ES2235324T3 - Empleo de a-glicosilceramidas para la obtencion de un agente terapeutico para enfermedades autoinmunes. - Google Patents

Empleo de a-glicosilceramidas para la obtencion de un agente terapeutico para enfermedades autoinmunes.

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ES2235324T3 ES98912758T ES98912758T ES2235324T3 ES 2235324 T3 ES2235324 T3 ES 2235324T3 ES 98912758 T ES98912758 T ES 98912758T ES 98912758 T ES98912758 T ES 98912758T ES 2235324 T3 ES2235324 T3 ES 2235324T3
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Tetsu Kawano
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Abstract

La invención se refiere a activadores celulares NKT, medicamentos destinados a enfermedades autoinmunes (por ejemplo eritematosis sitémica, esclerodermia sistémica, colitis ulcerosa, encefalomielitis, esclerosis múltiple y diabetes humana tipo 1) y abortivos. Estos medicamentos contienen como ingrediente activo la {al}-glicosilceramida de formula general (I) o sales o solvatos de la misma.

Description

Empleo de \alpha-glicosilceramidas para la obtención de un agente terapéutico para enfermedades autoinmunes.
Antecedentes de la invención Ámbito de la invención
La presente invención se refiere a agentes terapéuticos que activan las células NKT en caso de enfermedad autoinmune.
Técnica anterior
Se ha constatado que las células TCR (receptoras de células T) intermedias (células TCR^{int}), que se expresan de forma intermedia en receptores de células T (TCR), guardan relación con las células agresoras (o asesinas) naturales (NK, natural killer) en base a sus características, por ejemplo, presentan una morfología de tipo linfocito granular grande (LGL), se expresan constantemente en cadenas IL-2R\beta, y tienen gránulos de perforina, pero son claramente distintas de las células NK por cuanto tienen células TCR (Watanabe, H. y col., J. Immunol. 155, 2972, 1995). Se ha constatado además que, entre las células TCR^{int} activadas por la interleucina 12 (IL-12), las células NK 1.1^{+}TCR^{int} (NKT), que se expresan en las NK 1.1, son células efectoras importantes para el control de las metástasis hematógenas de tumores en el hígado y en los pulmones de los ratones (Hashimoto, W. y col., J. Immunol. 154, 4333, 1995; Anzai, R. y col., Immunol. 88, 82, 1996). Estos datos sugieren que las células NKT pueden tener un papel importante en la erradicación de las células cancerosas, parásitos, protozoos y bacterias infecciosas intracelulares, por ejemplo la Listeria monocytogenes y el Micobacterium tuberculosis (Seki, S. y col., Clin. Immunol. 28, 1069, 1996).
Las células NKT son también conocidas por estar estrechamente asociadas con el rechazo agudo en los trasplantes de médula ósea (Yankelevich, B. y col., J. Immunol. 142, 3423, 1989) y con el control de la producción de anticuerpos IgE mediante el control de la diferenciación Th1/Th2 de las células T colaboradoras (helper T cells) (Yoshimoto, T. y col., J. Exp. Med. 179, 1285, 1994). Por lo tanto, las células NKT son un grupo de nuevas células que están atrayendo actualmente una enorme atención.
Las células V\alpha14^{+} NKT son un subgrupo de las células NKT recién mencionadas. Muchas células V\alpha14^{+} NKT se expresan en el mRNA de V\alpha14J\alpha281 y lo tienen como cadena \alpha de TCR. Recientemente se ha observado que las células V\alpha14^{+} NKT están estrechamente relacionadas con el inicio de enfermedades autoinmunes. Se ha constatado que el número de células V\alpha14^{+} NKT disminuye selectivamente antes del inicio de una enfermedad autoinmune en ratones MRL lpr/lpr, que son los ratones modelo para una enfermedad autoinmune (lupus eritematoso sistémico humano), ya que en ellos se acumulan los linfocitos anormales en animales de 17-20 semanas de edad (Mieza, M.A. y col., J. Immunol. 156, 4035, 1996).
Se observan también fenómenos similares en ratones modelo de otras enfermedades autoinmunes, por ejemplo los ratones gld y los ratones (NZBxNZW)F1, lo cual pone de manifiesto que las células V\alpha14^{+} NKT están estrechamente relacionadas con el inicio de enfermedades autoinmunes (Makino, Y. y col., Clin. Immunol. 28, 1487, 1996).
Es todavía más interesante que se hayan observado también fenómenos similares en los humanos. La cadena V\alpha24J\alphaQ\alpha, un homólogo humano de la cadena V\alpha14J\alpha281 del ratón, se ha encontrado en las células CD4^{-}/CD8^{-} de la sangre periférica de personas sanas en un nivel del 20 al 50%, pero no se encuentra en absoluto en pacientes que sufren esclerosis (Sumida, T. y col., J. Exp. Med. 182, 1163, 1995).
Se sabe, por tanto, que las células V\alpha14^{+} NKT del ratón y las células V\alpha24J\alphaQ\alpha T de los humanos intervienen en diversas enfermedades autoinmunes provocadas por diferentes genes causales o trasfondo genético. Por consiguiente, la IL-12 que tenga una acción activadora de las células NKT, ya mencionada antes, se espera que sea un agente terapéutico para enfermedades autoinmunes, por ejemplo el lupus eritematoso sistémico (SLE) humano y la esclerosis sistémica (SSc). Sin embargo, un aumento acusado del número de linfocitos anormales (células T doble negativa CD3^{+}B220^{+}) en el bazo y en los nódulos (ganglios) linfáticos se ha observado en ratones MRL lpr/lpr a los que se ha administrado la IL-12, por comparación con ratones de control (Takenori Tsutsui y col., Actas de la Asamblea Anual de la Sociedad Japonesa de Inmunología 347, 1996).
En el organismo de los mamíferos están presentes \beta-galactosilceramidas o \beta-glucosilceramidas, a dichas ceramidas están unidos varios azúcares en una configuración \beta (Svennerholm, L. y col., Biochim. Biophys. Acta 280, 626, 1972; Karlsson, K.-A. y col., Biochim. Biophys. Acta 316, 317, 1973). Se sabe por un lado que las \alpha-galactosilceramidas tienen una marcada actividad inmunoestimulante y actividad antitumoral (Morita, M. y col., J. Med. Chem. 38, 2176, 1995) y que tales actividades de las \alpha-galactosilceramidas o \alpha-glucosilceramidas son más fuertes que las desplegadas por las \beta-galactosilceramidas o las \beta-glucosilceramidas (Motoki, K. y col., Biol. Pharm. Bull. 18, 1487, 1995). Se sabe además que la administración de compuestos que tengan una estructura de \alpha-glucosilceramida protege el cuerpo de la radiación (Motoki, K. y col., Bioorg. Med. Chem. Lett. 5, 2413, 1995), suprime la metástasis del melanoma B16 del ratón en el pulmón (Kobayashi, E. y col., Oncology Res. 7, 529, 1995) y la metástasis del adenocarcinoma de colon del ratón, Colon 26, y del linfoma T EL-4 del ratón en el hígado (Kazuhiro Motoki y col., Actas de la Asamblea Anual de la Asociación Japonesa del Cáncer 523, 1996) y aumenta el número de plaquetas y de leucocitos (Motoki, K. y col., Biol. Pharm. Bull. 19, 952, 1996). En el documento JP10045603-A se indica que el uso de una sulfátida como inhibidor de TNF-\alpha. En el documento WO 92/19633 se sugiere que una sulfátida similar puede actuar como antígeno de importancia patogénica en enfermedades autoinmunes.
Sin embargo, no existen informes que documenten que los compuestos que poseen una estructura de \alpha-glucosilceramida sean eficaces en enfermedades autoinmunes o que tales compuestos puedan tener efectos incluso sobre las células NKT.
Resumen de la invención
Los inventores presentes han encontrado ahora que las \alpha-glucosilceramidas amplían la actividades citotóxica antitumoral contra las células tumorales de las células NKT en los ratones RAG-1KO/V\alpha14tg/V\beta8.2tg (ratones que en la fracción de linfocitos tienen un número elevado de células NKT, pero carecen de células B, células T y de células NK), aumentan de modo acusado del número de células NKT, en especial células V\alpha14^{+} NKT de ratón y células V\alpha24^{+} NKT humanas, suprimen el hinchamiento anormal de los nódulos linfáticos axilares e inguinales (acumulación de linfocitos anormales) en los ratones MRL lpr/lpr, que se consideran los ratones modelo del lupus eritematoso sistémico humano y controlan la progresión de la colitis del ratón inducida con DSS del 4%.
Los inventores presentes han encontrado además que las \alpha-glucosilceramidas suprimen el inicio de la encefalomielitis autoinmune experimental. Esta encefalomielitis autoinmune experimental en el ratón es un modelo de la esclerosis múltiple humana. Los inventores presentes han encontrado también que las \alpha-glucosilceramidas suprimen el inicio espontáneo de la diabetes en ratones NOD que son los animales modelo de la diabetes humana de tipo I.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un agente terapéutico para enfermedades autoinmunes, tales como el lupus eritematoso, la esclerosis sistémica, la colitis ulcerosa, la encefalomielitis, la esclerosis múltiple o la diabetes de tipo I.
El agente terapéutico para las enfermedades autoinmunes según la presente invención contiene un compuesto que se define en la reivindicación 1 anexa.
Breve descripción de las figuras
En la figura 1 se muestra el efecto mejorador del KRN7000 en la actividad citotóxica de las células NKT contra las células tumorales. La proporción E/T indica el número de células efectoras (recuento de células del bazo)/el número de células diana (recuento de células YAC-1).
En la figura 2 se representa la estimulación de la proliferación de células NKT por acción del KRN 7000 en el bazo.
A: resultados del análisis FACS de la fracción de linfocitos del bazo. El eje horizontal indica la fluorescencia del anticuerpo monoclonal anti-TCR\alpha\beta marcado con FITC y el eje vertical indica la fluorescencia del anticuerpo monoclonal anti-NK1.1 marcado con citocromo.
