DE1695674A1

DE1695674A1 - Neues Verfahren zur Herstellung von Rubidomycin

Info

Publication number: DE1695674A1
Application number: DE19681695674
Authority: DE
Inventors: Andre Belloc; Yvan Charpentie; Jean Preud Homme; Jean Lunel
Original assignee: Rhone Poulenc SA
Current assignee: Rhone Poulenc SA
Priority date: 1967-03-15
Filing date: 1968-03-15
Publication date: 1972-02-24
Also published as: US3616242A; CS158214B2; CH484272A; FR1527892A; NL6803230A; BE712202A; SE355137B; DK118252B; GB1188262A

Description

Dr. F. Zumstoin - Dr. E. Αμπμμι

Dr. R. Ko«nigsb«rg«r
Dipl. Phys. R. Holzbauer

Pataiianw&lt·
München % BräuhoussJrafc· 4/Hl

SC 3082

RHONE-POULENC S.A., Paris / Frankreich

Neues Verfahren zur Herstellung von Rubidomycin

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Überführung des mit der Nr. 15 213 R.P. bezeichneten Antibioticum^ in Rubidomycin (13 057 R.P.) durch Hydrolyse in saurem Medium.

In der belgischen Patentschrift 632 391 sind das mit der Nr. 9 865 R.P. bezeichnete Antibioticum, seine drei Hauptbestandteile, die mit den Nummern 13 213 R»P-, 13 057 R.P. und 13 330 R.P. bezeichnet sind» das AgIykon von 9 865 R.P., das mit der Nr. i3 567 R*P« bezeichnet ist, die Herstellung des Antibioticums 9 865 R»P· " durch Züchtung von "Streptomyces 8899" oder "Streptomyceö 31 723" in geeignetem Medium und die Trennung dee AU'sibioticums 9 865 R.P. in seine Bestandteile sowie die Herstellung des Agljkons durch Hydrolyse von 9 865 R»P.. oder. Rubidomycin in der Siedehitze beschrieben.

BAD 209809/1568 ^B*

Das Antibioticum 9 865 R.Ρ» enthält im Durchschnitt 30 $> Rubidomycin vniä 30 bis 40 # des Antibioticum© S3 213 R.P-ί doch können dies© Mengenanteila in ziemlich weiten Grenssön 3© nach den Gewirawragsbedingungen des Antibiotioums 9 865 R.P. variiaren.

Bie beiden Hauptbestandteile (13 213 R«P· und Rubidomycin) weisen ein gang besonderes Interesse aufgrund ihrer sehr ausgeprägten Wirksamkeit gegen Krebs auf·

Das 13 213 R«P· ist zwar beim Tier etwa hundertmal wirksamer als das Rubidomycin« doch ist es auch hundertmal toxischer» Ausaerdem weist das Antibioticum 13 2ί3 R-P< den Nachteil auf, nicht kristallisiert werden zu können? während aas Rubidomycin leicht kristallisierbar ist. Ss ist daher wünschenswert, das 13 213 R*P· aus dem in vivo verwendeten Rubidomycin zu entfernen.

Die überführung von 13 213 R«P· in Rubidomycin waist somit den Vorteil auf» die Produktion an Rubidomycin zu erhöhen und eine unerwünschte Substanz in dem Endprodukt zu entfernen.

Die beiden Bestandteile (13 213 R»P· und Rubidomycin) enthalten die gleiche ohroraophore Gruppe oder Aglyko» gruppe, die mit der Nr. 13 567 R.P. bezeichnet iat„ ihre Konstitution kann sohematisoh auf folgende W dargestellt werden ;

209809/1568 bad original

169567.A

«3 567 R.P. + Aminozuoker » Rubidomycin Rubidomycin + Zucker * 13 213 R-Ρ«

Die Hydro3.ys« in «aurem Medium unter geeigneten Bedingungen bewirkt die beiden folgender» Reaktionen s

3 213 R.P. —- -£· Rubidomycin Rubidomycin ---—£> 13 567 R»Ρ« + Aminozucker.

