 730 mmol) zugefügt und die Mischung wurde 4 Stunden bei 95°C gerührt. Die Reaktionslösung wurde konzentriert, Ethylacetat wurde dem resultierenden Rest zugefügt und das Waschen wurde mit Wasser durchgeführt. Die Wasserschicht wurde wieder mit Ethylacetat extrahiert. Alle organischen Schichten wurden kombiniert, mit einer Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann unter Vakuum konzentriert, um ein Rohprodukt von Verbindung G7 zu erhalten. Ertrag 122 g (97 %). Das Produkt wurde für den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet. Ertrag 126 g (95 %). Eine Probe für den Assay wurde durch Silicagelchromatografie unter Verwendung von Hexan:Ethylacetat (9:1) als Elutionslösungsmittel gereinigt.
[α]²³ _D+16,5° (c0,5, CHCl₃/MeOH=1:1); Smp. 92–93°C; FDMS m/z 344 (M+1)⁺; ¹H-NMR (500 MHz, CD₃OD) δ 3,91 (1H, dd, J=3,7, 11,6Hz), 3,75 (1H, dd, J=7,9, 11,6Hz), 3,49–3,61 (3H, m), 1,50–1,71 (2H, m), 1,22–1,46 (24H, m), 0,90 (3H, t, J=6,7Hz)
(8) Synthese von Verbindung G8
Zu einer Methylenchloridlösung (750 ml) der Verbindung G7 (121 g, ungefähr 352 mmol) wurden Pyridin (250 ml) und Tritylchlorid (124 g, 445 mol) zugefügt und die Mischung wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Ethanol (30 ml) Würde tropfenweise zugefügt. Die Mischung wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, mit einer wäßrigen gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen sowie mit einer wäßrigen gesättigten Ammoniumchloridlösung und einer Salzlösung, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert. Der Rest wurde durch Silicagelchromatografie unter Verwendung von Hexan:Ethylacetat (10:1) als Elutionslösungsmittel gereinigt. Ertrag 34,4 g (52 % von G6).
[α]²⁴ _D+11,9° (c0,9, CHCl₃); FDMS m/z 585M⁺; ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃+D₂O) δ 7,24–7,61 (15H, m), 3,62–3,66 (2H, m), 3,51–3,57 (2H, m), 3,42 (1H, dd, J=6,0, 10,4Hz), 1,23–1,56 (26H, m), 0,88 (3H, t, J=6,7Hz)
(9) Synthese von Verbindung G9
Zu einer DMF-Lösung (300 ml) der Verbindung G8 (33,5 g, 57,3 mmol) wurde 60 %iges hydriertes Natrium (5,5 g, ungefähr 138 mmol als NaH) zugefügt und die Mischung wurde 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde auf 0°C abgekühlt und Benzylchlorid (15 ml, 120 mmol) wurde tropfenweise zugefügt. Die Mischung wurde 18 Stunden gerührt, während die Temperatur graduell auf Raumtemperatur angehoben wurde. Eiswasser (100 ml) wurde der Reaktionslösung zugefügt. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde eine Extraktion unter Verwendung von Ethylacetat durchgeführt. Der Extrakt wurde 3-mal mit einer Salzlösung gewaschen und alle organischen Schichten wurden kombiniert, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum zum Erhalt eines Rohprodukt von Verbindung G9 konzentriert. Das Produkt wurde für den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet. Ertrag 42,2 g (96 %). Eine Probe für den Assay wurde durch Silicagelchromatografie unter Verwendung von Hexan:Ethylacetat (100:1) als Elutionslösungsmittel gereinigt.
[α]²⁴ _D+9,8° (c1,0, CHCl₃); FDMS m/z 738(M-N₂)⁺; ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7,07–7,48 (25H, m), 4,57 (1H, d, J=11,6Hz), 4,44 (1H, d, J=11,6Hz), 4,41 (2H, s), 3,73–3,79 (1H, m), 3,46–3,56 (2H, m), 3,37 (1H, dd, J=8,6, 10,4Hz), 1,20–1,64 (26H, m), 0,88 (3H, t, J=6, 7Hz)
(10) Synthese von Verbindungen G10 und G11
Zu einer 1-Propanollösung (250 ml) der Verbindung G9 (41,2 g, ungefähr 54 mmol) wurde Methanol (30 ml) zugefügt und es wurden weiterhin 5 % Palladiumkohlenstoff (4,1 g) und Ammoniumformat (27,1 g, 4,3 mol) zugefügt. Nach einem Rühren für 16 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Mischung mit Ethylacetat verdünnt und mit Celite gefiltert. Das Filtrat wurde unter Vakuum konzentriert und der resultierende Rest wurde mit Ethylacetat verdünnt und 3-mal mit einer wäßrigen gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung und einer Salzlösung gewaschen. Alle organischen Schichten wurden kombiniert, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert, um ein Rohprodukt von G10 zu erhalten. Ertrag 38,9 g (98 %). Das so erhaltene G10 wurde für den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet.
Zu einer Methylenchloridlösung (300 ml) der Verbindung G10 wurden Hexacosansäure (22,4 g, 56,5 mmol) und WSC-Hydrogenchlorid (12,6 g, 64,6 mmol) zugefügt und die Mischung wurde 2 Stunden unter Erwärmen im Rückfluß gekocht. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und im Vakuum konzentriert. Ethylacetat (500 ml) wurde dem Rest zugefügt, und das Waschen wurde mit einer wäßrigen 0,5 M Salzsäurelösung, einer Salzlösung und einer wäßrigen gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung durchgeführt und weiter mit einer Salzlösung. Alle organischen Schichten wurden kombiniert, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann unter Vakuum konzentriert, um ein Rohprodukt der Verbindung G11 zu erhalten. Ertrag 53,2 g (88 %). Das so erhaltene G11 wurde für den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet. Eine Probe für den Assay wurde durch Silicagelchromatografie unter Verwendung von Hexan:Ethylacetat (100:1) als Elutionslösungsmittel gereinigt.
