JP5092122B2

JP5092122B2 - 新規ステロイド配糖体、ｎｇｆ関連活性物質、その製造方法及び探索方法、並びに脳機能障害予防薬

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Publication number: JP5092122B2
Application number: JP2007504844A
Authority: JP
Inventors: 小鹿　　一; 建華戚; 洋次坂神; 隆吉間宮
Original assignee: Nagoya University NUC; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Current assignee: Nagoya University NUC; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Priority date: 2005-02-25
Filing date: 2006-02-24
Publication date: 2012-12-05
Anticipated expiration: 2026-02-24
Also published as: WO2006090910A1; JPWO2006090910A1

Description

本発明は、オニヒトデ（学名：Ａｃａｎｔｈａｓｔｅｒｐｌａｎｃｉ）などから単離された新規ステロイド配糖体及びＮＧＦ関連活性物質に関するとともに、効率的にＮＧＦ関連活性物質を製造する方法及び探索する方法に関する。

ヒトデの一種であるオニヒトデは南方系のヒトデで珊瑚礁に棲息している。腕の数が１１〜１６本もあり、大型で全身に毒をもつ棘を有している。オニヒトデは体の下方部の中央にある口から胃袋を出して消化液を分泌し生きているサンゴを食べている。魚のすみかや観光資源になるサンゴを食い荒らす上にダイバーなどが棘で刺される危険があり、駆除の対象になっている。

ところで、駆除されたオニヒトデの有効な利用法が模索されている。本発明者らはヒトデなどの海洋生物の研究を通じて、ヒトデの含有する成分の同定や利用法を研究しており、例えば、アオヒトデ中に含まれる新規ステロイド配糖体が神経突起伸長活性（以下、「神経成長因子（ＮＧＦ）様活性」と称する）を有することを報告している（Ｊ．Ｑｉｅｔａｌ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００４），１２（１５），４２５９−４２６５．）。
本発明は上記実情に鑑みなされたものであり、オニヒトデの研究を通じて明らかになった新規ステロイド配糖体及び新規ステロイド配糖体の研究により明らかになった有効利用法を提供する。

オニヒトデから多数のサポニン（ステロイド配糖体）が発見されその構造が明らかにされてきた（特開平４−４１４２９号公報；特開昭６２−２４０６９７号公報；特表２００５−５２０８４１号公報；Ｃ．Ｐｉｚｚａｅｔａｌ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｙｎｏｐｓｅｓ（１９８５），（３），７６−７７．；Ｔ．Ｋｏｍｏｒｉｅｔａｌ，ＬｉｅｂｉｇｓＡｎｎａｌｅｎｄｅｒＣｈｅｍｉｅ（１９８３），（１），３７−５５．；Ｙ．Ｉｔａｋｕｒａｅｔａｌ，ＬｉｅｂｉｇｓＡｎｎａｌｅｎｄｅｒＣｈｅｍｉｅ（１９８６），（３），４９９−５０８．；Ｎ．Ｆｕｓｅｔａｎｉｅｔａｌ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ（１９８４），４７（６），９９７−１００２．；Ｉ．Ｋｉｔａｇａｗａｅｔａｌ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ（１９７８），２６（６），１８６４−７３．）。本発明者らはそれらに報告のない新規ステロイド配糖体を見いだしたと共に、それら新規ステロイド配糖体がＮＧＦ様活性を示すことを発見した。更に、ＮＧＦに対してその作用を増強する場合（以下、「ＮＧＦ増強活性」と称する）もあることを発見した（本明細書において、ＮＧＦ様活性とＮＧＦ増強活性とを併せて「ＮＧＦ関連活性」と称し、ＮＧＦ関連活性をもつ化合物を併せて「ＮＧＦ関連活性物質」と称する）。これらの知見に基づき以下の発明を完成した。なお、一般的にステロイドとはペルヒドロシクロペンタフェナントレン環を有する化合物の総称であるが、本明細書ではペルヒドロシクロペンタフェナントレン環を構成する水素の一部乃至全部が脱離して、炭素−炭素間の二重結合が形成された骨格を有するものもステロイドとして記載する。特に、ペルヒドロシクロペンタフェナントレン環の４及び５位の炭素間の結合が２重結合になっている化合物が具体的に記載されている。
（１）（ａ）すなわち、本発明の新規ステロイド配糖体は、下記一般式（１）又は式３９Ａに示す構造を有する化合物である。
（式（１）中、ＸはＸ^１又はＸ^２；ＹはＸがＸ^１のときＹ^１及びＹ^３の一方、ＸがＸ^２のときＹ^１〜Ｙ^３のうちのいずれか１つである。なお、Ｘ^１〜２及びＹ^１〜３は＊の部分にて結合する置換基である。）
（ｂ）また、本発明のその他の新規ステロイド配糖体は、下記一般式（１’）若しくは（１”）、又は、式６４−３、６５−３、６９−１１若しくは１０１−３で表されるステロイド配糖体である。
（式（１’）中、ＹはＹ^４〜７のうちのいずれか１つである。ＲはＹがＹ^４の場合は水素、Ｙ^５〜７の場合はメチル基である。なお、Ｙ^４〜７は＊の部分にて結合する置換基である。）
（式（１”）中、ＹはＹ^{４、６〜８}のうちのいずれか１つである。ＲはＹがＹ^４の場合は水素、Ｙ^５〜７の場合はメチル基である。なお、Ｙ^{４、６〜８}は＊の部分にて結合する置換基である。）
（ｃ）これら（ａ）及び（ｂ）に示す化合物は、従来、オニヒトデからは単離されていない化合物であり、ステロイド骨格の一端又は両端に１つの単糖が結合した構造を有している。一般的にヒトデが含有するステロイド配糖体は強い毒性を有することが知られているが、これら化合物は毒性が表れる濃度以下で強いＮＧＦ様活性及び／又はＮＧＦ増強活性を示すものである。従って、一般式（１）、（１’）及び（１”）並びに式３９Ａ、６４−３、６５−３、６９−１１及び１０１−３で表されるステロイド配糖体はＮＧＦ関連活性物質として提供することができる。なお、本明細書において「ＮＧＦ関連活性物質」などのような「物質」とは、純粋な化合物を示す他、複数の化合物を含む混合物であっても良い。ところで、一般式（１）中、ＸがＸ^１で、ＹがＹ^２である化合物もＮＧＦ関連活性（少なくともＮＧＦ増強活性）を有することは十分に予想できる。また、一般式（１’）及び（１”）中、Ｙの種類にかかわらず、Ｒを水素及びメチル基から自由に選択した化合物もＮＧＦ関連活性（少なくともＮＧＦ増強活性）を有することは十分に予想できる。
また、公知のオニヒトデ由来のステロイド配糖体と、ＮＧＦ関連活性を示す本発明のステロイド配糖体との構造を比較した結果、ＮＧＦ関連活性を示すための条件を推測することに成功し、以下の発明を完成した。
すなわち、本発明のＮＧＦ関連活性物質は、下記式（２）に記載の４環式縮合核を骨格とし、Ａ核及びＤ核のそれぞれに１又は２の単糖が直接又は間接的に結合するステロイド配糖体を含むことを特徴とする。
（式（２）中、Ａ〜Ｄの各核は二重結合を有することができ、且つ、任意の水素原子を−ＯＲ基（Ｒは水素、アルキル基又はアシル基）又はメチル基にて置換することができる。）
