CN106983760A - 一种增强肺腺癌细胞对cik细胞杀伤敏感性的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种增强肺腺癌细胞对CIK细胞杀伤敏感性的组合物，包括(A)活性成分和(B)肿瘤微环境调节成分；所述活性成分为神经鞘磷脂，所述肿瘤微环境调节成分选自磷酸铵、磷酸一氢铵、磷酸二氢铵。本发明提供的药物组合物可以显著增强肺腺癌细胞对CIK细胞的杀伤敏感性，可以用于制备成肺腺癌肿瘤组织靶向制剂，制备成增强肺腺癌细胞对CIK细胞杀伤敏感性的药物。

Description

一种增强肺腺癌细胞对CIK细胞杀伤敏感性的组合物
技术领域
本发明属于细胞免疫领域，涉及CIK细胞，具体涉及一种增强肺腺癌细胞对CIK细胞杀伤敏感性的组合物。
背景技术
肿瘤的生物免疫治疗作为第四种治疗手段日益受到重视。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cell，CIK)是近年来发现的一种非常有前景的过继免疫细胞，具有增殖迅速、杀瘤活性广谱且高效、毒副作用微小等优点，已经成为肿瘤生物免疫治疗的主力军。CIK细胞的主要效应细胞为CD3+CD56+表型T淋巴细胞，兼有NK细胞和T细胞的特征。在功能上，CIK一方面拥有T淋巴细胞强大抗肿瘤活性，另一方面拥有NK细胞非MHC限制性的杀伤肿瘤的特点，其增殖迅速、对正常造血影响轻微。
肿瘤细胞对CIK细胞的杀伤敏感性是影响CIK细胞免疫治疗效果的一个重要因素。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以显著增强肺腺癌细胞对CIK细胞杀伤敏感性的组合物。
本发明通过如下技术方案得以实现：
一种药物组合物，包括(A)活性成分和(B)肿瘤微环境调节成分；所述活性成分为神经鞘磷脂，所述肿瘤微环境调节成分选自磷酸铵、磷酸一氢铵、磷酸二氢铵。
一种药物制剂，含有上述药物组合物，还含有药学上可以接受的载体或辅料，制备成药学上可以接受的剂型。
优选地，该药物制剂为肺腺癌肿瘤组织靶向制剂。
神经鞘磷脂在制备增强肺腺癌细胞对CIK细胞杀伤敏感性的药物中的应用。
磷酸铵、磷酸一氢铵或磷酸二氢铵在制备增强肺腺癌细胞对CIK细胞杀伤敏感性的药物中的应用。
本发明优点：
本发明提供的药物组合物可以显著增强肺腺癌细胞对CIK细胞的杀伤敏感性，可以用于制备成肺腺癌肿瘤组织靶向制剂，制备成增强肺腺癌细胞对CIK细胞杀伤敏感性的药物。
附图说明
图1为各组CIK细胞对肺腺癌A549细胞的杀伤率(％)；
图2为各组处理方法对A549移植瘤的抑瘤率(％)。
具体实施方式
为了更好地解释本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步介绍。实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，属于本领域技术人员易于获得的范畴。
实施例1：细胞水平试验
一、实验材料
RPMI-1640培养基和胎牛血清均为Gibco产品。
肺腺癌A549细胞购于南京科佰生物科技有限公司。
各细胞因子购于武汉艾美捷科技有限公司。
二、实验方法
1、CIK细胞的制备
采集健康志愿者外周血20mL，预冷的PBS 1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，用RPMI-1640调整至2×106个/mL进行培养，培养基中含10％胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、1×105U/L青霉素、100mg/L链霉素和50μmol/L巯基乙醇、IFN-γ1000U/mL，于当日加入IFN-γ(1000μ/mL)，置于37℃和体积分数为5％的CO2培养箱中培养24h后加入IL-2(1000U/mL)、IL-1α(100μ/mL)、McAb(50μg/mL)，以后每3天换液1次，并补充等量细胞因子，于培养第14天收取CIK细胞。
2、肺腺癌A549细胞培养