Bs ist daher erforderlich, die Umvraad lungs bedingungen zu bestimmen, die erlauben„ das Maximum an Rubidomycin und das Minimum an "!3 567 R.P· zu erhalten.

Erfindungsgemäss kann die Hydrolyse in saurem Medium in wässriger Lösung und insbesondere in den Fermentationsmaischen oder in wässrig-organischer Lösung durchgeführt werden.

Unter den im allgemeinen verwendeten organischen Lösungsmitteln können die Alkohole mit * bis 4 Kohlenstoffatomen,, die Äther, wie beispielsweise Bioxan« oder tetrahydrofuran» die Ketone, wie beispielsweise Aceton und Methyläthylketon, die Ester, wie beispielsweise Bssigsäureäthylester, die chlorierten Lösungsmittel, wie beispielsweise Methy3,enchlorid oder Chloroforms oder Gemische dieser Lösungsmittel genannt werden.

Die Miiieralsäuren (z.B. Salzsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure) oder die organischen Säuren ^Essigsäure_r Oxalsäure und dergleichen) eignen sich i η verschiedene». Konssentra-

209809/1568 _BAD original

tionen, doch wird vorzugsweise Ch3orwaseerstoffsäure oder Oxalsäure mit Hormalitäten zwischen O_fOi η und 1 η verwendet.

Die Konzentration des umzuwandelnden Produkts In dem Reaktionsmedium kann von 0,01 bis 5 i> variieren.

Die Hydrolysereaktion wird bei einer Temperatur zwischen 10 und 75 ⁰G vorgenommen, und die Reaktionszeit, dia von der Temperatur abhängig ist, kann von 48 Stunden biss 30 Hinuten in diesem Intervall variieren« Vorzugsweise wird die Hydrolyse zwischen 15 Stunden bei 20 ⁰C und 1 Stunde bei 50 ⁰C vorgenommen»

Nach beendeter Reaktion wird das Rubidomycin aus dem Eeaktionsmedium nach den üblichen Methoden ssur Isolierung und Reinigung von Antibiotica abgetrennt.

Es ist erforderlich, das Rubidomycin, das 15 213 R«p_e und das 13 567 R.P. in den wässrigen» organischen ocier wässrig-organischen Lösungen, die Rohprodukte, die halb» gereinigten Produkte und die reinen Produkte bestimmen zu können, um die optimalen Hydrolysebedingungen unci die Zusammensetzung der Bndprodukte feststellen au können«

Die Bestimmungearbeitsweisen beruhen auf den Unterschieden der physiko-chemischen und biologischen Ei£<ra-

BAD

209809/1566 '

- 5 schäften der verschiedenen Bestandteile.

Die Verteilungschromatographie an Cellulose und die Absorptionschromatographie an Kieselsäuregel in mehreren Lösungsmittelsystemen, wie beispielsweise den Gemischen von niedrigen Alkohlen und Wasser, niedrigen Alkoholen, Estern von aliphatischen Säuren und Wasser, körnen angewendet werden, da die beiden Hauptbestandteile und das Aglykon verschiedene Rf-Werte aufweisen.

Da die Substanzen natürlich gefärbt sind,' ist es möglich, sie durch Dünnschichtchromatographie oder Säulenchromatographl. e zu trennen und sie entweder spektrographisch im Vergleich zu einem Standard zu bestimmen» oder einfache?' die abgetrennten Produkte in /.glykon 13 567 R.P» durch Btarke Hydrolyse überzuführen„ den Prozentsatz an Chromophorgruppe festzustellen und den Gehalt an ied3m der Bestandteile daraus zu ermitteln·