なお、「単糖がＡ核（Ｄ核）に直接的に結合する」とは、１又は２つの単糖（２つの場合は単糖同士で結合した二糖類も含む）がその単糖におけるＯＨ基によってＡ核などに結合していることをいう。そして、「単糖がＡ核（Ｄ核）に間接的に結合する」とは、１又は２つの単糖（２つの場合は単糖同士で結合した二糖類も含む）が間に１以上の炭素原子などからなる基を介してその単糖におけるＯＨ基によってＡ核などに結合していることをいう。間に介される基としてはアルキレン基のほか、ケトン、エーテル、二重結合などを一部乃至全部に有していても良い。
ここで、Ａ核及びＤ核の双方に１つずつの単糖が結合している化合物はＮＧＦ様活性及びＮＧＦ増強活性を示し、Ａ核及びＤ核のいずれか一方に１又は２つの単糖が結合している化合物は、主にＮＧＦ増強活性を示すことが判明している。
従って、ＮＧＦ増強活性をもつステロイド配糖体としては、前記Ａ核又は前記Ｄ核のいずれか一方に１又は２の単糖が直接又は間接的に結合している化合物である。
そして、前記のＮＧＦ増強活性を主に示すステロイド配糖体としては、下記式３３Ｂ、３４Ｂ２、３９Ａ２、３９Ａ３、７４−２及び７４−４のうちの少なくとも一種が例示できる。これらの化合物は全てオニヒトデ以外のヒトデから単離されている既知の化合物であるが、今回、本発明者らによりＮＧＦ関連活性を有することが明らかにされたものである。
ここで、前記ステロイド配糖体はヒトデ綱に属する生物からの抽出物に含有される化合物であることができる。
（２）そして、オニヒトデからの抽出物はＮＧＦ関連活性を発現する分画を含むことが判明している。これらの分画は、上述の新規ステロイド配糖体を単離することなくＮＧＦ関連活性を示す。また、上述の新規ステロイド配糖体はオニヒトデ抽出物の一部分画から単離されたものであり、上述した新規ステロイド配糖体が含まれないと予想される分画についても高いＮＧＦ関連活性を示すことが判明している。これら知見に基づいて以下の発明を完成した。
すなわち、ＮＧＦ関連活性物質を得る方法としては、アルコール又はアセトンからなる有機溶媒にて抽出したオニヒトデの有機溶媒抽出物から疎水分画を分離する工程と、
シリカゲル及び／又はデキストラン系担体を用いたクロマトグラフィ法にて該疎水分画を分画する工程と、を有することを特徴とする。
有機溶媒抽出物から疎水分画を分離することでステロイド配糖体を含む分画を得ることができ、その後のクロマトグラフィ法にてＮＧＦ関連活性を有するステロイド配糖体を含む分画を得ることができるものと推測される。
特に、クロマトグラフィ法としては、ＴＬＣ（担体：シリカゲル、溶離液：クロロホルム／メタノール＝８／２）にて測定したＲｆ値が０．２０以上、０．６４以下の範囲内に含まれる分画を該疎水分画からクロマトグラフィ法にて分離する工程を採用することができる。このＲｆ値を示す分画を分離することで高いＮＧＦ関連活性を示すＮＧＦ関連活性物質を得ることができる。
更に、クロマトグラフィ法としては、ＴＬＣ（担体：シリカゲル、溶離液：クロロホルム／メタノール＝８／２）にて測定したＲｆ値が０．２０未満の分画を該疎水分画からクロマトグラフィ法にて除外する工程を採用することができる。このＲｆ値を示す分画を除外分離することで毒性の高い分画が除去できる。
また、前記クロマトグラフィ法にて分離する工程として、前記Ｒｆ値が０．５２以上の分画を分離する工程を含むことで、より高いＮＧＦ関連活性を示すＮＧＦ関連活性物質を得ることができる。更に、前記クロマトグラフィ法にて分離する工程は、前記Ｒｆ値が０．３９以下の分画を分離する工程を含むこともできる。
これら製造方法にて得られたＮＧＦ関連活性物質は、上述の新規ステロイド配糖体からなる群のうちの少なくとも一の化合物を含有するものが望ましい。
（３）更に、ＮＧＦ関連活性物質を効率的に探索する手法を発明した。
すなわち、本発明のＮＧＦ関連活性物質の探索方法は、上記式（２）に記載の４環式縮合核を骨格とし、Ａ核及びＤ核の少なくとも一方に１又は２の単糖が直接又は間接的に結合するステロイド配糖体を含むか否かによりＮＧＦ関連活性の有無を判別することを特徴とする。
式（２）で示される４環式縮合核と単糖とが結合した化合物は、サポニンなどで代表されるように、含有するか否かの判定が容易な化合物である。その後、単糖の結合位置及び結合数を判別して上述の式（２）で示される４環式縮合核と所定個の単糖とが結合した化合物に該当するか否かを判断すればよい。ここで、単糖の結合数や結合位置も比較的容易に判別することができるので、従来の広くＮＧＦ関連活性物質をスクリーニングする方法と比較しても全体として簡便な方法である。
従って、４環式縮合核に糖が結合した配糖体（ステロイド配糖体など）の検出という比較的容易な操作により、ＮＧＦ関連活性物質及びその原料動物（植物）になりうる有望な候補を大まかに絞り込むことができ、探索に要する時間を大きく短縮することができる。
つまり、サポニン等のステロイド配糖体を含む生物材料を従来の方法などで効率的に絞り込むことで、その後に構造解析を行う化合物の数を減らすことが可能になり、ＮＧＦ関連活性物質の探索が容易になる。その後、絞り込みを行った生物材料などから、目的成分を分離して構造解析した物質について、その構造が前述の構造を有するか否かを判断することで、ＰＣ１２細胞アッセイを行うことなく、ＮＧＦ関連活性物質を探索することができる。また、これまでに発見されている多数のステロイド配糖体についてもその構造が前述の構造を有するか否かを判断することで、ＰＣ１２細胞アッセイを行うことなく、ＮＧＦ関連活性物質を探索することができる。
特に、前記ステロイド配糖体はヒトデ綱からの抽出物から探索されることが望ましい。

本発明のＮＧＦ関連活性物質は従来にない高い活性を有するものである。そして、駆除が求められているオニヒトデなどから容易に分離することができるので、入手性に優れる以上に、オニヒトデ駆除に対する動機付けともなりうるものである。
そして、本発明のＮＧＦ関連活性物質の探索方法は、しらみつぶしに天然資源中の有効成分を探索する以外で、簡単にＮＧＦ関連活性物質を探索することができる効果を有する。

図１実施例で得られたオニヒトデ抽出物から得られた活性画分ｆｒ．ＡをＨＰＬＣ（第１回目）にて分析した結果と、それぞれのピークに対応するステロイド配糖体を示した図である。
図２アカンタステロサイド４０Ａ及びＮＧＦをＰＣ１２細胞に添加した様子を示した顕微鏡写真のコピーである。
図３実施例で得られたオニヒトデ抽出物から得られた活性画分ｆｒ．ＣをＨＰＬＣ（第１回目）にて分析した結果と、それぞれのピークに対応するステロイド配糖体を示した図である。
図４実施例の老齢雄性マウスにおける学習記憶障害に対する作用の評価結果を示すグラフである。

（新規ステロイド配糖体）
本発明の新規ステロイド配糖体は下に示すアカンタステロサイド（ａｃａｎｔｈａｓｔｅｒｏｓｉｄｅ）３４Ａ、３４Ｂ、３４Ｃ、３９Ａ、４０Ａ及び４０Ｂの６個の化合物、並びに、下記式８０−３、９２−２、７８−３、１０１−３、６４−３、６５−２、６５−３、７６−３、６２−３、６９−１１、４２−２（アカンタステロサイド３９Ｂ）、３５−２（アカンタステロサイド３９Ａ４）の１２個の化合物である。
（ＮＧＦ関連活性物質）
