PL234609B1 - 4'-O-β-D-4"-metoksyglukopiranozylo-6-metyloflawon i sposób wytwarzania 4'-O-β-D-4"-metoksyglukopiranozylo-6-metyloflawonu - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest 4’-0-^-D-4”-metoksyglukopiranozylo-6-metyloflawonsposób wytwarzania 4’-0-^-D-4”-metoksyglukopiranozylo-6-metyloflawonu o wzorze 2, przedstawionym na rysunku.

Związek ten może znaleźć zastosowanie jako składnik środków farmaceutycznych.

Flawonoidy są związkami pochodzenia roślinnego przyjmowanymi przez ludzi na co dzień wraz z pożywieniem. Opisano wiele przykładów prozdrowotnego działania tych związków: przeciwalergicznego, przeciwzapalnego, czy przeciwnowotworowego. Coraz więcej dowodów wykazuje wpływ związków flawonoidowych na funkcjonowanie mózgu. Udowodniono, że niektóre flawonoidy mają zdolność do wiązania się z receptorami benzodiazepinowymi (J. Ai, K. Dekermendjian, X. Wang, M. Nielsen, M.-R. Witt, Drug Development Research, 1997, 41, 99-106).

Kwas gamma-aminomasłowy (GABA) jest głównym hamującym neuroprzekaźnikiem w mózgu ssaków. Benzodiazepiny, poprzez wiązanie się z receptorami GABA, wykazują działanie przeciwlękowe, uspokajające i łagodzące napięcie mięśniowe i są wykorzystywane w farmacji od lat sześćdziesiątych XX wieku. Związki te wykazują jednak wiele działań niepożądanych: zaburzają pamięć, powodują niezborność ruchów, nasilają działanie alkoholu i barbituranów, a także zwiększają prawdopodobieństwo rozwoju uzależnień (B. J. Hall, M. Chebib, J. R. Hanrahan, G. A.R. Johnston, European Journal of Pharmacology, 2004, 491, 1-8).

Dlatego istotne jest poszukiwanie związków pochodzenia naturalnego, które wykazywałyby działanie zbliżone do benzodiazepin, ale byłyby pozbawione wywoływanych przez nie skutków ubocznych.

6-metyloflawon wykazuje zdolność uwrażliwiana receptorów GABAA na kwas gamma-aminomasłowy. Udowodniono to m.in. w przypadku modyfikowanych żabich (Xenopus laevis) oocytów, które wykazywały ekspresję genów kodujących receptory kwasu gamma-aminomasłowego (B. J. Hall, M. Chebib, J. R. Hanrahan, G. A.R. Johnston, European Journal of Pharmacology, 2004, 491, 1-8).

Ai i współpracownicy zbadali zdolność oddziaływania 17 związków flawonoidowych na receptory GABA. Spośród przetestowanych związków 6-metyloflawon był najefektywniejszym inhibitorem dla receptorów GABAA/benzodiazepinowych w modelach ludzkich i szczurzych in vitro (J. Ai, K. Dekermendjian, X. Wang, M. Nielsen, M.-R. Witt, Drug Development Research, 1997, 41, 99-106).

Uważa się, że glikozydy flawonidów przed absorpcją w układzie pokarmowym muszą zostać poddane hydrolizie przez mikroflorę jelitową do odpowiednich aglikonów. Dowiedziono jednak, że częściowa absorpcja połączeń cukrowych flawonoidów również jest możliwa.

Flawonoidy w roślinach występują wyłącznie w połączeniu z jednostkami cukrowymi. Glikozylacja skutkuje wzrostem rozpuszczalności i stabilności cząsteczki. Większość wykorzystywanych obecnie farmaceutyków zawierających związki flawonoidowe wykorzystuje glikozydy, np. rutyna (3-0-rutynozyd kwercetyny) sprzedawana w formie tabletek czy pueraryna (8-C-glukozyd daidzeiny) podawana przez iniekcję (J. Xiao, T.S. Muzashvili, M.l. Georgiev, Biotechnology Advances, 2014, 32, 1145-1156).

