KR101084432B1

KR101084432B1 - 해양 피낭류로부터 추출된 예조퀴놀라이드 및 이를함유하는 의약

Info

Publication number: KR101084432B1
Application number: KR1020050008586A
Authority: KR
Inventors: 강헌중; 최혁재; 주문경
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2005-01-31
Filing date: 2005-01-31
Publication date: 2011-11-18
Also published as: KR20060087765A

Abstract

본 발명은 해양 피낭류로부터 추출된 예조퀴놀라이드(Yezoquinolide)가 갖는 인간의 저밀도 지방단백질(LDL; low density lipoprotein) 및 콜레스테롤 수치를 효과적으로 낮추고, 고밀도 지방단백질(HDL; high density lipoprotein)을 높이는 것으로 알려진 파네소이드 고아 핵 수용체(FXR; Farnesoid X Receptor;이하 FXR이라 한다.)의 길항효과와 이를 이용한 고지혈증 치료제에 관한 것이다. 상기 물질을 추출하기 위해서 해양 피낭류를 동결 건조하여 수분을 완전히 제거하고, 디클로로메탄과 메탄올로 추출한 다음, 이 용매를 감압하에서 증발시킨다. 그 잔류물을 메탄올과 n-헥산으로 분배 추출하여 얻어진 메탄올층에서 용매를 감압하에 제거하고, 잔류물을 다시 에틸아세테이트와 물로 분배 추출한다. 이와 같이 얻어진 에틸아세테이트층의 용매를 감압하에 제거한 뒤, 그 잔류물을 LH-20 수지 컬럼 크로마토그래피와 정상 컬럼 크로마토그래피, 그리고 역상 분석 HPLC로 정제하여 상기 물질을 얻을 수 있다.

상기 방법으로 분리된 예조퀴놀라이드는 파네소이드 고아 핵 수용체에 대한 우수한 저해 활성을 가지며, 낮은 세포독성을 보인다.

Description

해양 피낭류로부터 추출된 예조퀴놀라이드 및 이를 함유하는 의약{YEZOQUINOLIDE EXTRACTED FROM A MARINE TUNICATE AND A MEDICINE CONTAINING THE SAME}

본 발명은 해양 피낭류로부터 추출된 물질인 예조퀴놀라이드의 파네소이드 고아 핵 수용체에 대한 길항활성과 이를 이용한 고지혈증 치료제에 관한 것이다.

예조퀴놀라이드는 해양 피낭류로부터 추출된 물질이며, 이미 문헌에서는 해양 갈조류인 사가숨 사가미아눔(Sargassum sagamianum)으로부터 분리된 물질로 보고되었으나, 이의 생리활성은 보고된 바 없다. 그 구조식은 하기의 화학식 1로 나타낸다[Chem. Lett. 1987, 1365].

[화학식 1]

고지혈증을 일으키는 체내의 콜레스테롤은 파네소이드 고아 핵 수용체(FXR)와 간 고아 핵 수용체(LXR; Liver X Receptor)에 의해 간에서의 배출과 재흡수를 통해 조절된다. 콜레스테롤 농도가 높을 때, 콜레스테롤은 간에서 담즙산으로 바뀐다. 이 과정은 콜레스테롤-7-알파-히드록실라제(CYP7A1; Cholesterol-7a-hydroxylase)효소에 의해 조절되며, 이 효소의 유전자 발현은 간 고아 핵 수용체(LXR)에 의해 조절된다. 담즙산은 담즙염 배출 펌프(BSEP; Bile salt excretion pump)를 통해 간에서 내장으로 배출되고, 장내 담즙산 결합 단백질(I-BABP; Intestinal bile acid binding protein)과 회장 담즙산 운반체(IBAT; Ileal bile acid transporter)를 통해서 간으로 다시 흡수된다. 이 과정에서 각각의 단계의 단백질은 파네소이드 고아 핵 수용체(FXR)에 의해 강력하게 조절된다. 따라서 이 두 가지 핵 수용체의 리간드를 이용하여 생체 내 콜레스테롤의 양을 조절할 수 있다. 특히 파네소이드 고아 핵 수용체(FXR)는 담즙산의 수용체로서 간에 담즙산이 많으면 콜레스테롤-7-알파-히드록실라제(CYP7A1)의 발현을 억제하여 담즙산의 생성을 막는 한편, 담즙염 배출 펌프(BSEP)를 활성화시켜 간의 담즙산을 장으로 배출시킨다. 또한 장에서 장내 담즙산 결합 단백질(I-BABP)과 회장 담즙산 운반체(IBAT)의 발현을 촉진시켜 간에서의 담즙산 생성을 억제하는 역할을 한다고 알려져 있다. 이에 파네소이드 고아 핵 수용체의 길항제는 생체 내의 콜레스테롤을 담즙산으로 바꾸어 배출하는 기능을 함으로써 고지혈증 치료제로 활용이 가능하다. 그 단적인 예가 구굴스테론(guggulsterone)이다. 구굴스테론(guggulsterone)은 인도의 구굴루 (guggulu) 나무(학명;Commiphora mukul)에서 추출되어 전통적인 고지혈증 치료제로 천년이상 사용되어 온 약물이다. 최근 구굴스테론은 파네소이드 고아 핵 수용체의 길항제로 보고 된 바 있다[Nature, 2002, Jun, 411., Science, 2002, May, 1703].