A549细胞接种于培养瓶中，细胞培养液为含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的RPMI-1640，置入37℃、5％CO2培养箱孵育，待细胞长满培养瓶的80％，用胰酶进行消化、计数和传代。
3、CIK细胞对不同药物处理的A549细胞的杀伤活性
取对数期A549细胞，以1×105个/mL接种于96孔板，培养20h后，按如下分组给药，继续培养4h，弃去旧培养基，按n(效应细胞)/n(靶细胞)＝10/1加入培养至第14天的CIK细胞，同时设单独靶细胞和单独效应细胞对照组，于细胞培养箱培养4h后每孔加入CCK-8溶液，细胞培养箱中孵育4h，酶标仪测定OD450值(A值)，按如下公式计算杀伤率：
杀伤率(％)＝[1-(实验组A值-单独效应细胞组A值)/单独靶细胞组A值]×100％。
溶剂对照组：不给药，只添加等体积的溶剂；
组合物给药A组：神经鞘磷脂(终浓度20μM)+磷酸铵(终浓度5μM)；
组合物给药B组：神经鞘磷脂(终浓度20μM)+磷酸一氢铵(终浓度5μM)；
组合物给药C组：神经鞘磷脂(终浓度20μM)+磷酸二氢铵(终浓度5μM)；
给药对比A组：仅磷酸铵(终浓度5μM)；
给药对比B组：仅磷酸一氢铵(终浓度5μM)；
给药对比C组：仅磷酸二氢铵(终浓度5μM)；
给药对比D组：仅神经鞘磷脂(终浓度20μM)。
三、实验结果
各组CIK细胞对肺腺癌A549细胞的杀伤率见表1和图1。
表1各组CIK细胞对肺腺癌A549细胞的杀伤率(％，n＝3)
组别 杀伤率(％)
溶剂对照组 19.5±4.2
组合物给药A组 64.4±8.3
组合物给药B组 61.8±8.5
组合物给药C组 62.5±6.7
给药对比A组 21.3±3.9
给药对比B组 18.1±3.4
给药对比C组 20.7±4.1
给药对比D组 29.6±3.7
从表1和图1可以看出，神经鞘磷脂与磷酸铵或磷酸一氢铵或磷酸二氢铵的组合物可以显著提高肺腺癌A549细胞对CIK细胞的杀伤敏感性。单独的神经鞘磷脂虽然可以一定程度提高肺腺癌A549细胞对CIK细胞的杀伤敏感性，但是不够明显；而单独的磷酸铵或磷酸一氢铵或磷酸二氢铵则完全不能提高肺腺癌A549细胞对CIK细胞的杀伤敏感性。磷酸铵或磷酸一氢铵或磷酸二氢铵很可能是通过调节肿瘤微环境提高神经鞘磷脂的活性。
实施例2：动物水平试验
一、实验材料
BALB/c(nu/nu)雄性裸小鼠，鼠龄4-6周，购于武汉大学实验动物中心。
RPMI-1640培养基和胎牛血清均为Gibco产品。
肺腺癌A549细胞购于南京科佰生物科技有限公司。
各细胞因子购于武汉艾美捷科技有限公司。
二、实验方法
1、CIK细胞的制备
采集健康志愿者外周血20mL，预冷的PBS 1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，用RPMI-1640调整至2×106个/mL进行培养，培养基中含10％胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、1×105U/L青霉素、100mg/L链霉素和50μmol/L巯基乙醇、IFN-γ1000U/mL，于当日加入IFN-γ(1000μ/mL)，置于37℃和体积分数为5％的CO2培养箱中培养24h后加入IL-2(1000U/mL)、IL-1α(100μ/mL)、McAb(50μg/mL)，以后每3天换液1次，并补充等量细胞因子，于培养第14天收取CIK细胞。
2、肺腺癌A549细胞培养
A549细胞接种于100mL培养瓶中，细胞培养液为含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的RPMI-1640，置入37℃、5％CO2培养箱孵育，待细胞长满培养瓶的80％，用胰酶进行消化、计数和传代。
3、荷瘤裸鼠肿瘤模型构建、实验分组及CIK细胞体内抑瘤作用