Ausserdem ist die biologische Aktivität in vitro der beiden Bestandteile verschieden, und das Aglykon ist inaktiv» Wenn das reine Rubidomycin in Form der Base nach c:er Definition 1000 yug/mg entspricht, so entspricht reines 13 213 R»P. 60000/Ug/mg nach der turbidimetrischen Bestimmung unter Verwendung von Klebsieila pneumoniae

als empfindlichem Keim. Dieser Unterschied ermöglicht, nicht' nur die Rohprodukte und die Lösungen zu bestimmen,

209809/15S8

sondern auch sehr geringe Mengen an 13 213 R. P. in den gereinigten Rubidomycinfraktionen festzustellen. Zur Durchführung dieser Bestimmungen genügt es, die Produkte, wie oben angegeben, zu Chromatographieren und die Chromatogramme durch Bioautographie auf rait Bacillus aubtiliß oder Klebsiella pneumoniae beimpfter Nähragarplatte auszuwerten·

Sie folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken*

Die in den Beispielen angegebenen Ausbeuten sind auf folgende Weise definiert :

Gewicht des in dem erhaltenen Produkt Ausbeute = enthaltenen Rubidomycin^ _χ _1QQ

Gewicht des in dem behandelten Produkt enthaltenen Rubidomycin«

BeJBpJeI₁ t

Man stellt zwei Lösungen von reinem Rubidomycin und reinem 13 213 R.P. mit einem Gehalt von 5 mg/car in einem Essigsäureäthylester-Methanol-Gemisch (1 : 1 Volumina) her. Man setzt zu jeder Lösung eine Menge an In-Salzsäure zu, die 4 cmVg eingesetztem Produkt entspricht. Man bringt die Lösungen auf 25 ⁰O und hält sie in Bewegung. Man entnimmt in bestimmten Zeitintervallen μ Stunde, 4 Stunden, 9 Stunden, 20 Stunden) 0,5 cm' 3eder der Lösungen, die man mit 10 cm^ Äther ausfällt.

209809/1 568 "^{AD OalGINAL}

Man filtriert die erhaltenen Niederschläge, saugt sie ab und trocknet sie* Hau bestimmt sie durch Zirkularchromatographie auf Papier Arches Kr. 302, das mit Phosphatpuffer von pH 4»8 imprägniert ist, mit n-Butanol, das mit Wasser gesättigt ist, als Entwicklungslöeungsmittel. Han schneidet die sichtbaren Zonen, die Rubidomycin, 13 213 RoP. und 13 567 R*P* entsprechen, aus und eluiert sie mit 5 cnr eines Methanol-Chlorwasserstoffsäure-Oemischs (9 : 1 Volumina). Man erhitzt die filuate eineinhalb Stunden bei 50 ⁰C, um die beiden Bestandteile, Rubidomycin und 13 213 R.P., aTu 13 567 R.P. su hydrolysieren. Man misst die Absorption dieser Lösungen bei 480 nm und ermittelt hieraus die Gehalte an Rubidomycin, 13 213 R.P. und 13 567 R.P.

Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt :

Produkt

m ■».»■■■ <i ^Wii«>w^Mi iwja >irfH>i

13 213

bestimmte

bestimmt als Funktion der Zeit

Bestandteile t . ι ι ι

ι O Std .j 4 Std,

Rubidomycin,¹ 100

L·

90

Rubidomycin

ι 13 567 R.P

luv i jv

4 Std. j 9 Std.! 20 Std.

ι 90 ! 90 !