본 연구진에 의해 해양 피낭류로부터 추출 정제된 물질들에 대한 파네소이드 고아 핵 수용체에 대한 길항효과 검정을 통해 예조퀴놀라이드가 파네소이드 고아 핵 수용체에 대한 우수한 길항효과를 보임을 발견하였다. 이에 본 발명을 설명하고자 한다.

본 발명자들은 해낭 피낭류로부터 추출 정제된 물질들에 대한 파네소이드 고아 핵 수용체에 대한 길항효과 검정을 통해 이미 알려진 물질인 예조퀴놀라이드가 이전에는 알려지지 않았던 파네소이드 고아 핵 수용체에 대한 길항효과를 지니고 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

우선, 예조퀴놀라이드의 추출방법에 대해서 설명한다. 예조퀴놀라이드를 얻기 위하여 한국 연안에 서식하는 검은색 피낭류를 동결 건조하여 수분을 완전히 제거하고, 메탄올과 디클로로메탄의 혼합 유기용매로 추출한 후, 감압하에서 용매를 증발시킨다. 그리고 잔류물을 메탄올과 n-헥산 용매로 분배 추출하여 얻어진 메탄 올층을 증발시킨 다음, 그 잔류물을 다시 에틸아세테이트와 물로 분배 추출하여 에틸아세테이트 충을 얻는다. 감압하에서 에틸아세테이트층의 용매를 증발시킨 뒤, 추출물을 100% 메탄올에 녹여 LH-20 수지 컬럼 크로마토그래피와 실리카 정상 컬럼 크로마토그래피, 그리고 C18 역상 분석 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하여 예조퀴놀라이드를 얻는다.

상기 추출방법에 의해 검은색 해양 피낭류 1.2 kg(건식무게)으로부터 노란색 오일형태의 예조퀴놀라이드 16.0 mg(수율 0.1×10^-2%)을 얻었다. 이러한 방법으로 얻어진 해양천연물 예조퀴놀라이드는 코-트랜스팩션 어세이(co-transfection assay)를 통해 파네소이드 고아 핵 수용체에 대해 우수한 길항효과를 지니고 있음을 확인하였다.

먼저, 시료 준비 과정에서는 해양에서 채취한 즉시 냉동 보관된 검은색 해양 피낭류(건식 무게 1.2 kg)를 해동시키고, 잘게 썰어 동결건조한다. 상기 시료를 각각 1:1 비율의 메탄올과 디클로로메탄 혼합용액을 가하여 12시간 동안 상온에서 3차례에 걸쳐 추출하였다. 이 추출액을 여과하여 합한 뒤 실온에서 용매를 감압 증발시켜 제거하고, 최초추출물 18g를 얻었다. 다시 상기 추출물을 n-헥산과 메탄올로 분배 추출하여 나누고, 메탄올층의 용매를 감압하에서 제거한 후, 얻어진 물질을 다시 에틸아세테이트와 물로 분배 추출을 하였다. 이상의 과정에서 극성정도가 각각 다른 용매인 물, 에틸아세테이트, n-헥산으로 추출하여 상기의 3가지 추출물을 얻고, 이들 각각에 대하여 코-트랜스팩션 어세이를 통해 파네소이드 고아 핵 수 용체에 대한 길항효과를 측정하여 본 결과, 상기 3가지 추출물 중에서 에틸아세테이트로 추출된 분액이 가장 좋은 활성을 나타냄을 확인하고, 에틸아세테이트층의 물질을 분리 정제하였다. 상기의 에틸아세테이트층으로부터 얻어진 총 잔류물의 양은 1.5g이었다. 이 잔류물은 LH-20 수지 컬럼 상에서 100% 메탄올의 유기용매를 사용하여 분리, 정제하였다. 컬럼을 통과해 분리된 용출물은 28개의 획분으로 수집하였고, 각각에 대해 파네소이드 고아 핵 수용체에 대한 길항효과를 검색해 본 결과, 획분 11(E-11)부분에서 가장 좋은 활성을 확인하였다.