本発明のＮＧＦ関連活性物質としては上述の新規ステロイド配糖体が挙げられる。そして、上記式（２）にて示された４環式縮合核（｛ペルヒドロ｝シクロペンタフェナントレン環及びその誘導体）を骨格とする化合物であり、Ａ核及びＤ核のそれぞれに１又は２の単糖が直接又は間接的に結合するステロイド配糖体を含むものである。式（２）中、Ａ〜Ｄの各核はそれぞれ独立して二重結合を有することができる。また、任意の水素原子を−ＯＲ基（Ｒは水素、アルキル基又はアシル基）又はメチル基にて置換することができる。アルキル基としては炭素数１〜３程度、特にメチル基が好ましく、アシル基としては炭素数１〜３程度、特にアセチル基が好ましい。また、４環式縮合核に直接結合した−ＯＳＯ_３Ｈ基（Ｎａ塩、Ｋ塩なども含む）を有しないことが望ましい。
更に、式（２）で表される４環式縮合核はステロイドの核となる部分なので、任意の水素が任意の基にて置換されることが可能である。例えば、多数の公知のステロイドが有するように、シクロペンタフェナントレン環の１７位に下記式（Ａ）で示したような骨格をもつ置換基が結合した化合物が例示できる。
具体的には、式（２）にて表される４環式縮合核を有するステロイド配糖体としては上述の式３３Ｂ、３４Ｂ２、３９Ａ２、３９Ａ３、７４−２及び７４−４にて表される化合物が例示される。
ここで、ＮＧＦ様活性を示す化合物を得たい場合には、単糖がＡ核及びＤ核の双方に結合した化合物を用いる。ＮＧＦ増強活性を示す化合物を得たい場合には、単糖または二糖類がＡ核及びＤ核のいずれか一方に結合した化合物を用いる。単糖が結合する部位も特に限定せず、単糖がもつ炭素のどの部位にて結合しても良い。単糖はＡ核やＤ核に結合する際に直接的、間接的を問わずに結合している。間接的に結合する場合、間に介される基としては、アルキレン基のほか、ケトン、エーテル、二重結合などを一部乃至全部に有する基でも良い。
単糖の種類は特に限定しない。ペントース、ヘキソースなどどのような炭素数のものでもよい。また、２つの単糖が結合した二糖であってもよく、更には一部ＯＨ基がＯＲ基（Ｒはアルキル基（例えば炭素数１〜３程度、特にメチル基が好ましい）又はアシル基（例えば炭素数１〜３程度、特にアセチル基が好ましい）にて置換されていても良い。）及び／又は水素にて置換されていてもよい。単糖としては、キシロース、などが例示できる。
ここで、前記ステロイド配糖体はヒトデ綱に属する生物からの抽出物に含有される化合物であることが望ましい。
（ＮＧＦ関連活性物質の製造方法）
本発明のＮＧＦ関連活性物質を得る方法としては、アルコール又はアセトンからなる有機溶媒にて抽出したオニヒトデの有機溶媒抽出物から疎水分画を分離する工程と、シリカゲル及び／又はデキストラン系担体を用いたクロマトグラフィ法にてその疎水分画を分画する工程とを有することを特徴とする。本製造方法にて得られたＮＧＦ関連活性物質は、上述の新規ステロイド配糖体からなる群のうちの少なくとも一の化合物を含有することが望ましい。
・抽出操作
有機溶媒抽出物は、オニヒトデをすりつぶしたり粉砕したりした後に有機溶媒に浸漬することで、又は、有機溶媒の存在下にオニヒトデをすりつぶしたり粉砕することによって得ることができる。後の操作を容易に行うためにろ過を行って夾雑物を除去することが望ましい。オニヒトデはそのまま、凍結状態、乾燥状態などどのような状態で抽出操作に供しても良い。特に、取扱性の向上、含有する成分の劣化・損失の抑制などの目的で、凍結乾燥を採用することが好ましい。有機溶媒はメタノール、エタノール、ｎ−，ｉｓｏ−プロパノールなどのアルコールやアセトンなどから適宜選択できる（好ましくはメタノールを選択する）。
・疎水分画の分離
疎水分画を分離できる方法ならどのような方法を採用しても良い。例えば、逆相系の担体を用いて疎水分画を吸着させて分離する工程である。逆相系の担体としてはＯＤＳ系などが例示できる。化学構造、製品名などを例示すると、ＯＤＳ（Ｃ１８）、ＯＤＳ以外の逆相系担体、およびＤＩＡＩＯＮ、ＳＥＰＡＢＥＡＤＳなど合成吸着樹脂が挙げられる。
逆相系の担体に吸着させる方法を採用する場合、前述の有機溶媒抽出物中に水などを加えて極性を調節し担体に疎水分画が吸着されるようにする。例えば、ＯＤＳ系の担体を採用し、且つ、メタノール−水系の展開溶媒を採用する場合に、メタノール：水＝１：１程度の割合で混合した後に担体と接触させることで疎水分画は概ね吸着分離される。
その後、展開溶媒中のメタノール濃度を上昇させていくことで、担体に吸着した疎水分画を速やかに溶出・分離することができる。上記条件下においては、特に、７０％−９０％メタノールで溶離される分画に含まれる成分を疎水性成分として採用することが望ましい。
・疎水分画を更に分画する工程
先の工程で得られた疎水分画をシリカゲル及び／又はデキストラン系担体（順相系）を用いたクロマトグラフィ法にて分画する工程である。溶媒の極性を順次変化させることで疎水分画中に含まれる成分を速やかに分離できる。好ましい担体として化学構造及び製品名を例示すると、シリカゲル、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ２０などのデキストラン系担体が挙げられる。
（ａ）分離の程度を判断する手法としては原理的には得られたフラクション中のＮＧＦ関連活性の強度及び毒性の強度を判定することで行うことができる。ＮＧＦ関連活性の測定は、ＰＣ１２細胞など一般的な細胞を用いた試験系を用い、神経突起伸長を誘導するかどうかで判断する。単独で神経突起伸長を誘導する場合にはＮＧＦ様活性を示す分画であり、ＮＧＦの活性を増強する場合にはＮＧＦ増強活性を示す分画である。ＰＣ１２細胞が損傷を受ける場合には毒性があるものと判断できる。
（ｂ）簡易的に分離の程度を判断する手法としてはＴＬＣのＲｆ値により判断する方法がある。ＴＬＣの条件としては、担体がシリカゲル、溶離液がクロロホルム／メタノール＝８／２を採用する。分離した分画のＲｆ値が０．２０以上、０．６４以下の範囲内に含まれる場合に目的の分画であると判断することができる。このＲｆ値を示す分画を分離することで高いＮＧＦ関連活性を示すＮＧＦ関連活性物質を得ることができる。
また、同様のＴＬＣ条件を採用し、Ｒｆ値が０．２０未満の分画を前述の疎水分画から除外して残った分画を目的の分画とすることができる。具体的にはＲｆ値が０．２０未満の成分が混入しないように分離条件を制御することができる。
ここで、Ｒｆ値が０．５２以上の分画を含むようにすることで、より望ましいＮＧＦ関連活性を有する分画を得ることができる。また、Ｒｆ値が０．３９以下の分画を含むことも望ましい。
・その他
必要に応じて、その他の分離方法を追加することができる。例えば、上述の操作を繰り返し適用したり、他の担体を用いたクロマトグラフィ法にて分離したり、ＨＰＬＣを用いて分離したりすることができる。
（ＮＧＦ関連活性物質の探索方法）
本発明のＮＧＦ関連活性物質の探索方法は、上記式（２）に記載の４環式縮合核を骨格とし、Ａ核及びＤ核の少なくとも一方に１又は２の単糖が直接又は間接的に結合するステロイド配糖体を含むか否かによりＮＧＦ関連活性の有無を判別する。これらの化合物については前述のＮＧＦ関連活性物質の欄にて説明した事項がそのまま妥当するので更なる説明は省略する。
特に、ヒトデ綱に属する生物から探索することが効率的である。式（２）で示される４環式縮合核と単糖とが結合した化合物（４環式縮合核を有するアグリコン）は、サポニンなどで代表されるように、含有するか否かの判定が容易な化合物である。従って、４環式縮合核を有するアグリコンの検出という比較的容易な操作によりＮＧＦ関連活性物質及びその原料動物（植物）になりうる有望な候補を大まかに絞り込むことができ、探索に要する時間を大きく短縮することができる。