W ostatnich latach w leczeniu i prewencji chorób coraz większe znaczenie zyskują związki pochodzenia naturalnego i ich odpowiedniki uzyskane na drodze biotransformacji. Dlatego istotne jest poszukiwanie nowych sposobów wytwarzania związków aktywnych biologicznie, które mogą być wykorzystane w przemyśle farmaceutycznym, ale też kosmetycznym i spożywczym.

W dostępnej literaturze brak jest doniesień na temat chemicznej syntezy oraz otrzymywania na drodze biotransformacji 4’-0-^-D-4”-metoksyglukopiranozylo-6-metyloflawonu.

Z opisu zgłoszenia wynalazku P.416996 znany jest szczep Isaria fumosorosea KCH J2.

Istota wynalazku polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2. Po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 6-metyloflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu co najmniej 96 godzin. Kolejno produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg : 1 mL.

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 168 godzin.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Isaria fumosorosea KCH J2, następuje przyłączenie 4-metoksy-^-D-glukozy

PL 234 609 B1 przy C-4'. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu).

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 4’-0-^-D-4”-metoksyglukopiranozylo-6-metyloflawonu w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu.

Wykorzystanie biotransformacji, zamiast syntezy chemicznej, umożliwia, w sposób przyjazny dla środowiska, uzyskanie związków o wyższej biodostępności i aktywności biologicznej, niż użyte substraty (E. Kostrzewa-Susłow, J. Dmochowska-Gładysz, J. Oszmiański, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2007, 49 (1-4), 113-117, W. A. Loughlin, Bioresource Technology, 2000, 74, 49-62).

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

P r z y k ł a d. Do kolby Erlenmajera o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 10 g aminobaku i 30 g glukozy, wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2 ujawniony w zgłoszeniu patentowym o numerze P.416996. Po 96 godzinach jego wzrostu dodaje się 50 mg 6-metyloflawonu o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm³ tetrahydrofuranu. Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 7 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie, używając jako eluentu mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku 9:1.

Na tej drodze otrzymuje się 12 mg 4’-0-^-D-4”-metoksyglukopiranozylo-6-metyloflawonu (wydajność 13,2%). Stopień konwersji substratu według HPLC >99%.

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi.

Opis sygnałów pochodzących z widma 1H NMR (600 MHz, Aceton-d6): δ = 8,06 ppm (2H, d, J2-,3-(6-.5·) = 8,4 Hz, H-2', H-6'), δ = 7,93 ppm (1H, s, H-5), δ = 7,65 ppm (2H, s, H-7, H-8), δ = 7,27 ppm (2H, d, J3-,2-(s-,6·) = 8,4 Hz, H-3', H-5'), δ = 6,79 ppm (1H, s, H-3), δ = 5,14 ppm (1H, d, J = 7,7 Hz, H-1”), δ = 3,91 ppm (1H, d, J = 12 Hz, H-6”a), δ = 3,75 ppm (1H, dd, J = 11,3 Hz, 4,2 Hz, H-6”b), δ = 3,71 ppm (1H, t, J = 9, H-3”), δ = 3,62 ppm (1H, s, C-4”- OCH3), δ = 3,59 ppm (1H, m, H-5”), δ = 3,56 ppm (1H, t,

J = 8,5 Hz, H-2”), δ = 3,28 ppm (1H, t, J = 9,3 Hz, H-4”), δ = 2,5 ppm (1H, s, C6-CH3).

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. 4’-0-^-D-4”-metoksyglukopiranozylo-6-metyloflawon o wzorze 2.
2. 2. Sposób wytwarzania 4’-0-^-D-4”-metoksyglukopiranozylo-6-metyloflawonu, znamienny tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 6-metyloflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg : 1 mL.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.
5. 5. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że transformację prowadzi się przez 168 godzin.