이에 상기의 획분 11(E-11)을 선택하여 다시 실리카 정상 컬럼 상에서 8:3 비율의 n-헥산: 에틸아세테이트의 혼합유기용매를 사용하여 분리, 정제하였다. 이렇게 하여 다시 13개의 획분으로 2차 분리, 정제하였으며, 각각의 활성을 확인한 결과, 두 번째 획분(E-11-2)에서 더 향상된 활성 효과를 확인하였다.

따라서 상기 획분 11-2(E-11-2)의 용매를 저온에서 감압 건조시켜 유기물질 29.1 mg 얻었고, 이를 다시 100% 메탄올에 녹인 뒤, HPLC 칼럼(reversed-phase semi-preparative HPLC column, 입자 직경 4μm, 250 × 4.6 mm, 용출액 아세토나이트릴: 물= 70: 30, 용출속도 0.7 ㎖/min)상에서 분리 정제하여, 머무름 시간이 18분에서 노란색 오일형태의 예조퀴놀라이드 16.0 mg을 순수물질로 얻었다.

상기 방법에 따라 얻은 예조퀴놀라이드의 파네소이드 고아 핵 수용체에 대한 길항효과를 검정해 본 결과와 CV-1 세포에 대한 세포독성 결과는 후술하는 시험예에서 나타낸 바와 같이 고지혈증 치료에 우수한 효과를 나타내며, 또한, 독성이 거의 없어 의약으로서 유용함을 알 수 있다.

본 발명에 의해 분리, 정제한 후, 얻어진 예조퀴놀라이드는 메틸퀴논과 부테놀라이드의 부분구조를 갖는 플라스토퀴논이다.

상기의 추출방법에 의해 분리 정제된 예조퀴놀라이드의 분자구조는 핵자기공명(Nuclear Magnetic Resonance) 스펙트럼 및 고배율 질량분석(High-resolution mass) 자료에 의하여 결정되었으며, 핵자기 공명 스펙트럼에서 수소 핵자기 공명(¹H-NMR), 탄소 핵자기 공명(¹³C-NMR) 시그널에 대한 위치 지정(assignment)은 COSY(Correlation Spectroscopy), TOCSY(Total Correlation Spectroscopy), HSQC(Heteronuclear Single Quantum Coherence), HMBC(Heteronuclear Multiple Bond Coherence) 등의 분석 자료를 기초로 하여 결정하였다.

¹H-NMR (500MHz, CDCl₃) δ : 6.99 (q, 1H, J = 1.4 Hz), 6.54 (q, 1H, J = 1.6 Hz), 6.45 (dt, 1H, J = 1.7 Hz), 5.23 (t, 1H, J = 6.6 Hz), 5.16 (t, 1H, J = 6.2 Hz), 5.08 (tt, 1H, J = 1.3, 5.6 Hz), 4.97 (tt, 1H, J = 1.5, 7.5 Hz), 3.13 (d, 2H, J = 7.2 Hz), 2.37 (dd, 1H, J = 14.0, 7.4 Hz), 2.31 (tt, 2H, J = 6.5, 1.4 Hz), 2.30 (dd, 1H, J = 14.0, 7.4 Hz), 2.23 (q, 2H, J = 6.5 Hz), 2.16 (q, 2H, J = 7.5 Hz), 2.09 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 2.06 (d, 3H, J = 1.5 Hz), 1.69 (s, 6H), 1.63 (s, 3H), 1.60 (s, 3H)

¹³C-NMR (125MHz, CDCl₃) δ : 188.2, 188.1, 173.9, 148.6, 148.3, 146.1, 139.7, 134.2, 133.4, 133.1, 132.5, 130.1, 128.6, 123.1, 118.6, 80.3, 43.7, 39.5, 27.8, 26.6, 26.1, 25.9, 25.6, 18.0, 17.0, 16.3, 16.2

본 발명에 따른 예조퀴놀라이드의 물리적 특성은 다음과 같다.