B: resultados del análisis FACS de la fracción de linfocitos del bazo. El eje vertical indica el recuento celular relativo y el eje horizontal indica la fluorescencia del anticuerpo monoclonal V\alpha14 marcado con PE. La zona blanca indica la fluorescencia cuando está teñida con el anticuerpo monoclonal V\alpha14 marcado con PE después de haber realizado un tratamiento con un anticuerpo monoclonal V\alpha14 no marcado (bloqueo en frío). La zona sombreada indica la distribución de la fluorescencia del anticuerpo monoclonal V\alpha14 marcado con PE frente a las células V\alpha14^{+} después de la administración de un vehículo o del KRN 7000.
C: cambio en el número total de células, células T, células NK y células V\alpha14^{+} NKT en la fracción de linfocitos del bazo por administración del KRN 7000. \bullet: células V\alpha14^{+} NKT, \circ: células totales, \lozenge: células T, \Box: células NK.
En la figura 3 se representan los resultados en forma de progresión del hinchamiento linfático a lo largo del tiempo en ratones lpr/lpr a los que se ha administrado el KRN 7000. Los nódulos linfáticos se puntúan en 4 grados, a saber, - (0), + (1), ++ (2) y +++ (3), en función del tamaño. La suma de las puntuaciones de los lados derecho e izquierdo del nódulo linfático axilar (A) o del nódulo linfático inguinal (B) se presentan como índices de hinchamiento de nódulos linfáticos.
En la figura 4 se representan los índices de supervivencia de los ratones MRL lpr/lpr a los que se ha administrado el KRN 7000.
En la figura 5 se representa la actividad del KRN 7000 en la supresión de la colitis en ratones, inducida con DSS del 4%. Durante el ensayo, el DSS del 4% se administra en continuo a los ratones junto con el agua de beber.
A: cambio del peso corporal de los ratones en los diferentes grupos. B: índices de supervivencia de los ratones en los diferentes grupos.
En la figura 6 se indica el efecto del KRN 7000 en la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) inducida en ratones C57BL/6, por ejemplo con la proteína oligodendroglia de mielina (MOG). A: grupo al que se administra el vehículo. B: grupo al que se administra el KRN 7000 (20 \mug/kg). Los síntomas de la EAE se puntúan del modo siguiente: puntuación clínica: 0: normal; 1: parálisis de las colas; 2: insuficiencia de reflejo estático; 3: parálisis de las patas traseras; 4: parálisis de las patas delanteras y traseras; 5: muerte.
En la figura 7 se representa el efecto del KRN 7000 en la diabetes espontánea de ratones NOD.
En la figura 8 se representa la actividad estimulante del KRN 7000 en la proliferación de células V\alpha24^{+} NKT. Después de una reacción de linfocitos mixta autóloga empleando células mononucleadas de sangre periférica como células de respuesta (responder cells), se recuperan las células CD4^{-}CD8^{-} para especificar el fenotipo empleando anticuerpos marcados. Las líneas de puntos indican la distribución de fluorescencia cuando se tiñen con anticuerpos de control (IgG de ratón o IgM de rata) y las líneas continuas indican la distribución de fluorescencia cuando se tiñen con anticuerpos anti-CD3, CD4, CD8 y V\alpha24, V\beta11 (Immunotech), y anticuerpos anti-NKRP1a (Becton Dickinson).
En la figura 9 se representa la actividad estimulante del KRN 7000 en la proliferación de células V\alpha24^{+} NKT. Cuando se tratan las células que presentan antígeno con el KRN 7000 se observa una estimulación de la proliferación de las células V\alpha24^{+} NKT de una manera dependiente del número de células que presentan antígeno.
En la figura 10 se representa el resultado de las reacciones de síntesis del KRN 7000, el compuesto \alpha-glucosilceramida representativo empleado en la presente invención. En la figura, "pyr" indica piridina, BrPPh_{3}(CH_{2})_{12}CH_{3} indica el bromuro de tridecanotrifenilfosfonio, el n-BuLi indica n-butil-litio, MsCl indica cloruro de metanosulfonilo, BnBr indica bromuro de bencilo y 1-PrOH indica alcohol propílico.
La figura 11 es la continuación de las reacciones de síntesis, representadas en la figura 10. ESC-HCl incida el clorhidrato de la 1-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)-carbodiimida, MS4A indica tamices moleculares de 4\ring{A} y Hex4NBr indica bromuro de tetrahexilamonio.
En la figura 12 se representan las fórmulas químicas de los compuestos de los ejemplos de 1 a 3.
Descripción detallada de la invención Compuestos de la fórmula (I)
En los compuestos de la fórmula (I), en el grupo ceramida, X indica con preferencia un número entero entre 11 y 25.
En R^{2}, Y indica con preferencia un número entero entre 9 y 17, con mayor preferencia entre 11 y 15.
Las combinaciones preferidas de X y R^{2} en el resto ceramida de la fórmula (I) son compuestos en los que X es un número entero entre 21 y 25 y R^{2} es un sustituyente (b) (en el que Y es un número entero entre 11 y 15) y compuestos en los que X es un número entero entre 9 y 13 y R^{2} es un sustituyente (a) (en el que Y es un número entero entre 11 y 15).
Las combinaciones preferidas para los símbolos de R^{3} y R^{9} del resto azúcar de la fórmula (I) son compuestos en los que R^{3} y R^{6} son H, R^{4} es OH o cualquier sustituyente de los grupos de (A) a (D), R^{5} es OH o cualquier sustituyente del grupo (E) o (F), R^{7} y R^{8} son en cada caso H u OH (pero R^{7} y R^{8} son diferentes entre sí) y R^{9} es CH_{2}OH, CH_{3}, H o cualquier sustituyente de los grupos de (A') a (D').
Las combinaciones más preferidas incluyen los compuestos en los que R^{3} y R^{6} son H, R^{4} y R^{5} son OH, R^{7} y R^{8} son en cada caso H u OH (pero R^{7} y R^{8} son diferentes entre sí) y R^{9} es CH_{2}OH o cualquier sustituyente de los grupos de (A') a (D') y compuestos en los que R^{3}, R^{6} y R^{8} son H, R^{4}, R^{5} y R^{7} son OH y R^{9} es CH_{2}OH.
Los ejemplos preferidos de compuestos de la fórmula (I) comprenden los compuestos en los que
X es un número entero entre 21 y 25,
R^{2} es un sustituyente (b) (en el que Y es un número entero entre 11 y 15),
R^{3} y R^{6} son H,
R^{4} es OH o un grupo elegido entre el conjunto formado por los grupos de (A) a (D),
R^{5} es OH o un grupo elegido entre el conjunto formado por los grupos (E) y (F),
R^{7} y R^{8} son en cada caso H u OH (pero R^{7} y R^{8} no son el mismo sustituyente) y
R^{9} es CH_{2}OH o un grupo elegido entre el conjunto formado por los grupos de (A') a (D'):
los compuestos en los que
X es un número entero de 9 a 13,
R^{2} es un sustituyente (a) (en el que Y es un número entero de 11 a 15),
R^{3} y R^{6} son H,
R^{4} y R^{5} son OH,
R^{7} y R^{8} son en cada caso H u OH (pero R^{7} y R^{8} no son el mismo sustituyente) y
R^{9} es H, CH_{3} o CH_{2}OH;
los compuestos en los que
X es un número entero entre 21 y 25,
R^{2} es un sustituyente (b) (en el que Y es un número entero entre 11 y 15),
R^{3} y R^{6} son H,
R^{4} y R^{5} son OH,
R^{7} y R^{8} son en cada caso H u OH (pero R^{7} y R^{8} no son el mismo sustituyente) y
R^{9} es CH_{2}OH o un grupo seleccionado entre el conjunto formado por los grupos de (A') a (D'); y
los compuestos en los que
X es un número entero entre 21 y 25,
R^{2} es un sustituyente (b) (en el que Y es un número entero entre 11 y 15),
R^{3}, R^{6} y R^{8} son H,
R^{4}, R^{5} y R^{7} son OH y
R^{9} es CH_{2}OH.
Los compuestos preferidos que son componentes eficaces de agentes terapéuticos según la presente invención incluyen:
el (2S,3S,4R)-1-(\alpha-D-galactopiranosiloxi)-2-hexacosanoilamino-3,4-octadecanodiol (KRN 7000),
el (2S,3R)-1-(\alpha-D-galactopiranosiloxi)-2-tetradecanoil-amino-3-octadecanol (AGL-517),
el (2S,3R)-1-(\alpha-D-glucopiranosiloxi)-2-tetradecanoil-amino-3-octadecanol (AGL-563),
el (2S,3R)-1-(6'-desoxi-\alpha-D-galactopiranosiloxi)-2-tetradecanoilamino-3-octadecanol (AGL-571),
el (2S,3R)-1-(\beta-L-arabinopiranosiloxi)-2-tetradecanoil-amino-3-octadecanol (AGL-577),
el O-\alpha-D-galactopiranosil-(1\rightarrow6)-O-\alpha-D-galactopiranosil-(1\rightarrow1)-(2S,3S,4R)-2-amino-N-hexacosanoil-1,3,4-octadecanotriol (AGL-586),
el O-\alpha-D-galactopiranosil-(1\rightarrow6)-O-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow1)-(2S,3S,4R)-2-amino-N-hexacosanoil-1,3,4-octadecanotriol (AGL-584),
el O-\alpha-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-O-\alpha-D-galactopiranosil-(1\rightarrow1)-(2S,3S,4R)-2-amino-N-[(R)-2-hidroxitetracosanoil]-1,3,4-octadecanotriol (S1140B-9),
el O-\beta-D-galactofuranosil-(1\rightarrow3)-O-\alpha-D-galactopiranosil-(1\rightarrow1)-(2S,3S,4R)-2-amino-N-[(R)-2-hidroxitetracosanoil]-1,3,4-octadecanotriol (719-7) y
\newpage
el O-(N-acetil-2-amino-2-desoxi-\alpha-D-galactopiranosil-(1\rightarrow3)-O-[\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow2)]-O-\alpha-D-galactopira-
nosil-(1\rightarrow1)]-(2S,3S,4R)-2-amino-N-[(R)-2-hidroxitetracosanoil]-1,3,4-octadecanotriol (STL-8).