その後、単糖の結合位置及び結合数を判別して上述の式（２）に該当する化合物であるか否かを判断すればよい。ここで、単糖の結合数や結合位置も比較的容易に判別することができるので、従来の広くＮＧＦ関連活性物質をスクリーニングする方法と比較しても全体として簡便な方法である。例えば、単糖の含有割合を測定し、その値をこれらステロイド配糖体の濃度などと比較することで式（２）で表される４環式縮合核に対する単糖の結合数を算出できる。また、−ＯＳＯ_３Ｈ基（Ｎａ塩、Ｋ塩なども含む）を有していない化合物を探索することが望ましい。

〔試験１：オニヒトデからＮＧＦ関連活性物質を分離する方法〕
（抽出）
沖縄で採集したオニヒトデ４．５ｋｇ（湿質量）を凍結乾燥し、乾燥品１．２ｋｇをメタノール１６．５Ｌとともにミキサーで破砕し、ポリタンク中、室温で１週間放置した。混合物を、ろ紙を用いて吸引ろ過し、残渣をメタノールで洗浄し、ろ液に合わせた。ろ液１９Ｌを減圧濃縮してメタノール抽出物３１４ｇを得た。
（疎水分画の分離）
上記メタノール抽出物３１４ｇを５０％メタノール水溶液１Ｌに溶解し、逆相カラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ１４０Ｃ１８−ＯＰＮ、ナカライテスク、１ｋｇ、φ１０５×２００ｍｍ）を用いてクロマトグラフィーを行った（流速は自然落下速度）。溶離液と体積、フラクション（ｆｒ）番号は以下のとおり：５０％ＭｅＯＨ（１．５Ｌ、ｆｒ．１−３）、６０％ＭｅＯＨ（１．５Ｌ、ｆｒ．４−６）、７０％ＭｅＯＨ（３Ｌ、ｆｒ．７−１２）、８０％ＭｅＯＨ（２．１Ｌ、ｆｒ．１３−１７）、９０％ＭｅＯＨ（１．５Ｌ、ｆｒ．１８−２０）、ＭｅＯＨ（１．５Ｌ、ｆｒ．２１−２４）。
７０％−９０％メタノールで溶離されるフラクション（ｆｒ．１１−１９）を合わせ減圧濃縮してステロイド配糖体（サポニン）含有部４．７６ｇを得た。
（クロマトグラフィ法）
上記ステロイド配糖体含有部４．７６ｇをクロロホルム−メタノール（９５：５）１００ｍＬに溶解し、シリカゲルカラム（Ｈｉ−Ｆｌａｓｈ２Ｌ、山善、１６５ｇ、φ４８ｘ１７０ｍｍ）を用いてクロマトグラフィーを行った（流速２０ｍＬ／ｍｉｎ）。溶出液は、クロロホルム−メタノール（９５：５）から同（４５：５５）の直線グラジエント（１２０分）を用い、３分（６０ｍＬ）ごとに分取した。ｆｒ．２４−２６（６９−７８分）を合わせ減圧濃縮し、神経突起伸張活性を示す画分ｆｒ．Ａ２７７ｍｇを得た。
この物質（５μｇ／ｍＬ）はＰＣ１２細胞の２６％に神経突起の伸張を誘導し、神経突起を伸張しない程度の微量のＮＧＦ（１．５ｎｇ／ｍＬ）の存在下では神経突起伸張活性は７７％に増強された。
また、ｆｒ．Ｂ（５７２ｍｇ、ｆｒ．２７−２９）、ｆｒ．Ｃ（９３０ｍｇ、ｆｒ．３０−３４）は単独では突起伸張活性を示さなかったが、ＮＧＦ（１．５ｎｇ／ｍＬ）の活性を２７％（ｆｒ．Ｂ）、４５％（ｆｒ．Ｃ）まで増強した。以降の高極性画分ｆｒ．Ｄ（２３１ｍｇ）、ｆｒ．Ｅ（９８８ｍｇ）はＮＧＦ関連活性を示す前に細胞毒性を示した。
（ＮＧＦ関連活性の測定方法）
ラット副腎髄質褐色細胞腫由来ＰＣ１２細胞は、理研セルバンクから入手した。
凍結保存細胞（２ｘ１０^４細胞）を培地（ＭＥＭＥ−１０％牛胎児血清−５％馬血清）で洗浄し、培地１０ｍＬとともに９ｃｍシャーレに撒き、５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃、１週間静置培養した。細胞を収穫し新しい培地で２ｘ１０^５細胞／シャーレになるように希釈して１週間培養する継代培養操作を４回繰返した後、収穫した細胞を試験に用いた（継代操作は１２回まで）。以下、培養とは５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃で行うものとする。
２４穴マイクロタイタープレートの各ウエルに、２ｘ１０^４細胞のＰＣ１２細胞を含む培地１ｍＬを入れ、２４時間静置培養した。培地を、適当な濃度のサンプルを含む無血清ＭＥＭＥ培地１ｍＬ（１％ＤＭＳＯ含有）に交換し、２４時間ごとに１週間、細胞の様子を観察した。約１００細胞が観察できる視野３つを無作為に選択し、突起長が細胞径より長い細胞数を計測して、その割合をパーセントに換算して、神経突起伸張活性とした。
単独で添加した場合の神経突起伸長活性をＮＧＦ様活性の値とし、神経突起伸長を誘導しない濃度（１．５ｎｇ／ｍＬ）のＮＧＦを添加した状態で更に添加した場合の神経突起伸長活性をＮＧＦ増強活性の値とした。
〔試験２：ｆｒ．Ａから新規ステロイド配糖体を単離する方法〕
・ＨＰＬＣ（１回目）
上記の活性画分ｆｒ．Ａ２７７ｍｇをＨＰＬＣで精製した。条件は次のとおり：カラムＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−１２０Ｔ（φ２０ｘ２５０ｍｍ、ＹＭＣ）、溶媒７０％ＭｅＯＨ、流速８ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長２０５ｎｍ、１／３づつ注入。ピークごとに分取し、２５画分を得た。
・ＨＰＬＣ（２回目以降）
上記の画分のうちｆｒ．２１（１７．６ｍｇ）をＨＰＬＣ（溶媒４０％ＭｅＣＮ、カラムなどその他の条件は同上）で精製し、新規ステロイド配糖体であるアカンタステロサイド４０Ｂ（１５．０ｍｇ）を得た。また、ｆｒ．２２（５２．５ｍｇ）をＨＰＬＣ（同条件）で精製し、新規ステロイド配糖体であるアカンタステロサイド４０Ａ（１０．７ｍｇ）を得た。同様に、ｆｒ．１３（１２．６ｍｇ）から新規ステロイド配糖体であるアカンタステロサイド３４Ｃ（５．６ｍｇ）を、ｆｒ．２０（２９．２ｍｇ）から２種の新規ステロイド配糖体であるアカンタステロサイド３４Ｂ（４．３ｍｇ）及び３９Ａ（１０．２ｍｇ）を得た。さらに、ｆｒ．１２（１１．４ｍｇ）、ｆｒ．１７（７．８ｍｇ）、ｆｒ．１９（１４．８ｍｇ）、ｆｒ．２２（５２．５ｍｇ）から、４種の既知物質を得た。以上の結果を図１に示す。図１には一回目のＨＰＬＣにて得られたチャートとそれぞれのピークから単離されたステロイド配糖体及びそのＮＧＦ関連活性の値を示す。図１では、ステロイド配糖体が単離されたピークから線を引き出して示している。これらのステロイド配糖体が単離されたピークは、上記条件下において、左（保持時間が小さい）から、ｐｅａｋ１（ｆｒ．１２）：５３−５６分；ｐｅａｋ２（ｆｒ．１３）：５６−６０分；ｐｅａｋ３（ｆｒ．１７）：７７−８１分；ｐｅａｋ４（ｆｒ．１９）：８７−９０分；ｐｅａｋ５（ｆｒ．２０）：９０−９６分；ｐｅａｋ６（ｆｒ．２１）：９６−１０５；ｐｅａｋ７（ｆｒ．２２）：１０６−１２５分程度の範囲に現れる大きなピークであることから識別できる。これら保持時間を参考にピークを分離することで目的の化合物を容易に単離できる。
また、アカンタステロサイド４０Ａ及びＮＧＦを用いて、ＰＣ１２細胞の神経突起伸長を誘導した後の様子を示した顕微鏡写真を図２に示す。図２の右上がコントロールであり、何も添加しなかった場合、細胞の形状が変化しないのに対して、アカンタステロサイド４０Ａ（左下）及びＮＧＦ（右下）を添加した場合には、細胞から多数の突起が伸長していることが判る。
以下に、得られた新規ステロイド配糖体の旋光度、^１Ｈ−ＮＭＲ、^１３Ｃ−ＮＭＲ及び質量分析の結果を以下に示す。なお、ここには詳細を示さないが上記３４Ａに示される化合物についてもその存在を確認している。