[α]²⁴ _D+5,3° (c0,4, CHCl₃); FDMS m/z 1118M⁺; ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7,20–7,38 (25H, m), 5,57 (1H, d, J=9,1Hz), 4,80 (1H, d, J=11, 6Hz), 4,48-4,50 (3H, m), 4,24–4,32 (1H, m), 3,83 (1H, dd, J=3,0, 6,7Hz), 3,43–3,51 (2H, m, H1a), 3,29 (1H, dd, J=4,3, 9,8Hz), 1,92 (2H, t, J=7,3Hz), 1,28–1,60 (72H, m), 0,88 (6H, t, J=6, 7Hz)
(11) Synthese von Verbindung G12
Zu einer Methylenchloridlösung (180 ml) der Verbindung G11 (52,2 g, ungefähr 47 mmol) wurde Methanol (36 ml) zugefügt, dann wurde eine 10 %ige Methanolchloridlösung (3,0 ml) tropfenweise zugefügt und die Mischung wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde mit Natriumhydrogencarbonatpulver (18 g) neutralisiert und mit Celite gefiltert. Der Rest wurde mit Methylenchlorid gewaschen. Das Filtrat und die Waschung wurden kombiniert und mit einer Salzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann unter Vakuum konzentriert. Der Rest wurde in Aceton unter Erwärmen gelöst und die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und durch Präzipitation gereinigt. Ertrag 38,6 g (77 % von G9).
[α]²⁴ _D-29,7° (c0,7, CHCl₃); Smp. 75–76,5°C; FDMS m/z 876M⁺; ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7,30–7,47 (10H, m), 6,03 (1H, d, J=7,9Hz), 4,72 (1H, d, J=11,6Hz), 4,66 (1H, d, J=11,6Hz), 4,61 (1H, d, J=11,6Hz), 4,45 (1H, d, J=11,6Hz), 4,12–4,17 (1H, m), 4,00 (1H, dt, Jt=4,3, Jd=7,3Hz), 3,67–3,72 (2H, m), 3,61 (1H, ddd, J=4,3, 8,6, 11,6Hz), 1,94–2,05 (2H, m), 1,15–1,69 (72H, m), 0,88 (6H, t, J=6,1Hz)
(12) Synthese von Verbindung G13

1) 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-D-galactopyranosylacetat (79,8 g) wurden in einer Mischung aus Toluol (160 ml) und Isopropylether (520 ml) gelöst und die Lösung wurde auf -10 bis 0°C abgekühlt. Zu dieser Lösung wurde eine Isopropyletherlösung (2,8 mmol/ml, ungefähr 100 ml), enthaltend 2,0 Äquivalentvolumen von HBr, zugefügt. Nach einem Rühren für ungefähr 90 Minuten bei -10 bis 0°C wurde eine wäßrige 5 %ige Natriumhydrogencarbonatlösung in die Reaktionslösung gegossen und überschüssiges HBr wurde durch Rühren neutralisiert. Das gesamte Volumen wurde in einen Trenntrichter für die Auftrennung übertragen, dann wurde die wäßrige Schicht verworfen und das Waschen wurde 2-mal mit einer wäßrigen 10 %igen Natriumchloridlösung durchgeführt. Nach einer Konzentration im Vakuum wurde 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-D-galactopyranosylbromid (GalBr) als Sirup erhalten.
2) DMF (140 ml), dann eine Toluollösung (250 ml) von GalBr (ungefähr 137 mmol) wurden zu einer Toluollösung (420 ml) der Verbindung G12 (60,0 g, 68,6 mmol), Tetrahexylammoniumbromid (89,4 g, 206 mmol) und Molekularsieben 4A (60 g) zugefügt. Die Mischung wurde 72 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Methanol (12 ml) wurde der Reaktionslösung zugefügt und die Mischung wurde 2 Stunden gerührt. Auf die Filtration mit Celite und das Waschen mit einer wäßrigen gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung und einer Salzlösung folgte ein Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat und Konzentration im Vakuum. Acetonitril wurde dem resultierenden Rest zugefügt und die Mischung wurde 2 Stunden gerührt. Das resultierende Präzipitat wurde im Vakuum getrocknet, um ein Trockenpulver zu erhalten. Dieses Pulver wurde durch Silicagelchromatografie unter Verwendung von Hexan:Ethylacetat (8:1) als Elutionslösungsmittel gereinigt. Ertrag 70,9 g (74 %). [α]²⁴ _D+18,8° (c0,9, CHCl₃); Smp. 74–75°C; FDMS m/z 1399(M+1)⁺; ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7,21–7,37 (30H, m), 6,12 (1H, d, J=9,0Hz), 4,91 (1H, d, J=11,6Hz), 4,84 (1H, d, J=3,7Hz), 4,72–4,80 (4H, m), 4,35–4,65 (7H, m), 4,12–4,18 (1H, m), 3,99–4,05 (2H, m), 3,84–3,93 (4H, m), 3,73 (1H, dd, J=3,7, 11,0Hz), 3,47–3,51 (2H, m), 3,42 (1H, dd, J=6,1, 9,1Hz), 1,87–1,99 (2H, m), 1,18–1,70 (72H, m), 0,88 (6H, t, J=7,4Hz)

(13) Synthese von Verbindung KRN7000
Verbindung G13 (60,0 g, 42,9 mmol) wurde zu Ethanol (960 ml) zugefügt, um eine Suspension zu ergeben, zu der eine Ethanolsuspension von 20 %igem Hydroxypalladium (6,0 g) zugefügt wurde. Weiterhin wurde eine Wasserstoffquelle, 4-Methylcyclohexen (120 ml, 93,5 mmol) zugefügt. Nach einem Kochen unter Rückfluß für 4 Stunden unter Erwärmen wurde die Filtration durchgeführt und das Lösungsmittel entfernt. Der Rest wurde mit erwärmtem Ethanol gewaschen. Man ließ das Filtrat bei Raumtemperatur stehen, um ein weißes Präzipitat zu erhalten, und das Präzipitat wurde gefiltert und im Vakuum getrocknet. Das resultierende Pulver wurde in Ethanol:Wasser (92:8, 3,5 l) suspendiert und durch Wärme unter Rühren gelöst. Man ließ die Lösung stehen, um wiederum das Präzipitat zu erhalten. Die Lösung mit dem Präzipitat wurde gefiltert und der Filtratkuchen wurde im Vakuum getrocknet, um ein weißes Pulver zu erhalten. Ertrag 35,0 g (95 %).