Un compuesto especialmente preferido para el uso como principio activo en agentes terapéuticos según la presente invención es el (2S,3S,4R)-1-(\alpha-D-galactopiranosiloxi)-2-hexacosanoilamino-3,4-octadecanodiol (KRN 7000).
Los compuestos de la fórmula (I) pueden estar presentes en forma de sales no tóxicas y farmacéuticamente aceptables de los mismos. Las sales de la fórmula (I) incluyen las sales de adición de ácido, por ejemplo las sales con ácidos inorgánicos (p.ej. ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico y ácido fosfórico) o con ácidos orgánicos (p.ej. ácido acético, ácido propiónico, ácido maleico, ácido oleico, ácido palmítico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido fumárico, ácido glutámico, ácido pantoténico, ácido laurilsulfónico, ácido metanosulfónico y ácido ftálico).
Los compuestos de la fórmula (I) pueden estar en forma de solvatos de los mismos (p.ej. hidratos).
Los compuestos de la fórmula (I) pueden obtenerse por cualquier método adecuado de síntesis de \alpha-glucosilceramidas.
En primer lugar se sintetiza un resto ceramida empleando como material de partida la D-lixosa, después se introduce un azúcar en esta ceramida para obtener los compuestos de la fórmula (I). Un método general para sintetizar tales \alpha-gluosilceramidas se describe por ejemplo en los documentos WO 93/5055, WO 94/2168, WO 94/9020 y WO 94/24142.
Los compuestos de la fórmula (I) pueden aislarse también a partir de productos naturales (p.ej. organismos biológicos) y purificarse por cromatografía de columna o métodos similares.
Uso de los compuestos de la fórmula (I)
Los inventores presentes han encontrado que la actividad citotóxica antitumoral de las células NKT se amplía cuando se administra el KRN 7000, un compuesto representativo de la presente invención, a ratones RAG-1KO/V\alpha14tg/
V\beta8.2tg (ejemplo de ensayo farmacológico 1).
Los inventores presentes han encontrado que las \alpha-glucosilceramidas aumentan de forma acusada el número de células NKT, en especial de células V\alpha14^{+} NKT y de células V\alpha-24^{+} NKT (ejemplos de ensayos farmacológicos 2, 6 y 9). Se ha constatado que las células células V\alpha14^{+} NKT de ratón y las células células V\alpha24^{+} NKT humanas intervienen en diversas enfermedades autoinmunes provocadas por diferentes genes causantes y trasfondo genético, tal como sugieren los hallazgos siguientes: que las células V\alpha-14^{+} NKT disminuyen en los ratones modelo de enfermedad autoinmune, que las células T V\alpha24^{+} J\alphaQ\alpha desaparecen en los pacientes que sufren esclerosis y que las células V\alpha24^{+} NKT disminuyen en gran manera en los pacientes que sufren una diabetes avanzada del tipo I (Mieza, M.A. y col., J. Immunol. 156, 4035, 1996; Makino, Y. y col., Clin. Immunol. 28, 1487, 1996; Sumida, T. y col., J. Exp. Med. 182, 1163, 1995; Wilson y col., Nature 391, 177, 1998). Los inventores presentes han encontrado que cuando se administra el KRN 7000 a ratones MRL lpr/lpr, que se consideran los ratones modelo del lupus eritematoso sistémico humano (Sakamoto, A., Clin. Immunol. 28, 1558, 1996), se suprime el hinchamiento anormal de los nódulos linfáticos axilares e inguinales (acumulación de linfocitos anormales) (ejemplo de ensayo farmacológico 3). El hinchamiento anormal de los nódulos linfáticos es un síntoma característico observado en los ratones MRL lpr/lpr a medida que pasa el tiempo.
Las "células NKT" empleado en esta descripción incluyen las células V\alpha24^{+} NKT humanas y las células V\alpha14^{+} NKT de ratón. Las células V\alpha24^{+} NKT humanas son un subgrupo de las células T V\alpha24J\alphaQ\alpha humanas y significan células T doble negativa (CD4^{-}CD8^{-}) V\alpha24^{+} (Dellabona, P. y col., J. Exp. Med. 180, 1171, 1994). Además, el término "activación de células NKT" incluye una mejora o ampliación de la actividad citotóxica y de la estimulación de la proliferación de las células NKT.
Según la presente invención, el compuesto de la fórmula (I) o una sal o un solvato del mismo puede utilizarse para la fabricación de agentes terapéuticos destinados al tratamiento de enfermedades autoinmunes. El término "enfermedad autoinmune" empleado en esta descripción indica el lupus eritematoso sistémico, la esclerosis sistémica, la colitis ulcerosa, la esclerosis múltiple, la encefalomielitis, la diabetes de tipo I, el reumatismo articular crónico, el síndrome de Sjoegren, la cirrosis biliar primaria, la púrpura trombocitopénica idiopática, la anemia hemolítica autoinmune, la miastenia grave, la oftalmia simpatética, el síndrome de Goodpasture (p.ej. la nefritis glomerular), la anemia perniciosa y la enfermedad de Hashimoto. El término "tratamiento" o "terapia" empleado en la presente descripción incluye la "prevención".
El compuesto de la fórmula (I) o una sal o un solvato de la misma y la IL-12 pueden formularse en formas de dosificación idóneas, en función del tratamiento médico, de la vía de administración y de la finalidad perseguida con la administración, p.ej. agentes inyectables, suspensiones, emulsiones, ungüentos, cremas, tabletas, cápsulas, gránulos, polvos, píldoras, gránulos, pastillas, formulaciones para la administración rectal, supositorios aceitosos y supositorios solubles en agua.
Las distintas formulaciones farmacéuticas pueden fabricarse por métodos convencionales empleando los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables siguientes: excipientes por ejemplo disolventes (p.ej. agua, solución salina fisiológica), agentes hinchantes o cargas de relleno (p.ej. lactosa, almidón, celulosa cristalina, manita, maltosa, hidrogenofosfato cálcico, anhídrido silícico blando y carbonato cálcico); adyuvantes, por ejemplo agentes solubilizantes (p.ej. etanol y polisolvatos), agentes aglutinantes (p.ej. almidón, polivinilpirrolidona, hidroxipropilcelulosa, etilcelulosa, carboximetilcelulosa y goma arábiga), agentes desintegrantes (p.ej. almidón y carboximetilcelulosa cálcica), agentes lubricantes (p.ej. estearato magnésico, talco y aceite hidrogenado), agentes estabilizantes (p.ej. lactosa, manita, maltosa, polisolvatos, Macrogol y aceite de ricino hidrogenado polietoxilado), agentes isotónicos, agentes humectantes, agentes lubricantes, agentes dispersantes, agentes tamponantes y agentes solubilizantes; y aditivos, por ejemplo antioxidantes, conservantes, saborizantes y agentes aromatizantes, agentes analgésicos, agentes estabilizantes, agentes colorantes y agentes edulcorantes.
Si fuera necesario, a las diversas formulaciones farmacéuticas se les pueden añadir glicerina, dimetilacetamida, lactato sódico del 70%, tensioactivos y sustancias alcalinas (p.ej. etilendiamina, etanolamina, carbonato sódico, arginina, meglumina y trisaminometano).
En la presente invención, el compuesto de la fórmula (I) y la IL-12 pueden administrarse a través de cualquier vía idónea, por ejemplo en el caso de animales por administración intraperitoneal o subcutánea, administración intravenosa o intra-arterial y por administración local mediante inyección. Además, en el caso de humanos, puede utilizarse la administración intravenosa o intra-arterial, administración local mediante inyección, administración intraperitoneal o intratorácica, administración subcutánea, administración intramuscular, administración sublingual, absorción percutánea o administración rectal. La más preferida es la administración intravenosa.
Los compuestos eficaces individuales de los agentes terapéuticos de la presente invención pueden administrarse de forma continua o intermitente, en función de la situación del individuo. Las dosis actuales vienen determinadas en función de una gran variedad de factores, por ejemplo los métodos de administración, el estado general del paciente, por ejemplo la edad, el peso corporal, el sexo y la sensibilidad, el tiempo de administración y otros medicamentos que se tomen simultáneamente. Una dosis diaria de los compuestos de la fórmula (I) y de la IL-12 para un adulto humano, por ejemplo para la administración intravenosa, se sitúa en general entre 0,001 y 10 mg, con preferencia entre 0,1 y 1 mg. El compuesto de la fórmula (I) se formula con preferencia en preparados liofilizados, que se disuelven con preferencia en agua destilada apta las inyecciones, antes de administrarse a los pacientes.
Ejemplos
La presente invención se ilustra además con los ejemplos siguientes.
Síntesis, aislamiento y purificación de los compuestos Ejemplo 1 Síntesis del (2S,3S,4R)-1-(\alpha-D-galactopiranosiloxi)-2-hexacosanoilamino-3,4-octadecanodiol (KRN 7000)
Las etapas de la síntesis se ilustran en las figuras 10 y 11.
(1) Síntesis del compuesto G1
Se añade ácido sulfúrico (0,5 ml) a una solución de D-lixosa (200 g, 1,33 moles) en acetona (3,0 litros), que se ha secado con cloruro cálcico, y se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 18 horas. Se añaden tamices moleculares de 4\ring{A} pulverizados (100 g), se neutraliza la mezcla reaccionante, después se filtra a través de Celite y se lava el residuo resultante con acetona. Se reúnen el líquido filtrado y el líquido de lavado y se concentran con vacío, obteniéndose un producto en bruto de G1. Rendimiento: 240 g (95%). Se utiliza el producto para la etapa siguiente sin más purificación. Se purifica una muestra para ensayo por cromatografía a través de gel de sílice empleando como eluyente una mezcla 9/1 de hexano/acetona.
Punto de fusión: 76-78ºC; EM-FD m/z: 191 (M+1)^{+}; RMN-H^{1} (500 MHz, CDCl_{3}) \delta = 5,45 (1H, d, J = 1,8 Hz), 4,83
(1H, dd, J = 3,7, 5,5 Hz), 4,64 (1H, d, J = 6,1 Hz), 4,27-4,30 (1H, m), 3,90-3,99 (2H, m), 1,48 (3H, s), 1,32 (3H, s).
