KR101196467B1 - 해면동물로부터 스칼라레인 유사체, 그의 회수방법 및이를 함유하는 의약 - Google Patents

Abstract

본 발명은 해면동물로부터 하기 일반식(I)의 스칼라레인(scalarane-based sesterterpenes) 유사체 및 그의 추출방법, 및 상기 천연물들을 이용한 파네소이드 고아 핵 수용체(farnesoid orphan receptor; FXR) 억제 효과에 관한 것이다. 상기 물질을 추출하기 위해서 해면동물을 동결 건조하여 수분을 완전히 제거하고, 디클로로메탄과 메탄올로 추출한 다음, 이 용매를 감압하에서 증발시킨다. 그 잔류물을 메탄올과 n-헥산으로 분배 추출하여 얻어진 메탄올층에서 용매를 감압하에 제거시킨다. 그 잔류물을 다시 에틸아세테이트와 물로 분배 추출한다. 이와 같이 얻어진 에틸아세테이트층의 용매를 감압하에 제거한 뒤, 그 잔류물을 LH-20 수지 컬럼 크로마토그래피, 그리고 역상 분석 HPLC로 정제하여 상기 물질들을 얻을 수 있다.

Description

해면동물로부터 스칼라레인 유사체, 그의 회수방법 및 이를 함유하는 의약 {SCALARANE-BASED SESTERPERMENS, METHOD OF RECOVERING AND A MEDICINE CONTAINING THE SAME}

본 발명은 하기 일반식(I)의 스칼라레인(scalarane-based sesterterpenes) 유사체, 해면동물부터 이를 회수하는 방법, 및 이를 함유하는 의약에 관한 것이다.

[식중, X 및 Y의 각각 수소원자, 히드록시기 또는 카르복실기(

)이고,

Z는 수소원자 또는 옥소기(=O)이다]

파네소이드 고아 핵 수용체(farnesoid orphan receptor; FXR)는 인간의 콜레스테롤 대사에 관여하는 핵수용체로, FXR의 활성을 억제하였을 경우, 인간의 저밀도 지방단백질(LDL; low density lipoprotein) 및 콜레스테롤 수치를 효과적으로 낮추고, 고밀도 지방단백질(HDL; high density lipoprotein)을 높임이 문헌에 보고된 다 있다[Science, 2002, 296, 1703]. 특히 인도에서 2천년 동안 사용해온 고지혈증치료제 구굴스테론(guggulsterone)이 FXR의 길항제로 판명됨으로써, 선택적인 FXR의 활성 억제 물질은 콜레스테롤 대사 질환 및 고지혈증 치료제로 개발가능하다.

스칼라레인 유사체들은 다양한 해양생물로부터 분리되었으며, 면역 억제, 세포독성과 같은 다양한 생리활성이 보고되었으나 [J. Nat. Prod. 2000, 63, 527], 핵수용체 FXR에 대한 스칼라레인 유사체의 활성에 대하여 보고 된 바는 없다.

상기 일반식(I) 의 스칼라레인 유사체중, X가 히드록시기이고, Y가 C-O-C(O)-H이고, Z가 수소인 화합물(이하, 일반식 (I-1)이라 함)은 신규물질이며, X가 카르복시(O-C(O)-H)기이고, Y가 수소원자이고, Z가 옥소(=O)기인 화합물(이하, 일반식(I-2)라 함) 및 X가 카르복시(O-C(O)-H)기이고, Y가 수소원자이고, Z가 수소원자인 화합물(이하, 일반식(I-3)라 함)은 갯민숭달팽이류(Glossodoris sp.)로부터 추출된 물질로 이미 문헌에 보고 된 물질이나 생리활성이 보고된 바는 없다[J. Chem. Soc., Perkin Trans.1 1977, 1587].