[α]²³ _D+43,6° (c1,0, Pyridin); Smp. 189,5–190,5°C; negative FABMS m/z 857(M-H)^–; IR (cm^–1, KBR) 3300, 2930, 2850, 1640, 1540, 1470, 1070; ¹H-NMR (500 MHz, C₅D₅N) δ 8,47 (1H, d, J=8,5Hz), 5,58 (1H, d, J=3, 7Hz), 5,27 (1H, m), 4,63–4,70 (2H, m), 4,56 (1H, m), 4,52 (1H, t, J=6,1Hz), 4,37–4,47 (4H, m), 4,33 (2H, m), 2,45 (2H, t, J=7,3Hz), 2,25–2,34 (1H, m), 1,87–1,97 (2H, m), 1,78–1,85 (2H, m), 1,62–1,72 (1H, m), 1,26–1,45 (66H, m), 0,88 (6H, t, J=6,7Hz); ¹³C-NMR (125 MHz, C₅D₅N) δ 173,2 (s), 101,5 (d), 76,7 (d), 73,0 (d), 72,5 (d), 71,6 (d), 71,0 (d), 70,3 (d), 68,7 (t), 62,7 (t), 51,4 (d), 36,8 (t), 34,4 (t), 32,1 (t), 30,4 (t), 30,2 (t), 30,03 (t), 30,00 (t), 29,93 (t), 29,87 (t), 29,81 (t), 29,76 (t), 29, 6 (t), 26,5 (t), 26,4 (t), 22,9 (t), 14,3 (q)
Beispiel 2: Isolierung und Reinigung von O-α-D-Galactopyranosyl-(1→2)-O-α-D-galatopyranosyl-(1→1)-(2S,3S,4R)-2-amino-N-[(R)-2-hydroxytetracosanoyl]-1,3,4-octadecantriol (S1140B-9)
Ein gefriergetrocknetes Pulver (447,1 g) von Schwämmen, die in einer Tiefe von 15-25 m aus dem Meer nahe Kume Island der Okinawa Präfektur geerntet wurden, wurde mit einer Mischung aus Chloroform und Methanol extrahiert, dann wurde die extrahierte Flüssigkeit im Vakuum konzentriert, um 51,28 g Extrakt zu erhalten. Der Extrakt wurde mit Ethylacetat und Wasser geteilt und die obere Schicht und die Mittelschicht wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert, um 18,37 g bzw. 9,44 g der Fraktionen zu erhalten. Eine Alkoholschicht, die durch das Teilen der Fraktion erhalten wurde, erhalten von der oberen Schicht mit 10 %igem wäßrigen Methanol und n-Hexan, und die Fraktion erhalten von der mittleren Schicht wurden kombiniert und konzentriert. Durch Wiederholung der Silicagelchromatografie wurden 169,9 mg einer einzelnen aktiven Komponente auf Normalphasen-DC erhalten. Die weitere Reinigung wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer ODS-AM-Säule (einem Produkt von YMC, 250 mm × 20 mm Durchmesser, Methanol, 9,0 ml/min) (Retentionszeit: 30,3 min) durchgeführt, um 10,2 mg der gereinigten Titelverbindung (S1140B-9) zu erhalten.
Die Titelverbindung kann auch durch das von F. Cafieri et al., Liebigs Ann. Chem. 1995, 1477–1481, beschriebene Verfahren isoliert und gereinigt werden.
negative FABMS m/z 1007[(M-H)^–]; IR; ¹H-NMR (500 MHz, C₅D₅N, 24°C) δ (ppm) 8,55 (1H, d, J=9,2Hz, NH), 5,60 (1H, d, J=3,7Hz, H1''), 5,57 (1H, d, J=3,7Hz, H1'''), 5,13 (1H, m, H2), 4,75 (1H, dd, J=3,7, 10,4Hz, H2''), 4,62 (2H, m), 4,54 (4H, m), 4,25–4,47 (10H, m), 2,17 (2H, m), 1,99 (1H, m), 1,87 (2H, m), 1,75 (1H, m), 1,65 (2H, m), 1,12–1,49 (60H, m), 0,85 (6H, m, terminales Methyl); ¹³C-NMR (125 MHz, C₅D₅N, 45°C) δ (ppm) 175,5 (s, C1'), 99,5 (d, C1'''), 98,6 (d, C1''), 76,7 (d, C2''), 76,0 (d, C3), 72,8 (d, C4), 72,6 (d, C5''), 72,6 (d, C4''), 72,5 (d, C2), 71,3 (d, C3'''), 7,10 (d), 70,8 (d), 70,5 (d, C2'''), 69,7 (d, C3''), 68,6 (t, C1), 62,7 (t), 62,5 (t), 51,2 (t, C2), 39,4 (t), 35,6 (t), 33,7 (t), 32,2 (t), 30,5 (t), 30,3 (t), 30,1 (t), 30,0 (t), 29,7 (t), 29,6 (t), 26,7 (t), 26,0 (t), 23,0 (t), 22,9 (t), 14,3 (q, terminales Methyl)
Beispiel 3
Die folgenden Verbindungen wurden gemäß den in den der rechten Spalte angegebenen Referenzen synthetisiert.