将所有裸鼠进行200cGy的全身辐照24h以去除体内的NK细胞。取对数生长期肺腺癌A549细胞用0.25％胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，台盼蓝拒染法记数活细胞数占95％以上，将细胞密度调至1×107/ml，每只裸鼠取0.2ml细胞悬液接种于裸鼠右下侧腹部皮下，术前测量体重。接种后每日观察，待出现肉眼可见移植瘤后，用游标卡尺测量移植瘤，待移植瘤体积达100mm3左右将裸鼠按瘤体积和荷瘤鼠体重均衡原则随机分组如下：
溶剂对照组：只给等体积的溶剂；
组合物给药A组：神经鞘磷脂(10mg/kg)+磷酸铵(5mg/kg)；
组合物给药B组：神经鞘磷脂(10mg/kg)+磷酸一氢铵(5mg/kg)；
组合物给药C组：神经鞘磷脂(10mg/kg)+磷酸二氢铵(5mg/kg)；
给药对比A组：仅磷酸铵(5mg/kg)；
给药对比B组：仅磷酸一氢铵(5mg/kg)；
给药对比C组：仅磷酸二氢铵(5mg/kg)；
给药对比D组：仅神经鞘磷脂(10mg/kg)。
各组于移植瘤处皮下注射给药，给药8小时后经尾静脉输注CIK细胞悬液(1×106个/kg)，隔天一次，连续十次。药物及CIK细胞处理结束后一天，颈椎脱臼法处死裸鼠，照相，观察记录各组裸鼠包块形态大小，将肿块剥出、称重，冷藏于-80℃备用。
通过肿瘤抑制率观察各组处理方法对肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长抑制作用：
抑瘤率(％)＝(1-给药组瘤重/溶剂对照组瘤重)×100％。
三、实验结果
各组处理方法对A549移植瘤的抑瘤率结果如表2和图2所示。
表2各组处理方法对A549移植瘤的抑瘤率(％，n＝5)
组别 抑瘤率(％)
组合物给药A组 64.7±5.4
组合物给药B组 60.6±6.2
组合物给药C组 61.9±5.8
给药对比A组 与溶剂对照组体积无显著差异(p＞0.05)
给药对比B组 与溶剂对照组体积无显著差异(p＞0.05)
给药对比C组 与溶剂对照组体积无显著差异(p＞0.05)
给药对比D组 19.5±3.8
从表2和图2可以看出，神经鞘磷脂与磷酸铵或磷酸一氢铵或磷酸二氢铵的组合物可以显著提高肺腺癌A549移植瘤对CIK细胞的杀伤敏感性。单独的神经鞘磷脂虽然可以一定程度提高肺腺癌A549移植瘤对CIK细胞的杀伤敏感性，但是不够明显；而单独的磷酸铵或磷酸一氢铵或磷酸二氢铵则完全不能提高肺腺癌A549移植瘤对CIK细胞的杀伤敏感性。磷酸铵或磷酸一氢铵或磷酸二氢铵很可能是通过调节肿瘤微环境提高神经鞘磷脂的活性。
本发明提供的药物组合物可以显著增强肺腺癌细胞对CIK细胞的杀伤敏感性，可以用于制备成肺腺癌肿瘤组织靶向制剂，制备成增强肺腺癌细胞对CIK细胞杀伤敏感性的药物。
上述实施例仅用于进一步解释本发明的技术方案，本领域技术人员应当明白，任何简单替换或修改均不脱离本发明，本发明的保护范围并不受限于上述具体实施例。

Claims (5)

1.一种药物组合物，其特征在于：包括(A)活性成分和(B)肿瘤微环境调节成分；所述活性成分为神经鞘磷脂，所述肿瘤微环境调节成分选自磷酸铵、磷酸一氢铵、磷酸二氢铵。
2.一种药物制剂，其特征在于：含有权利要求1所述的药物组合物，还含有药学上可以接受的载体或辅料，制备成药学上可以接受的剂型。
3.根据权利要求2所述的药物制剂，其特征在于：该制剂为肺腺癌肿瘤组织靶向制剂。
4.神经鞘磷脂在制备增强肺腺癌细胞对CIK细胞杀伤敏感性的药物中的应用。
5.磷酸铵、磷酸一氢铵或磷酸二氢铵在制备增强肺腺癌细胞对CIK细胞杀伤敏感性的药物中的应用。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN1259872A (zh) * 1997-04-10 2000-07-12 麒麟麦酒株式会社 含有α－糖基神经酰胺的NKT细胞活化剂
CN105925526A (zh) * 2015-09-11 2016-09-07 中国人民解放军总医院 一种增强cik细胞活性的方法与cik细胞及其制备方法和应用

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