상기 일반식(I)화합물이 고지혈증의 치료에 효과가 있는 것은 현재까지 알려진 바 없다. 본 발명자는 해면동물로부터 추출 정제된 물질들에 대한 FXR 길항 효과를 검증한 결과, 일반식(I) 화합물이 우수한 FXR 억제 효과를 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 해면동물로부터 스칼라레인(scalarane-based sesterterpenes) 유사체 1, 2, 3를 추출하는 방법, 신규 화합물 유사체 1 및 상기 천연물들을 이용한 FXR 억제 효과에 관한 것이다.

본 발명에 따른 스칼라레인(scalarane-based sesterterpenes) 유사체 1, 2, 3의 추출방법은 추출시료인 해면동물로 한 것으로, 그 추출과정은 해면동물을 메탄올과 디클로로메탄으로 추출하여 감압하에서 증기화하고, 그 잔류물을 메탄올과 n-헥산 용매로 분배 추출하여 얻어진 메탄올층을 증기화한 후, 그 잔류물을 다시 에틸아세테이트와 물로 분배 추출하여 얻어진 에틸아세테이트층을 다시 증기화한 후, 용매가 에틸아세테이트인 추출물을 크로마토그래피로 분리정제하여 스칼라레인(scalarane-based sesterterpenes) 유사체 1, 2, 3을 최종 추출하는 과정으로 이루어진다.

상기와 같은 추출방법에 의해서 추출시료인 해면동물 1 kg으로부터 스칼라레인(scalarane-based sesterterpenes) 유사체 1, 2, 3을 각각 6 mg, 7 mg, 5 mg을 추출할 수 있었다. 상기의 스칼라레인(scalarane-based sesterterpenes) 유사체 1 은 신규 물질이며, 스칼라레인 2 및 3은 이미 알려진 천연물질로, FXR에 대해 길항 활성을 나타냄을 확인하였다.

먼저, 시료 준비 과정에서는 해양에서 채취한 즉시 냉동 보관된 해면동물을 해동시켜, 이 해면동물(1 kg, 습식무게)을 2 ×2 ㎠ 크기로 잘게 썰어 시료를 준비한 후, 상기 시료를 3번에 걸쳐 각각 1: 1 비율 메탄올: 디클로로메탄(CH₂Cl₂)의 혼합 유기 용매 1 L로 상온에서 1차 추출하였다. 이어서 상기의 추출물을 감압하에서 증기화하여 잔류물(46.7g)을 얻고, 그 잔류물을 메탄올과 n-헥산으로 1차 분배 추출하였다. 그 다음, 용매가 메탄올인 추출물을 감압하에서 증기화하여 잔류물을 얻고, 그 잔류물을 물과 에틸아세테이트로 2차 분배추출하고, 상기 수층은 수층과 같은 분량의 n-부탄올으로 3차 분배추출하였다.

한편, 이상의 과정에서 극성정도가 각각 다른 용매, 즉, 물, n-부탄올, 에틸아세테이트 및 n-헥산으로 추출하여 상기의 4가지 추출물을 얻었고, 이들 각각에 대해서 코-트랜스팩션 어세이(co-transfection assay)를 통한 FXR에 대한 길항 활성을 검정해 본 결과, 상기 4가지 추출물 중에서 용매가 에틸아세테이트인 추출물이 가장 좋은 길항 활성(100 ㎍/㎖에서 FXR 활성 100% 억제)을 가진 것으로 확인되었으므로, 상기의 에틸아세테이트 추출물에 대해서 분리정제과정을 실시하였다. 여기서 코-트랜스팩션 어세이란 동물세포를 5% 이산화탄소 환경 하에서 10%의 소혈청과 1%의 항생제를 첨가한 DMEM 배지에 하루 동안 배양하고, 배양된 세포에 인간의 핵수용체인 FXR 단백질 발현 유전자와 FXR에 의해서 조절되는 발광유전자를 포함하 는 벡터를 세포 내에 주입하여 발현시킨 후에 FXR의 활성물질인 CDCA (chenodeoxycholic acid)와 추출물이나 화합물을 넣어 하루를 더 배양하고, 발광 유전자의 발현 정도를 확인하여 핵수용체 FXR의 억제정도를 대조군과 비교 확인하는 보편적인 방법으로, β-갈락토시데이즈 유전자를 이용하여 시료 첨가 시에 나타나는 피펫팅의 오류를 보정하였다.