Beziehungen zwischen den Verbindungen der Formel (I) und den in dem oben erwähnten Beispiel beschriebenen Verbindungen sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1
Biologischer Test
Pharmakologisches Testbeispiel 1: Verstärkende Wirkung von KRN7000 auf die zytotoxische Aktivität von NKT-Zellen gegen Tumorzellen (diese Verwendung ist nicht gemäß der vorliegenden Erfindung)
Das folgende Experiment wurde unter Verwendung der Verbindung von Beispiel 1 (KRN7000) als repräsentative glycosidische Verbindung der vorliegenden Erfindung durchgeführt.
Ein Vehikel (physiologische Salzlösung, enthaltend 0,025 Polysolvat 20) oder 100 μg/kg KRN7000 wurde intravenös an RAG-1KO/Vα14tg/Vβ8.2tg Mäuse verabreicht (die eine große Zahl von NKT-Zellen in ihrer Lymphozytenfraktion jedoch nicht B-Zellen, T-Zellen oder NK-Zellen tragen), und 24 Stunden später wurde die Milz von jeder Maus entnommen, um Milzzellen durch konventionelle Verfahren herzustellen. Die RAG-1KO/Vα14tg/Vβ8.2tg Mäuse wurden durch Deletion des RAG-1-Gens und erzwungene Expression der Vα14 und Vβ8.2 Gene etabliert (T. Kawano et al., Science, 278, 1626-1629 (1997)). Diese Mäuse sind von Masaru Taniguchi, School of Medicine, Chiba Universität erhältlich. Die zytotoxische Aktivität dieser Milzzellen gegenüber Mauslymphom YAC-1-Zellen wurde durch das 4-Stunden-⁵¹Cr-Freisetzungsverfahren untersucht (E. Kobayashi et al., Oncology Res., 7, 529 (1955)). Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt.
Wie in 1 gezeigt, war die zytotoxische Aktivität gegen YAC-1-Zellen signifikant höher bei den Milzzellen, die von den Mäusen hergestellt wurden, denen KRN7000 verabreicht worden war, als bei denjenigen, die von Mäusen hergestellt wurden, denen das Vehikel verabreicht wurde.
Diese Ergebnisse zeigen an, daß KRN7000 die zytotoxische Aktivität von Milz-NKT-Zellen gegen Tumorzellen erhöht, wenn man in Betracht zieht, daß RAG-1KO/Vα14tg/Vβ8.2tg Mäuse eine große Anzahl von NKT-Zellen jedoch nicht B-Zellen, T-Zellen oder NK-Zellen in der Lymphozytenfraktion der Milzzellen tragen.
Die oben erwähnten Ergebnisse zeigen an, daß KRN7000 eine Fähigkeit zur Verstärkung der lytischen Aktivität von NKT-Zellen gegen Tumorzellen aufweist.
Pharmakologisches Testbeispiel 2: Stimulation der Milz-NKT-Zellproliferation durch KRN7000
Ein Vehikel (physiologische Salzlösung, enthaltend 0,5 Polysolvat 20) oder 1, 10 oder 100 ng/kg KRN7000 wurde intravenös an C57BL/6 Mäuse (Japan SLC, Inc.) verabreicht und die Milz der individuellen Mäuse wurde nach 24 Stunden entnommen, um Milzzellen durch konventionelle Verfahren herzustellen. Diese Milzzellen wurden in einer Kunststoffschale 30 Minuten inkubiert, um nichtadhärente Zellen herzustellen. Durch Entfernung der B-Zellen bei diesen nichtadhärenten Zellen wurde eine Lymphozytenfraktion hergestellt. T-Zellen, NK-Zellen, NKT-Zellen und Vα14⁺-NKT-Zellen in dieser Fraktion wurden durch die 3-Farben-FACS-Analyse unter Verwendung des FITC-markierten anti-TCR αβ monoklonalen Antikörpers (Pharmingen) analysiert, des Zytochrom-markierten anti-NK1.1 monoklonalen Antikörpers (Pharmingen) und des PE-markierten anti-Vα14 monoklonalen Antikörpers (2). Der anti-Vα14 monoklonale Antikörper wurde durch Implantation des anti-Vα14 monoklonalen Antikörpers, der Hybridome erzeugt (CMS-1, erhältlich von Masaru Taniguchi et al., School of Medicine, Chiba Universität) bei Nacktmäusen erhalten und durch Gewinnen von Aszites von den Tieren zur Reinigung des Antikörpers. In den 2A und 2B wurde die Anzahl von NK1.1-Zellen, TCRαβ-Zellen und Vα14-Zellen in der Lymphozytenfraktion als Fluoreszenzintensität der markierten Antikörper gegen diese Zellen ausgedrückt.
Wie in 2A dargestellt, wurde ein deutlicher Anstieg der Rate von NK1.1⁺ TCRαβ⁺-Zellen in der Milzlymphozytenfraktion bei Tieren beobachtet, denen 100 ng/kg KRN7000 verabreicht wurde im Vergleich zu Tieren, denen das Vehikel verabreicht wurde.