83

13 567 R.P.! -}

13 213 R.P.I

L^t0

M3 213 R.P.I 95 ! 79

j 10 S 66

t - - -I

10 59

?y ι PP

17 35

13 567 R.P.[

ί 3 1

«^ ^e i mm ^i*

37 4

55 10

209809/1568

Beispiel 2

Man stellt zwei Lösungen von reinem Rubidomycin und reinem 13 213 R.P« mit einem Gehalt won 3*25 mg/cm⁵ in einem Lösungsmittelgemisch von Essigsäureäthylester und Methanol (1:1 Volumina) her» Mari setzt eine Menge an 1n-Salzsäure zu, die 4 cnr je g eingesetztem Produkt entspricht. Man bringt auf 37 ⁰C und hält unter Bewegung. Man entnimmt in bestimmten Zeitintervallen"(1 Stunde, 2 Stunden, 4 Stunden, 6 Stunden und 24 Stunden) 30 Mikroliter aus jeder der Lösungen und bringt sie auf eine Kieselsäuregel-Dünnschicht, die mit Phosphatpuffer von pH 7 imprägniert ist, auf. Man entwickelt die Chromatogramme mit der Lösungsmittelphase eines Gemische n-ButanoX· EseigsäureäthyleBter-Wasser (5 : 5 ι 2,5 Volumina). Man gewinnt durch Abkratzen die Zonen des Kieselsäursgels, die die getrennten Bestandteile enthalten. Man eluiert diese Fraktionen von Kieselsäuregel mit einem Gemisch Methanol-Chlorwasserstoffsäure (9 : U Volumina). Man erhitzt die Eluate 1 1/2 Stunden bei 50 ⁰C, um die beiden Bestandteile, Rubidomycin und 13 213 R.P., zu 13 567 R.P« zu hydrolysieren. Man misst die Absorption dieser Lögungen bei 480 mn und ermittelt hieraus die Gehalte an Rubidomycin, 13 213 R-P. und 13 567 R.P.

Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt s

209809/1568 BAD ORDINAL

Produkt

Rubidomycin Rubidomycin

213 Η·Ρ.

bestimmte Bestandteile

13 567 R.P.

13 213

Rubidomycin

13 567 R.P.

>, bestimmt ale Punktion der Zeit . .. _ + »

OStd.

100

-ι

S«.} 2 8t& 4SW.

6St5d.| 24Std.

j 70 {55 j 47

- ι 15 J 30 _„ _ j -f—h-

88

i 25 »20

t ο

I 55 i 50

t i

53

I
4

46

! 20 j 30

I
I

40

17 83

18

82

Beispiel 3

Kin stellt zwei Lösungen von reinem Rubidomycin und reinem 13 213 R.P. mit einem Gehalt von 5 ag/or in einem Gemisch Methanol-Essigsäureäthylester (1:1 Volumina) her. Zu aliquoten Anteilen dieser Lösungen setzt man Mengen an 1n-Salsssäure au» die 2 bsv· 8 oar je g eingesetztem Produkt entsprechen. Man behandelt diese Lösungen wie in Beispiel 2 angegeben.

Die erhaltenen Brgebnisee sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt :

209809/1568

-
in-

I behandel-

2cinVgT

13.213 R.P.

I
j bestimmte

! ^₉ bestimmt als

98
1

! 1st«

78
20

I
I 23b,

Funktion der Zeit

I
I

36
54

ί 6St.
ι
I

ί 24 St.

HCl

i tee
I Produkt

ι Bestand-
i teile

OSt.
I

1

2

I
I

4St

i 79
ί 21
ι

10

ι—~ -*

I
I

100
i 0

! 97
ί 3

I

I
I-
'

I 55
45

Rubidomycin

I Rubidomycin
i 13*567 R.P.

i 100
\ 0

100
O

t

i——ι

Γ \

I
I j

Rubidomycin

I
I

98
2

67
30

85
\5

I 20
ι
ί 66
ί

O
75

κ- «. <» _. - — j

13 213 R.P.
Rubidomycin

tv— 1

3

15

25

8cnr/g

13-567 R.P.

98
I

. - _

I _„.

' ^.. j

.,_ ₌.₌

1

ι_β«.«._β „„, ι

1

36

18

13 213 R.P.
I

j ^j

1 !

63

95
5

63

75
25 j

45
55

I
j
J

Rubidomycin
13-567 R-P.

1
■

19
!