(1) 외관 : 노란색 기름

(2) 분자식 : C₂₇H₃₄O₄

(3) 분자량 : 422

(4) 용해도 : 클로로포름에 잘 녹음

(5) 성상 : 상온에서 기름상

시험예 1

상기에서 얻어진 예조퀴놀라이드의 유효성과 독성을 하기 시험법으로 조사하였다.

[코-트랜스팩션 어세이]

CV-1 세포를 이용하여 어세이를 수행하였으며, 세포배양은 5%의 이산화탄소가 포함된 37℃ 배양기에서 10% FBS, DBS(delipidated)와 1% 페니실린/스트렙토마이신을 넣은 DMEM 배지를 이용하여 96 웰 플레이트에서 수행하였다. 실험은 세포 접종, 트랜스팩션, 물질 처리, 결과 확인의 4단계를 나누어 수행하였다. CV-1 세포를 96웰 플레이트에 6,000 세포/웰로 접종하고, 24시간 후에 트랜스팩션하였다. 배양한 세포에 hFXR 발현벡터와 리포터로 FXR 결합부위가 포함된 루시퍼라제(luciferase) 벡터 및 β-gal 발현벡터를 트랜스팩션하였다. 하루 동안 배양기에 배양 시킨 뒤 비교시료로 디메틸설폭시드와 대표적인 파네소이드 고아 핵 수용체의 길항제인 구굴스테론을 사용하였으며, 디메틸설폭시드 웰을 제외한 모든 웰 1에 CDCA(Chenodeoxy cholic acid; FXR agonist)를 넣었다. 물질은 디메틸설폭시드에 녹였으며, media를 이용하여 다양한 농도로 세포에 처리하였다. 24시간 동안 인큐베이터에서 배양한 후, 세포를 용해하여, 루미노미터(Luminometer)와 마이트로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 루시퍼라제와 β-갈락토시다제 활성을 측정하였다. 측정된 루시퍼라제 값은 β-갈락토시다제 값을 이용하여 보정하였으며, 이 값을 이용하여 그래프를 그리고, IC₅₀값을 결정하였다.

[표 1] 예조퀴놀라이드의 파네소이드 고아 핵 수용체에 대한 길항효과 결과

	IC₅₀(μM)
예조퀴놀라이드	29.6

[MTT 어세이]

정제된 물질들의 세포독성은 MTT 어세이로 조사하였다. MTT는 물에 용해되는 노란색의 물질이나, 살아있는 세포에 유입될 경우 미토콘드리아에 있는 탈수소효소에 의해 물에 용해되지 않는 보라색의 결정으로 변성된다. 이 물질을 디메틸설폭시드에 용해시킨 후, 550nm에서 흡광도를 측정하면 세포독성을 확인할 수 있다. 실험 방법은 다음과 같다.

CV-1 세포를 DMEM 동물 배지에 10%의 소혈청과 1%의 항생제를 넣어서 5% 이산화탄소가 주입되는 배양기에 한 웰당 6000개의 세포가 들어가도록 한 다음 하루 동안 배양하였다. 이 플레이트 위에 원하는 물질을 처리한 뒤, 하루 동안 37℃배양기에 보관한다. 그 다음날 C1CR serum 과 MTT (10 mg/ml)를 5:1로 섞어준 뒤 각 웰에 처리해 준다. 포일로 싼 뒤, 약 30분간 인큐베이터에 보관한다. 모든 용액을 털어낸 후, 각 웰에 DMSO를 넣어준다. 550nm에서 MTT를 측정한다.

[표 2] CV-1세포에 대한 예조퀴놀라이드의 세포독성 결과

	IC₅₀(μM)
예조퀴놀라이드	237 >

본 발명에 의한 추출방법으로부터 예조퀴놀라이드가 높은 수율로 분리 정제되어 질 수 있고, 예조퀴놀라이드는 파네소이드 고아 핵 수용체에 대한 우수한 길항효과를 가지고 있으며, 낮은 세포독성을 보이므로, 이를 이용한 고지혈증 치료제로서 유용하다.

Claims

하기 화학식의 예조퀴놀라이드를 유효성분으로 함유하는 고지혈증 치료제.

[화학식 1]