Wie in 2B dargestellt, wurde ein Anstieg der Rate von Vα14⁺-Zellen bei NK1.1⁺ TCRαβ⁺-Zellen deutlich bei Tieren beobachtet, denen 100 ng/kg KRN7000 verabreicht wurde im Vergleich zu Tieren, denen das Vehikel verabreicht wurde.
Weiterhin, wie dargestellt in 2C, ist die Zahl der NK-Zellen in den Milzlymphozytenfraktionen der Mäuse, denen 10 oder 100 ng/kg KRN7000 verabreicht wurde, gleich zu derjenigen der Mäuse, denen Vehikel verabreicht wurde. Ein ungefähr 2-facher Anstieg der Zahl der Lymphozytenfraktionen und T-Zellen wurde jedoch bei den Mäusen beobachtet, denen KRN7000 verabreicht wurde im Vergleich mit den Mäusen, denen Vehikel verabreicht wurde. Weiterhin stieg die Zahl der Vα14^–-NKT-Zellen und Vα14⁺-NKT-Zellen in der Milzlymphozytenfraktion der Mäuse, denen KRN7000 verabreicht wurde, ungefähr um das mehr als 3-fache (Daten nicht dargestellt) und um das mehr als 4-fache im Vergleich mit denjenigen der Mäuse, denen Vehikel verabreicht wurde.
Weiterhin zeigten Analysen von T-Zellen, NK-Zellen, Vα14^–-NKT-Zellen und Vα14⁺-NKT-Zellen in der Leber einen deutlichen Anstieg der Zahlen der Vα14^–-NKT-Zellen und Vα14⁺-NKT-Zellen durch eine KRN7000 Verabreichung, ähnlich wie im Fall der Milz (Daten nicht dargestellt).
Die oben erwähnten Ergebnisse zeigen an, daß KRN7000 eine Fähigkeit zur Erhöhung der Zahl von NKT-Zellen aufweist, insbesondere von Vα14⁺-NKT-Zellen im Körper.
Pharmakologisches Testbeispiel 3: Unterdrückung der Lymphknotenschwellung bei MRL lpr/lpr Mäusen durch KRN7000
Zehn Tiere pro Gruppe von weiblichen MRL lpr/lpr Mäusen (Sakamoto, A. Clin. Immunol., 28, 1558 (1966)) wurden für das folgende Experiment verwendet. Während der Beobachtung von 21 MRL Mäusen, die im Alter von 6 Wochen erstanden worden waren, wurde ein Anschwellen der axiliären Lymphknoten bei einer Maus im Alten von 10 Wochen erkannt. Dementsprechend wurden die anderen 20 Mäuse statistisch in 2 Gruppen verteilt. Ein Vehikel (eine physiologische Salzlösung, enthaltend 0,025 Polysolvat 20) oder KRN7000 (100 μg/kg) wurde zweimal pro Woche (am Dienstag und Freitag) den oben erwähnten 2 Tiergruppen, beginnend im Alter von 11 Wochen, intraperitoneal verabreicht. Axiliäre und inginuale Lymphknoten wurden zweimal pro Woche überprüft, um das Fortschreiten der Lymphknotenanschwellung über die Zeit zu beobachten. Die Lymphknoten wurden in 4 Grade eingeteilt, d.h. –(0), +(1), ++(2) und +++(3), als Funktion der Größe. Die Gesamtbewertungen von sowohl der rechten als auch der linken Seite des axiliären Lymphknotens (A) oder des inguinalen Lymphknotens (B) wurden als Lymphknotenschwellungs-Indices, wie dargestellt in 3, ausgedrückt.
Wie in 3A dargestellt, war das Anschwellen der axiliären Lymphknoten bei MRL Mäusen mit dem Altern durch Verabreichung von KRN7000 deutlich unterdrückt. Weiterhin war außerdem, wie in 3B dargestellt, das Anschwellen der inguinalen Lymphknoten bei MRL Mäusen mit dem Altern ebenfalls durch Verabreichung von KRN7000 deutlich unterdrückt. Anders ausgedrückt, hat KRN7000 eindeutig die Fähigkeit, das Lymphknotenanschwellen bei MRL Mäusen zu unterdrücken.
Die MRL Maus ist eine Modellmaus für menschlichen systemischen Lupus erythematosus (A. Sakamoto, Clin. Immun., 28, 1558 (1996)). Die oben erwähnten Ergebnisse zeigen, daß KRN7000 für die Behandlung von systemischem Lupus erythematosus effektiv ist.
Pharmakologisches Testbeispiel 4: Wirkung von KRN7000 auf die Überlebenszeitspanne von MRL lpr/lpr Mäusen
Zehn Tiere pro Gruppe von weiblichen MRL lpr/lpr Mäusen wurden für das folgende Experiment verwendet. MRL Mäuse, die im Alter von 4 Wochen erstanden worden waren, wurden statistisch auf 2 Gruppen verteilt (10 Tiere pro Gruppe). Ein Vehikel (eine physiologische Salzlösung, enthaltend 0,025 Polysolvat 20) oder KRN7000 (100 μg/kg) wurde zweimal pro Woche (am Dienstag und Freitag) den Tieren, beginnend im Alter von 5 Wochen, intraperitoneal verabreicht. Das Überleben der Tiere wurde täglich beobachtet.
Wie in 4 dargestellt, überlebten drei Mäuse, denen KRN7000 verabreicht worden war, selbst 350 Tage nach Beginn der Verabreichung, während alle Mäuse, denen das Vehikel verabreicht worden war, innerhalb von 250 Tagen nach Beginn der Verabreichung starben.