アカンタステロサイド４０Ａ：［α］^２５ _Ｄ−２０（ｃ０．０６，ＭｅＯＨ）；^１ＨＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ ０．８９（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），０．９３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），０．９５（１Ｈ，ｍ），０．９６（１Ｈ，ｍ），１．００（１Ｈ，ｍ），１．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ），１．１０（３Ｈ，ｓ），１．１６（３Ｈ，ｓ），１．１９（１Ｈ，ｍ），１．２０（２Ｈ，ｍ），１．２２（１Ｈ，ｍ），１．３７（１Ｈ，ｍ），１．４９（１Ｈ，ｍ），１．５０（１Ｈ，ｍ），１．５５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．４，３．０Ｈｚ），１．５８（１Ｈ，ｍ），１．５９（１Ｈ，ｍ），１．７２（１Ｈ，ｍ），１．７４（１Ｈ，ｍ），１．８０（１Ｈ，ｍ），１．８１（１Ｈ，ｍ），１．８２（１Ｈ，ｍ），１．８３（２Ｈ，ｍ），１．９６（１Ｈ，ｍ），２．４３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．７，２．４Ｈｚ），２．８１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０，７．８Ｈｚ），２．８１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０，７．８Ｈｚ），３．０１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），３．１８（２Ｈ，ｍ），３．２２（１Ｈ，ｍ），３．２９（１Ｈ，ｍ），３．４１（１Ｈ，ｍ），３．４６（１Ｈ，ｍ），３．５３（１Ｈ，ｍ），３．５７（３Ｈ，ｓ），３．６１（３Ｈ，ｓ），３．６８（１Ｈ，ｍ），３．８０（２Ｈ，ｍ），３．８３（１Ｈ，ｍ），３．８７（１Ｈ，ｍ），３．９８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．２，２．４Ｈｚ），４．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．８，２．４Ｈｚ），４．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），４．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）；^１３ＣＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ １５．８（ｑ），１６．７（ｑ），１８．６（ｑ），１９．６（ｔ），１９．９（ｑ），２０．１（ｑ），２６．０（ｔ），２９．５（ｄ），３０．３（ｔ），３１．２（ｄ），３３．２（ｔ），３４．８（ｔ），３６．８（ｓ），４１．３（ｔ），４３．１（ｔ），４５．２（ｓ），４５．４（ｔ），４６．１（ｄ），４９．９（ｄ），５７．１（ｄ），６０．５（ｄ），６０．９（ｑ），６１．０（ｑ），６３．７（ｄ），６６．８（ｔ），６６．９（ｔ），７０．９（ｄ），７１．３（ｄ），７２．０（ｔ），７４．１（ｄ），７４．６（ｄ），７６．９（ｓ），７７．５（ｄ），８０．３（ｄ），８０．９（ｄ），８３．０（ｄ），８４．９（ｄ），８７．６（ｄ），１０３．６（ｄ），１０５．３（ｄ）．ＨＲＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳｆｏｕｎｄｍ／ｚ７９７．４６５３（Ｍ＋Ｎａ），ｃａｌｃｄ．ｆｏｒＣ_４０Ｈ_７０Ｏ_１４Ｎａ７９７．４６５８．
アカンタステロサイド４０Ｂ：［α］^２５ _Ｄ−３５（ｃ０．８１，ＭｅＯＨ）；^１ＨＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ ０．８９（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），０．９３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），０．９９（１Ｈ，ｍ），１．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ），１．０２（１Ｈ，ｍ），１．１１（３Ｈ，ｓ），１．１７（１Ｈ，ｍ），１．１９（１Ｈ，ｍ），１．２０（１Ｈ，ｍ），１．２８（１Ｈ，ｍ），１．３６（３Ｈ，ｓ），１．３７（１Ｈ，ｍ），１．４７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．６，３．０Ｈｚ），１．４９（２Ｈ，ｍ），１．６２（１Ｈ，ｍ），１．７５（１Ｈ，ｍ），１．７９（１Ｈ，ｍ），１．８１（２Ｈ，ｍ），１．８６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．２，３．０Ｈｚ），１．９６（１Ｈ，ｍ），１．９８（１Ｈ，ｍ），２．５８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．０，２．４Ｈｚ），２．８２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０，７．８Ｈｚ），３．０１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），３．１８（１Ｈ，ｍ），３．１８（１Ｈ，ｍ），３．２２（１Ｈ，ｍ），３．２９（１Ｈ，ｍ），３．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．６，６．３Ｈｚ），３．４６（１Ｈ，ｍ），３．５３（１Ｈ，ｍ），３．５７（３Ｈ，ｓ），３．６１（３Ｈ，ｓ），３．８０（２Ｈ，ｍ），３．９８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．８，２．４Ｈｚ），４．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．８，２．４Ｈｚ），３．８３（１Ｈ，ｍ），４．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），４．１８（１Ｈ，ｍ），４．３０（１Ｈ，ｓ），４．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．６３（１Ｈ，ｓ）；^１３ＣＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ１６．７（ｑ），１８．６（ｑ），１９．５（ｔ），１９．９（ｑ），２０．１（ｑ），２２．７（ｑ），２６．０（ｔ），２７．９（ｔ），２９．５（ｄ），３１．２（ｄ），３４．８（ｔ），３７．７（ｓ），３９．７（ｔ），４３．０（ｔ），４４．４（ｔ），４５．０（ｓ），４６．０（ｄ），５７．８（ｄ），６０．５（ｄ），６０．９（ｑ），６１．１（ｑ），６３．６（ｄ），６６．８（ｔ，２Ｃ），７０．９（ｄ），７１．２（ｄ），７２．０（ｔ），７４．６（ｄ），７６．２（ｓ），７６．４（ｄ），７７．４（ｄ），７７．５（ｄ），８０．９（ｄ），８３．０（ｄ），８４．９（ｄ），８７．６（ｄ），１０４．６（ｄ），１０５．３（ｄ），１２６．９（ｄ），１４８．５（ｓ）．ＨＲＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳｆｏｕｎｄｍ／ｚ７９５．４５４４（Ｍ＋Ｎａ），ｃａｌｃｄ．ｆｏｒＣ_４０Ｈ_６８Ｏ_１４Ｎａ７９５．４５２５．