(2) Síntesis del compuesto G2
Se añaden piridina (10 ml) y cloruro de tritilo (39,0 g) a una solución del compuesto G1 (239 g, unos 1,26 mmoles) en cloruro de metileno (168 ml) y se agita la mezcla a 32ºC durante 4 horas. Se añade etanol (8 ml) por goteo y se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas. Se lava con una solución acuosa saturada de cloruro amónico, una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico y una solución de cloruro sódico y se efectúa una concentración con vacío. Se disuelve el residuo resultante en acetato de etilo, se enfría a 0ºC y después se cristaliza. Rendimiento: 51 g (87% calculado sobre la D-lixosa).
Punto de fusión: 174-176ºC; EM-FD m/z: 432 M^{+}; RMN-H^{1} (500 MHz, CDCl_{3}) \delta = 7,21-7,49 (15H, m), 5,38 (1h; d, J = 2,4 Hz), 4,75 (1H, dd, J = 3,7, 6,1 Hz), 4,59 (1H, d, J = 6,1 Hz), 4,31-4,35 (1H, m), 3,43 (1H, dd, J = 4,9, 9,8 Hz), 3,39 (1H, dd, J = 6,7, 9,8 Hz), 1,29 (3H, s), 1,28 (3H, s).
(3) Síntesis del compuesto G3
A una solución de bromuro de tridecanotrifenilfosfonio (962 g, 1,16 moles; obtenido por ebullición de 1-bromotridecano y trifenilfosfina a 140ºC durante 4,5 horas) en THF (1500 ml) se le añade por goteo a 0ºC en atmósfera de argón una solución 2,5 M de n-butil-litio en hexano (462 ml, 366 mmoles). Se agita la mezcla durante 15 minutos, después se añade por goteo una solución del compuesto G2 (250 g, 579 mmoles) en THF (450 ml). Se agita la mezcla durante 18 horas, dejando subir paulatinamente la temperatura hasta temperatura ambiente. Se concentra la solución reaccionante con vacío, al residuo se le añade una mezcla 10/7/3 de hexano/metanol/agua (1000 ml) y se lava la mezcla con una solución acuosa saturada de cloruro amónico. Se extrae la fase acuosa con hexano (500 ml). Se reúnen las fases orgánicas, se secan con sulfato magnésico anhidro y después se concentran con vacío, obteniéndose un producto en bruto del compuesto G3. Se utiliza el producto en la etapa siguiente sin más purificación. Rendimiento: 339 g (98%). Se purifica una muestra para ensayo por cromatografía a través de gel de sílice, empleando como eluyente una mezcla 9/1 de hexano/acetato de etilo.
EM-FD m/z: 598 M^{+}; RMN-H^{1} (500 MHz, CDCl_{3}) \delta = 7,21-7,45 (15H, m), 5,48-5,59 (2H, m), 4,91 (0,7H, t, J = 7,3 Hz), 4,44 (0,3H, t, J = 7,3 Hz), 4,26 (0,3H, dd, J = 4,3, 7,3 Hz), 4,21 (0,7H, dd, J = 4,3, 6,7 Hz), 3,75 (0,7H, m), 3,69 (0,3H, m), 3,24 (0,3H, dd, J = 4,9, 9,8 Hz), 3,17 (0,7H, dd, J = 4,9 9,8 Hz), 3,09-3,14 [1H, (3,11, dd, J = 4,9, 9,2 Hz), H1bE solapado por encima], 1,75-2,03 (2H, m), 1,49 (3H, s), 1,39 y 1,38 (3H, cada uno s), 1,21-1,34 (20H, m), 0,88 (3H, t, J = 6,7 Hz).
(4) Síntesis del compuesto G4
A una solución del compuesto G3 (338 g, unos 565 moles) en cloruro de metileno (1500 ml) se le añade piridina (500 ml) y después se le añade por goteo el cloruro de metanosulfonilo (49 ml, 633 mmoles). Se agita la mezcla a 31ºC durante 24 horas. Se añade etanol (40 ml) por goteo y se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hora. Se concentra con vacío, se añade al residuo para separarlo una mezcla 10/7/3 de hexano/metanol/agua (1000 ml). Se extrae la fase acuosa 3 veces con hexano (200 ml). Se reúnen las fases orgánicas, se secan con sulfato magnésico anhidro y después se concentran con vacío, obteniéndose el producto en bruto del compuesto G4. Se utiliza el producto para la etapa siguiente sin más purificación. Rendimiento: 363 g (95%). Se purifica una muestra para ensayo por cromatografía a través de gel de sílice empleando como eluyente una mezcla 9/1 de hexano/acetato de etilo.
EM-FD m/z: 676 M^{+}; RMN-H^{1} (500 MHz, CDCl_{3}) \delta = 7,21-7,47 (15H, m), 5,41 (0,7H, ddd, J = 5,5, 9,2, 11,0 Hz), 5,32 (0,7H, bt, J = 11,0 Hz), 5,22 (0,3H, bdd, J = 9,2, 15,0 Hz), 5,02 (0,3H, dt, Jt = 7,3 Hz, Jd = 15,0 Hz), 4,8 (0,7H, ddd, J = 3,1, 5,5, 7,9 Hz), 4,73 (0,7H, dd, J = 5,5, 9,8 Hz), 4,64-4,67 (0,3H, m), 4,61 (0,3H, dd, J = 5,5, 9,2 Hz), 4,48 (0,7H, dd, J = 5,5, 7,9 Hz), 4,22 (0,3H, dd, J = 5,5, 9,2 Hz), 3,55 (0,3H, dd, J = 2,4, 11,6 Hz), 3,45 (0,7H, dd, J = 3,2, 11,0 Hz), 3,06-3,12 [4H, (3,12, s), (3,11, s), (3,09, dd, J = 3,11, 11,0 Hz)], 166-1,82 (2H, m), 1,47 y 1,46 (3H, cada uno s), 1,39 (3H, s), 1,13-1,35 (20H, m), 0,88 (3H, t, J = 6,8 Hz).
(5) Síntesis del compuesto G5
A una solución del compuesto G4 (362 g, unos 536 moles) en cloruro de metileno (1500 ml) se le añade metanol (350 ml) y después se le añade por goteo ácido clorhídrico concentrado (200 ml). Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 5 horas. Se neutraliza la solución reaccionante por adición de hidrogenocarbonato sódico y después se filtra. Se concentra el líquido filtrado con vacío y se añade acetato de etilo al residuo resultante y se lava con una solución salina. Se extrae la capa acuosa con acetato de etilo, se reúnen las fases orgánicas, se secan con sulfato magnésico anhidro y se concentran con vacío. Se efectúa una cristalización en hexano. Rendimiento: 161 g (70% calculado sobre G2).
Punto de fusión: 66-67ºC; EM-FD m/z: 377 (M-H_{2}O)^{+}; RMN-H^{1} (500 MHz, CDCl_{3}+D_{2}O) \delta = 5,86 (0,3H, dt, Jt = 7,3 Hz, Jd = 14,7 Hz), 5,77 (0,7H, dt, Jt = 7,3, Jd = 10,4 Hz), 5,55 (0,3H, ancha dd, J = 7,3, 14,7 Hz), 5,49 (0,7H, bt, J = 9,8 Hz), 4,91-4,97 (1H, m), 4,51 (0,7H, bt, J = 9,8 Hz), 4,11 (0,3H, bt, J = 7,3 Hz), 3,94-4,03 (2H, m), 3,67-3,73 [1H, (3,7, dd, J = 3,1, 6,7 Hz), (3,69, dd, J = 3,1, 7,3 Hz)], 3,20 y 3,19 (3H, cada uno s), 2,05-2,22 (2H, m), 1,22-1,43 (20H, m), 0,88 (3H, t, J = 6,7 Hz).
(6) Síntesis del compuesto G6
A una solución del compuesto G5 (160 g, unos 405 moles) en THF (780 ml) se le añade paladio al 5% sobre sulfato bárico (16 g). Después de reemplazar el aire de la cámara de reacción por gas hidrógeno se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 20 horas. Se filtra la solución reaccionante a través de Celite, después se lava con una mezcla 1/1 de cloroformo/metanol. Se reúnen el líquido filtrado y el líquido de lavado y se concentran con vacío. Se cristaliza el residuo resultante en acetato de etilo. Rendimiento: 146 g (91%).
[\alpha]^{23}_{D} = +12º (c1, CHCl_{3}/MeOH = 1/1); punto de fusión: 124-126ºC; EM-FD m/z: 397 (M+1)^{+}; RMN-H^{1} (500 MHz, CDCl_{3}/CD_{3}OD = 1/1) \delta = 4,93-4,96 (1H, m, H2), 3,91 (1H, dd, J = 6,7, 12,2 Hz), 3,85 (1H, dd, J = 4,9, 12,2 Hz), 3,54-3,60 (1H, m), 3,50 (1H, dd, J = 1,8, 8,5 Hz), 3,19 (3H, s), 1,75-1,83 (1H, m), 1,53-1,62 (1H, m), 1,21-1,45 (24H, m), 0,89 (3H, t, J = 6,7 Hz).
(7) Síntesis del compuesto G7
A una solución del compuesto G6 (145 g, 365 moles) en DMF (1000 ml) se le añade azida sódica (47 g, 730 mmoles) y se agita la mezcla a 95ºC durante 4 horas. Se concentra la solución reaccionante, se añade acetato de etilo al residuo resultante y se efectúa un lavado con agua. Se extrae de nuevo la fase acuosa con acetato de etilo. Se reúnen las fases orgánicas, se lavan con una solución salina, se secan con sulfato magnésico anhidro y después se concentran con vacío, obteniéndose un producto en bruto del compuesto G7. Rendimiento: 122 g (97%). Se utiliza el producto en la etapa siguiente sin más purificación. Rendimiento: 126 g (95%). Se purifica una muestra para ensayo por cromatografía a través de gel de sílice empleando como eluyente una mezcla 9/1 de hexano/acetato de etilo.
[\alpha]^{23}_{D} = +16,5º (c0,5, CHCl_{3}/MeOH = 1/1); punto de fusión: 92-93ºC; EM-FD m/z: 344 (M+1)^{+}; RMN-H^{1} (500 MHz, CD_{3}OD) \delta = 3,91 (1H, dd, J = 3,7, 11,6 Hz), 3,75 (1H, dd, J = 7,9, 11,6 Hz), 3,49-3,61 (3H, m), 1,50-1,71 (2H, m), 1,22-1,46 (24H, m), 0,90 (3H, t, J = 6,7 Hz).