Pharmakologisches Testbeispiel 5: Unterdrückung einer durch 4 %iges DSS induzierten Maus-Colitis durch KRN7000
Zehn Tiere pro Gruppe von CDF1 Mäusen (6 Wochen alt, weiblich) (Japan SLC Inc.) wurden für das folgende Experiment verwendet. Tag 0 war als der Tag definiert, an dem eine 4 %ige DSS-Lösung (4 % (G/V) Dextrannatriumsulfat (DSS), gelöst in Wasser) zum ersten Mal als Trinkwasser zur Verfügung gestellt wurde. Die Tiere wurden in 3 Gruppen unterteilt, d.h. eine Gruppe, der 100 μg/kg KRN7000 intraperitoneal an den Tagen 1, 5 und 9 verabreicht wurde, eine Gruppe, der 1 μg/Maus IL-12 an den Tagen 1, 3, 5, 7 und 9 verabreicht wurde, und eine unbehandelte (Kontroll) Gruppe. Das Körpergewicht wurde gemessen und Überleben oder Tod der Tiere wurde täglich beobachtet. Veränderungen im Körpergewicht und der Überlebensrate sind in den 5A bzw. 5B dargestellt.
Wie in 5A gezeigt, wurde ein Gewichtsverlust zu einem extrem frühen Zeitpunkt in der Gruppe beobachtet, der IL-12 verabreicht wurde im Vergleich mit der Kontrollgruppe. Der Gewichtsverlust wurde jedoch deutlich zu einem späteren Zeitpunkt bei der Gruppe beobachtet, der KRN7000 verabreicht wurde im Vergleich mit der Kontrollgruppe.
Weiter war, wie dargestellt in 5B, die Überlebenszeitspanne der mit IL-12 behandelten Mäuse signifikant kürzer als diejenige der Kontrollgruppe. Die Überlebenszeitspanne der mit KRN7000 behandelten Mäuse war jedoch signifikant länger als diejenige der Kontrollgruppe.
Die durch 4 %iges DSS induzierte Maus-Colitis ist ein Modell für menschliche Colitis ulcerosa (C. Elson et al., Gastroenterology, 109, 1344 (1995)). Dementsprechend zeigen die oben erwähnten Ergebnisse, daß KRN7000 für die Behandlung der Colitis ulcerosa effektiv ist.
Pharmakologisches Testbeispiel 6: Stimulierung der NKT-Zellproliferation durch Verbindungen mit einer α-Glycosylceramidstruktur
Die Stimulation der NKT-Zellproliferation durch Verbindungen mit einer α-Glycosylceramidstruktur wurde unter Verwendung von Milzzellen von RAG-1KO/Vα14tg/Vβ8.2tg Mäusen, wie dargestellt im Pharmakologischen Testbeispiel 1, untersucht.
Milzzellen wurden aus der Milz von RAG-1KO/Vα14tg/Vβ8.2tg Mäusen durch konventionelle Verfahren hergestellt. Diese Milzzellen wurden mit 2 × 10⁶ Zellen/ml in einem RPMI 1640 Medium, supplementiert mit 10 % FCS, suspendiert und 100 μl von jeder Suspension wurden in Vertiefungen einer Platte mit rundem Boden und 96 Vertiefungen plattiert. Zehn unterschiedliche Arten von Verbindungen mit einer α-Glycosylceramidstruktur, wie dargestellt in 12, wurden den Vertiefungen der Platten in einer Endkonzentration von 1, 10 oder 100 ng/ml zugefügt und die Platten wurden 2 Tage inkubiert. 16 Stunden nach der Zugabe von [³H] Thymidin (0,5 μCi/Vertiefung) wurden die Zellen geerntet. Die Menge an [³H] Thymidin, die in die Zellen inkorporiert war, wurde durch Flüssigszintillationszählung gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2
Wie in Tabelle 2 dargestellt, wurde für alle obigen Verbindungen gezeigt, daß sie eine signifikante Aktivität zur Stimulierung von einer NKT-Zellproliferation in einer Konzentration von 100 ng/ml im Vergleich mit der mit Vehikel versetzten Gruppe aufwiesen.
Die oben erwähnten Ergebnisse zeigen, daß glycosidische Verbindungen mit einem α-D-Glycosylceramid und glycosidische Verbindungen mit einem α-D-Glycosylceramid, worin ein anderer Zucker an den Zuckerbestandteil gebunden ist, für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen effektiv sind.
Pharmakologisches Testbeispiel 7: Unterdrückung des Ausbruchs einer experimentellen Autoimmun-Encephalomyelitis durch KRN7000
Zehn Tiere pro Gruppe von C57BL/6 Mäusen (6 Wochen alte Weibchen) wurden für das folgende Experiment verwendet. 200 μg eines Teilpeptids eines Myelinoligodendrocytenglycoproteins (MOG33-55) und 500 μg Mycobacterium tuberculosis H37Ra wurden zu Freunds inkompletten Adjuvans zur Herstellung einer Emulsion zugesetzt. Die Mäuse wurden durch subkutane Injektion dieser Emulsion an Tag 0 und Tag 7 immunisiert. Weiterhin wurden 500 ng Pertussistoxin intraperitoneal am Tag 1 und am Tag 2 verabreicht, um eine experimentelle Autoimmun-Encephalomyelitis (EAE) bei Mäusen zu induzieren. Die Tiere wurden in 2 Gruppen unterteilt, d.h. eine Gruppe, der 20 μg/kg KRN7000 intraperitoneal an den Tagen 1, 5, 8, 12 und 15 verabreicht wurde, und eine Gruppe, der ein Vehikel (0,5 %, Polysolvat 20) auf ähnliche Weise verabreicht wurde. Das Niveau der EAE-Symptome wurde täglich beobachtet. Das Niveau der EAE-Symptome von individuellen Mäusen in jeder Gruppe wurde in 6 dargestellt.