S. - . J

ι _ _ _ ~ .... j

^r 1

1

24 !

_ ι

13 213 R.P. !

70

40

38

Rubidomycin '

6 j
. 1

35 j

34

13 567 R.P.
_ _ i

Beiapiel

Han löst 8 Anteile von 1 g rohem Antibioticum 9-865 R.P. _f das 345/ug/ag an Rubidomycin und 400/ug/mg an I3. 213 R.P< enthält, In 8-mal 5 car Chloroform* Man setzt zu jedem Anteil 10 cm' eines Gemische n~Butanol- 6n-Sals8äure (96 s 4 Volumina) zu. Man bringt diese Lösungen auf 20° oder 30 ⁰C und hält sie in Bewegung. In regelmäßigen Zeit-Intervallen (2, 4t 8 und 16 Stunden) bestimmt man die Zu» sammensetzung eines bei 2O⁰C gehaltenen Anteils und eines bei 3O⁰C gehaltenen Anteils. Zu diesem Zweck setst man zu

209809/1568

■χ .

jedem Λateil ^50 enr eines Aeeton-Hexan-Gemischs (1 s 1 Volumira) ssu, um das Rubidomycin und das 13 213 RoP« auszufäll€n. Die erhaltenen Produkte werden filtriert, abgesaugi _f getrocknet und durch Kolorimetrie »ur Bewertung des Prczentgehalts an Rubidooyein und durch Turbidimetric mit Klebsiella pneumoniae als empfindlichem Keim zur ErmittluEg des Gehalts an 13· 213 R°P· bestimmt a

In der folgenden !Tabelle sind die erhaltenen Ergebnisse zusammengestellt :

9?empe-j

ratur,

in

20°C

3ü°C

Baueij

in

Stun-j
den

r-e^toei

16

4
8
6

wicht!

Charakteristiken der erhaltenen Produkte

Rubidomycin

Gehalt} Gwicht; Gehalt}Gewicht /ug/ingt

0,73
0,73
0,73

0,7

0,72

0,6

345 630 670 710

345 665

670 670 745

0,345
0*490
0,520
0,515

0,345
0,465

0,469
0,480
0,445

13 213 R.

I—f

400
90
68
60

Γ"

400
76

55
41

0,400 0,063 0,053 0,042

0,400 0,053 0,038 0,029

33 ι 0,020

ι ι

• «»■»feil

Ausbeute

Rubido- } 13 213 R»P« myoin,

100 142 150 149

100

335

136

139 129

00 16 13 10

00

13

9,5

209809/1568

In 1840 cm' eines Hethanol-Essigsäureäthylester-Gemiechs (i : 1 Volumina) löst man 46 g eines Produkte mit einem Gehalt voa 150 /Ug/eg an Rubidomycin, 650 /Ug/mg an 13. 213 R.P. und 200 /Ug/mg an 13 567 R.P. (restliches Produkt, stamaend aus der Fraktionierung von 9 685 R.P., wobei der größte Teil des Rubidomycins entfernt worden war). Man setzt 55 cm^ 1n-Salzsäure zu. Man hält 10 Stunden bei 37 ⁰C unter Rühren. Man engt die Löoung bei 30 ⁰C unter vermindertem Druck (20 mm Hg) auf 500 cm⁵ ein.

Man setzt 500 cnr Butanol zu und engt erneut bis auf 500 cm'

•5 ein. Man fällt die so erhaltene Butanollösung mit 5000 cnr Hexen,

Der Niederschlag wird abfiltriert, gewaschen, abgesaugt und getrocknet. Man erhält 42 g Produkt, dessen Merkmale in der folgenden Tabelle zusammengestellt sind :

wicht

I "

H

M e r

k m

a I

e

GewichtδGehalt

-Jz

«g/m

β

ί Gewicht

TT

13 567 R.P.