(8) Síntesis del compuesto G8
A una solución del compuesto G7 (121 g, unos 352 mmoles) en cloruro de metileno (750 ml) se le añade piridina (250 ml) y cloruro de tritilo (124 g, 445 mmoles) y se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 16 horas. Se añade etanol por goteo (30 ml). Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos, se lava con una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico, una solución acuosa saturada de cloruro amónico y una solución salina, se seca con sulfato magnésico anhidro y se concentra con vacío. Se purifica el residuo resultante por cromatografía a través de gel de sílice empleando como eluyente una mezcla 10/1 de hexano/acetato de etilo. Rendimiento: 34,4 g (52%, calculado sobre el G6).
[\alpha]^{24}_{D} = +11,9º (c0,9, CHCl_{3}); EM-FD m/z: 585 M^{+}; RMN-H^{1} (500 MHz, CDCl_{3}+D_{2}O) \delta = 7,24-7,61 (15H, m), 3,62-3,66 (2H, m), 3,51-3,57 (2H, m), 3,42 (1H, dd, J = 6,0, 10,4 Hz), 1,23-1,56 (26H, m), 0,88 (3H, t, J = 6,7 Hz).
(9) Síntesis del compuesto G9
A una solución del compuesto G8 (33,5 g, 57,3 mmoles) en DMF (300 ml) se le añade sodio hidrogenado del 60% (5,5 g, unos 138 mmoles en forma de NaH) y se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 40 minutos. Se enfría la solución reaccionante a 0ºC y se le añade por goteo cloruro de bencilo (15 ml, 120 mmoles). Se agita la mezcla durante 18 horas dejando que se caliente paulatinamente hasta temperatura ambiente. Se añade agua-hielo (100 ml) a la solución reaccionante. Una vez interrumpida la reacción se efectúa una extracción empleando acetato de etilo. Se lava el extracto 3 veces con una solución salina, se reúnen los extractos orgánicos, se secan con sulfato magnésico y después se concentran con vacío, obteniéndose un producto en bruto del compuesto G9. Este producto se emplea en la etapa siguiente sin más purificación. Rendimiento: 42,2 g (96%). Se purifica una muestra para ensayo por cromatografía a través de gel de sílice empleando como eluyente una mezcla 100/1 de hexano/acetato de etilo.
[\alpha]^{24}_{D} = +9,8º (c1,0, CHCl_{3}); EM-FD m/z: 738 (M-N_{2})^{+}; RMN-H^{1} (500 MHz, CDCl_{3}) \delta = 7,07-7,48 (25H, m), 4,57 (1H, d, J = 11,6 Hz), 4,44 (1H, d, J = 11,6 Hz), 4,41 (2H, s), 3,73-3,79 (1H, m), 3,46-3,56 (2H, m), 3,37 (1H, dd, J = 8,6, 10,4 Hz), 1,20-1,64 (26H, m), 0,88 (3H, t, J = 6,7 Hz).
(10) Síntesis de los compuestos G10 y G11
A una solución del compuesto G9 (41,2 g, unos 54 mmoles) en 1-propanol (250 ml) se le añade metanol (30 ml) y después se le añade paladio al 5% sobre carbón (4,1 g) y formiato amónico (27,1 g, 4,3 moles). Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 16 horas, se diluye con acetato de etilo y se filtra a través de Celite. Se concentra el líquido filtrado con vacío y se disuelve el residuo resultante con acetato de etilo, se lava 3 veces con una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico y con una solución salina. Se reúnen las fases orgánicas, se secan con sulfato magnésico anhidro y después se concentran con vacío, obteniéndose un producto en bruto de G10. Rendimiento: 38,9 g (98%). El G10 así obtenido se emplea en la etapa siguiente sin más purificación.
A una solución del compuesto G10 en cloruro de metileno (300 ml) se le añaden ácido hexacosánico (22,4 g, 56,5 mmoles) y cloruro de hidrógeno WSC (12,6 g, 64,6 mmoles) y se mantiene la mezcla en reflujo durante 2 horas por calentamiento. Se enfría la mezcla a temperatura ambiente y se concentra con vacío. Al residuo se le añade acetato de etilo (500 ml) y se efectúa un lavado con una solución acuosa 0,5 M de ácido clorhídrico, una solución salina y una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico y de nuevo con una solución salina. Se reúnen las fases orgánicas, se secan con sulfato magnésico anhidro y después se concentran con vacío, obteniéndose un producto en bruto del compuesto G1. Rendimiento: 53,2 g (88%). Se utiliza el G11 así obtenido para la etapa siguiente sin más purificación. Se purifica una muestra para ensayo por cromatografía a través de gel de sílice empleando como eluyente una mezcla 100/1 de hexano/acetato de etilo.
[\alpha]^{24}_{D} = +5,3º (c0,4, CHCl_{3}); EM-FD m/z: 1118 M^{+}; RMN-H^{1} (500 MHz, CDCl_{3}) \delta = 7,20-7,38 (25H, m), 5,57 (1H, d, J = 9,1 Hz), 4,80 (1H, d, J = 11,6 Hz), 4,48-4,50 (3H, m), 4,24-4,32 (1H, m), 3,83 (1H, dd, J = 3,0, 6,7 Hz), 3,43-3,51 (2H, m, H1a), 3,29 (1H, dd, J = 4,3, 9,8 Hz), 1,92 (2H, t, J = 7,3 Hz), 1,28-1,60 (72H, m), 0,88 (6H, t, J = 6,7 Hz).
(11) Síntesis del compuesto G12
A una solución del compuesto G11 (52,2 g, unos 47 mmoles) en cloruro de metileno (180 ml) se le añade metanol (36 ml), después se le añade por goteo una solución de metanol al 10% en cloruro de metileno (3,0 ml) y se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas. Se neutraliza la solución reaccionante con hidrogenocarbonato sódico en polvo (18 g) y se filtra a través de Celite. Se lava el residuo con cloruro de metileno. Se reúnen el líquido del filtrado y el líquido del lavado y se lavan con una solución salina. Se seca la fase orgánica con sulfato magnésico anhidro y se concentra con vacío. Se disuelve el residuo en acetona con calentamiento y se enfría la solución a 0ºC y se purifica por precipitación. Rendimiento: 38,6 g (77% calculado sobre G9).
[\alpha]^{24}_{D} = -29,7º (c0,7, CHCl_{3}); punto de fusión: 75-76,5ºC; EM-FD m/z: 876 M^{+}; RMN-H^{1} (500 MHz, CDCl_{3}) \delta = 7,30-7,47 (10H, m), 6,03 (1H, d, J = 7,9 Hz), 4,72 (1H, d, J = 11,6 Hz), 4,66 (1H, d, J = 11,6 Hz), 4,61 (1H, d, J = 11,6 Hz), 4,45 (1H, d, J = 11,6 Hz), 4,12-4,17 (1H, m), 4,00 (1H, dt, Jt = 4,3, Jd = 7,3 Hz), 3,67-3,72 (2H, m), 3,61 (1H, ddd, J = 4,3, 8,6, 11,6 Hz), 1,94-2,05 (2H, m), 1,15-1,69 (72H, m), 0,88 (6H, t, J = 6,1 Hz).
(12) Síntesis del compuesto G13
1) Se disuelve el acetato de 2,3,4,6-tetra-O-bencil-D-galactopiranosilo (79,8 g) en una mezcla de tolueno (160 ml) y éter isopropílico (520 ml) y se enfría la solución entre -10 y 0ºC. A esta solución se le añade una solución de éter isopropílico (2,8 mmoles/ml, unos 100 ml) que contiene 2,0 equivalentes en volumen de HBr. Después de agitar durante unos 90 minutos entre -10 y 0ºC se vierte sobre la solución reaccionante una solución acuosa de hidrogenocarbonato sódico al 5% y se neutraliza el exceso de HBr con agitación. Se trasvasa la totalidad del volumen a un embudo de decantación para efectuar la separación, después se descarta la fase acuosa y se efectúan 2 lavados con una solución acuosa de cloruro sódico al 10%. Se concentra con vacío, obteniéndose el bromuro de 2,3,4,6-tetra-O-bencil-\alpha-D-galactopiranosilo (GalBr) en forma de jarabe.
2) A una solución del compuesto G12 (60,0 g, 68,6 mmoles), bromuro de tetrahexilamonio (89,4 g, 206 mmoles) y tamices moleculares de 4\ring{A} (60 g) en tolueno (420 ml) se le añade DMF (140 ml) y después una solución del GalBr (unos 137 mmoles) en tolueno (250 ml). Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 72 horas. Se añade metanol (12 ml) a la solución reaccionante y se agita la mezcla durante 2 horas. Se filtra a través de Celite y se lava con una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico y una solución salina, después se seca con sulfato magnésico anhidro y se concentra con vacío. Se añade acetonitrilo al residuo resultante y se agita la mezcla durante 2 horas. Se seca el precipitado resultante con alto vacío, obteniéndose un polvo seco. Se purifica este polvo por cromatografía a través de gel de sílice empleando como eluyente una mezcla 8/1 de hexano/acetato de etilo. Rendimiento: 70,9 g (74%).
[\alpha]^{24}_{D} = +18,8º (c0,9, CHCl_{3}); punto de fusión: 74-75ºC; EM-FD m/z: 1399 (M+1)^{+}; RMN-H^{1} (500 MHz, CDCl_{3}) \delta = 7,21-7,37 (30H, m), 6,12 (1H, d, J = 9,0 Hz), 4,91 (1H, d, J = 11,6 Hz), 4,84 (1H, d, J = 3,7 Hz), 4,72-4,80 (4H, m), 4,35-4,65 (7H, m), 4,12-4,18 (1H, m), 3,99-4,05 (2H, m), 3,84-3,83 (4H, m), 3,73 (1H, dd, J = 3,7, 11,0 Hz), 3,47-3,51 (2H, m), 3,42 (1H, dd, J = 6,1, 9,1 Hz), 1,87-1,99 (2H, m), 1,18-1,70 (72H, m), 0,88 (6H, t, J = 7,4 Hz).