Wie in 6 dargestellt, zeigten bei der Gruppe, der das Vehikel verabreicht wurde (6A), alle Mäuse einen Ausbruch von EAE innerhalb von 15 Tagen nach der ersten MOG-Peptidimmunisierung und 80 % davon starben. Bei der Gruppe, der KRN7000 verabreicht wurde (6B), zeigten jedoch 4 von 10 Mäusen einen EAE-Ausbruch und nur 2 von ihnen starben.
Die oben erwähnten Ergebnisse zeigen, daß KRN7000 den EAE-Ausbruch bei Mäusen unterdrückte. EAE ist ein Modell für menschliche Multiple Sklerose (MS) (Autoimmune Disease Models, herausgegeben von I.R. Cohen und A. Miller, Academic Press, Inc. (1994), Kapitel 1, S. 1). Daher zeigen die oben erwähnten Ergebnisse, daß KRN7000 für die Behandlung der Multiplen Sklerose effektiv ist.
Pharmakologisches Testexperiment 8: Unterdrückung des Ausbruchs von Maus Diabetes durch KRN7000
Zehn Tiere pro Gruppe von NOD/ShiJic (NOD) Mäusen (6 Wochen alte Weibchen) (Japan Clea, Inc.) wurden für das folgende Experiment verwendet. NOD Mäuse zeigen den Ausbruch von Diabetes mit dem Altern. Die Tiere wurden in 2 Gruppen unterteilt, d.h. eine Gruppe, der 100 μg/kg KRN7000 intraperitoneal zweimal pro Woche, beginnend in einem Alter von 7 Wochen verabreicht wurde, und eine unbehandelte Kontrollgruppe. Die Gegenwart und Abwesenheit von Diabetes-Symptomen wurde wöchentlich überprüft. Das Blutglucoseniveau wurde unter Verwendung eines Glucometers (Miles Sankyo) gemessen und Mäuse, die einen Wert von mehr als 200 mg/dl zweimal aufeinanderfolgend zeigten, wurden als diabetisch diagnostiziert. 7 zeigt die Inzidenz von Diabetes Mäusen in beiden Gruppen.
Wie in 7 dargestellt, wurde keine der Mäuse, denen KRN7000 verabreicht wurde, selbst im Alter von 35 Wochen diabetisch, während 80 % der Mäuse in der Kontrollgruppe im Alter von 35 Wochen eine Diabetes bekamen.
Die oben erwähnten Ergebnisse zeigen, daß KRN7000 den spontanen Ausbruch von Diabetes bei NOD Mäusen unterdrückt. Die NOC Maus ist ein Modelltier für menschliche Typ I-Diabetes (Autoimmune Disease Models, herausgegeben von I.R. Cohen und A. Miller, Academic Press, Inc. (1994), Kapitel 9, S. 149). Die oben erwähnten Ergebnisse zeigen, daß KRN7000 für die Behandlung der Typ I-Diabetes effektiv ist.
Pharmakologisches Testbeispiel 9: Stimulierung der Vα24⁺-NKT-Zellproliferation durch KRN7000
Periphere mononukleäre Blutzellen eines normalen menschlichen Subjekts wurden 4 Tage in einem AIM-Medium, supplementiert mit 10 % FCS unter Zugabe von GM-CSF (400 U/ml), IL-4 (200 U/ml) und KRN7000 (100 ng/ml) kultiviert, um Antigenpräsentierende Zellen herzustellen.
Eine autologe Mischleukozytenreaktion (MLR) wurde unter Verwendung dieser Antigen-präsentierenden Zellen als Stimulatorzellen und autologen peripheren mononukleären Blutzellen als Responderzellen durchgeführt. Nach einer Inkubation für 10 Tage wurde IL-2 (5 U/ml) zugefügt, die Inkubation wurde für weitere 4 Tage fortgesetzt und die Zellen wurden geerntet. Als nächstes wurden CD4, CD8 doppelt negative Zellen aus diesen geernteten Zellen gewonnen und eine Phänotypanalyse unterzogen. Die Phänotypanalyse wurde durch die Fluoreszenzintensität von markierten Antikörpern gegen Zellen mit verschiedenen Phänotypen ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in 8 dargestellt.
Wie in 8 dargestellt, wurde gezeigt, daß eine größere Zahl von Zellen mit dem Phänotyp CD4^–CD8^–CD3⁺Vα24⁺Vβ11⁺NKRP1A⁺ (einer Untergruppe von Vα24⁺-NKT-Zellen) in diesen Zellgruppen vorlagen.
Die Zellen wurden unter Verwendung von IL-2 (5 U/ml) kultiviert, um die Proliferation von Vα24⁺-NKT-Zellen zu stimulieren, die als Responderzellen in der folgenden autologen Mischleukozytenreaktion verwendet wurden. Autologe periphere mononukleäre Blutzellen wurden 4 Tage unter Zugabe von GM-CSF + IL-4 und 100 ng/ml KRN7000, AGL-583 (β-Galactosylceramid, β-GalCer) oder 0,1 % DMSO (Vehikel) zur Herstellung von Antigen-präsentierenden Zellen kultiviert. Eine autologe Mischleukozytenreaktion wurden unter Verwendung dieser Antigen-präsentierenden Zellen als Stimulatorzellen durchgeführt. Nach Inkubation für 2 Tage wurde [³H] Thymidin (0,5 μCi/ml) zugefügt und die Zellen wurden nach 8 Stunden geerntet, um die [³H] Thymidinaufnahme in die Zellen zu messen, und zwar durch eine Flüssigszintillationszählvorrichtung. Die Ergebnisse sind in 9 dargestellt.