アカンタステロサイド３４Ｃ：［α］^２３ _Ｄ−２５（ｃ０．４２，ＭｅＯＨ）；^１ＨＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ０．９４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），１．０３（１Ｈ，ｍ），１．０５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．１２（３Ｈ，ｓ），１．１８（１Ｈ，ｍ），１．１９（１Ｈ，ｍ），１．２２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．０，５．４Ｈｚ），１．２８（１Ｈ，ｍ），１．３６（３Ｈ，ｓ），１．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．４，３．０Ｈｚ），１．４９（１Ｈ，ｍ），１．７２（１Ｈ，ｍ），１．７５（１Ｈ，ｍ），１．７８（１Ｈ，ｍ），１．８６（１Ｈ，ｍ），１．８７（１Ｈ，ｍ），１．９７（１Ｈ，ｍ），１．９８（２Ｈ，ｍ），２．１２（１Ｈ，ｍ），２．２９（１Ｈ，ｍ），２．５７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．７，２．７Ｈｚ），２．８２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．７，８．１Ｈｚ），３．１６（１Ｈ，ｍ），３．３０（１Ｈ，ｍ），３．３５（１Ｈ，ｍ），３．４７（１Ｈ，ｍ），３．５６（１Ｈ，ｍ），３．５７（３Ｈ，ｓ），３．８１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．４，５．４Ｈｚ），３．９８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．２，２．４Ｈｚ），４．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．８，２．４Ｈｚ），４．１８（１Ｈ，ｍ），４．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．８，２．４Ｈｚ），４．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），４．７４（１Ｈ，ｓ），４．８１（１Ｈ，ｓ），５．６３（１Ｈ，ｓ）；^１３ＣＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ１６．８（ｑ），１７．２（ｑ），１８．４（ｑ），１９．５（ｔ），２２．７（ｑ），２７．９（ｔ），３０．６（ｄ），３２．９（ｔ），３５．５（ｔ），３７．７（ｓ），３９．７（ｔ），４３．０（ｔ），４３．４（ｄ），４４．４（ｔ），４５．１（ｓ），５７．８（ｄ），６０．５（ｄ），６１．１（ｑ），６３．７（ｄ），６６．８（ｔ），６７．５（ｔ），７１．３（ｄ），７６．２（ｓ），７６．４（ｄ），７７．５（ｄ，２Ｃ），８０．９（ｄ），８２．８（ｄ），８４．９（ｄ），１０９．２（ｄ），１０４．６（ｄ），１２６．９（ｄ），１４８．６（ｓ），１５４．０（ｓ）．ＨＲＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳｆｏｕｎｄｍ／ｚ６４７．３７６５（Ｍ＋Ｎａ），ｃａｌｃｄ．ｆｏｒＣ_３４Ｈ_５６Ｏ_１０Ｎａ６４７．３７０６．
アカンタステロサイド３４Ｂ：［α］^２５ _Ｄ−１６（ｃ０．１１，ＭｅＯＨ）；^１ＨＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ０．８９（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），０．９３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．０１（１Ｈ，ｍ），１．０２（１Ｈ，ｍ），１．０４（１Ｈ，ｍ），１．１１（３Ｈ，ｓ），１．１６（１Ｈ，ｍ），１．１７（１Ｈ，ｍ），１．２０（１Ｈ，ｍ），１．２２（１Ｈ，ｍ），１．２８（１Ｈ，ｍ），１．３６（３Ｈ，ｓ），１．４５（１Ｈ，ｍ），１．４９（２Ｈ，ｍ），１．６１（１Ｈ，ｍ），１．７５（１Ｈ，ｍ），１．７９（１Ｈ，ｍ），１．８１（１Ｈ，ｍ），１．８３（１Ｈ，ｍ），１．８７（１Ｈ，ｍ），１．９６（１Ｈ，ｍ），１．９８（１Ｈ，ｍ），２．５８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．０，３．０Ｈｚ），２．８２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０，７．８Ｈｚ），３．１８（１Ｈ，ｍ），３．２９（１Ｈ，ｍ），３．４６（２Ｈ，ｍ），３．５３（１Ｈ，ｍ），３．５７（３Ｈ，ｓ），３．８０（１Ｈ，ｍ），３．９８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．２，２．７Ｈｚ），４．１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．８，２．４Ｈｚ），４．１７（１Ｈ，ｂｒｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），４．３０（１Ｈ，ｂｒｓ），４．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．６３（１Ｈ，ｓ）；^１３ＣＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ１６．７（ｑ），１８．６（ｑ），１９．７（ｔ），１９．９（ｑ），２０．１（ｑ），２２．７（ｑ），２５．６（ｔ），２７．９（ｔ），２９．０（ｄ），３１．２（ｄ），３５．８（ｔ），３７．７（ｓ），３９．７（ｔ），４３．０（ｔ），４４．４（ｔ），４５．０（ｓ），４８．５（ｄ），５７．８（ｄ），６０．６（ｄ），６１．１（ｑ），６３．６（ｄ），６３．９（ｔ），６６．８（ｔ），７１．３（ｄ），７６．２（ｓ），７６．４（ｄ），７７．５（ｄ，２Ｃ），８０．９（ｄ），８３．０（ｄ），８４．９（ｄ），１０４．６（ｄ），１２６．９（ｄ），１４８．５（ｓ）．ＨＲＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳｆｏｕｎｄｍ／ｚ６４９．３９３９（Ｍ＋Ｎａ），ｃａｌｃｄ．ｆｏｒＣ_３４Ｈ_５８Ｏ_１０Ｎａ６４９．３９２２．