ι Gewl cht

g

«
j)

MMMM M ai

g

Il

ί g

η
η
It

β

«
M

Rubidomycin

3

13

213 R.P.

e

Gehalt

Pro
duk

Il
Μ

"" Ύ "

- ·

-i

S

650

K
II

^ug/mg

te

M
M

Gehalt

6,9

M
Il

29,2

Il

"·-

9,2

46

·*
Il

/Ug/mg

π
i
JU

U

«
n

H

310

|1

200

η

18,5

Il

13

tt
It

10,5

nicht be

42

M
Il
Il

150

M

Ii
ii
It

handelt

11
K

H
U

250 \

nach Be

Il
Il

it
H

handlung

440

H

erhalten

H

η

209809/1568

BAD

Man löet 10 g gemäas Beispiel 5 erhaltenes Produkt in 200 em^ eines Systeme n-ButanOl-m/i5«Phosphatpuffer von pH 6,5» Man führt eine Gegenstromverteilung von 50 Überführungen in einer Craig-Apparatur mit 50 Zellen durch· Man macht drei Fraktionen (Zellen O bis 14» 14 bis 40» 4o bis 50)· Bann behandelt man die drei Fraktionen in identischer Weise. Man trennt die wässrigen Phasen ab, verdünnt die Butylphasen mit 1 Volumen Hexan und extrahiert dreimal mit ^e 1/4 Volumen Wasser. Die wässrigen Extrakte werden vereinigt, lean extrahiert 8ie bei pH θ zweimal mit je i/2 Volumen Chloroform. Man wäscht das Gemisch bei pH 8 mit 1/10 VoI · Wasser. Man engt auf 100 cnr ein und fällt mit 1000 cnr Hexan aus.. Die Niederschläge werden abfiltriert, gewaschen und getrocknet ·

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt s

Gehalt ! Gawioht !!Gehalt

I 13 567 K.P.

Göwichtjl Gehalt i Gwwioht g {j /ig/mg j g

jjj ·' i ι*"*' I. „«,«i „«. ~j·---————■'I'—»="-~—""-*«»if·»—«=··»-"—y=·—*<——>«.««—

3*1

0,09 S 30

I 250

r~-

erhalten

0,16

1,75 j» 545

2,5

0,045

0,0275

2,84

BAD ORIGINAL

Beispiel 7

Man löst O₁5 g des gemäss Beispiel 6 erhaltenen Produkts mit einem Gehalt von 910>ug/mg an Rubidomycin in 5 ca? eines Gemische Dioxan-Wasser (8 : 2 Volumina). Kan stellt den pH-Wert durch Zugabe von 0,1 cm' konzentrierter Salzsäure auf 4 ein· Man setzt langsam unter ständigem Rühren 35 cnr Dioxan zu. Bas Rubidomycin-hydrochlorid kristallisiert aus. Der Niederschlag wird abflltriert, mit 5 cnr Dioxan gewaschen und bei 45 ⁰C unter vermindertem Druck (0,5 ma Hg) getrocknet. Man erhält 0,480 g Rubidomyoin-hydrochlorid, das die folgenden Merkmale aufweist :

Biologisch bestimmter Gehalt = 955/Ug/mg

Atta?.yse s C « 55,35 ?δ, H = 6,45 ^, 0 « 30,1 #, H « 2,55 96, Cl= 6,05 #.

Ultraviolett-Spektrum (bestimmt mit einer Lösung in 96 ?4-igem Äthanol) :

Absorptionsmaximum bei 236 nm - B^ J_n " 645

1 <£ Absorptionsmaximum bei 250 ran - E ^

1 cm ^Ä

1 4> Absorptionsmaximum bei 288 nm - B ^ _β ^q Abaorptionsmaximum bei 472 n» - B¹ ^ * 209