(13) Síntesis del compuesto KRN 7000
Se prepara una suspensión del compuesto G13 (60,0 g, 42,9 mmoles) en etanol (960 ml), a esta suspensión se le añade una suspensión de hidroxi-paladio al 20% (6.0 g) en etanol. A continuación se añade una fuente de hidrógeno, el 4-metilciclohexeno (120 mg, 93,5 mmoles). Se mantiene en ebullición a reflujo durante 4 horas, se efectúa una filtración y se elimina el disolvente. Se lava el residuo con metanol caliente. Se deja el líquido filtrado en reposo a temperatura ambiente para obtener un precipitado blanco, se filtra el precipitado y se seca con vacío. Se suspende el polvo resultante en una mezcla 92/8 de etanol/agua (3,5 litros) y se disuelve por calentamiento y agitación. Se deja la solución en reposo para obtener, de nuevo, un precipitado. Se filtra la solución con el precipitado y se seca la torta del filtro con vacío, obteniéndose un polvo blanco. Rendimiento: 35,0 g (95%).
[\alpha]^{23}_{D} = +43,6º (c1,0, piridina); punto de fusión: 189,5-190,5ºC; EM-FAB negativo m/z: 857 (M-H)^{-}; IR (KBr, cm^{-1}) 3300, 2930, 2850, 1640, 1540, 1470, 1070; RMN-H^{1} (500 MHz, C_{5}D_{5}N) \delta = 8,47 (1H, d, J = 8,5 Hz), 5,58 (1H, d, J = 3,7 Hz), 5,27 (1H, m), 4,63-4,70 (2H, m), 4,56 (1H, m), 4,52 (1H, t, J = 6,1 Hz), 4,37-4,47 (4H, m), 4,33 (2H, m), 2,45 (2H, t, J = 7,3 Hz), 2,25-2,34 (1H, m), 1,87-1,97 (2H, m), 1,78-1,85 (2H, m), 1,62-1,72 (1H, m), 1,26-1,45 (66H, m), 0,88 (6H, t, J = 6,7 Hz); RMN-C^{13} (125 MHz, C_{5}D_{5}N) \delta = 173,2 (s), 101,5 (d), 76,7 (d), 73,0 (d), 72,5 (d), 71,6 (d), 71,0 (d), 70,3 (d), 68,7 (t), 62,7 (t), 51,4 (d), 36,8 (t), 34,4 (t), 32,1 (t), 30,4 (t), 30,2 (t), 30,03 (t), 30,00 (t), 29,93 (t), 29,87 (t), 29,81 (t), 29,76 (t), 29,6 (t), 26,5 (t), 26,4 (t), 22,9 (t), 14,3 (q).
Ejemplo 2 Aislamiento y purificación del O-\alpha-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-O-\alpha-D-galactopiranosil-(1\rightarrow1)-(2S,3S,4R)-2-amino-[(R)-2-hidroxitetracosanoil]-1,3,4-octadecanotriol (S1140B-9)
Se extrae un polvo liofilizado de esponjas (447,1 g), que se recolectan en el mar a una profundidad de 15-25 m, cerca de la isla Kume, provincia de Okinawa (Japón), con una mezcla de cloroformo y metanol y después se concentra con vacío el líquido extraído, obteniéndose 51,28 g de extracto. Se reparte el extracto entre acetato de etilo y agua y se secan la capa superior y la capa central con sulfato sódico anhidro y se concentran con vacío, obteniéndose fracciones de 18,37 g y 9,44 g, respectivamente. Se reúnen la capa alcohólica, obtenida después de repartir la fracción de la capa superior entre metanol al 10% en agua y n-hexano, y la fracción obtenida de la capa central y se concentran. Se efectúa repetidamente una cromatografía a través de gel de sílice, obteniéndose 169,9 mg de un único componente activo según cromatografía de capa fina (CCF) en fase normal. Se efectúa también una cromatografía HPLC en fase inversa empleando una columna ODS-AM (un producto de YMC, 250 mm de longitud x 20 mm de diámetro, eluyente: metanol, caudal: 9,0 ml/min) (tiempo de retención: 30,3 minutos), obteniéndose 10,2 mg del compuesto epigrafiado purificado (S1140B-9).
El compuesto epigrafiado puede aislarse y purificarse también por el método descrito por F. Cafieri y col., Liebigs Ann. Chem. 1477-1481, 1995.
EM-FAB negativo m/z 1007 [(M-H)^{-}]; IR; RMN-H^{1} (500 MHz, C_{5}D_{5}N, 24ºC) \delta (ppm) = 8,55 (1H, d, J = 9,2 Hz, NH), 5,60 (1H, d, J = 3,7 Hz, H1''), 5,57 (1H, d, J = 3,7 Hz, H1'''), 5,13 (1H, m, H2), 4,75 (1H, dd, J = 3,7, 10,4 Hz, H2''), 4,62 (2H, m), 4,54 (4H, m), 4,25-4,47 (10H, m), 2,17 (2H, m), 1,99 (1H, m), 1,87 (2H, m), 1,75 (1H, m), 1,65 (2H, m), 1,12-1,49 (60H, m), 0,85 (6H, m, metilo terminal); RMN-C^{13} (125 MHz, C_{5}D_{5}N, 45ºC) \delta (ppm) = 175,5 (s, C1'), 99,5 (d, C1'''), 98,6 (d, C1''), 76,7 (d, C2''), 76,0 (d, C3), 72,8 (d, C4), 72,6 (d, C5''), 72,6 (d, C4''), 72,5 (d, C2), 71,3 (d, C3'''), 71,0 (d), 70,8 (d), 70,5 (d, C2'''), 69,7 (d, C3''), 68,6 (t, C1), 62,7 (t), 62,5 (t), 51,2 (t, C2), 39,4 (t), 35,6 (t), 33,7 (t), 32,2 (t), 30,5 (t), 30,3 (t), 30,1 (t), 30,0 (t), 29,7 (t), 29,6 (t), 26,7 (t), 26,0 (t), 23,0 (t), 22,9 (g), 14,3 (q, metilo terminal).
Ejemplo 3
Los compuestos siguientes se sintetizan según los métodos descritos en las referencias que se indican en la columna derecha.
1
Las relaciones entre los compuestos de la fórmula (I) y los compuestos descritos en el ejemplo recién mencionado se recogen en la tabla 1.
TABLA 1
3
Ensayo biológico
Ejemplo de ensayo farmacológico 1
Ampliación del efecto del KRN7000 en la actividad citotóxica de las células NKT contra las células tumorales (este uso no es acorde con la presente invención).
El siguiente experimento se lleva a cabo empleando el compuesto del ejemplo 1 (KRN 7000) como compuesto glucosídico representativo de la presente invención.
Se administra un vehículo (solución salina fisiológica que contiene un 0,025% de Polysolvate 20) o 100 \mug/kg de KRN 7000 por vía intravenosa a ratones RAG-1KO/V\alpha14tg/V\beta8.2tg (ratones que en la fracción de linfocitos tienen un número elevado de células NKT, pero carecen de células B, células T y de células NK) y pasadas 24 horas se extrae el bazo a cada uno de los ratones para preparar células esplénicas por métodos convencionales. Los ratones RAG-1KO/V\alpha14tg/V\beta8.2tg se establecen por deleción del gen RAG-1 y por expresión forzada de los genes V\alpha14 y V\beta8.2 (Kawano T. y col., Science 278, 1626-1629, 1997). El proveedor de estos ratones es Masaru Taniguchi, Facultad de Medicina, Universidad de Chiba (Japón). Se investiga la actividad citotóxica de estas células esplénicas sobre las células YAC-1 de linfoma de ratón por el método de la liberación de Cr^{51} en 4 horas (Kobayashi, E. y col., Oncology Res. 7, 529, 1955). Los resultados se presentan en la figura 1.
De la figura 1 se desprende que la actividad citotóxica contra las células YAC-1 es significativamente mayor en las células esplénicas obtenidas de los ratones a los que se ha administrado el KRN 7000 que en las obtenidas a partir de ratones a los que solamente se ha administrado el vehículo.
Estos resultados indican que el KRN 7000 amplía la actividad citotóxica de las células NKT esplénicas contra las células tumorales, considerando que los ratones RAG-1KO/V\alpha14tg/V\beta8.2tg llevan en la fracción de linfocitos de las células esplénicas un número elevado de células NKT, pero carecen de células B, células T y de células NK.
Los resultados recién mencionados indican que el KRN 7000 tiene la capacidad de ampliar la actividad de lisis de las células NKT contra las células tumorales.
\newpage
Ejemplo de ensayo farmacológico 2
Estimulación de la proliferación de células NKT esplénicas con el KRN 7000
Se administra un vehículo (solución salina fisiológica que contiene un 0,5% de Polysolvate 20) o bien 1, 10 ó 100 ng/kg de KRN 7000 por vía intravenosa a ratones C57BL/6 (Japan SLC, Inc.) y se extrae el bazo de los ratones individuales después de 24 horas para preparar células esplénicas por métodos convencionales. Estas células esplénicas se incuban en una cubeta de plástico durante 30 minutos para obtener células no adherentes. Eliminando las células B de estas células no adherentes se obtiene una fracción de linfocitos. Se analizan las células T, las células NK, las células NKT y las células V\alpha14^{+} NKT de esta fracción mediante análisis FACS de 3 colores empleando el anticuerpo monoclonal anti-TCR \alpha\beta marcado con FITC (Pharmingen), el anticuerpo monoclonal anti-NK1.1 marcado con citocromo (Pharmingen) y anticuerpo monoclonal anti-V\alpha14 marcado con PE (figura 2). El anticuerpo monoclonal anti-V\alpha14 se obtiene por implantación de los hibridomas que producen el anticuerpo monoclonal anti-V\alpha14 (CMS-1; suministrados por Masaru Taniguchi y col., Facultad de Medicina, Universidad de Chiba, Japón) a ratones desnudos (sin pelo) y recuperando las ascitis de los animales para purificar los anticuerpos. En las figuras 2A y 2B se representan los números de las células NK1.1, células TCR\alpha\beta y células V\alpha14 de la fracción de linfocitos en forma de intensidad de fluorescencia de los anticuerpos marcados frente a estas células.