アカンタステロサイド３９Ａ：［α］^２５ _Ｄ−２５（ｃ０．１３，ＭｅＯＨ）；^１ＨＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ０．９０（９Ｈ，ｍ），０．９４（１Ｈ，ｍ），０．９５（３Ｈ，ｓ），１．００（２Ｈ，ｍ），１．１２（３Ｈ，ｓ），１．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），１．２２（１Ｈ，ｍ），１．２６（１Ｈ，ｍ），１．３０（２Ｈ，ｍ），１．３５（１Ｈ，ｍ），１．５０（１Ｈ，ｍ），１．５４（１Ｈ，ｍ），１．５６（１Ｈ，ｍ），１．５７（１Ｈ，ｍ），１．５８（２Ｈ，ｍ），１．７３（２Ｈ，ｍ），１．７５（１Ｈ，ｍ），１．７９（１Ｈ，ｍ），１．８３（１Ｈ，ｍ），１．８６（１Ｈ，ｍ），１．８９（１Ｈ，ｍ），２．００（１Ｈ，ｍ），２．３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．７，２．７Ｈｚ），２．８６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０，７．８Ｈｚ），３．１０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ），３．１７（１Ｈ，ｍ），３．３４（１Ｈ，ｍ），３．３８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），３．４６（３Ｈ，ｓ），３．５７（３Ｈ，ｓ），３．５９（１Ｈ，ｍ），３．６３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．０，５．７Ｈｚ），３．７６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．０，３．０Ｈｚ），３．８５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），３．９４（１Ｈ，ｍ），３．９７（１Ｈ，ｍ），３．９９（１Ｈ，ｍ），４．０４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．６，０．６Ｈｚ），４．２７（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝９．６，３．６Ｈｚ），４．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．０７（１Ｈ，ｓ）；^１３ＣＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ１５．４（ｑ），１５．９（ｑ），１８．４（ｑ），１９．０（ｑ），１９．８（ｔ），３１．５（ｄ），３１．７（ｔ），３２．９（ｔ），３６．３（ｔ），３６．３（ｄ），３６．７（ｓ），４１．４（ｔ），４１．７（ｄ），４２．９（ｔ），４５．５（ｔ），４５．５（ｓ），４９．０（ｄ），５６．０（ｄ），５７．２（ｄ），５９．１（ｓ），６１．２（ｓ），６２．５（ｔ），６４．４（ｔ），６６．６（ｄ），７０．１（ｄ），７２．４（ｄ），７４．２（ｄ），７６．５（ｄ），７７．２（ｓ），７７．８（ｄ），８０．８（ｄ），８３．８（ｄ），８４．４（ｄ），８４．９（ｄ），９２．７（ｄ），１０５．２（ｄ），１０７．８（ｄ）．ＨＲＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳｆｏｕｎｄｍ／ｚ７６７．４５５８（Ｍ＋Ｎａ），ｃａｌｃｄ．ｆｏｒＣ_３９Ｈ_６８Ｏ_１３Ｎａ７６７．４５５２．
〔試験３：ｆｒ．Ｃから新規ステロイド配糖体を単離する方法〕
・ＨＰＬＣ（１回目）
上記の活性画分ｆｒ．Ｃ（９３０ｍｇ）をＨＰＬＣで精製した。条件は次のとおり：カラムＯＤＳＤｅｖｅｌｏｓｉｌ−ＵＧ−５（φ２８ｘ２５０ｍｍ），溶媒７０％ＭｅＯＨ，流速１８ｍｌ／ｍｉｎ，検出波長２０５ｎｍ，２回に分けて注入。図３に示すように、クロマトピークに基づき５画分（Ｆｒ．Ｃ−１〜Ｃ−５）を得た。
・ＨＰＬＣ（２回目以降）
上記の画分のそれぞれについて表１に示すように分離精製した。
具体的には以下の通りである。ｆｒ．Ｃ−１（保持時間ｔＲ＝３８−４５ｍｉｎ，１４．８ｍｇ）をＨＰＬＣ（条件Ｋ，Ｆ）で精製し化合物８０−３（２．９ｍｇ）、化合物９２−２（１．０ｍｇ）及び化合物７８−３（１．４ｍｇ）を、ＨＰＬＣ（条件Ｋ，Ｆ，Ｅ）で精製し化合物１０１−３（２．１ｍｇ）を得た。
ｆｒ．Ｃ−２（ｔＲ＝５１−６２ｍｉｎ，１１４．７ｍｇ）をＨＰＬＣ（条件Ｄ，Ｅ，Ｆ）で精製し化合物６２−３（３．５ｍｇ）を、ＨＰＬＣ（条件Ｄ，Ｉ，Ｊ）で精製し化合物６５−２（４．５ｍｇ）、化合物６５−３（２．１ｍｇ）及び化合物６４−３（５．４ｍｇ）を、ＨＰＬＣ（条件Ｄ，Ｆ）で精製し化合物７６−３（３．０ｍｇ）を得た。
ｆｒ．Ｃ−３（ｔＲ＝７３−８２ｍｉｎ，５７．９ｍｇ）をＨＰＬＣ（条件Ａ，Ｅ，Ｆ，Ｇ）で精製し化合物６９−１１（２．０ｍｇ）を、ＨＰＬＣ（条件Ａ，Ｈ）で精製し２種の化合物７４−２及び７４−４を得た。
ｆｒ．Ｃ−４（ｔＲ＝８２−１０３ｍｉｎ，６６．７ｍｇ）をＨＰＬＣ（条件Ｂ，Ｃ，Ｄ）で精製し化合物４２−２（１４．２ｍｇ）を得た。
ｆｒ．Ｃ−５（ｔＲ＝１０３−１２６ｍｉｎ，２４．８ｍｇ）をＨＰＬＣ（条件Ａ）で精製し化合物３５−２（１９．７ｍｇ）を得た。
ＨＰＬＣ条件
Ａ：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ−ＯＤＳ−５（φ２０ｘ２５０ｍｍ），４０％ＭｅＣＮ，８ｍｌ／ｍｉｎ，ＲＩｄｅｔｅｃｔｏｒ
Ｂ：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ−ＯＤＳ−５（φ２０ｘ２５０ｍｍ），４０％ＭｅＣＮ，８ｍｌ／ｍｉｎ，ＵＶ２０５ｎｍ
Ｃ：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ−ＯＤＳ−５（φ２０ｘ２５０ｍｍ），３５％ＭｅＣＮ，８ｍｌ／ｍｉｎ，ＵＶ２０５ｎｍ
Ｄ：Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ（φ２０ｘ２５０ｍｍ），３５％ＭｅＣＮ，８ｍｌ／ｍｉｎ，ＵＶ２０５ｎｍ
Ｅ：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ−ＯＤＳ−ＵＧ−５（φ１０ｘ２５０ｍｍ），３５％ＭｅＣＮ，２ｍｌ／ｍｉｎ，ＲＩｄｅｔｅｃｔｏｒ
Ｆ：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ−ＯＤＳ−ＵＧ−５（φ１０ｘ２５０ｍｍ），７０％ＭｅＯＨ，２ｍｌ／ｍｉｎ，ＲＩｄｅｔｅｃｔｏｒ
Ｇ：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ−ＯＤＳ−ＵＧ−５（φ１０ｘ２５０ｍｍ），５３％ＥｔＯＨ，１．５ｍｌ／ｍｉｎ，ＲＩｄｅｔｅｃｔｏｒ
Ｈ：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ−ＯＤＳ−ＳＲ−５（φ２０ｘ２５０ｍｍ），７０％ＭｅＯＨ，８ｍｌ／ｍｉｎ，ＲＩｄｅｔｅｃｔｏｒ
Ｉ：Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ（φ２０ｘ２５０ｍｍ），７０％ＭｅＯＨ，８ｍｌ／ｍｉｎ，ＲＩｄｅｔｅｃｔｅｒ
Ｊ：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ−ＯＤＳ−ＳＲ−５（φ２０ｘ２５０ｍｍ），３５％ＭｅＣＮ，８ｍｌ／ｍｉｎ，ＲＩｄｅｔｅｃｔｏｒ
Ｋ：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ−ＯＤＳ−ＳＲ−５（φ２０ｘ２５０ｍｍ），３５％ＭｅＣＮ，８ｍｌ／ｍｉｎ，ＵＶ
・各化合物について^１Ｈ−ＮＭＲデータ（ＣＤ_３ＯＤ，６００ＭＨｚ）を示す。
（ＮＧＦ関連活性について）
（１）図１に示した各ステロイド配糖体について、ＮＧＦ様活性及びＮＧＦ増強活性を測定した結果を表５に示す。なお、表５に示す化合物タイプにおけるステロイド核とは、式（２）に示した４環式縮合核に対応する構造であり、各化合物毎に僅かに異なっている。そして、表５の上から、式（２）に示すＡ核に単糖が１つ結合したもの（α）、Ａ核及びＤ核の双方に１つずつ単糖が結合したもの（β）、そして、Ｄ核に２つの単糖（二糖類）が結合したもの（γ）、の大きく３つのタイプに分類できる。