즉, 상기의 에틸아세테이트 추출물을 감압하에서 증기화하여 1.76 g 잔류물을 얻었다. 이 잔류물 1.76 g은 LH-20 수지 컬럼상에서 크로마토그래피하였는데, 용리유체는 100% 메탄올을 사용하였다. 이 컬럼을 통과해 나온 용출물을 9개의 분획(fraction)으로 수집하였다. 상기와 같이 수집된 9개의 분획(fraction) 각각에 대해 FXR 억제효과를 본 결과, 분획5(E-5)이 가장 좋은 억제효과를 나타내었다(50 ㎍/㎖에서 FXR 100% 억제).

상기의 분획3(E-3)을 선택하여 C-18 역상 반-분취 HPLC 컬럼(C-18 reversed phase semi-preparative HPLC column(Optiampak RS C-18, 10 um, 250 ×10 mm, 자외선검출기= 210 nm, 용출 속도 3.0 ml/min)상에서 용리유체로 아세토나이트릴: 물(85: 15)을 사용하여 크로마토그래피하여 용출물을 얻은 다음, 그 용출물을 감압하에서 증기화하여 무정형의 화합물 스칼라레인 유사체 1, 2, 3 (각각 6 mg, 7 mg, 5 mg) 을 얻었다.

C-18 역상 반-분취 HPLC 컬럼에서 스칼라레인 유사체 1의 머무름 시간은 15분, 유사체 2의 머무름 시간은 17분, 유사체 3의 머무름 시간은 20분이었다.

스칼라레인 유사체 1, 2, 3에 대해서 FXR 길항 효과를 실시하여 본 결과, 상 기 스칼라레인 유사체 1, 2, 3가 각각 1.4 μM, 39.5 μM, 19.3 μM의 농도에서 FXR 활성을 50% 억제하였다(각각 IC₅₀ = 1.4 μM, 39.5 μM, 19.3 μM ).

상기 무결정 화합물 스칼라레인(scalarane-based sesterterpenes) 유사체 1, 2, 3의 동정(同定)과정은 ¹H-nmr(nuclear magnetic resonance;핵자기공명), ¹³C-nmr 및 HREIMS 실험결과를 분석함으로써 이루어졌다.

즉, 상기 화합물 스칼라레인 유사체 (Ⅰ-1)에 대해서 nmr 실험을 하였는데, 클로로포름-d, 아세톤-d ₆ , 벤젠-d ₆ , 메탄올-d ₄ 등의 용매에서 상기 화합물의 nmr을 찍어본 결과 클로로포름-d에서 피크의 분리가 가장 좋았다. ¹H-nmr 시그날과 ¹³C-nmr 시그날을 COSY, HSQC, HMBC 실험을 통하여 화학구조를 결정하였다.

또한, 상기 화합물에 대해서 HREIMS를 측정해 본 결과 m/z 428.31에서 [M-H₂O]⁺이온과 m/z 446.4에서 [M⁺]이온이 확인되었다.

상기 실험들에서 얻은 자료들을 이용해서 상기화합물의 구조를 결정하였는바, 상기 물질은 스칼라레인 유사체로서, 5환을 갖는 구조를 나타내었다.

본 발명에 따른 화합물 스칼라레인 유사체 (Ⅰ-1)의 물리-화학적 특성은 다음과 같다.

(1) 외관: 무색 무정형

(2) 화학식: C₂₇H₄₂O₅

(3) 용해도: 유기용매에 상당히 잘 녹는다.

(4) 안정도: 실온에서 대체적으로 안정한 편이다.

(5) 자외선 파장에서 흡수대를 가지지 않는다.