1 cm

Absorptionsmaximum bei 487 na - b¹ ^ » 209

1 cm

Absorptionsaaxiraum bei 523 nm - E * * 116

1 cm

209809/ 1S68 bad original

Beispiel 8

Man löst 463 g Antibioticum 9 865 R.P· in Form der rohen Base mit einem Gehalt von 330 yug/ng an Rubidomycin und 330 >ug/mg an 13 213 R»P· in 2,3 1 Chloroform. Wen setzt unter Rühren 4,6 1 eines Gemische n-Butanol-6n« Salzsäure (96 : 4 Volumina) zu. Man bringt die Lösung 15 Stunden auf 30 ⁰C. Man fällt eine erste Fraktion durch Zugabe von 35 1 Aceton aus· Man filtriert diesen niederschlag, wäscht ihn und trocknet ihn. Man erhält eine zweite Fraktion durch Zugabe von 42 1 Hexan zu den Mutterlaugen der ersten Fraktion. Man filtriert, wäscht und trocknet wie bei der ersten Fraktion.

In der nachfolgenden Tabelle sind die erhaltenen Ergebnisse zusammengestellt :

Produkte

i^wicht J Gehalt! ι/ug/mg

nicht behandelt

erhalten:
1.Fraktion
2«Fraktion

Ge- I

15 213

Wi-Ii imftnt

463 I

330

189 Ü

58

H J

86D 532

Gewicht 1 Gehalt!Gewicht

153

158
32

H N

I!

it

H )! Il

I! H H 13 H

330

15

10

2 Ausbeute

^s an

153

2*8 0,5

R M

Il Η

»103 )

« J 122,5

S19,5*

209809/1568

Man löst 187 g des wie in Beispiel 8 beschrieben erhaltenen Hydrochloride mit einem Gehalt von 860 yug/mg an Rubidomycin und 15 yug/mg an 13 213 R.P. in 360 cm⁵ Hethanol» Kan setzt 57 cnr Wasser und 1,38 1 Dioxan au. Man klärt durch Dekantieren und lässt langsam unter Rühren 12,6 1 Dioxan zufliessen, was die Kristallisation bewirkt. Man filtriert dae kristallisierte Produkt ab, saugt es ab_t wäscht es und trocknet es. Man erhält eine zweite Fraktion, indem man die Mutterlaugen auf 2 1 einengt und 2 1 Hexan zusetzt. Man isoliert das Produkt durch trleren« Waschen und Trocknen.

In der nachfolgenden Tabelle sind die erhaltenen Ergebnisse zusammengestellt :

Produkt

nicht behandelt

erhalten

13 213 R.

J.

GehaltiGewicht »Gehalt

jj Ausbeute

Gewicht κ Rubidog H mycin, #

Il It R Il H

O_f6

N Il H

I! 77 ) ü ) 95.4 0,76 ü 18,4}

Das so erhaltene Rubidomycin-hydroohlorid ist mit dero in Beispiel 7 erhaltenen identisch.

209809/1568

BAD ORiGiNAL

Beispiel^ 10

Man teilt 200 1 Maische in zwei gleiche Anteile A und B mit eines Gehalt von 43»8_/H8/cnr an Rubidomycin und 30 ^ig/oBT an 13 213 R-P- Der Anteil A wird einer sauren Hydrolyse unterzogen, und der Anteil B, der keiner sauren Behandlung unterzogen wird, dient als Vergleich*

Man setzt zu dem Anteil A 30 g Oxalsäure je liter zu. Man bringt auf 50 ⁰C und 'hält eine Stunde in Bewegung. Man filtriert in Anwesenheit einer Filterhilfe* Man wäscht mit Wasser von 50 ⁰C und kühlt die i23 1 des eo erhaltenen Filtrate auf + 5 ⁰G ab. Man stellt den pH-Wert auf 4_t5 ein.