En la figura 2A se observa un aumento acusado de la porción de células NK1.1 TCR\alpha\beta^{+} en la fracción de linfocitos del bazo en los animales a los que se han administrado 100 ng/kg de KRN 7000 frente a los animales a los que solamente se ha administrado el vehículo.
En la figura 2B se observa un claro aumento en la porción de células V\alpha14^{+} dentro de las células NK1.1 TCR\alpha\beta^{+} en animales a los que se han administrado 100 ng/kg de KRN 7000 frente a los animales a los que solamente se ha administrado el vehículo.
Además, de la figura 2C se desprende que el número de células NK en las fracciones de linfocitos esplénicos de ratones a los que se han administrado 10 ó 100 ng/kg de KRN 7000 es igual al de los animales a los que solamente se ha administrado el vehículo. Sin embargo, se observa un aumento 2 veces mayor de los números de las fracciones de linfocitos y de células T en los ratones a los que se han administrado el KRN 7000 frente a los animales a los que solamente se ha administrado el vehículo. Por otro lado, el número de células V\alpha14^{-} NKT y de células V\alpha14^{+} NKT en la fracción de linfocitos del bazo aumenta en más de tres veces y más de cuatro veces, respectivamente, en los ratones a los que se administra el KRN 7000 (datos no mostrados) con respecto al número que presentan los ratones a los que se administra el vehículo.
Además, los análisis de las células T, células NK, células V\alpha14^{-} NKT y de células V\alpha14^{+} NKT en el hígado arrojan un aumento notable de los números de las células V\alpha14^{-} NKT y de células V\alpha14^{+} NKT debido a la administración del KRN7000, de modo semejante al observado en el caso del bazo (valores no mostrados).
Los resultados mencionados antes indican que el KRN 7000 tiene la capacidad de aumentar el número de células NKT, en especial de las células V\alpha14^{+} NKT, en el cuerpo.
Ejemplo de ensayo farmacológico 3
Supresión del hinchamiento de nódulos linfáticos en ratones MRL lpr/lpr por acción del KRN 7000
Para el siguiente ensayo se utilizan diez animales por grupo de ratones hembras MRL lpr/lpr (Sakamoto, A., Clin. Immunol. 28, 1558, 1996). Durante la observación de 21 ratones MRL adquiridos con una edad de 6 semanas, se advierte el hinchamiento de los nódulos linfáticos axilares en un ratón de 10 semanas de edad. Después de esto se reparten los 20 ratones restantes en 2 grupos al azar. A los 2 grupos de animales recién mencionados se les administra un vehículo (una solución salina fisiológica que contiene un 0,025% de Polysolvate 20) o KRN 7000 (100 \mug/kg) por vía intraperitoneal dos veces por semana (el martes y el viernes) a partir del momento que alcanzan una edad de 11 semanas. Se examinan los nódulos linfáticos axilares e inguinales dos veces por semana para observar el proceso del hinchamiento del nódulo (ganglio) linfático con el tiempo. Se puntúan los nódulos linfáticos en 4 grados, a saber: - (0), + (1), ++ (2) y +++ (3) en función del tamaño. Las puntuaciones totales de los lados derecho e izquierdo del nódulo linfático axilar (A) o del nódulo linfático inguinal (B) se expresan en forma de índices de hinchamiento de nódulos linfáticos, tal como se representa en la figura 3.
Tal como se muestra en la figura 3A, el hinchamiento de los nódulos linfáticos axilares de los ratones MRL a medida que pasa el tiempo se suprime claramente cuando se les administra el KRN 7000. Además, en la figura 3B se indica que el hinchamiento de los nódulos linfáticos inguinales de los ratones MRL a medida que pasa el tiempo se suprime también claramente cuando se les administra el KRN 7000. En otras palabras, el KRN 7000 tiene una capacidad clara de suprimir el hinchamiento de los nódulos linfáticos de los ratones MRL.
El ratón MRL es un ratón modelo para el lupus eritematoso sistémico humano (Sakamoto, A., Clin. Immun. 28, 1558, 1996. Los resultados recién mencionados indican que el KRN 7000 es eficaz para tratar el lupus eritematoso sistémico.
Ejemplo de ensayo farmacológico 4
Efecto del KRN 7000 en el período de supervivencia de los ratones MRL lpr/lpr
En el siguiente ensayo se utilizan diez animales por grupo de ratones hembra MRL lpr/lpr. Se adquieren los ratones MRL con una edad de 4 semanas y se dividen al azar en 2 grupos (10 animales por grupo). Se administra por vía intraperitoneal un vehículo (una solución salina fisiológica que contiene un 0,025% de Polysolvate 20) o el KRN 7000 (100 \mug/kg) dos veces por semana (los martes y los viernes) a los animales, empezando en el momento en el que alcanzan las 5 semanas de edad. Se observa la supervivencia de los animales cada día.
Tal como se muestra en la figura 4, tres ratones a los que se ha administrado el KRN 7000 sobreviven incluso 350 días después del inicio de la administración, mientras que todos los ratones a las que se administra el vehículo mueren en un período de 250 días después del inicio de la administración.
Ejemplo de ensayo farmacológico 5
Supresión de la colitis inducida en el ratón con DSS del 4% mediante el KRN 7000
Para el siguiente ensayo se utilizan diez animales por grupo, tomando para ello ratones CDF1 (de 6 semanas de edad, hembras) (Japan SLC Inc.). Se define el día 0 como el día en el que se proporciona por primera vez como agua de beber una solución de DSS al 4% (4% p./v.) de dextrano-sulfato sódico (DSS) en agua. Se dividen los animales en 3 grupos, a saber, un grupo al que se administran por vía intraperitoneal 100 \mug/kg de KRN 7000 en los días 1, 5 y 9; un grupo al que se administra 1 \mug/ratón de IL-12 por vía intraperitoneal en los días 1, 3, 5, 7 y 9; y un grupo sin tratamiento (grupo de control). Se determina el peso corporal y se observa a diario la supervivencia o muerte de los animales. En las figuras 5A y 5B se representan los cambios registrados en el peso corporal y en el índice de supervivencia, respectivamente.
Tal como se muestra en la figura 5A, se observa una pérdida de peso en un período extraordinariamente temprano en el grupo al que se administra la IL-12, si se compara con el grupo de control. Sin embargo, la pérdida de peso se observa obviamente en un período más tardío en el grupo al que se administra el KRN 7000, si se compara con el grupo de control.
Además, en la figura 5B se observa que el período de supervivencia de los ratones tratados con la IL-12 es significativamente más corto que el del grupo de control. En cambio, el período de supervivencia del grupo de ratones tratados con el KRN 7000 es significativamente más largo que el del grupo de control.
La colitis de ratón inducida con DSS del 4% es un modelo de la colitis ulcerosa humana (Elson, C. y col., Gastroenterology 109, 1344, 1995). Por consiguiente, los resultados recién mencionados indican que el KRN 7000 es eficaz para tratar la colitis ulcerosa.
Ejemplo de ensayo farmacológico 6
Estimulación de la proliferación de células NKT con compuestos que tienen estructura de \alpha-glucosilceramida
La estimulación de la proliferación de células NKT con compuestos que tienen estructura de \alpha-glucosilceramida se investiga empleando células de bazo de ratones RAG-1KO/V\alpha14tg/V\beta8.2tg mencionados en el ejemplo de ensayo farmacológico 1.
Las células esplénicas se preparan a partir del bazo de ratones RAG-1KO/V\alpha14tg/V\beta8.2tg por métodos convencionales. Estas células de bazo se suspenden a razón de 2 x 10^{6} células/ml en un medio RPMI 1640 complementado con FCS del 10% y se depositan 100 \mul de cada suspensión en los hoyos de placas de fondo redondo que contienen 96 hoyos. Se introducen en los hoyos diez tipos distintos de compuestos que tienen estructura de \alpha-glucosilceramida, recogidos en la figura 12, en una concentración final de 1, 10 ó 100 ng/ml y se incuban las placas durante 2 días. Dieciséis horas después de la adición de la timidina-[H^{3}] (0,5 \muCi/hoyo) se recolectan las células. La cantidad de timidina-[H^{3}] incorporada a los hoyos se mide con un contador de centelleo líquido. Los resultados se recogen en la tabla 2.
TABLA 2
5
Tal como se indica en la tabla 2, todos los compuestos anteriores despliegan una actividad significativa de estimulación de la proliferación de las células NKT en una concentración de 100 ng/ml, si se comparan con el grupo al que se administra solamente el vehículo.
Los resultados recién presentados indican que los compuestos glucosídicos que tienen una estructura de \alpha-glucosilceramida y los compuestos glucosídicos que tienen una estructura de \alpha-glucosilceramida, sobre cuyo grupo azúcar se ha unido otro azúcar, son eficaces para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.
Ejemplo de ensayo farmacológico 7
Supresión del inicio de la encefalomielitis autoinmune experimental mediante el KRN 7000
En el siguiente ensayo se utilizan diez animales por grupo de ratones C57BL (hembras de 6 semanas de edad). Para preparar la emulsión se añaden 200 \mug de un péptido parcial de glucoproteína de oligodendrocito de mielina (MOG33-55) y 500 \mug del Mycobacterium tuberculosis H37Ra al adyuvante incompleto de Freund. Los ratones se inmunizan mediante la inyección subcutánea de esta emulsión en el día 0 y en el día 7. Además se administran por vía intraperitoneal 500 ng de toxina de la tos ferina en el día 1 y en el día 2 para inducir la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en los ratones. Se dividen los animales de 2 grupos, a saber, un grupo al que se administran 20 \mug/kg de KRN 7000 por vía intraperitoneal en los días 1, 5, 8, 12 y 15 y un grupo al que se administra el vehículo (Polysolvate 20 al 0,5%) de igual manera. Se observa cada día el nivel de los síntomas EAE. El nivel de los síntomas de la EAE de los ratones individuales de cada grupo se representa en la figura 6.
Tal como se indica en la figura 6, en el grupo al que se administra el vehículo (figura 6A), todos los ratones presentan el inicio de la EAE dentro de los 15 días después de la primera inmunización con el péptido MOG y mueren el 80% de animales de este grupo. En cambio, en el grupo al que se administra el KRN 7000 (figura 6B), 4 de los 10 ratones presentan el inicio de la EAE y solamente mueren 2 animales de este grupo.