¹H NMR (600MHz, CDCl₃) δ : 5.49 (s, 1H), 5.30 (d, 1H, J = 6.6 Hz), 4.53 (d, 1H, J = 6.7 Hz), 4.52 (d, 1H, J = 6.7 Hz), 4.32 (d, 1H, J =12.1 Hz), 4.32 (br s, 1H), 4.23 (d, 1H, J = 12.1 Hz), 3.58 (dd, 1H, J = 11.2, 4.2 Hz), 3.53 (br s, 1H), 2.39 (m, 1H), 2.26 (br m, 1H), 2.19 (m, 1H), 2.12 (dt, 1H, J = 11.2, 3.0 Hz), 2.08 (s, 3H), 1.79 (m, 1H), 1.75 (m, 1H), 1.49 (m, 1H), 1.4-1.7 (m, 4H), 1.39 (m, 1H), 1.28 (dd, 1H, J = 11.2, 4.2 Hz), 1.14 (dt, 1H, J = 12.4, 4.5 Hz), 1.05 (br s, 1H), 0.90 (s, 3H), 0.89 (s, 3H), 0.89 (bs, 1H), 0.84 (s, 3H), 0.81 (s, 3H), 0.83 (s, 3H), 0.81 (m, 1H)

¹³C NMR (75.5MHz, CDCl₃) δ : 177.1, 134.5, 117.5, 99.0, 81.1, 77.4, 68.6, 64.5, 60.8, 58.6, 56.6, 54.2, 41.9, 40.3, 40.1, 39.9, 37.2, 36.8, 33.2, 33.1, 25.5, 23.3, 21.2, 21.2, 18.6, 18.5, 16.4, 8.9

상기 화합물 스칼라레인 유사체 (Ⅰ-2)에 대해서 화합물 스칼라레인(scalarane-based sesterterpenes) 유사체 1과 같은 방법으로 nmr 실험을 통하여 화학 구조를 결정하였다. 스칼라레인(scalarane-based sesterterpenes) 유사체 2의 화학 구조는 유사체 1과 유사하였으나, 24번 위치의 탄소가 메틸기로 친화되었으 며, 12번의 작용기가 히드록시기(OH)가 아닌 아세틸기(CH₃COO)로 바뀌었으며, 20번의 탄소가 케톤이었다.

또한, 상기 화합물에 대해서 LREIMS를 측정해 본 결과 m/z 398.27에서 [M-COOH]⁺이온과 m/z 444.2에서 [M⁺]이온이 확인되었다.

상기 실험들에서 얻은 자료를 이용하여 상기화합물의 화학 구조를 결정하였는바, 상기 물질은 스칼라레인 유사체로서, 락톤이 포함된 5환을 갖는 구조를 나타내었다.

본 발명에 따른 화합물 스칼라레인 유사체 (Ⅰ-2)의 물리-화학적 특성은 다음과 같다.

(1) 외관: 무색 무정형

(2) 화학식: C₂₇H₄₀O₅

(3) 용해도: 유기용매에 상당히 잘 녹는다.

(4) 안정도: 실온에서 대체적으로 안정한 편이다.

(5) 자외선 파장에서 흡수대를 가지지 않는다.

¹H NMR (600MHz, CDCl₃) δ : 6.85 (d, 1H, J = 2.6 Hz), 5.65 (s, 1H), 4.93 (s, 1H), 4.67 (dd, 1H, J = 11.4, 4.2 Hz), 2.57 (s, 1H), 2.40 (m, 1H), 2.22 (m, 1H), 2.06 (s, 3H), 1,85 (dd, 1H, J = 12.4, 3.1 Hz), 1.74 (dt, 2H, J = 12.4, 2.8 Hz), 1.60 (d, 1H, J = 12.6 Hz), 1,56 (m, 2H), 1.42-1.45 (m, 4H), 1.33 (dd, 1H, J = 12.4, 3.1 Hz), 1.08 (dt, 1H, J = 3.1 Hz), 1.00 (dd, 1H), 0.97 (m, 1H), 0.95 (s, 3H), 0.92 (s, 3H), 0.84 (s, 3H) 0.83 (s, 3H), 0.80 (s, 3H), 0.80 (m, 1H)