Wie in 9 dargestellt, zeigten die Antigenpräsentierenden Zellen, die mit dem Vehikel oder β-Galactosylceramid behandelt worden waren, keine Wirkung auf die Vα24⁺-NKT-Zellproliferation, während Antigenpräsentierende Zellen, die mit KRN7000 behandelt worden waren, einen deutlichen stimulativen Effekt auf die Vα24⁺-NKT-Zellproliferation zeigten, auf eine Weise, die von der Zahl der Antigen-präsentierenden Zellen abhing. Weiterhin wurden inhibitorische Wirkungen von anti-CD1a, CD1b, DC1c und CD1d Antikörpern auf die Stimulation der Vα24⁺-NKT-Zellproliferation durch die mit KRN7000 behandelten Antigenpräsentierenden Zellen bewertet. Im Ergebnis inhibierte nur der anti-CD1d Antikörper die Stimulation der Vα24⁺-NKT-Zellproliferation (Daten nicht dargestellt).
Die oben erwähnten Ergebnisse zeigen, daß KRN7000 für die Stimulierung der Proliferation von menschlichen Vα24⁺-NKT-Zellen effektiv ist, einem Gegenstück der Maus Vα14⁺-NKT-Zellen. Unter Betrachtung des vorliegenden Berichts, daß Patienten mit fortgeschrittener Typ I-Diabetes eine extrem geringe Zahl von Vα14⁺-NKT-Zellen aufweisen (Wilson et al., Nature, 391, 177 (1998)), und der Ergebnisse der Pharmakologischen Testbeispiele 3, 7 und 8, legen diese Ergebnisse deutlich nahe, daß KRN7000 für die Verhinderung oder Behandlung von Autoimmunerkrankungen wirksam ist, worin menschliche Vα14⁺-NKT-Zellen beteiligt sind, wie zum Beispiel systemischer Lupus erythematosus, systemische Sklerose, Multiple Sklerose und Typ I-Diabetes.
Pharmakologisches Testbeispiel 10: Akuter Toxizitätstests durch einfache Verabreichung
Die Verbindung von Beispiel 1 wurde intravenös an Mäuse verabreicht. Die Ergebnisse zeigten, daß die LD₅₀ für die Verbindung mehr als 10 mg/kg betrug. Weiterhin hatte die Verbindung eine niedrige Toxizität und zeigte kein besonderes Symptom bei einem Verabreichungsniveau von 10 mg/kg.

Claims

Verwendung einer Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes oder Solvats davon zur Herstellung eines therapeutischen Mittels zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten:
worin: R¹ H oder OH repräsentiert, x eine ganze Zahl zwischen 7 und 27 ist, R² einen Substituenten repräsentiert, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den folgenden (a) bis (e) (worin y eine ganze Zahl zwischen 5 und 17 ist): (a) -CH₂(CH₂)_yCH₃ (b) -CH(OH)(CH₂)_yCH₃ (c) -CH(OH)(CH₂)_yCH(CH₃)₂ (d) -CH=CH(CH₂)_yCH₃ (e) -CH(OH)(CH₂)_yCH(CH₃)CH₂CH₃ und R³ bis R⁹ repräsentieren Substituenten, die wie in irgendeinem der folgenden Punkte (i) bis (ii) definiert sind. (i) R³, R⁶ und R⁸ repräsentieren H, und R⁴ repräsentiert H, OH, NH₂, NHCOCH₃ oder einen Substituenten, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A) bis (D):
R⁵ repräsentiert OH oder einen Substituenten, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (E) und (F)
R⁷ repräsentiert OH oder einen Substituenten, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A) bis (D)
R⁹ repräsentiert H, CH₃, CH₂OH oder einen Substituenten, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A') bis (D'):
(ii) R³, R⁶ und R⁷ repräsentieren H, und R⁴ repräsentiert H, OH, NH₂, NHCOCH₃ oder einen Substituenten, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A) bis (D):
R⁵ repräsentiert OH oder einen Substituenten, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Gruppen (E) und (F)
R⁸ repräsentiert OH oder einen Substituenten, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A) bis (D):
R⁹ repräsentiert H, CH₃, CH₂OH oder einen Substituenten, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Gruppen (A') bis (D'):
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Autoimmunkrankheit systemischer Lupus erythematosus oder systemische Sklerose ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Autoimmunkrankheit ulcerative Colitis ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Autoimmunkrankheit Encephalomyelitis oder Multiple Sklerose ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Autoimmunkrankheit Typ I-Diabetes ist.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, worin R³ und R⁶ H repräsentieren, R⁴ repräsentiert OH oder einen Substituenten irgendeiner der Gruppen (A) bis (D), R⁵ repräsentiert OH oder einen Substituenten der Gruppen (E) oder (F), R⁷ und R⁸ repräsentieren jeweils H oder OH, worin R⁷ und R⁸ nicht beide denselben Substituenten repräsentieren, und R⁹ repräsentiert CH₂OH, CH₃, H oder einen Substituenten irgendeiner der Gruppen (A') bis (D').
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, worin x eine ganze Zahl zwischen 21 und 25 ist und R² repräsentiert den Substituenten (b), worin y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 ist.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, worin x eine ganze Zahl zwischen 9 und 13 ist und R² repräsentiert den Substituenten (a), worin y eine ganze Zahl zwischen 11 und 15 ist.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Verbindung der Formel (I) (2S,3S,4R)-1-(α-D-Galactopyranosyloxy)-2-hexacosanoylamino-3,4-octadecandiol ist.