Los resultados recién mencionados indican que el KRN 7000 suprime el inicio de la EAE en los ratones. La EAE es un modelo de la esclerosis múltiple (MS) humana (ver Autoimmune Disease Models, coordinado por Cohen, I.R. y Miller, A., editorial Academic Press, Inc., 1994, capítulo 1, p. 1). Por lo tanto, los resultados recién mencionados indican que el KRN 7000 es eficaz para tratar la esclerosis múltiple.
Ejemplo de ensayo farmacológico 8
Supresión del inicio de la diabetes en ratones mediante el KRN 7000
En el siguiente ensayo se emplean diez animales por grupo de ratones NOD/ShiJic (NOD) (hembras de 6 semanas de edad). Los ratones NOD despliegan el inicio de la diabetes con el tiempo. Se dividen los animales en dos grupos, a saber, un grupo al que se administran por vía intraperitoneal 100 \mug/kg de KRN 7000 dos veces por semana, a partir del momento que cumplen 7 semanas de edad y un grupo de control que no recibe tratamiento. Se examina cada semana la presencia o ausencia de los síntomas de diabetes. Se mide el nivel de glucosa en sangre empleando un glucómetro (Miles Sankyo) y se diagnostican como diabéticos aquellos ratones que tienen un valor de más de 200 mg/dl en dos mediciones consecutivas. En la figura 7 se presenta la incidencia de ratones diabéticos en los dos grupos.
Tal como se observa en la figura 7, ninguno de los ratones a los que se administra el KRN 7000 adquiere la diabetes incluso cuando alcanza una edad de 35 semanas, mientras que el 80% del grupo de control se convierten en diabéticos cuando llegan a las 35 semanas de edad.
Los resultados recién mencionados indican que el KRN 7000 suprime el inicio espontáneo de la diabetes en ratones NOD. El ratón NOD es un animal modelo de la diabetes de tipo I humana (ver Autoimmune Disease Models, coordinado por Cohen, I.R. y Miller, A., editorial Academic Press, Inc., 1994, capítulo 9, p. 149). Los resultados recién mencionados indican que el KRN 7000 es eficaz para tratar la diabetes de tipo I.
Ejemplo de ensayo farmacológico 9
Estimulación de la proliferación de células V\alpha24^{+} NKT mediante el KRN 7000
Se cultivan durante 4 días células mononucleadas de la sangre periférica de una persona humana normal en un medio AIM complementado con FCS del 10% con la adición de GM-CSF (400 U/ml), IL-4 (200 U/ml) y KRN 7000 (100 ng/ml) para preparar células que presenten antígenos.
Se lleva a cabo una reacción de leucocito mixto (MLR) autólogo empleando estas células que presentan antígenos como células estimulantes y células mononucleadas autólogas de sangre periférica como células de respuesta. Después de la incubación durante 10 días se añade la IL-2 (5 U/ml), se prosigue la incubación durante 4 días más y se recolectan las células. A continuación se recuperan las células doblemente negativas CD4, CD8 de las células recolectadas y se someten a un análisis de fenotipo. El análisis de fenotipo se expresa mediante la intensidad de fluorescencia de los anticuerpos marcados frente a las células que tienen diversos fenotipos. Los resultados se recogen en la figura 8.
De la figura 8 se desprende que en estos grupos de células existe un número grande de células que tienen el fenotipo CD4^{-}CD8^{-}CD3^{+}V\alpha24^{+}V\beta11^{+}NKRP1A^{+} (un subgrupo de las células V\alpha24^{+} NKT).
Se cultivan las células utilizando la IL-2 (5 U/ml) para estimular la proliferación de las células V\alpha24^{+} NKT, que se emplean como células de respuesta en la siguiente reacción de leucocito mixto autólogo. Se cultivan durante 4 días las células mononucleadas autólogas de la sangre periférica a las que se añade GM-CSF + IL-4 y 100 ng/ml de KRN 7000, AGL-583 (\beta-galactosilceramida, \beta-GalCer) o DMSO del 0,1% (vehículo) para preparar células que presenten antígenos. Se lleva a cabo una reacción de leucocito mixto autólogo empleando estas células que presentan antígenos como células estimulantes. Después de una incubación de 2 días se añade la timidina-[H^{3}] (0,5 \muCi/ml) y se recolectan las células después de 8 horas para medir la absorción de timidina-[H^{3}] en las células mediante un contador de centelleo líquido. Los resultados se recogen en la figura 9.
De la figura 9 se desprende que las células que presentan antígenos, tratadas con el vehículo o con la \beta-galactosilceramida, no presentan efecto alguno en cuanto a proliferación de células V\alpha24^{+} NKT, mientras que las células que presentan antígenos y se han tratado con el KRN 7000 muestran un marcado efecto estimulante en la proliferación de las células V\alpha24^{+} NKT de una manera dependiente del número de células que presentan antígenos. Se evalúan además los efectos inhibidores de los anticuerpos anti-CD1a, CD1b, CD1c y CD1d en la estimulación de la proliferación de células V\alpha24^{+} NKT por parte de las células que presentan antígenos y se han tratado con KRN 7000. Como resultado de ello, solamente los anticuerpos anti-CD1d inhiben la estimulación de la proliferación de células V\alpha24^{+} NKT (datos no mostrados).
Los resultados recién mencionados indican que el KRN 7000 es eficaz para estimular la proliferación de las células V\alpha24^{+} NKT humanas, correspondientes en el hombre a las células V\alpha14^{+} NKT del ratón. Considerando los informes actuales en los que los pacientes que sufren una diabetes avanzada de tipo I tienen un número extremadamente bajo de células V\alpha24^{+} NKT (Wilson y col., Nature 391, 177, 1998) y los resultados de los ejemplos de ensayos farmacológicos 3, 7 y 8, los resultados sugieren con fuerza que el KRN 7000 es eficaz para prevenir o tratar las enfermedades autoinmunes, en las que intervienen células V\alpha24^{+} NKT humanas, por ejemplo el lupus eritematoso sistémico, la esclerosis sistémica, la esclerosis múltiples y la diabetes de tipo I.
\newpage
Ejemplo de ensayo farmacológico 10
Ensayo de toxicidad aguda por una administración única
Se administra el compuesto del ejemplo 1 a los ratones por vía intravenosa. Los resultados indican que la LD_{50} del compuesto es superior a 10 mg/kg. Además, el compuesto tiene una toxicidad baja que no provoca síntomas particulares cuando el nivel de administración es de 10 mg/kg.

Claims (9)

1. Uso de un compuesto de la fórmula (I) o una sal o un solvato del mismo para la fabricación de un agente terapéutico destinado al tratamiento de una enfermedad autoinmune:
6
en la que
R^{1} significa H u OH,
X significa un número entero entre 7 y 27,
R^{2} significa un sustituyente elegido entre el grupo formado por los siguientes de (a) a (e) (en los que Y significa un número entero de 5 a 17):
(a) -CH_{2}(CH_{2})_{Y}CH_{3}
(b) -CH(OH)(CH_{2})_{Y}CH_{3}
(c) -CH(OH)(CH_{2})_{Y}CH(CH_{3})_{2}
(d) -CH=CH(CH_{2})_{Y}CH_{3}
(e) -CH(OH)(CH_{2})_{Y}CH(CH_{3})CH_{2}CH_{3} y
de R^{3} a R^{9} significan sustituyentes definidos en uno cualquiera de los apartados i) o ii):
i) R^{3}, R^{6} y R^{8} significan H y
R^{4} significa H, OH, NH_{2}, NHCOCH_{3} o un sustituyente elegido entre el conjunto formado por siguientes grupos de (A) a (D):
7
R^{5} significa OH o un sustituyente elegido entre el conjunto formado por los siguientes grupos (E) y (F):
8
R^{7} significa OH o un sustituyente elegido entre el conjunto formado por los siguientes grupos de (A) a (D):
9
R^{9} significa H, CH_{3}, CH_{2}OH o un sustituyente elegido entre el conjunto formado por los siguientes grupos de (A') a (D'):
10
ii) R^{3}, R^{6} y R^{7} significan H y
R^{4} significa H, OH, NH_{2}, NHCOCH_{3} o un sustituyente elegido entre el conjunto formado por siguientes grupos de (A) a (D):
11
R^{5} significa OH o un sustituyente elegido entre el conjunto formado por los siguientes grupos (E) y (F):
12
R^{8} significa OH o un sustituyente elegido entre el conjunto formado por los siguientes grupos de (A) a (D):
13
R^{9} significa H, CH_{3}, CH_{2}OH o un sustituyente elegido entre el conjunto formado por los siguientes grupos de (A') a (D'):
14
2. Uso según la reivindicación 1, en el que la enfermedad autoinmune es el lupus eritematoso sistémico o la esclerosis sistémica.
3. Uso según la reivindicación 1, en el que la enfermedad autoinmune es la colitis ulcerosa.
4. Uso según la reivindicación 1, en el que la enfermedad autoinmune es la encefalomielitis o la esclerosis múltiple.
5. Uso según la reivindicación 1, en el que la enfermedad autoinmune es la diabetes de tipo I.
6. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5: en el que R^{3} y R^{6} significan H, R^{4} significa OH o un sustituyente de uno cualquiera de los grupos de (A) a (D), R^{5} significa OH o un sustituyente del grupo (E) o (F), R^{7} y R^{8} significan en cada caso H u OH, pero el grupo R^{7} y el R^{8} no significan el mismo sustituyente, y R^{9} significa CH_{2}OH, CH_{3}, H o un sustituyente de uno cualquiera de los grupos de (A') a (D').
7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, en el que X significa un número entero entre 21 y 25 y R^{2} significa un sustituyente (b) en el que Y significa un número entero entre 11 y 15.
8. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, en el que X significa un número entero entre 9 y 13 y R^{2} significa un sustituyente (a) en el que Y significa un número entero entre 11 y 15.
9. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, en el que el compuesto de la fórmula (I) es el (2S,3S,4R)-1-(\alpha-D-galactopiranosiloxi)-2-hexacosanoilamino-3,4-octadecanodiol.
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