表５から明らかなように、ＮＧＦ様活性はタイプβのみにしか確認されていないこと、タイプα、β及びγのいずれもＮＧＦ増強活性を示していること、から、（１）タイプβの構造を有する化合物には、ＮＧＦ様活性を期待することができること、（２）タイプα〜γなどで例示されるステロイド核に単糖又は二糖類が１つ結合した化合物はＮＧＦ関連活性を有すること、が推測できる。
また、（１）ＮＧＦ様活性を有する化合物を必要とする場合には、タイプβの構造を有する化合物を探索すれば得られること、（２）ＮＧＦ増強活性を有する化合物を必要とする場合には、ステロイド核に単糖又は二糖類が１つ結合した化合物を探索すれば得られること、が推測できる。
そして、本発明の新規ステロイド配糖体（アカンタステロサイド４０Ａ、Ｂ、３４Ｂ、Ｃ及び３９Ａ）は、毒性を示さずに、４０μＭ程度まで活性が認められている。また、２０μＭ程度の濃度でも充分な効果が発揮されている。なお、これらのステロイド配糖体が示すＮＧＦ関連活性は従来からＮＧＦ関連活性が知られている化合物よりも高い活性を示している。
（２）化合物３５−２及び化合物４２−２についても（１）と同様にＮＧＦ様活性とＮＧＦ増強活性とを測定した。結果を表６に示す。
表６より明らかなように、化合物３５−２及び化合物４２−２は、いずれも非常に強いＮＧＦ様活性及びＮＧＦ増強活性を示すことが明らかになった。これは表５からも予想できることである。つまり、化合物３５−２及び化合物４２−２はステロイド核の両端に糖が結合した構造をもつタイプβに相当するからである。その他、タイプβに相当する化合物８０−３、７６−３及び６５−２についても強いＮＧＦ様活性及びＮＧＦ増強活性を示している。
また、タイプγに相当する化合物６４−３も高いＮＧＦ様活性及びＮＧＦ増強活性を示している。しかしながら、表５より予測できるように、ＮＧＦ様活性についてはタイプβに相当する化合物よりも僅かに弱くなっている。
〔高齢雄性マウスにおける学習記憶障害に対する作用の評価〕
上述のｆｒ．Ａ（以下、「試験試料」と称する）をマウスに投与した場合の学習記憶障害に対する作用を検討した。
（方法）
８〜１０ヶ月齢のＩＣＲ系雄性マウス（ａｇｅｄ群）を用いた。毎夕、体重測定後に、各群に皮下投与した。試験試料の投与量は、体重１ｋｇ当たり１ｍｇ又は１０ｍｇとなるように試験試料を生理食塩液に溶解した群（各１０匹）、及び、生理食塩水をそのまま投与する群（１０匹）とした。投与は１４日間行った。１４日間投与を行った後、常法に従いＹ字型迷路試験を行った。なお、対照群として６週齢のＩＣＲ系雄性マウス（Ｙｏｕｎｇ群：１０匹）を用い、同様に生理食塩水を皮下投与した。
（結果および考察）
結果を図４に示す。図４左方から明らかなように、Ｙｏｕｎｇ群（対照：Ｓａｌ）に比べ、生理食塩水投与のａｇｅｄ群（Ｓａｌ）では短期記憶の障害が観察された。試験試料を１０ｍｇ／ｋｇ投与したａｇｅｄ群（ＯＪＫ１０）では短期記憶の障害は認められなかった。また、試験試料を１ｍｇ／ｋｇ投与したａｇｅ群（ＯＪＫ１）でもａｇｅｄ群のＳａｌとＯＪＫ１０との中間程度の短期記憶障害の程度を示し、ある程度の改善傾向が認められたことから試験試料の濃度としては体重１ｋｇ当たり１ｍｇ未満でも効果が発揮できる可能性も充分に考えられる。
Ｙ字型迷路試験中の試行内の行動量を示す総アーム進入数（ｔｏｔａｌａｒｍｅｎｔｒｉｅｓ）も同様な傾向を示した。すなわち、図４右方から明らかなように、ＯＪＫ１０の群はもちろん、試験試料の投与量が１ｍｇ／ｋｇであるＯＪＫ１の群においてもＹｏｕｎｇ群と同程度にまで回復することが明らかになった。
以上、試験試料をマウスに投与することで、成長・老化に伴い発生する脳機能障害に効果をもたらすことが明らかになった。また、詳細は示さないが、本試験試料を投与することによる行動異常などの顕著な副作用の発生は認められないことから、本試験試料は予防的な使用方法に供される可能性があることが明らかになった。

本発明の新規ステロイド配糖体はＮＧＦ関連活性などが期待できる。ＮＧＦ関連活性を有する物質は薬理作用として痴呆治療、学習能力向上などに有効な作用を発揮することが期待され、薬剤としての応用が期待できる。従って、それらＮＧＦ関連活性物質を製造、探索する方法についても産業上の利用可能性を有する。

Claims

下記一般式（１）又は式３９Ａで表されるステロイド配糖体。
（式（１）中、ＸはＸ^１又はＸ^２；ＹはＸがＸ^１のときＹ^３、ＸがＸ^２のときＹ^２及びＹ^３のうちのいずれか１つである。なお、Ｘ^１〜２及びＹ^２〜３は＊の部分にて結合する置換基である。）
下記一般式（１’）若しくは（１”）、又は、式６４−３、６５−３、６９−１１若しくは１０１−３で表されるステロイド配糖体。
（式（１’）中、ＹはＹ^４〜７のうちのいずれか１つである。ＲはＹがＹ^４の場合は水素、Ｙ^５〜７の場合はメチル基である。なお、Ｙ^４〜７は＊の部分にて結合する置換基である。）
（式（１”）中、ＹはＹ^{４、６〜８}のうちのいずれか１つである。ＲはＹがＹ^４の場合は水素、Ｙ^５〜７の場合はメチル基である。なお、Ｙ^{４、６〜８}は＊の部分にて結合する置換基である。）
請求項１又は２に記載のステロイド配糖体を含むことを特徴とするＮＧＦ関連活性物質。
下記式３３Ｂ、３４Ｂ２、３９Ａ２、３９Ａ３、７４−２及び７４−４のうちの少なくとも一種であるＮＧＦ関連活性物質。
前記ステロイド配糖体はオニヒトデからの抽出物に含有される化合物である請求項３又は４に記載のＮＧＦ関連活性物質。
アルコール又はアセトンからなる有機溶媒にて抽出したオニヒトデの有機溶媒抽出物から疎水分画を分離する工程と、
シリカゲル及び／又はデキストラン系担体を用いたクロマトグラフィ法にて該疎水分画を分画する工程と、を有することを特徴とする、請求項１〜５に記載のステロイド配糖体のうちの少なくとも一の化合物を含むＮＧＦ関連活性物質の製造方法。
アルコール又はアセトンからなる有機溶媒にて抽出したオニヒトデの有機溶媒抽出物から疎水分画を分離する工程と、
ＴＬＣ（担体：シリカゲル、溶離液：クロロホルム／メタノール＝８／２）にて測定したＲｆ値が０．２０以上、０．６４以下の範囲内に含まれる分画を該疎水分画からクロマトグラフィ法にて分離する工程と、を有することを特徴とする、請求項１〜５に記載のステロイド配糖体のうちの少なくとも一の化合物を含むＮＧＦ関連活性物質の製造方法。
アルコール又はアセトンからなる有機溶媒にて抽出したオニヒトデの有機溶媒抽出物から疎水分画を分離する工程と、
ＴＬＣ（担体：シリカゲル、溶離液：クロロホルム／メタノール＝８／２）にて測定したＲｆ値が０．２０未満の分画を該疎水分画からクロマトグラフィ法にて除外する工程と、を有することを特徴とする、請求項１〜５に記載のステロイド配糖体のうちの少なくとも一の化合物を含むＮＧＦ関連活性物質の製造方法。
前記クロマトグラフィ法にて分離する工程は、前記Ｒｆ値が０．５２以上の分画を分離する工程を含む請求項７又は８に記載のＮＧＦ関連活性物質の製造方法。
前記クロマトグラフィ法にて分離する工程は、前記Ｒｆ値が０．３９以下の分画を分離する工程を含む請求項７又は８に記載のＮＧＦ関連活性物質の製造方法。
請求項６〜１０のいずれかに記載の製造方法にて製造されうることを特徴とする、請求項１〜５に記載のステロイド配糖体のうちの少なくとも一の化合物を含むＮＧＦ関連活性物質。
請求項３〜５及び１１のいずれかに記載のＮＧＦ関連活性物質を有し、老化に伴い発生する脳機能障害を予防乃至治療する医薬であることを特徴とする脳機能障害予防薬。