PL238964B1 - Sposób wytwarzania 4’-hydroksy-5,7-dimetoksyflawonu - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania 4'-hydroksy-5,7-dimetoksyflawonu o wzorze 2. W wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Isaria fumosorosea KCh J2, następuje O-demetylacja. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu).

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 4'-hydroksy-5,7-dimetoksyflawonu.

Metoda, według wynalazku może znaleźć zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym do wytwarzania składników preparatów poprawiających funkcjonowanie przewodu pokarmowego.

Flawony są syntezowane przez rośliny i stanowią składnik naszej diety o wysokim potencjale antyoksydacyjnym oraz zdolności do modulowania wielu układów enzymatycznych związanych z wieloma chorobami (Mughal E.U., Ayaz M., Hussain Z., Hasan A., Sadiq A., Riaz M., Malik A., Hussain S., Choudhary M.l. 2006. Synthesis and antibacterial activity of substituted flavones, 4-thioflavones and 4-iminoflavones. Bioorg. Med. Chem. 14: 4704-4711). Różne naturalne, półsyntetyczne i syntetyczne pochodne flawonów zostały scharakteryzowane pod kątem szeregu działań terapeutycznych, takich jak działania przeciwzapalne, przeciwestrogenowe, przeciwdrobnoustrojowe (Cushnie T.P.T., Lamb A.J. 2005. Antimicrobial activity of flavonoids. Int. J. Antimicrol. Agents 26: 343-35), przeciwalergiczne, przeciwutleniające, przeciwnowotworowe czy też cytotoksyczne (Havsteen B. 1983. Flavonoids, a class of natural products of high pharmacological potency. Biochem. Pharmacol. 32: 1141-1148; Aregawi M., Williams R., Dye C., Cibulskis R., Otten M. 2008. World Malaria 2008, World Health Organization (WHO): Geneva).

4'-hydroksy-5,7-dimetoksyflawon był wyizolowany z endemicznej rośliny (Strobilanthes formosanus) stosowanej w medycynie ludowej na Tajwanie. Preparaty z tej bogatej w związki flawonoidowe rośliny są stosowane do leczenia zarówno nieżytów gardła jak i problemów związanych z funkcjonowaniem wątroby (Kuo-ChingKao, Yu-Ling Ho, I- Hsin Lin, Li-Kang Ho, Yuan-ShiunChang. Flavone Glycosides from Strobilanthes formosanus. Journal of the Chinese Chemical Society, 2004, 51,199-204). Związek ten był również wyizolowany z Kaempferia parviflora - rośliny stosowanej na Tajlandii do leczenia dolegliwości związanych z nieprawidłowym funkcjonowaniem jelit (ToshiakiAzuma, Yasuo Tanaka, HiroeKikuzaki. Phenolicglycosides from Kaempferia parviflora. Phytochemistry 69 (2008) 2743-2748). Wysoką aktywność prozdrowotną posiadają również bogate w metoksyflawony ekstrakty z tej rośliny (Patanasethanont, D., Nagai, J., Yumoto, R., Murakami, T., Sutthanut, K., Sripanidkulchai, B.O., Yenjai, C., Takano, M., 2006. Effects of Kaempferia parviflora extracts and their flavone constituents on P-glycoprotein function. J.Pharm. Sci. 96, 223-233).

W literaturze nie ma doniesień dotyczących zastosowania metod biotechnologicznych do uzyskania 4'-hydroksy-5,7-dimetoksyflawonu.

Szczep Isaria fumosorosea KCh J2 był wcześniej ujawniony w literaturze (Dymarska M., Grzeszczuk J., Urbaniak M., Janeczko T., Pląskowska E., Stępień Ł., Kostrzewa-Susłow E.; (2017) The newstrain of Isaria fumosorosea KCH J2 efficiently biocatalyses glycosylation of 6-methylflavone. Plos One. 12, e.0184885; Kozłowska E., Dymarska M., Kostrzewa-Susłow E.; Janeczko T., (2017) Isaria fumosorosea KCh J2 entomopathogenic strain as an effective biocatalyst for steroid compound transformations. Molecules, 22, 1511, doi:10.3390.).

Istota wynalazku polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCh J2. Po upływie co najmniej 48 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 5,7,4'-trimetoksyflawon wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. T ransformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 1 dobę. Kolejno produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.

W wyniku regioselektywnej O-demetylacji otrzymuje się 4'-hydroksy-5,7-dimetoksyflawon, a reakcję prowadzi się w wodnej kulturze szczepu Isaria fumosorosea KCh J2.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,2 g : 1 L.

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 9 dni.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Isaria fumosorosea KCh J2, następuje regioselektywna O-demetylacja w substracie. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu).

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 4'-hydroksy-5,7-dimetoksyflawonu, z wydajnością izolowaną na poziomie 50% (konwersją według HPLC= 70%),w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu.

PL 238 964 Β1

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

Przykład. Do kolby Erlenmajera o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 5 g aminobaku i 15 g glukozy, wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCh J2. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje się 100 mg 5,7,4'-trimetoksyflawonu o wzorze 1, rozpuszczonego w 2 cm³ dimetylosulfotlenku (DMSO). Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 9 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się trzykrotnie chloroformem, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie, używając jako eluentu mieszaniny heksan i aceton 9:1.

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi:

¹H NMR (600 MHz) (DMSO) δ (ppm): 3.82 (s, 3H, C-5-OCH₃), 3.89 (s, 3H, C-7-OCH₃), 6.49 (d, 1H, J = 2.3 Hz, H-6), 6.59 (s, 1H, H-3), 6.83 (d, 1H, J = 2.3 Hz, H-8), 6.89-6.92 (m, 2H, H-3’, H-5’), 7.87-7.90 (m, 2H, H-2’, H-6'), 10.22 (s, 1H, C-4'-OH), ¹³C NMR (151 MHz, DMSO) δ = 55.94 (C-7-OCH₃), 56.06 (C-5-OCH₃), 93.32 (C-8), 96.16 (C-6), 106.13 (C-3), 108.25 (C-4a), 115.83 (C-3’, C-5’), 121.37 (C-1'), 127.84 (C-2', C-6'), 159.12 (C-8a), 160.06 (C-2), 160.24 (C-5), 160.51 (C-4 ), 163.58 (C-7), 175.65 (C-4).

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania 4'-hydroksy-5,7-dimetoksyflawonu, znamienny tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza: się szczep Isaria fumosorosea KCh J2, następnie po upływie co najmniej 48 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 5,7,5'-trimetoksyflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 1 dobę, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,2 g : 1 L.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że transformację prowadzi się przez 9 dni.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mieszaninę poreakcyjną oczyszcza się, używając jako eluentu mieszaniny heksan aceton 9:1.