Man filtriert die Maische B in Anwesenheit einer Filterhilfe und nimmt das Mycel, das die gesamte Aktivität enthält, in 90 1 eines Methanol-Waeser-Gemischs (6:3 Volumina), das 2 kg Oxalsäure enthält, auf* Man hält 1/2 Stunde in Bewegung. Dann filtriert man und nimmt den Filterkuchen in 50 1 eines Methanol-tfasser-Gemischs (3 ; 2 Voluraina), das 1 kg Oxalsäure enthält, auf. Man wäscht mit 20 Methanol-Wasser-Gemiech (1:1 Volumina). Man kühlt die 165 1 des so erhaltenen Filtrate auf + 5 ⁰C ab und neutralisiert sie bis auf pH 4,5»

e Filtrate A und B werden anschllessend getrennt in folgender Weise behandelt !

Jedeo Flltrat wird in eine Säule geführt, die 5 1 Amber-

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lite IRG 50 in saurem Zyklus enthält. Bas FiItrat durchströmt das Amberlite-Bett von unten nach oben mit einer Rate von 15 l/Stunde. Die Säule wird anschliessend mit 50 1 Wasser für das Pil trat A und mit 50 1 50#-igem Methanol für das Pil trat B mit einer Rate von 15 l/Stunde von unten nach oben zirkulierend und dann mit 75 1 einer MethanollöBung mit 10 i» Wasser von oben nach unten zirkulierend mit einer Rate von 15 l/Stunde gewaschen.

Die Waschflüssigkeit en werden verworfen und die Säule wird dann mit einer Lösung der folgenden Zusammensetzung eluiert :

Natriumchlorid 10 g

Wasser 100

Methanol ad 5000 cm .

Das Eluafc, das den grös&ten feil des Antibioi;lcums enthält, besitzt ein Volumen von 40 1. Ss wird unter vermindertem Diuck (20 mm Hg) bei 35 ⁰C auf ein Volumen von 5 eingeengt.

Das Konzentrat wird bei pH 7,5 nacheinander zweimal mit Je 5 1 Chloroform extrahiert. Der Chloroformextrakt wird

mit einer Lösung von Essigsäure in Chloroform (1s ΐθ Volu mina) au:? pH 4 eingestellt und dann bei 30°C unter vermindertem D:nick (20 mm Hg) auf ein Volumen von 200 cm* eingeengt. Dan Antibioticum wird mit 2 1 Hexan ausgefällt, ab-

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gesaugt, gewaschen und getrocknet.

Sie erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle ssusaem engest eilt :

verschie—·	VoIu- aten(l)	I	Rubidomycin	Gewicht g	13 213	R.Po	1- Ausbeute	\|13 213 [ R.P. ! *
dene Phasen	oder Gewicht (β)	100 1 •	Gehali /oder */as/mg*		Gehalt ι ' oder /ig/mg	: Sewioh-l ! β	I Rubi- i domy- ! ein, * ¹
		ι 123 1
Maieche	> ι 165 1 ί		4,38		•
A oder B	5,45 g I	43,8	5,8	30	3		28
PiItrat von A	7 g ι	47,2	4,3	6,9	0,85 j	132	96
Auszug von B	26	4,78	; i7,5	2,9	98	21,5
Produkt A	875	3,57 ί I	120	0,65	110 I I	76
Produkt B	! 510 I	ί 325	2,28 !	81,5

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Claims

169567A Patentansprüche

1. Verfahren zur Überführung des Antibiotieums 13 213 R«P· in Rubidomycin« dadurch gekennzeichnet, dass man eine das Antibioticum 13 213 R»P· enthaltende Lösung der Einwirkung einer verdünnten Säure zwischen 48 Stunden bei 10 ⁰C und 30 Minuten bei 75 ⁰C aussetzt und dann das Rubidomycin aus der Lösung isoliert·

2. Verfahren nach Anspruch 1; dadurch gekennzeichnet, dass man zwischen 15 Stunden bei 20 ⁰C und 1 Stunde bei 50 ⁰C arbeitet.

3· Verfahren nach Anspruoh 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Säure bei einer Konzentration von 0,01 bis 1 η verwendete

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