¹³C NMR (75.5MHz, CDCl₃) δ : 171.7, 167.2, 135.5, 127.7, 99.5, 82.0, 58.9, 58.5, 56.5, 53.4, 41.9, 41.4, 39.8, 38.4, 37.5, 37.4, 33.2, 33.1, 23.6, 23.4, 21.4, 21.2, 18.4, 17.9, 16.5, 16.4, 10.1

상기 화합물 스칼라레인 유사체 (Ⅰ-3)에 대해서 nmr 실험을 하여 화학 구조를 결정하였다. 유사체 3의 화학 구조는 유사체 2과 유사하였다. 다만 20번 탄소가 메틴인(CH₂)로 치환된 것이 유사체 2와 다른 점이다.

또한, 상기 화합물에 대해서 LREIMS를 측정해 본 결과 m/z 412.38에서 [M-H₂O]⁺이온과 m/z 430.2에서 [M⁺]이온이 확인되었다. 상기 실험들에서 얻은 시그날들에 의해서 상기화합물의 구조를 지정하였는바, 상기 물질은 스칼라레인 유사체로서, 5환을 갖는 구조를 나타내었다.

본 발명에 따른 화합물 스칼라레인 유사체 (Ⅰ-3)의 물리-화학적 특성은 다음과 같다.

(1) 외관: 무색 무정형

(2) 화학식: C₂₇H₄₂O₄

(3) 용해도: 유기용매에 상당히 잘 녹는다.

(4) 안정도: 실온에서 대체적으로 안정한 편이다.

(5) 자외선 파장에서 흡수대를 가지지 않는다.

¹H NMR (600MHz, CDCl₃) δ : 5.55 (s, 1H), 5.38 (t, 1H, J = 4.9 Hz), 4.67 (dd, 1H, J = 11.4, 4.3 Hz), 4.41 (dd, 1H, J = 11.4, 0.2 Hz), 4.14 (dd, 1H, J = 11.4, 0.1 Hz), 2.75 (dd, 1H, J = 5.9, 0.1 Hz), 2.23 (s, 1H), 2.11 (m, 1H), 2.05 (s, 3H), 2.03 (m, 1H), 1.83 (dd, 1H, J = 12.4, 3.0 Hz), 1.71 (dt, 1H, J = 9.7, 3.2 Hz), 1,51-1.65 (m, 4H), 1.34-1.43 (m, 4H), 1.25 (m, 2H), 1.12 (td, 1H, J = 9.2, 3.9 Hz), 0.99 (d, 1H, J = 11.6, Hz), 0.93 (m, 1H), 0.93 (s, 3H), 0.89 (s, 3H), 0.84 (s, 3H) 0.83 (s, 3H), 0.79 (s, 3H)

¹³C NMR (75.5MHz, CDCl₃) δ : 170.9, 136.2, 116.5, 99.8, 82.6, 68.4, 61.4, 58.3, 56.5, 53.8, 41.9, 41.4, 39.6, 38.0, 37.5, 37.4, 33.2, 33.1, 29.7, 23.6, 22.1, 21.5, 21.2, 18.4, 18.0, 16.5, 9.87

본 발명에 의해 확인된 일반식(Ⅰ)의 스칼라레인은 파네소이드 고아 핵 수용체에 대해 매우 우수한 길항작용을 가지고 있으며, 낮은 세포독성을 보이므로, 이를 이용한 고지혈증 치료제로서 유용하다.

Claims (2)

1. 하기 일반식(Ⅰ)의 스칼라레인을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 치료제.

   

   [식중, X 및 Y의 각각 수소원자, 히드록시기 또는 카르복실기(

   

   )이고,

   Z는 수소원자 또는 옥소기(=O)이다]
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